CN103520772A - 一种制备皮肤移植用脱细胞真皮材料的改进工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备皮肤移植用脱细胞真皮材料的改进工艺：是在反复超低温冻融结合超声振荡工艺的基础上，以1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺为交联剂，通过向脱细胞真皮中导入透明质酸后修饰其胶原纤维，降低其降解率，起到保护胶原纤维，改善脱细胞真皮对创面降解因子的耐受性，经过本发明改进工艺后制备的皮肤移植用脱细胞真皮材料，更适宜医学烧伤及整形专科应临床使用。
Description
所属技术领域
本发明涉及医学烧伤及整形专科临床应用医用材料领域，尤其是涉及一种制备皮肤移植用脱细胞真皮材料的改进工艺。
背景技术
众所周知，在医学烧伤及整形专科临床中，严重创伤和大面积烧伤患者存在皮肤缺失的巨大创面，而治疗中消灭创面需要进行皮肤移植，使用的皮源来自自体皮或异体皮，但自体皮源紧张，尤其是大面积的皮肤缺损，取得自体皮就更为困难，所以在治疗过程中，就需要使用异体皮替代自体皮，异体皮为天然真皮，与人类皮肤相似，价格低廉，来源广泛，其真皮胶原纤维框架与人类真皮近似，可诱导成纤维细胞、血管内皮细胞长入，指导新生组织合成，只是存在着对人体的抗原性，如果能消除其抗原性则可成为理想的自体皮替代物，解决目前临床上异体皮来源不足的问题。因此研制如何对异种皮除细胞、进而去除异种皮肤抗原性，保留其完整的真皮胶原纤维的三维结构的异种真皮材料就成为目前组织工程真皮研制的热点。现有脱细胞真皮制造技术分为化学脱细胞处理法和物理脱细胞处理法，化学脱细胞法采用化学试剂破坏并去除其细胞，并结合戊二醛等交联剂交联降低其免疫原性，存在着破坏胶原结构、遗留生物毒性等缺点。近年来，也出现了采用物理手段脱除异种皮细胞的方法，如利用反复超低温冻融结合超声振荡法制备的脱细胞真皮材料，临床试验证明，其相容性好，能保存完整的胶原纤维支架三维结构，但在临床实验中发现脱细胞真皮基质移植于创面后，降解速度较快，创面或多或少存在局部溶解倾向的问题，认为是与胶原纤维支架失去了原有无定形基质的主要成分透明质酸的保护有关，从而降低了脱细胞真皮对创面降解因子的耐受性，如何解决这一问题，改进反复超低温冻融结合超声振荡法制备的工艺，提高脱细胞真皮对创面降解因子的耐受性，成为研究及临床应用的热点课题，也是本领域面临的重要任务。
发明内容
本发明的目的在于提出一种使脱细胞真皮基质移植于创面后，能降低降解速度、提高脱细胞真皮对创面降解因子的耐受性的制备皮肤移植用脱细胞真皮材料的改进工艺。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案，一种制备皮肤移植用脱细胞真皮材料的改进工艺：是在反复超低温冻融结合超声振荡工艺的基础上，以1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺为交联剂，简称EDC交联剂(I-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride,EDC)，通过向脱细胞真皮中导入透明质酸后修饰其胶原纤维，降低其降解率，具体工艺步骤如下：
a.取3月龄中华香猪猪背部皮，经清洗、去毛刀去毛后，以取皮鼓切取厚度为0.25-0.35毫米中厚皮片备用；
b.将皮片无菌塑封袋密封标记后置入-80℃--90℃超低温冰箱，冷冻6-8小时后取出，40℃--50℃温水复温，至皮片完全融化，低温冷冻及复温过程重复3次；
c.将反复冻融处理过的皮片浸入3％-5％-的高渗氯化钠溶液中浸泡30-40分钟后取出，用蒸馏水反复洗涤后备用；
d.将蒸馏水反复洗涤后的皮片平铺放在网格状金属筐内架空的平面网格托层上，将网格状金属筐整体置入充满庆大霉素阴阳离子洗脱液的KQ-250DB数控超声清洗器内，使皮片完全浸入庆大霉素阴阳离子洗脱液中，进行超声振荡洗涤72小时，超声振荡洗涤过程中每两小时上下颠倒更换金属筐朝向一次，每6小时更换一次洗脱液，当猪皮表皮层已与真皮层松脱后，用镊子将表皮剥除，经反复震荡洗涤72小时后充分脱除细胞；
e.将KQ-250DB数控超声清洗器内的庆大霉素阴阳离子洗脱液置换成庆大霉素蒸馏水进行超声振荡清洗脱除细胞后的皮片，振荡清洗过程中每4小时更换一次蒸馏水，振荡清洗72-84小时后，使皮片内的洗脱液含量低于万分之一，超声振荡期间洗脱液及蒸馏水的温度控制在25～35℃；
f.将步骤e.制备的皮片正反面分别以紫外线照射消毒，并使用碘伏及4000U／L庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时后，制备成用于皮肤移植脱细胞真皮材料，经装袋密封并标记后，以-80℃--90℃低温冷冻保存备用；
g.将低温冷冻保存的脱细胞真皮材料取出后自然解冻复温后，去除包装，以稀碘伏及庆大霉素生理盐水浸泡2小时，取出以滤纸吸干水分后称重；
H.用称重所得脱细胞真皮材料重量以公式：
W透明质酸=W脱细胞真皮÷1000计算得到交联脱细胞真皮所需透明质透明质酸重量；
I.在室温下，配置0.05mol／l的MES缓冲液，用HCL溶液及NAOH溶液调PH到5.6备用，然后将步骤H计算所得配置所需的透明质酸钠晶体溶于配置好的MES缓冲液中，充分搅拌，需随配随用，使透明质酸钠浓度为2毫克／毫升；
J.将交联剂EDC及N-羟基琥珀酰亚氨晶体(N-hydroxysuccinimide，NHS)，简称NHS，同溶于配置好的MES缓冲液中，使EDC浓度为0.8毫克／毫升，NHS浓度为0.48毫克／毫升，1：1混合透明质酸钠溶液及EDC／NHS缓冲液，室温下反应10分钟；终止反应后弃去容器中PBS缓冲液，加入含有4000U／L庆大霉素的浓度为4mol／l的NaCl溶液，置于恒温振荡器中在25℃恒温下轻微晃动24小时，频率为60次／分，每6小时换液1次，弃去洗涤液后以含有4000U／L庆大霉素的蒸馏水依上述条件洗涤24小时，每4小时换液1次，将水溶性的交联剂EDC充分洗脱，确保无EDC残留。将处理后真皮以紫外线照射消毒，真皮正反面各照射1小时，以稀碘伏及4000U／L庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时，封口包装，标记日期、规格，放入低温冰箱备用。
k.将脱细胞猪真皮基质浸入反应液中，加盖固定、密封后，置于DSHZ-300多用途水浴恒温振荡器中在25℃恒温下轻微晃动2小时，频率为60次／分，反应完成后弃去反应液，加入PBS缓冲液2毫升，置于恒温振荡器中在25℃恒温下轻微晃动30分钟，频率为60次／分，后弃去洗涤液，重复洗涤过程4次共计2小时，以终止透明质酸与胶原纤维蛋白的交联反应；
m.终止反应后弃去容器中PBS缓冲液，加入含有4000U／L庆大霉素的浓度为4mol／l的NaCl溶液，置于恒温振荡器中在25℃恒温下轻微晃动24小时，频率为60次／分，每6小时换液1次，弃去洗涤液后以含有4000U／L庆大霉素的蒸馏水依上述条件洗涤24小时，每4小时换液1次，将水溶性的交联剂EDC充分洗脱，无EDC残留；
n.将步骤m.处理后真皮以紫外线照射消毒，真皮正反面各照射1小时，以稀碘伏及4000U／L庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时后，得到脱细胞真皮材料，封口包装并标记日期及规格后，放入低温冰箱备用。
本发明的工作原理是：因反复冻融结合超声振荡制备法制备的脱细胞真皮在反复冻融及超声振荡洗脱的制备过程中，透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸肝素等细胞外无定形基质成分也随细胞成分同时被洗出，脱离胶原支架，使胶原支架失去原有的外环境及保护。脱细胞真皮在作为胶原支架模板覆盖创面后，胶原纤维支架与创面基底直接接触，创面大量存在的炎症细胞可产生丰富的胶原酶及炎性因子，大量胶原酶可直接作用于胶原纤维，使胶原支架快速降解，降解快于新的胶原的合成，从而导致创面二次裸露。通过向脱细胞真皮中导入透明质酸等无定形细胞外基质，可进一步改造脱细胞真皮，使其接近真皮自然的生理、物理状态，使脱细胞真皮对创面的炎症因子有适当的耐受性，在促进创面新生胶原合成的同时，稳定的降解，实现胶原纤维的履带式代谢。
1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺(EDC)可作用于有机物的羧基及氨基，广泛应用于蛋白结合、复合物形成、细胞修饰等成肽过程。EDC可活化羧基基团，活化的羧基团可与相邻近的氨基反应形成共价键，交联过程中交联剂EDC并不结合入合成物中，并因其具良好的水溶性可经充分的洗脱不残留于新的化合物中，因此被称为零长度交联剂。
透明质酸的每个双糖单位可提供1个羧基团，经EDC活化，反应生成含脲基的中间化合物：N-乙酸脲加合物，并释放水溶性含脲副产物。此中间产物性质活泼，易于造成透明质酸链间的反应及自身的水解。通过同时添加NHS，使NHS与中间产物结合，使中间化合物保持活性的同时，使化合物的稳定性相对提高，避免中间产物过快降解，使下一步与胶原蛋白分子的交联反应充分进行。产生的相对稳定的中间产物可与邻近的胶原纤维的游离氨基反应，产生多个酰胺键将透明质酸链锚定到胶原纤维上。
EDC只作为催化剂促进透明质酸羧基与胶原蛋白氨基的结合，而并不结合至脱细胞基质内，反应完成后因其溶于水的性质可经蒸馏水反复洗涤洗脱出胶原外，不影响真皮的生物特性，无生物毒性残留。从而将透明质酸导入胶原纤维三维支架，而不导入其他有毒物质，起到保护胶原纤维，改善脱细胞真皮对创面降解因子的耐受性，达到了本发明的目的。
具体实施方式
实施例：
下面结合实施例详述本发明：一种制备皮肤移植用脱细胞真皮材料的改进工艺：是在反复超低温冻融结合超声振荡工艺的基础上，以1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺(I-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride，EDC)为交联剂，通过向脱细胞真皮中导入透明质酸后修饰其胶原纤维，降低其降解率，具体工艺步骤如下：
g.取3月龄中华香猪猪背部皮，经清洗、去毛刀去毛后，以取皮鼓切取厚度为0.3毫米中厚皮片备用；
h.将皮片无菌塑封袋密封标记后置入-85℃超低温冰箱，冷冻6小时后取出，45℃温水复温，至皮片完全融化，低温冷冻及复温过程重复3次；
i.将反复冻融处理过的皮片浸入3％的高渗氯化钠溶液中浸泡40分钟后取出，用蒸馏水反复洗涤后备用；
j.将蒸馏水反复洗涤后的皮片平铺放在网格状金属筐内架空的平面网格托层上，将网格状金属筐整体置入充满庆大霉素阴阳离子洗脱液的KQ-250DB数控超声清洗器内，使皮片完全浸入庆大霉素阴阳离子洗脱液中，进行超声振荡洗涤72小时，超声振荡洗涤过程中每两小时上下颠倒更换金属筐朝向一次，每6小时更换一次洗脱液，当猪皮表皮层已与真皮层松脱后，用镊子将表皮剥除，经反复震荡洗涤72小时后充分脱除细胞；
k.将KQ-250DB数控超声清洗器内的庆大霉素阴阳离子洗脱液置换成庆大霉素蒸馏水进行超声振荡清洗脱除细胞后的皮片，振荡清洗过程中每4小时更换一次蒸馏水，振荡清洗72-84小时后，使皮片内的洗脱液含量低于万分之一，超声振荡期间洗脱液及蒸馏水的温度控制在25-35℃；
l.将步骤e.制备的皮片正反面分别以紫外线照射消毒，并使用碘伏及4000U／L庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时后，制备成用于皮肤移植脱细胞真皮材料，经装袋密封并标记后，以-85℃低温冷冻保存备用；
g.将低温冷冻保存的脱细胞真皮材料取出后自然解冻复温后，去除包装，以稀碘伏及庆大霉素生理盐水浸泡2小时，取出以滤纸吸干水分后称重；
H.用称重所得脱细胞真皮材料重量以公式：
W透明质酸=W脱细胞真皮÷1000计算得到交联脱细胞真皮所需透明质透明质酸重量；
I.在室温下，配置0.05mol／l的MES缓冲液，用HCL溶液及NAOH溶液调PH到5.6备用，然后将步骤H计算所得配置所需的透明质酸钠晶体溶于配置好的MES缓冲液中，充分搅拌，需随配随用，使透明质酸钠浓度为2毫克／毫升；
J.将交联剂EDC及N-羟基琥珀酰亚氨(N-hydroxysuccinimide，NHS)晶体同溶于配置好的MES缓冲液中，使EDC浓度为0.8毫克／毫升，NHS浓度为0.48毫克／毫升，1：1混合透明质酸钠溶液及EDC／NHS缓冲液，室温下反应10分钟；终止反应后弃去容器中PBS缓冲液，加入含有4000U／L庆大霉素的浓度为4mol／l的NaCl溶液，置于恒温振荡器中在25℃恒温下轻微晃动24小时，频率为60次／分，每6小时换液1次，弃去洗涤液后以含有4000U／L庆大霉素的蒸馏水依上述条件洗涤24小时，每4小时换液1次，将水溶性的交联剂EDC充分洗脱，确保无EDC残留。将处理后真皮以紫外线照射消毒，真皮正反面各照射1小时，以稀碘伏及4000U／L庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时，封口包装，标记日期、规格，放入低温冰箱备用。
k.将脱细胞猪真皮基质浸入反应液中，加盖固定、密封后，置于DSHZ-300多用途水浴恒温振荡器中在25℃恒温下轻微晃动2小时，频率为60次／分，反应完成后弃去反应液，加入PBS缓冲液2毫升，置于恒温振荡器中在25℃恒温下轻微晃动30分钟，频率为60次／分，后弃去洗涤液，重复洗涤过程4次共计2小时，以终止透明质酸与胶原纤维蛋白的交联反应；
m.终止反应后弃去容器中PBS缓冲液，加入含有4000U／L庆大霉素的浓度为4mol／l的NaCl溶液，置于恒温振荡器中在25℃恒温下轻微晃动24小时，频率为60次／分，每6小时换液1次，弃去洗涤液后以含有4000U／L庆大霉素的蒸馏水依上述条件洗涤24小时，每4小时换液1次，将水溶性的交联剂EDC充分洗脱，无EDC残留；
n.将步骤m.处理后真皮以紫外线照射消毒，真皮正反面各照射1小时，以稀碘伏及4000U／L庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时后，得到脱细胞真皮材料，封口包装并标记日期及规格后，放入低温冰箱备用。
Claims (1)
1.一种制备皮肤移植用脱细胞真皮材料的改进工艺：是在反复超低温冻融结合超声振荡工艺的基础上，以1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺为交联剂，通过向脱细胞真皮中导入透明质酸后修饰其胶原纤维，降低其降解率，具体工艺步骤如下：
a.取3月龄中华香猪猪背部皮，经清洗、去毛刀去毛后，以取皮鼓切取厚度为0.25-0.35毫米中厚皮片备用；
b.将皮片无菌塑封袋密封标记后置入-80℃--90℃超低温冰箱，冷冻6-8小时后取出，40℃--50℃温水复温，至皮片完全融化，低温冷冻及复温过程重复3次；
c.将反复冻融处理过的皮片浸入3％-5％-的高渗氯化钠溶液中浸泡30-40分钟后取出，用蒸馏水反复洗涤后备用；
d.将蒸馏水反复洗涤后的皮片平铺放在网格状金属筐内架空的平面网格托层上，将网格状金属筐整体置入充满庆大霉素阴阳离子洗脱液的KQ-250DB数控超声清洗器内，使皮片完全浸入庆大霉素阴阳离子洗脱液中，进行超声振荡洗涤72小时，超声振荡洗涤过程中每两小时上下颠倒更换金属筐朝向一次，每6小时更换一次洗脱液，当猪皮表皮层已与真皮层松脱后，用镊子将表皮剥除，经反复震荡洗涤72小时后充分脱除细胞；
e.将KQ-250DB数控超声清洗器内的庆大霉素阴阳离子洗脱液置换成庆大霉素蒸馏水进行超声振荡清洗脱除细胞后的皮片，振荡清洗过程中每4小时更换一次蒸馏水，振荡清洗72-84小时后，使皮片内的洗脱液含量低于万分之一，超声振荡期间洗脱液及蒸馏水的温度控制在25～35℃；
f.将步骤e.制备的皮片正反面分别以紫外线照射消毒，并使用碘伏及4000U／L庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时后，制备成用于皮肤移植脱细胞真皮材料，经装袋密封并标记后，以-80℃--90℃低温冷冻保存备用；
g.将低温冷冻保存的脱细胞真皮材料取出后自然解冻复温后，去除包装，以稀碘伏及庆大霉素生理盐水浸泡2小时，取出以滤纸吸干水分后称重；
h.用称重所得脱细胞真皮材料重量以公式：
W透明质酸=W脱细胞真皮÷1000计算得到交联脱细胞真皮所需透明质透明质酸重量；
i.在室温下，配置0.05mol／l的MES缓冲液，用HCL溶液及NAOH溶液调PH到5.6备用，然后将步骤H计算所得配置所需的透明质酸钠晶体溶于配置好的MES缓冲液中，充分搅拌，需随配随用，使透明质酸钠浓度为2毫克／毫升；
j.将交联剂EDC及N-羟基琥珀酰亚氨晶体同溶于配置好的MES缓冲液中，使EDC浓度为0.8毫克／毫升，NHS浓度为0.48毫克／毫升，1：1混合透明质酸钠溶液及EDC／NHS缓冲液，室温下反应10分钟；终止反应后弃去容器中PBS缓冲液，加入含有4000U／L庆大霉素的浓度为4mol／l的NaCl溶液，置于恒温振荡器中在25℃恒温下轻微晃动24小时，频率为60次／分，每6小时换液1次，弃去洗涤液后以含有4000U／L庆大霉素的蒸馏水依上述条件洗涤24小时，每4小时换液1次，将水溶性的交联剂EDC充分洗脱，确保无EDC残留。将处理后真皮以紫外线照射消毒，真皮正反面各照射1小时，以稀碘伏及4000U／L庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时，封口包装，标记日期、规格，放入低温冰箱备用。
k.将脱细胞猪真皮基质浸入反应液中，加盖固定、密封后，置于DSHZ-300多用途水浴恒温振荡器中在25℃恒温下轻微晃动2小时，频率为60次／分，反应完成后弃去反应液，加入PBS缓冲液2毫升，置于恒温振荡器中在25℃恒温下轻微晃动30分钟，频率为60次／分，后弃去洗涤液，重复洗涤过程4次共计2小时，以终止透明质酸与胶原纤维蛋白的交联反应；
l.终止反应后弃去容器中PBS缓冲液，加入含有4000U／L庆大霉素的浓度为4mol／l的NaCl溶液，置于恒温振荡器中在25℃恒温下轻微晃动24小时，频率为60次／分，每6小时换液1次，弃去洗涤液后以含有4000U／L庆大霉素的蒸馏水依上述条件洗涤24小时，每4小时换液1次，将水溶性的交联剂EDC充分洗脱，无EDC残留；
m.将步骤m.处理后真皮以紫外线照射消毒，真皮正反面各照射1小时，以稀碘伏及4000U／L庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时后，得到脱细胞真皮材料，封口包装并标记日期及规格后，放入低温冰箱备用。
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