KR20220083621A

KR20220083621A - 조직 재생용 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20220083621A
Application number: KR1020210176235A
Authority: KR
Inventors: 유석환
Original assignee: 주식회사 로킷헬스케어
Priority date: 2020-12-11
Filing date: 2021-12-10
Publication date: 2022-06-20
Also published as: WO2022124847A1

Abstract

본 발명은 미분화된 지방 조직 추출물 및 세포배양체 유래 세포외기질 파우더를 포함하는, 조직 재생용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

조직 재생용 조성물 및 이의 제조방법{Composition for Tissue Regeneration And Method for Preparing the Same}

본 명세서는 2020년 12월 11일에 한국특허청에 제출된 한국 특허 출원 제 10-2020-0173573호의 출원일의 이익을 주장하며, 그 내용 전부는 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 조직 재생용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

화상은 손상 기전에 따라 열탕화상, 접촉화상, 화염화상, 섬광화상, 화학화상, 전기화상, 방사선화상으로 분류할 수 있다. 대부분의 보호 상피층과 거의 모든 진피층이 파괴되는 심부 2도 화상 및 3도 화상은 세균을 빠르게 받아들이고 감염을 일으킬 수 있다.

화상에서의 감염예방은 화상 환자의 간호시 통상적으로 중요한 문제이다. 대부분의 화상에서의 감염은 치료되지 않을 경우, 생명을 위협하는 패혈증으로 빠르게 진행될 수도 있다. 따라서, 화상의 환부를 신속하게 처치하는 것이 문제이며, 미국 특허 제3,761,590호에서는 기존 화상 치료에 유용한 실버 설파디아진을 함유하는 농후한 크림 연고를 제조하는 방법이 기술되어 있다.

그러나, 이들 크림계 제품은 단지 멸균 기술만을 사용하여 환부를 도포하고 있다. 또한, 이러한 유형의 약물 투여 작업은 대단히 시간 소모적이고, 동일한 용기의 다중 사용으로 인한 환자들 간의 교차 오염(crosscontamination) 가능성을 생각할 수 있다. 교차 오염으로 인해 통상적으로 의사가 이 제품을 환자에게 처방하는 것이 제지되고, 각 치료 후 가정에서보다는 임상적으로만 사용된다. 그러므로 환자는 화상이 좀 나았다 하더라도 이 크림을 새로 도포하는 과정에서 감염에 노출될 우려가 있다. 따라서, 당해 기술분야에서는 화상 치료용으로 저렴하고 덜 고통스럽고 사용이 쉬우며 투명하고 교차 오염되지 않는 제형을 개발할 필요성이 있다.

즉, 현재 화상용 치료재는 드레싱 이외에는 별다른 치료재는 개발 되어 있지 않으며, 치료 방법도 계속 생겨나는 가피를 제거하면서 드레싱을 덮어서 자연적인 치유를 기다리는 외과적 방법외에는 없는 실정이다. 그러므로, 화상 치료에 있어서, 감염 방지와 함께 피부 재생 효과가 탁월한 화상 치료제의 개발이 필요하다.

본 발명은 손상 또는 손실된 조직, 구체적으로 손상 또는 손실된 피부 조직을 치료할 수 있는 조직 재생용 조성물 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 실시상태는, 미분화된(micronized) 지방 조직 추출물; 및 세포배양체 유래 세포외기질 파우더를 포함하는, 조직 재생용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 실시상태는, A) 미분화된 지방 조직 추출물을 준비하는 단계; B) 세포배양체 유래 세포외기질 파우더를 준비하는 단계; 및 C) 상기 미분화된 지방 조직 추출물과 상기 세포배양체 유래 세포외기질 파우더를 혼합하는 단계;를 포함하는, 조직 재생용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 조직 재생용 조성물은 손상 또는 손실된 조직의 효과적인 재생이 이루어져 빠른 회복을 도울 수 있는 이점이 있다. 특히, 본 발명에 따른 조직 재생용 조성물은 화상 등으로 인하여 손상된 피부 조직을 효과적으로 회복시킬 수 있다. 나아가, 상기 조직 재생용 조성물을 스프레이로 도포하는 경우, 환부의 추가 감염을 방지할 수도 있다.

도 1은 실험예에 따른 화상 모델이 적용된 돼지의 환부 치료 결과를 나타낸 것이다.

본 명세서에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서에서 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

상기 미분화된 지방 조직 추출물은 환부에서 세포 분화가 촉진되도록 하는 역할을 할 수 있다. 그리고, 상기 세포배양체 유래 세포외기질 파우더는 환부에서 세포가 분화할 수 있는 기질 역할을 효과적으로 수행할 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 미분화된 지방 조직 추출물과 상기 세포배양체 유래 세포외기질 파우더의 중량비는 1:10 내지 10:1일 수 있다. 상기 중량비 범위 내에서, 상기 조직 재생용 조성물은 환부에서 효과적으로 세포의 분화를 유도하여 손상 또는 손실된 조직의 재생을 효과적으로 도울 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 미분화된 지방 조직 추출물은 100 ㎛ 내지 300 ㎛의 필터 공경을 통과하는 지방조직 유래 세포외기질을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 미분화된 지방 조직 추출물은 100 ㎛ 내지 300 ㎛ 범위의 크기를 가지는 지방 조직의 세포외기질을 포함하고, 이는 손상 또는 손실된 환부에서의 조직 재생에 필요한 인자들을 다수 포함하여, 환부의 치료가 효과적으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 미분화된 지방 조직 추출물은 동종 유래 조직 또는 세포로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 미분화된 지방 조직 추출물은 자가 지방 조직으로부터 유래된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 미분화된 지방 조직 추출물은 시술 대상인 환자 또는 동물의 지방 조직을 이용하여 추출된 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 세포배양체 유래 세포외기질은 동종 또는 자가 세포 및/또는 조직을 이용하여 배양된 조직으로부터 탈세포화된 것을 의미할 수 있다. 즉, 상기 세포배양체는 인체 또는 동물에서 추출된 조직이 아닌, 체외에서 세포 또는 조직을 이용하여 배양된 것으로서 세포 및 세포외기질을 포함하는 배양된 조직일 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 세포배양체 유래 세포외기질 파우더의 평균 입경은 10 ㎛ 내지 30 ㎛일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포배양체 유래 세포외기질 파우더의 평균 입경은 10 ㎛ 내지 20 ㎛, 또는 10 ㎛ 내지 15 ㎛일 수 있다. 상기 세포배양체 유래 세포외기질 파우더는 고상의 입자로서, 상기 범위의 평균 입경을 가지며, 이는 환부에서 세포의 분화가 일어날 수 있는 매질 역할을 할 수 있다. 상기 세포배양체 유래 세포외기질 파우더의 평균 입경이 상기 범위를 벗어나는 경우, 환부에서의 세포 분화가 효과적으로 일어나는 환경을 제공하지 못하여, 환부의 회복이 더뎌질 수 있다. 상기 세포배양체 유래 세포외기질 파우더의 평균 입경은 컴퓨터 프로그램을 통하여 단위 면적에서 수집된 입자의 입경 평균을 계산하는 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 세포배양체 유래 세포외기질 파우더는 동종의 조직 또는 세포로부터 유래될 수 있다. 구체적으로, 상기 세포배양체 유래 세포외기질 파우더는 자가 유래 조직으로부터 유래될 수 있다. 구체적으로, 상기 세포배양체 유래 세포외기질 파우더는 시술이 필요한 부위의 동종 또는 자가 조직 및/또는 세포로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어 상기 조직 재생용 조성물이 피부 재생을 위한 경우, 상기 세포배양체 유래 세포외기질 파우더는 피부 세포 및/또는 조직으로부터 유래될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 세포배양체 유래 세포외기질 파우더는 인체 또는 시술 대상인 환자의 진피세포로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 실시상태는, 상기 조직 재생용 조성물의 제조방법을 제공한다.

전술한 조직 재생용 조성물에서의 미분화된 지방 조직 추출물 및 세포배양체 유래 세포외기질 파우더의 내용은 상기 조직 재생용 조성물의 제조방법에서 그대로 적용될 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 미분화된 지방조직 추출물은 추출된 지방조직을 이용하여 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 미분화된 지방조직 추출물은 일반적인 지방 흡입술을 이용하여 지방 조직을 추출한 후, 이를 미분화하여 수득될 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 지방조직은 자가지방 조직일 수 있다. 구체적으로, 상기 지방조직은 환자의 자가지방일 수 있으며, 지방 흡입술을 통하여 추출될 수 있다. 또한, 상기 지방조직은 지방 흡입술을 이용하여 지방조직을 추출한 후, 지방조직과 함께 섞인 생리 식염수 및 혈액을 적어도 일부 제거하여 수득할 수 있다. 구체적으로, 상기 지방조직은 지방 흡입술을 이용하여 수득되는 추출물을 소정의 시간 동안 방치하여 지방층과 분리되는 피 및 생리 식염수 층을 제거하여 수득될 수 있다. 이와 같이 생리 식염수 및 혈액을 제거하는 경우, 보다 효과적으로 하기의 지방조직 추출물을 추출할 수 있으며, 제조된 지방조직 추출물은 치료에 적합한 성장 인자 및 활성 세포를 보다 효과적으로 포함할 수 있다.

A) 단계는, a1) 2 ㎜ 내지 5 ㎜의 공경(pore) 직경을 가지는 제1 필터, 400 ㎛ 내지 800 ㎛의 공경(pore) 직경을 가지는 제2 필터, 및 150 ㎛ 내지 250 ㎛ 의 공경(pore) 직경을 가지는 제3 필터를 순차적으로 이용하여, 지방조직을 단계적으로 분쇄하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 제1 내지 제3 필터는 마이크로나이저일 수 있다. 또한, 상기 제1 내지 제3 필터는 시린지 필터로서, 주사기를 이용하여 지방조직을 통과시켜 이를 분쇄할 수 있다. 상기 시린지 필터는 스테인레스 재질일 수 있으며, 충분한 강도를 확보하여 효과적으로 지방조직을 분쇄할 수 있다. 또한, 상기 제1 내지 제3 필터는 필터 백(filter bag)일 수 있으며, 이는 유연한 플라스틱 소재의 밀폐된 주머니 형상의 필터 키트로서, 일측에 주입구가 구비되고 타측에 배출구가 구비되며, 필터로 내부 공간이 분획된 형태일 수 있다. 필터 백을 이용하는 경우, 필터 백에 지방 조직을 주입하고 이를 외부 압력(예를 들어, 실리콘 주걱 등과 같은 도구를 이용한 가압)을 가하여 필터에 통과시켜, 지방조직을 분쇄할 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, a1) 단계는 상기 지방조직을 각각의 필터에서 적어도 2회 왕복시켜 지방조직을 분쇄하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 내지 제3 필터는 시린지 필터로서, 양 단에 주사기를 장착한 후, 주사기의 피스톤 운동을 반복하여, 추출된 지방조직을 분쇄하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, a1) 단계는 추출된 지방조직을 2 ㎜ 내지 5 ㎜, 구체적으로 2 mm 내지 4 mm 또는 2 mm 내지 3 mm의 공경(pore) 직경을 가지는 제1 필터에 적어도 2회 왕복하여 통과시키는 1차 분쇄 단계를 포함할 수 있다. 상기 1차 분쇄 단계는 추출된 지방조직을 2회 내지 7회, 또는 2회 내지 3회 상기 제1 필터를 통과시켜 분쇄하는 것일 수 있다. 또한, 상기 1차 분쇄 단계는 상기 제1 필터를 통과하지 못한 잔여물을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 상기 1차 분쇄 단계에서 제거되는 잔여물은 지방조직 내의 섬유질일 수 있다. 상기 섬유질은 제2 및 제3 필터를 이용한 지방조직의 분쇄에 방해가 될 수 있고, 또한 조직 재생 패치의 활성을 저해할 수 있는 원인이 될 수 있으므로, 제거하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 a1) 단계는 제1 필터를 통하여 분쇄된 지방조직을 400 ㎛ 내지 800 ㎛의 공경(pore) 직경을 가지는 제2 필터에 적어도 2회 왕복하여 통과시키는 2차 분쇄 단계를 포함할 수 있다. 상기 2차 분쇄 단계는 제1 필터를 통하여 분쇄된 지방조직을 2회 내지 7회, 또는 2회 내지 3회 상기 제2 필터를 통과시켜 분쇄하는 것일 수 있다. 또한, 상기 2차 분쇄 단계는 상기 제2 필터를 통과하지 못한 잔여물을 제거하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 a1) 단계는 제2 필터를 통하여 분쇄된 지방조직을 150 ㎛ 내지 250 ㎛의 공경(pore) 직경을 가지는 제3 필터에 적어도 2회 왕복하여 통과시키는 3차 분쇄 단계를 포함할 수 있다. 상기 3차 분쇄 단계는 제2 필터를 통하여 분쇄된 지방조직을 2회 내지 7회, 또는 2회 내지 3회 상기 제3 필터를 통과시켜 분쇄하는 것일 수 있다. 또한, 상기 3차 분쇄 단계는 상기 제3 필터를 통과하지 못한 잔여물을 제거하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, a1) 단계는 전술한 바와 같이 단계적으로 공경 직경이 작은 필터를 이용하여 지방조직을 분쇄하여, 지방조직을 미분쇄하기 위한 시간을 크게 단축할 수 있으며, 지방조직 추출물 내의 세포들이 높은 세포 활성을 유지할 수 있다. 구체적으로, a1) 단계를 이용하는 경우, 물리적인 방법으로 지방조직을 미분쇄함에도 불구하고, 효과적으로 치료에 효과적인 지방조직 및 활성 세포 및 활성 단백질을 다량 확보할 수 있는 장점이 있다. 나아가, a1) 단계를 이용하는 경우, 세포외기질 및 성장인자를 최적의 활성 상태로 수집 가능하며, 또한 (3D) 바이오 프린팅을 수행할 수 있는 물성을 갖도록 할 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, A) 단계는 a2) 상기 제3 필터에 의하여 미분화된 지방조직을 생리 식염수와 혼합하고 이를 방치하여, 수상층(aqueous phase layer) 및 유기상층(organic phase layer)으로 상분리시킨 후, 수상층을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 불순물을 최소화하기 위하여, a2) 단계는 2회 이상 반복하여 수행될 수 있다. 이를 통하여, 본 발명에서 의도하는 최종 조직 재생 패치의 활성을 방해할 수 있는, 지나치게 미분쇄되어 세포 활성이 떨어지는 지방조직, 피, 생리 식염수 및 마취액 등을 제거할 수 있다. 이를 통하여, 세포 분화에 효과적으로 도움을 줄 수 있는 인자를 다량으로 포함하는 지방조직 유래 세포외기질을 수득할 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, A) 단계는, a3) 상기 제3 필터에 의하여 미분화된 지방조직을 25 ㎛ 내지 125 ㎛ 의 공경(pore) 직경을 가지는 제4 필터를 통하여 거른 후, 여과물을 제거하고 상기 제4 필터에 포집되는 잔여물을 수집하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 제3 필터에 의하여 미분화된 지방조직을 상기 제4 필터로 여과한 후, 여과된 물질을 버리고 필터에 포집되는 물질을 수득하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 a3) 단계는 a1) 단계를 통하여 미분화된 지방조직을 생리 식염수와 혼합한 후, 상기 제4 필터를 이용하여 여과하여, 여과되는 물질을 분리하여 제거한 후, 상기 제4 필터에 포집되는 물질을 미분화된 지방 조직 추출물로서 이용하는 것일 수 있다. 상기 여과되어 제거되는 물질은 지나치게 미분쇄되어 세포 활성이 떨어지는 세포, 지방 조직, 피, 생리 식염수 및 마취액 등을 포함할 수 있다. 이를 통하여, 보다 순도 높은 지방조직 유래 세포외기질을 획득할 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, B) 단계는, b1) 소정의 패턴 및 강성을 가지는 세포배양 기재 상에서 세포층을 배양한 후, 상기 세포배양 기재와 상기 세포층을 분리하여 세포배양체를 수득하는 단계; b2) 상기 세포배양체를 탈세포화하여 탈세포화 세포배양체를 수득하는 단계; 및 b3) 상기 탈세포화 세포배양체를 동결건조한 후, 이를 분쇄하여 세포배양체 유래 세포외기질 파우더를 수득하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 세포배양 기재는, 0 ℃ 내지 30 ℃ 중 어느 한 지점의 온도에서 녹는점을 가지는 기재, 0 ℃ 내지 30 ℃ 중 어느 한 지점의 온도에서 소수성에서 친수성으로 변환되는 기재, 또는 효소에 의하여 분해되는 기재일 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 b1) 단계는 35 ℃ 내지 40 ℃의 분위기에서 수행될 수 있다. 이는 상기 세포배양 기재가 0 ℃ 내지 30 ℃ 중 어느 한 지점의 온도에서 녹는점을 가지는 기재, 또는 0 ℃ 내지 30 ℃ 중 어느 한 지점의 온도에서 소수성에서 친수성으로 변환되는 기재인 경우, 상기 온도 범위(즉, 35 ℃ 내지 40 ℃)의 분위기에서 세포배양 기재가 고상의 형태 또는 소수성을 유지하도록 하고, 배양되는 세포가 활발하게 활동하도록 하여 세포층의 형성을 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 세포배양 기재는 하이드로겔을 주성분으로 포함하는 하이드로겔 기재일 수 있다.

상기 "하이드로겔"은 물을 대량으로 포함할 수 있는 물질로서, 산소, 물, 수용성 영양물, 효소 및 사이토카인 등의 폴리펩티드 등의 세포 생존에 필요한 물질, 노폐물 등을 쉽게 전염 이동시킬 수 있는 재료 또는 형태인 것을 의미할 수 있다. 상기 하이드로겔은 콜로이드 입자를 함유하는 수용액을 고상화하여 형성되는 하이드로겔 입자일 수 있다. 상기 하이드로겔은 예를 들어, 폴리아크릴아미드(poly(acrylamide)), 폴리아크릴산(poly(acrylic acid)), 폴리히드록시에틸 메타크릴레이트(poly(hydroxyethyl methacrylate)), 폴리비닐 알코올(poly(vinyl alcohol)), 폴리유산(poly(lactic acid)), 폴리글리콜산(poly(glycolic acid)) 등의 수용성, 친수성, 또는 물 흡수성 합성 고분자; 및 다당류, 단백질, 및 핵산 등을 화학 가교한 하이드로겔로 이루어진 입자일 수 있다. 상기 다당류로는 히알루론산(hyaluronic acid) 및 콘드로이친 황산(chondroitin sulfate) 등의 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan), 전분, 글리코겐, 아가, 펙틴, 섬유소 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한 단백질로 콜라겐 및 그 가수 분해물인 젤라틴, 프로테오글리칸(proteoglycan), 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 라미닌(laminin), 엔탁틴(entactin), 테나신(tenascin), 트롬보스폰딘(thrombospondin), 폰빌레브란트인자(von Willebrand factor), 오스테오폰틴(osteopontin), 피브리노겐(fibrinogen) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 세포배양 기재는 폴리포스파젠계 하이드로겔, 플루로닉계 하이드로겔 및 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 중 적어도 1종을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포배양 기재는 폴리포스파젠계 하이드로겔 기재, 플루로닉계 하이드로겔 기재 또는 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 기재일 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 폴리포스파젠계 하이드로겔은 온도 감응성의 폴리포스파젠계 화합물을 포함하여, 녹는점이 약 4 ℃ 내지 약 10 ℃로 조절될 수 있다. 예를 들어, 대한민국 공개 공보 제10-2017-0061530호에 개시된 온도 감응성 및 가교성 포스파젠계 하이드로젤, 대한민국 공개 공보 제10-2014-0016521호에 개시된 분해 속도 조절이 가능한 이온기를 가지는 포스파젠계 고분자, 대한민국 공개 공보 제10-2007-0076386호에 개시된 생분해성 온도 감응성 폴리포스파젠계 하이드로젤이 본 발명의 폴리포스파젠계 하이드로겔에 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 플루로닉계 하이드로겔은 플루로닉 고분자를 이용하여, 녹는점의 온도를 약 0 ℃ 내지 30 ℃로 조절할 수 있다. 상기 플루로닉 고분자는 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO)의 구조(PEO-PPO-PEO)를 갖는 고분자라면 모두 사용 가능하다. 예를 들어, F로 시작하는 F38, F68, F77, F77, F98, F108, F127 유도체 등과, L로 시작하는 L31, L42, L43, L44, L62, L72, L101 유도체 등과, P로 시작하는 P75, P103, P104 유도체 등(모두 상품명)이 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 플루오닉 고분자 중 미국 식품의약국(FDA)의 허가를 받은 분자량이 약 8,700 달톤인 F68과 분자량이 약 12,600 달톤인 F127을 사용할 수 있다.

다만, 상기 세포배양 기재는 폴리포스파젠계 하이드로겔, 플루로닉계 하이드로겔에 한정되는 것은 아니며, 30 ℃ 이하의 온도에서 녹는점을 가지는 하이드로겔 이라면, 상기 제1 기재 및/또는 추가의 제1 기재로 적용할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 세포배양 기재는 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 기재일 수 있다. 또한, 상기 세포배양 기재는 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)로 표면 처리된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포배양 기재는 표면에 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)가 크리프팅 결합되거나, 표면 코팅된 것일 수 있다. 상기 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)는 30 ℃ 이하의 분위기, 구체적으로 약 20 ℃ 내지 약 30 ℃의 분위기에서 소수성에서 친수성으로 전환되므로, 상기 세포배양 기재가 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 기재 또는 이로 표면 처리된 기재인 경우, 약 20 ℃ 내지 약 30 ℃의 생리 식염수를 이용하여 세포배양 기재를 손쉽게 제거할 수 있다. 또한, 상기 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)를 통하여, 상기 세포배양 기재 상에서 세포층이 보다 잘 형성될 수 있으며, 상기 세포배양 기재의 제거 시 상기 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)도 함께 세포층에서 쉽게 분리될 수 있다. 다만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니며, 30 ℃ 이하의 온도에서 소수성에서 친수성으로 변환하는 특성을 가진 물질이라면 상기 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)과 마찬가지로 적용할 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 세포배양 기재는 효소 감응성 펩타이드(enzyme-susceptible peptide)를 포함하는 하이드로겔 기재일 수 있다. 예를 들면, 상기 세포배양 기재는 효소 감응성 펩타이드와 폴리(에틸렌글리콜)(PEG)겔을 포함하는 하이드로겔 기재일 수 있다. 또한, 상기 세포배양 기재는 MMPs(matrix metallopro teinases), 엘라스타제 및/또는 플라스민에 의하여 분해될 수 있는 아미노산 서열이 부착된 하이드로겔 기재일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포배양 기재는 아미노산 서열이 부착된 PEG-숙신이미딜 프로피오네이트 하이드로겔(PEG-succinimidyl propionate hydrogel) 기재, 예를 들어 합성 테트라펩타이드 Ala-Pro-Gly-Leu(4armPEG10k-LGPA)로 기능화된 PEG-아민이 부착된 PEG-숙신이미딜 프로피오네이트 하이드로겔 기재일 수 있다. 또는, 상기 세포배양 기재는 아민 반응성 PEG-모노아크릴레이트와 콜라게나아제 감응성 펩타이드(collagenase sensitive peptide)(Gly-Gly-Leu'Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Lys), 또는 인테그린 결합 도메인 펩타이드(integrin-binding domain peptide)(Tyr-Ile-Shy-Ser-Arg)가 부착된 PEG-하이드로겔 기재일 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 세포배양 기재는 카르복실메틸 셀룰로오스(CMC) 또는 알지네이트(Al)를 포함하는 하이드로겔 기재일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 카르복실메틸 셀룰로오스 또는 알지네이트는 티라민으로 컨쥬게이션된 것일 수 있다. 즉, 상기 세포배양 기재는 티라민으로 컨쥬게이션된 카르복실메틸 셀룰로오스(CMC-ty)를 포함하는 하이드로겔 기재일 수 있다. 또한, 상기 제세포배양 기재는 티라민으로 컨쥬게이션된 알지네이트(Al-ty)를 포함하는 하이드로겔 기재일 수 있다.

상기 세포배양 기재는 적어도 0.5 %의 CMC-ty 또는 Al-ty를 포함하는 하이드로겔 기재일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포배양 기재는 0.5 % 내지 4 %의 CMC-ty 또는 Al-ty를 포함하는 하이드로겔 기재일 수 있다. 상기 %는 wt% 또는 vol%일 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 효소는 카르복실메틸 셀룰로오스 분해효소 또는 알지네이트 분해효소일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포배양 기재가 카르복실메틸 셀룰로오스 기재인 경우, 상기 효소는 카르복실메틸 셀룰로오스 분해효소일 수 있다. 또한, 상기 세포배양 기재가 알지네이트 기재인 경우, 상기 효소는 알지네이트 분해효소일 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 세포배양 기재는, 0 ℃ 내지 30 ℃ 중 어느 한 지점의 온도에서 녹는점을 가지는 기재 또는 0 ℃ 내지 30 ℃ 중 어느 한 지점의 온도에서 소수성에서 친수성으로 변환되는 기재이고, b1) 단계는 상기 세포배양 기재의 녹는점 이하의 온도 또는 친수성으로 변환되는 온도를 제공하여, 상기 세포층을 분리하는 것일 수 있다. 구체적으로, b1) 단계는 상기 세포배양 기재의 녹는점 이하의 온도 또는 상기 세포배양 기재가 친수성으로 변환되는 온도를 가지는 용액에 상기 세포배양 기재를 접촉시키는 것일 수 있다. 이 때, 상기 세포배양 기재의 녹는점 이하의 온도를 가지는 용액은 약 4 ℃ 내지 약 30 ℃의 온도를 가지는 생리 식염수일 수 있다. 또는, b1) 단계는 주변 온도를 상기 세포배양 기재의 녹는점 이하의 온도 또는 상기 세포배양 기재가 친수성으로 변환되는 온도로 낮추는 것일 수 있다. 이때, 상기 주변 온도(대기 온도)는 약 4 ℃ 내지 약 30 ℃일 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 세포배양 기재는, 상기 세포배양 기재는 효소에 의하여 분해되는 기재이고, b1) 단계는 효소를 포함하는 용액에 상기 세포배양 기재를 접촉시켜, 상기 세포층을 분리하는 것일 수 있다. 구체적으로, b1) 단계는 상기 세포배양 기재를 분해하는 효소를 포함하는 용액에 상기 세포배양 기재를 접촉시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 b2) 단계에서의 탈세포화는 당업계에 공지된 탈세포화 기술을 제한없이 적용할 수 있다. 본 발명과 같이 세포배양체를 탈세포화하는 경우, 추출된 인체 또는 동물 조직을 탈세포화하는 경우에 비하여 탈세포가 수월하므로, 세포층 및/또는 조직의 세포외기질에 포함된 성분을 최대한 보존하며 탈세포를 하여, 유효 성분을 최대한 남길 수 있는 이점이 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, b3) 단계는 상기 탈세포화 세포배양체를 동결건조하여 고형화한 후 이를 분쇄할 수 있다. 상기 동결건조는 당업계에서 일반적으로 알려진 동결건조 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 나아가, b3) 단계는 상기 동결건조된 탈세포화 세포배양체를 액체 질소 분위기에서 볼밀법과 같은 기계적 분쇄를 통하여, 10 ㎛ 내지 30 ㎛, 10 ㎛ 내지 20 ㎛, 또는 10 ㎛ 내지 15 ㎛의 평균 입경을 가지는 세포배양체 유래 세포외기질 파우더를 수득할 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 세포배양 기재는 세포층의 특성을 구현하기 적합한 소정의 패턴 또는 강성을 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 세포배양 기재는 진피조직과 유사한 패턴 및/또는 강성을 가질 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 조직 재생용 조성물은 피부 치료용 조성물일 수 있다. 구체적으로, 상기 조직 재생용 조성물은 진피조직의 치료 용도로 이용될 수 있으며, 특히, 화상 환자의 환부에서 진피 조직을 재생하는데 효과적일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시상태는, 상기 조직 재생용 조성물을 포함하는 화상치료용 스프레이 조성물을 제공한다. 상기 화상치료용 스프레이 조성물은 일반 스프레이 방식 또는 에어로졸 스프레이 방식에 적합하도록 조성이 조절될 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 기술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[실시예]

미분화된 지방 조직 추출물의 수득

지방 흡입술을 이용하여 화상 모델이 적용된 돼지의 복부에서 70 ㎖ 내지 150 ㎖의 흡입물을 추출하고, 약 5분 동안 방치한 후 지방 조직과 함께 섞여 나온 식염수 및 피를 가라앉혀 침전물을 제거하여 지방 조직을 수득하였다.

그리고 나서, 지방이 담긴 주사기와 새 주사기를 공경이 2.4 ㎜인 스테인레스 시린지 필터(Adnizer, SKT-AN-2400, BSL)가 포함된 커넥터의 양방향 주입구에 장착하고, 피스톤 운동으로 지방조직이 필터를 2 내지 3회 통과하며 분쇄되도록 한 후, 필터를 통과하지 못한 섬유질 등을 제거하였다. 그리고 나서, 섬유질이 제거된 지방조직을 공경 직경이 약 500 ㎛인 시린지 필터 및 공경 직경이 약 200 ㎛인 시린지 필터를 이용하여 순차적으로 지방조직을 분쇄하며, 필터를 통과하지 못한 잔여물을 제거하였다. 이와 같이 분쇄된 지방조직을 생리식염수와 혼합한 후 방치하여 세포, 피 등을 포함하는 수상층을 제거하는 과정을 2회 수행하여, 미분화된 지방조직 추출물을 수득하였다.

진피 세포 유래 세포외기질의 수득

하이드로겔 시트를 제조하기 위하여, 젤라틴 몰드를 준비하고 몰드의 바닥은 마이크로 패턴을 형성하였다. 약 25 ℃의 분위기에서, pH 6-7의 MES 버퍼에 약 2 wt%의 함량으로 알지네이트가 포함된 알지네이트 용액을 상기 젤라틴 몰드 내에 넣었다. 그리고, 제조되는 하이드로겔 시트의 상면을 평평하게 하기 위하여 니트로셀룰로오스막을 덮고, 이를 고정하기 위한 플라스틱 메쉬 및 유리판을 적층하였다. 그리고 나서, 알지네이트 가교 수용액을 적가하여 몰드 내의 알지네이트 용액을 하이드로겔화 하였다. 이후, 약 37 ℃의 washing buffer (Saline, PBS, ddH₂O)를 이용하여 젤라틴 몰드를 녹이는 방법으로 제거하여 알지네이트 하이드로겔 시트를 제조하였다.

그리고 나서, 약 37 ℃의 분위기에서, 상기 제조된 플루로닉 하이드로겔 시트의 패턴이 형성된 면 상에 화상 모델이 적용된 돼지의 진피 세포를 배양하여 세포층을 형성하였다. 그리고, 하이드로겔 시트를 제거하여 진피세포로부터 유래된 세포배양체를 수득하였다.

수득된 세포배양체를 탈세포화 용액을 이용하여 탈세포화 처리를 한 후, 이를 동결건조 보존액을 이용하여 동결건조하였다. 그리고 나서, 동결건조된 탈세포화 세포배양체를 액체질소로 냉각된 볼밀에서 분쇄하여, 약 15 ㎛의 평균 입경을 가지는 진피 세포배양체 유래 세포외기질을 수득하였다.

조직 재생용 조성물의 제조

상기와 같이 수득된 지방조직 추출물 10 ml과 25mg/ml 농도의 진피 세포배양체 유래 세포외기질 10 ml를 시린지 주사기를 이용하여 균질화되도록 혼합하여, 조직 재생용 조성물을 제조하였다.

[실험예]

실시예에 따라 수득된 조직 재생용 조성물을 아르곤과 함께 스프레이 장비에 주입한 후, 2도 내지 3도의 화상 모델이 적용된 돼지의 환부에 스프레이한 후, 환부의 재생 효과를 관찰하였다.

비교예로서, 2도 내지 3도의 화상 모델이 적용된 돼지의 환부를 별도의 처리 없이 드레싱만 하여 환부의 재생 효과를 관찰하였다.

도 1은 실험예에 따른 화상 모델이 적용된 돼지의 환부 치료 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, Day 28의 사진에서 하얗게 보이는 주름들은 이미 외피세포가 증식 이동하여 상처가 외피로 덮힌 상피화가 완료된 것을 보여준다. 더욱이 비교예와 같이 일반적인 창상 치유의 수축이 일어나며 사각형에서 다이아몬드 모양으로 닫혀서 흉터를 남기는 치유과정과는 달리, 실시예의 경우에는 수축 없이 재생이 되어(사각형 모양을 유지하면 닫히고 있음) 흉터가 최소화된 상태로 재생되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 환부 치료 후 35일이 지난 결과를 비교하면, 별도의 처리 없이 드레싱만을 실시한 비교예의 경우 흉터가 선명하게 보이는 반면, 실시예에 따른 조직 재생용 조성물 로 처리한 환부는 흉터를 최소화하며 회복된 것을 확인할 수 있었다.

Claims

미분화된(micronized) 지방 조직 추출물; 및 세포배양체 유래 세포외기질 파우더를 포함하는, 조직 재생용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 미분화된 지방 조직 추출물과 상기 세포배양체 유래 세포외기질 파우더의 중량비는 1:10 내지 10:1인 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 미분화된 지방 조직 추출물은 100 ㎛ 내지 300 ㎛의 필터 공경을 통과하는 지방조직 유래 세포외기질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 미분화된 지방 조직 추출물은 자가 지방 조직으로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 세포배양체 유래 세포외기질 파우더의 평균 입경은 10 ㎛ 내지 30 ㎛인 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 세포배양체 유래 세포외기질 파우더는 동종의 조직 또는 세포로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 조성물.
A) 미분화된 지방 조직 추출물을 준비하는 단계;
B) 세포배양체 유래 세포외기질 파우더를 준비하는 단계; 및
C) 상기 미분화된 지방 조직 추출물과 상기 세포배양체 유래 세포외기질 파우더를 혼합하는 단계;를 포함하는, 조직 재생용 조성물의 제조방법.
청구항 7에 있어서,
A) 단계는, a1) 2 ㎜ 내지 5 ㎜의 공경(pore) 직경을 가지는 제1 필터, 400 ㎛ 내지 800 ㎛의 공경(pore) 직경을 가지는 제2 필터, 및 150 ㎛ 내지 250 ㎛의 공경(pore) 직경을 가지는 제3 필터를 순차적으로 이용하여, 지방조직을 단계적으로 분쇄하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 조성물의 제조방법.
청구항 8에 있어서,
A) 단계는, a2) 상기 제3 필터에 의하여 미분화된 지방조직을 생리 식염수와 혼합하고 이를 방치하여, 수상층(aqueous phase layer) 및 유기상층(organic phase layer)으로 상분리시킨 후, 수상층을 제거하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 조성물의 제조방법.
청구항 8에 있어서,
A) 단계는, a3) 상기 제3 필터에 의하여 미분화된 지방조직을 25 ㎛ 내지 125 ㎛의 공경(pore) 직경을 가지는 제4 필터를 통하여 거른 후, 여과물을 제거하고 상기 제4 필터에 포집되는 잔여물을 수집하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 조성물의 제조방법.
청구항 7에 있어서,
B) 단계는,
b1) 소정의 패턴 및 강성을 가지는 세포배양 기재 상에서 세포층을 배양한 후, 상기 세포배양 기재와 상기 세포층을 분리하여 세포배양체를 수득하는 단계;
b2) 상기 세포배양체를 탈세포화하여 탈세포화 세포배양체를 수득하는 단계; 및
b3) 상기 탈세포화 세포배양체를 동결건조한 후, 이를 분쇄하여 세포배양체 유래 세포외기질 파우더를 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 조성물의 제조방법.
청구항 11에 있어서,
상기 세포배양 기재는, 0 ℃ 내지 30 ℃ 중 어느 한 지점의 온도에서 녹는점을 가지는 기재, 0 ℃ 내지 30 ℃ 중 어느 한 지점의 온도에서 소수성에서 친수성으로 변환되는 기재, 또는 효소에 의하여 분해되는 기재인 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 조성물의 제조방법.
청구항 11에 있어서,
상기 세포배양 기재는, 0 ℃ 내지 30 ℃ 중 어느 한 지점의 온도에서 녹는점을 가지는 기재 또는 0 ℃ 내지 30 ℃ 중 어느 한 지점의 온도에서 소수성에서 친수성으로 변환되는 기재이고,
b1) 단계는 상기 세포배양 기재의 녹는점 이하의 온도 또는 친수성으로 변환되는 온도를 제공하여, 상기 세포층을 분리하는 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 조성물의 제조방법.
청구항 11에 있어서,
상기 세포배양 기재는 효소에 의하여 분해되는 기재이고,
b1) 단계는 효소를 포함하는 용액에 상기 세포배양 기재를 접촉시켜, 상기 세포층을 분리하는 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 조성물의 제조방법.
청구항 11에 있어서,
b3) 단계는 동결건조된 탈세포화 세포배양체를 액체 질소 분위기에서 기계적 분쇄를 하는 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 조성물의 제조방법.