RU2547799C1 - Способ создания биоинженерного каркаса легкого крысы - Google Patents
Способ создания биоинженерного каркаса легкого крысы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2547799C1 RU2547799C1 RU2013157732/14A RU2013157732A RU2547799C1 RU 2547799 C1 RU2547799 C1 RU 2547799C1 RU 2013157732/14 A RU2013157732/14 A RU 2013157732/14A RU 2013157732 A RU2013157732 A RU 2013157732A RU 2547799 C1 RU2547799 C1 RU 2547799C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lung
- rat
- quality
- bioengineered
- frame
- Prior art date
Links
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к созданию биоинженерного органа, и может быть использовано в трансплантологии. Способ создания биоинженерного каркаса легкого крысы включает перфузию легкого детергентно-энзиматическим методом, контроль качества каркаса гистологическим исследованием. На фоне постоянной соответствующей физиологическим параметрам вентиляции легких атмосферным воздухом через трахею в течение 24 часов осуществляют через легочную артерию перфузию легких путем последовательного воздействия децеллюляризирующих растворов. Для этого с равной продолжительностью воздействия используют фосфатный буфер, 1% водный раствор дезоксихолата натрия, свиную панкреатическую ДНКазу I, очищенную воду. После чего для обеспечения качества последующей рецеллюляризации с помощью колориметрического метода подтверждают биосовместимость созданного каркаса легкого, жизнеспособность, а также сохранность его архитектоники путем определения его биомеханической прочности на растяжение и сжатие, фиксируя легочный комплайнс. Способ обеспечивает сохранение структуры матрикса легкого и его качества, исключает риск контаминации. 1 табл.
Description
Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано в клеточной биологии, молекулярной биологии, торакальной хирургии для создания биоинженерного органа в качестве трансплантата.
Трансплантация органов является эффективным методом лечения пациентов, страдающих заболеваниями в терминальной стадии, но, к сожалению, она связана с постоянным недостатком донорских органов, необходимостью пожизненной иммуносупрессивной терапии, имеет высокий процент смертности, а также по этическим соображениям пересадка органов не проводится во многих странах [Fuchs J.R. et al., 2001]. Это вызывает потребность в новых способах лечения для восстановления или замещения поврежденных органов и тканей, что позволит избежать сложностей, связанных с аллогенной трансплантацией. Многообещающей стратегией в репарации или замещении поврежденных органов и тканей является тканевая инженерия [Ott Н.С.et al., 2008]. Тканевая инженерия включает в себя разработку и модификацию биологических (природных) или искусственных каркасов (носителей), а также оценку и поддержание жизнеспособности клеток или тканей, взаимодействующих с ними. С целью исключения иммунных реакций биологические каркасы должны быть децеллюляризированы, но при этом сохранять исходную структуру ткани и внеклеточного матрикса (ВКМ). Известно, что децеллюляризация - это процесс, направленный на удаление клеток из ткани с сохранением ВКМ и трехмерности структуры органа [Ott Н.С.et al., 2008; Badylak S.F. et al., 2011]. Исследования по созданию естественных каркасов методом децеллюляризации ведутся для следующих органов: трахеи, пищевода, сердца, легких, скелетной мышцы, диафрагмы и др. [Atala А., 2009; Ott Н.С.et al., 2008; Badylak S.F. et al., 2011; Conconi M.T. et al., 2005; Macchiarini P. et al., 2008].
С учетом высокой смертности от хронических заболеваний дыхательной системы, весьма актуальной является разработка способа создания биоинженерного легкого.
В частности, известен способ децеллюляризации органокомплекса легких мыши [Price А.Р., England К.А. et al. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Part A 2010; 16: 2581-91]. Протокол включает в себя перфузию легких мыши через трахею и сосудистое русло очищенной водой, детергентами и ферментами: 0,1% раствором тритона Х-100, 2% раствором содиумдодецилсульфата, хлоридом натрия, свиной панкреатической ДНКазой типа 1S в течение 63 часов. Контроль качества полученного каркаса определяли гистологическими методами и регистрацией эластических свойств.
Основными недостатками данного способа являются повреждение гистологической структуры альвеол легких вследствие перфузии через дыхательные пути и воздействия высоких концентраций детергентов, а также длительность проведения децеллюляризации, повышающая риск бактериальной контаминации. Способ предусматривает контроль получаемого биоинженерного каркаса легкого только по данным гистологического исследования и по оценке эластических свойств каркаса. Также в данном протоколе децеллюляризацию проводят на модели легких мыши, что, в связи с физиологическими отличиями животных, не может транслироваться на модель крысы без изменений и дополнений.
За ближайший аналог принят способ проведения децеллюляризации легких крысы [Ott Н.С., Clippinger В., Conrad С.et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 2010; 16: 927-33], заключающийся в проведении физиологической ретроградной перфузии легких через легочную артерию фосфатным буфером (PBS) с добавлением гепарина и антибиотиков, деионизированной водой и растворами детергентов: 0,1% содиумдодецилсульфата и тритона Х-100 в течение 72 часов. Контроль качества проводился путем гистологического исследования, анализа морфологической структуры и механических свойств полученного каркаса.
Основным недостатком данного способа является длительность проведения децеллюляризации, создающая угрозу бактериальной контаминации каркаса.
Задачи: максимальное сохранение гистологической структуры внеклеточного матрикса легкого, обеспечение щадящего режима обработки биологического материала, снижение концентраций детергентов, физиологическая вентиляция легких, снижение времени экспозиции растворов и вероятности бактериальной контаминации получаемого каркаса, т.е. повышение качества получаемого биоинженерного материала и обеспечение контроля его качества.
Сущностью предложенного изобретения является то, что на фоне постоянной соответствующей физиологическим параметрам вентиляции легких атмосферным воздухом через трахею перфузию легочной артерии в течение 24 часов осуществляют путем последовательного воздействия через легочную артерию децеллюляризирующих растворов: фосфатного буфера; 1% водного раствора дезоксихолата натрия; свиной панкреатической ДНКазы I; очищенной воды с равной продолжительностью приемов воздействия, после чего для обеспечения качества последующей рецеллюляризации с помощью колориметрического метода подтверждают биосовместимость созданного биоинженерного каркаса легкого крысы, жизнеспособность клеток на каркасе, сохранность архитектоники полученного каркаса путем использования методов рутинного гистологического исследования и определения его биомеханической прочности на растяжение и сжатие, фиксируя легочной комплайнс.
Технический результат способа состоит в повышении качества получаемого материала каркаса, отсутствии бактериальной контаминации каркаса, полном нивелировании негативных эффектов известных способов того же назначения. Для достижения указанного результата использовались сниженные концентрации и сокращенное время экспозиции перфузионных растворов, а также применение физиологической вентиляции легких при проведении децеллюляризации (параметры вентиляции соответствуют естественным у животных - крыс). Ранее использовавшиеся протоколы повреждали паренхиму легких и несли высокий риск развития бактериальной контаминации, что крайне неблагоприятно сказывается на качестве полученного каркаса легкого и возможности последующего создания биоинженерного органа. Кроме того, способ предусматривает контроль качества получаемого биоинженерного каркаса легкого на жизнеспособность, совместимость, адекватность трансплантата планируемому реципиенту.
Способ создания биоинженерного легкого крысы осуществляют следующим образом: проводят забор органокомплекса «сердце-легкие» после эвтаназии крысы с соблюдением этических норм, фиксируют органокомплекс в биореакторе, выполняют децеллюляризацию легких детергентно-энзиматическим методом в течение 24 часов на фоне постоянной вентиляции трахеи атмосферным воздухом путем последовательного воздействия децеллюляризирующих растворов: фосфатного буфера; 1% водного раствора дезоксихолата натрия (неионного детергента щадящего действия, разрушающего клеточные мембраны и способствующего лизису клеток для получения каркаса легкого); свиной панкреатической ДНКазы I; очищенной воды с равной продолжительностью воздействия. Контроль качества полученного биоинженерного каркаса осуществляют методами рутинного гистологического исследования и определения предельных биомеханических параметров на растяжение и сжатие для подтверждения сохранности архитектоники внеклеточного матрикса легких и отсутствия клеточных элементов на легочном каркасе, а также использованием регистрации биомеханических данных с целью обеспечения соответствия биомеханических свойств имплантата реципиенту дополнительной регистрацией легочного комплайнса при моделировании физиологических условий для установления сохранной способности легких к растяжению и сжатию. Определение легочного комплайнса включает в себя регистрацию величин дыхательного объема, давления плато, пикового дыхательного объема легких, давление в легочной артерии и грудной полости. Жизнеспособность клеток на полученном каркасе определяют путем колориметрического анализа с использованием ХТТ-реагента в целях установления биосовместимости полученного каркаса и проведения последующих экспериментов по рецеллюляризации. Колориметрический анализ проводится согласно рекомендациям в инструкции производителя.
Способ апробирован в течение 2 лет на биологическом материале (органокомплекс «сердце-легкие») экспериментальных животных (крысах). Результаты полностью подтвердили решаемые задачи. Получены естественные матриксы органов с сохранным внеклеточным матриксом и отсутствием клеточных структур.
Данный способ создания биоинженерного легкого использован в эксперименте на 30 крысах-самцах линии Lewis. Выполнены забор и фиксация в биореакторе органокомплекса «сердце-легкие» с последующей децеллюляризацией легких по предлагаемому способу. Пример: забор органокомплекса «сердце-легкие» проведен у крысы-самца линии Lewis весом 200 г после проведенной эвтаназии передозировкой наркотических средств в соответствии с этическими требованиями. Органокомплекс фиксирован в биореакторе. Начата децеллюляризация легких: на фоне постоянной вентиляции трахеи атмосферным воздухом в течение 24 часов проводили последовательную перфузию легочной артерии децеллюляризирующими растворами: фосфатным буфером; 1% водным раствором дезоксихолата натрия; свиной панкреатической ДНКазой I; очищенной водой с равной продолжительностью приемов воздействия. Контроль качества полученного биоинженерного каркаса осуществляли методами рутинного гистологического исследования (окрашивание гематоксилин-эозином, трихромом по Массону, окрашивание по Ван Гизон), а также путем определения предельных биомеханических параметров на растяжение и сжатие с дополнительной регистрацией легочного комплайнса при моделировании физиологических условий. Определение легочного комплайнса включает в себя регистрацию величин дыхательного объема, давления плато, пикового дыхательного объема легких, давление в легочной артерии и грудной полости на всем протяжении децеллюляризации во время моделирования вдоха и выдоха у животного. Жизнеспособность клеток на полученном каркасе определяли путем колориметрического анализа с использованием ХТТ-реагента с целью определения биосовместимости полученного каркаса и проведения последующих экспериментов по рецеллюляризации. Колориметрический анализ проводится согласно рекомендациям в инструкции производителя. В результате экспериментов по децеллюляризации получен каркас легких с сохранением гистологической архитектоники и белков внеклеточного матрикса. Вышеуказанный каркас при проведении колориметрического анализа продемонстрировал биосовместимость и нетоксичность по отношению к клеткам, которым он был засеян.
Claims (1)
- Способ создания биоинженерного каркаса легкого крысы, включающий перфузию легкого детергентно-энзиматическим методом, контроль качества каркаса гистологическим исследованием, отличающийся тем, что на фоне постоянной соответствующей физиологическим параметрам вентиляции легких атмосферным воздухом через трахею перфузию легочной артерии в течение 24 часов осуществляют путем последовательного воздействия через легочную артерию децеллюляризирующих растворов: фосфатного буфера; 1% водного раствора дезоксихолата натрия; свиной панкреатической ДНКазы I; очищенной воды с равной продолжительностью воздействия, после чего для обеспечения качества последующей рецеллюляризации с помощью колориметрического метода подтверждают биосовместимость созданного биоинженерного каркаса легкого крысы, жизнеспособность, сохранность архитектоники полученного каркаса путем определения его биомеханической прочности на растяжение и сжатие, фиксируя легочный комплайнс.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013157732/14A RU2547799C1 (ru) | 2013-12-24 | 2013-12-24 | Способ создания биоинженерного каркаса легкого крысы |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013157732/14A RU2547799C1 (ru) | 2013-12-24 | 2013-12-24 | Способ создания биоинженерного каркаса легкого крысы |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2547799C1 true RU2547799C1 (ru) | 2015-04-10 |
Family
ID=53296482
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013157732/14A RU2547799C1 (ru) | 2013-12-24 | 2013-12-24 | Способ создания биоинженерного каркаса легкого крысы |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2547799C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2654686C1 (ru) * | 2017-06-07 | 2018-05-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный медицинский университет" Минздрава России (ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России) | Способ восстановления функциональных свойств тканеинженерной конструкции диафрагмы |
RU2713803C1 (ru) * | 2019-01-10 | 2020-02-07 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Амурская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ децеллюризации легкого для получения внеклеточного матрикса |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110287071A1 (en) * | 2009-02-01 | 2011-11-24 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Methods of generating tissue using devitalized, acellular scaffold matrices derived from micro-organs |
RU2445008C1 (ru) * | 2010-11-25 | 2012-03-20 | Евгений Богданович Топольницкий | Способ замещения циркулярных дефектов трахеи |
RU2453291C1 (ru) * | 2010-11-17 | 2012-06-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" РАМН) | Способ получения матрикса трахеи для аллогенной трансплантации |
US20130028984A1 (en) * | 2011-07-28 | 2013-01-31 | Lifecell Corporation | Natural tissue scaffolds as tissue fillers |
-
2013
- 2013-12-24 RU RU2013157732/14A patent/RU2547799C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110287071A1 (en) * | 2009-02-01 | 2011-11-24 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Methods of generating tissue using devitalized, acellular scaffold matrices derived from micro-organs |
RU2453291C1 (ru) * | 2010-11-17 | 2012-06-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" РАМН) | Способ получения матрикса трахеи для аллогенной трансплантации |
RU2445008C1 (ru) * | 2010-11-25 | 2012-03-20 | Евгений Богданович Топольницкий | Способ замещения циркулярных дефектов трахеи |
US20130028984A1 (en) * | 2011-07-28 | 2013-01-31 | Lifecell Corporation | Natural tissue scaffolds as tissue fillers |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
OTT H.C. et al.Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 2010; 16:927-33. * |
ПЕТРОСЯН Л. С. Изменение жидкостных свойств мембраны фосфатидилхолиновых липосом при различных концентрациях дезоксихолата натрия. Биол. Мембраны, 1989, Т.6, N4, C. 386-389. РАБИНОВИЧ Ю. Я., Пересадка легкого в эксперименте. Трансплантация органов, 1990, C. 237-238. PRICE A.P. et al. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Part A 2010; 16: 2581-91. NICHOLS JE et al. Production and utilization of acellular lung scaffolds in tissue engineering. J Cell Biochem. 2012 Jul;113(7):2185-92,abstr * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2654686C1 (ru) * | 2017-06-07 | 2018-05-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный медицинский университет" Минздрава России (ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России) | Способ восстановления функциональных свойств тканеинженерной конструкции диафрагмы |
RU2713803C1 (ru) * | 2019-01-10 | 2020-02-07 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Амурская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ децеллюризации легкого для получения внеклеточного матрикса |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7075446B2 (ja) | 肺バイオリアクタ | |
JP6609595B2 (ja) | 肺臓の組織工学 | |
JP2021120012A (ja) | 臓器および組織の脱細胞化および再細胞化 | |
JP6072179B2 (ja) | バイオ人工肺 | |
Peloso et al. | Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering | |
Haykal et al. | Evaluation of the structural integrity and extracellular matrix components of tracheal allografts following cyclical decellularization techniques: comparison of three protocols | |
JP2022107023A (ja) | 臓器および組織を脱細胞化および再細胞化する方法 | |
Weymann et al. | Perfusion‐decellularization of porcine lung and trachea for respiratory bioengineering | |
JP6505088B2 (ja) | インプラント及びその製造方法 | |
CN109689071B (zh) | 肺上皮工程中的人气道干细胞 | |
Tebyanian et al. | Histologic analyses of different concentrations of TritonX-100 and Sodium dodecyl sulfate detergent in lung decellularization | |
RU2547799C1 (ru) | Способ создания биоинженерного каркаса легкого крысы | |
RU2550286C1 (ru) | Способ моделирования биоинженерного каркаса сердца в эксперименте на крысе | |
RU2654686C1 (ru) | Способ восстановления функциональных свойств тканеинженерной конструкции диафрагмы | |
RU2662554C2 (ru) | Способ подготовки материала для создания биоинженерной конструкции пищевода | |
RU2625002C1 (ru) | Способ стимуляции адгезиогенеза в плевральной полости при политравмах с преимущественным поражением грудной клетки | |
Zhou et al. | De-Epithelialization Protocol with Tapered Sodium Dodecyl Sulfate Concentrations Enhances Short-Term Chondrocyte Survival in Porcine Chimeric Tracheal Allografts | |
RU2714327C1 (ru) | Способ ускоренной децеллюляризации биологической ткани или органа | |
US20210128786A1 (en) | Avian based lung assist device | |
AU2016319066A1 (en) | Tissue engineering | |
Ma et al. | Comparative assessment of two detergents for decellularized lung scaffolds | |
JP2023552085A (ja) | 腎臓オルガノイド培養及び移植のための脱細胞腎臓組織由来支持体及びその製造方法 | |
Gilpin et al. | Patient-Derived Airway Stem Cells In Human Lung Bio-Engineering | |
Duisit | Human face bioengineering | |
CN111632196A (zh) | 一种去α-半乳糖基抗原脱细胞基质的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20151225 |