CN103520773A - 一种用于皮肤移植脱细胞真皮材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于皮肤移植脱细胞真皮材料的制备方法，经过对猪皮采用反复冻融结合超声振荡的工艺步骤制备而成的脱细胞真皮材料，是完全通过物理方法充分去除真皮中的细胞成分，降低真皮的免疫原性，而不影响胶原纤维的三维结构及排列极性，并保留完整的基底膜，可作为完整的组织支架，成为真皮再生的模板，脱细胞真皮天然的三维空隙利于成纤维细胞及血管内皮细胞的长入、基质的重建，可作为良好的组织工程真皮应用于临床使用。

Description

一种用于皮肤移植脱细胞真皮材料的制备方法

所属技术领域

本发明涉及医学烧伤及整形专科临床应用医用材料领域，尤其是涉及一种用于皮肤移植脱细胞真皮材料的制备方法。

背景技术

当前，在医学烧伤及整形专科临床中，严重创伤和大面积烧伤患者存在皮肤缺失的巨大创面，而治疗中消灭创面基本上是以自体皮移植为主，但自体皮源紧张，尤其是大面积的皮肤缺损，取得自体皮就更为困难或不现实，所以在治疗过程中，就需要皮肤替代物暂时或长期覆盖创面，而寻找皮肤替代物覆盖创面，就成为严重创伤及大面积烧伤治疗的需要。目前的皮肤真皮替代物，其来源包括合成材料及天然真皮材料，均存在一定限制性。由于合成材料存在着诸多的缺点，在当前的临床治疗中已经基本不用。而天然真皮材料由于与人类皮肤相似，而成为皮肤移植的首选。其中异种皮价格低廉，来源广泛，其真皮胶原纤维框架与人类真皮近似，可诱导成纤维细胞、血管内皮细胞长入，指导新生组织合成，只是存在着对人体的抗原性，如果能消除其抗原性则可成为理想的皮肤替代物，解决目前临床上异体皮来源不足的问题。因此研制如何对异种皮除细胞、进而去除异种皮肤抗原性，保留其完整的真皮胶原纤维的三维结构的异种真皮材料就成为目前组织工程真皮研制的热点。现有脱细胞真皮制造技术均为化学试剂处理的方法破坏其细胞，并结合戊二醛等交联剂交联降低免疫原性，存在着破坏胶原结构、遗留生物毒性等缺点。近年来也提出了采用物理手段脱除异种皮细胞的方法，在降低其抗原性的前提下，保留完整的胶原纤维三维结构，期望解决化学试剂处理方法制备真皮材料存在的缺点，临床试验证明物理方法制备真皮的优点是不言而喻的。将物理方法制备真皮的工艺进行完善，尽快使之应用于临床治疗是本领域当前亟待解决的重要任务。

发明内容

本发明的目的是提供一种以物理方法脱除异种皮细胞、降低其抗原性及消除免疫原性、进而保留其完整的胶原纤维三维结构的用于皮肤移植脱细胞真皮材料的制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种用于皮肤移植脱细胞真皮材料的制备方法，采用反复冻融结合超声振荡法的技术方案，具体工艺步骤如下：

a.取3月龄中华香猪猪背部皮，经清洗、去毛刀去毛后，以取皮鼓切取厚度为0.25-0.35毫米中厚皮片备用；

b.将皮片无菌塑封袋密封标记后置入-80℃--90℃超低温冰箱，冷冻6-8小时后取出，40℃--50℃温水复温，至皮片完全融化，低温冷冻及复温过程重复3次；

c.将反复冻融处理过的皮片浸入3％-5％-的高渗氯化钠溶液中浸泡30-40分钟后取出，用蒸馏水反复洗涤后备用；

d.将蒸馏水反复洗涤后的皮片平铺放在网格状金属筐内架空的平面网格托层上，将网格状金属筐整体置入充满庆大霉素阴阳离子洗脱液的KQ-250DB数控超声清洗器内，使皮片完全浸入庆大霉素阴阳离子洗脱液中，进行超声振荡洗涤72小时，超声振荡洗涤过程中每两小时上下颠倒更换金属筐朝向一次，每6小时更换一次洗脱液，当猪皮表皮层已与真皮层松脱后，用镊子将表皮剥除，经反复震荡洗涤72小时后充分脱除细胞；

e.将KQ-250DB数控超声清洗器内的庆大霉素阴阳离子洗脱液置换成庆大霉素蒸馏水进行超声振荡清洗脱除细胞后的皮片，振荡清洗过程中每4小时更换一次蒸馏水，振荡清洗72-84小时后，使皮片内的洗脱液含量低于万分之一，超声振荡期间洗脱液及蒸馏水的温度控制在25～35℃；

f.将步骤e.制备的皮片正反面分别以紫外线照射消毒，并使用碘伏及4000U／L庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时后，制备成用于皮肤移植脱细胞真皮材料，经装袋密封并标记后，以-80℃一90℃低温冷冻保存备用；

g.在临床使用前将低温冷冻保存的真皮材料再次以稀碘伏及庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时。

本发明的原理是：利用液氮的超低温作用真皮组织时细胞内液固化，产生冰晶对细胞质膜、细胞器的切割力及反复冻融细胞间的机械力，这些机械力反复作用于组织细胞使细胞成分充分破碎，再利用超声震荡的方法充分去除细胞碎片。细胞内外存在大量的水分，其中细胞内液在温度下降通过冰点时凝固，形成大量尖锐冰晶，破坏微丝、微管、细胞器质膜及细胞膜。而胶原纤维成分相对坚韧，且受到无定形细胞外基质的缓冲保护，不会受到冰晶的影响。低温凝固后细胞体积膨胀，造成细胞自身的机械挤压，促进细胞破裂。另一方面细胞外液也凝固膨胀，细胞间机械分离使桥粒、半桥粒等细胞间连接被充分打断。反复的冻融使上述切割、分离过程重复进行，冻融的机械力使细胞充分的破裂死亡，并完全打断细胞间连接，破碎细胞的碎片可以通过超声振荡下随着阴阳离子洗脱液反复洗脱而充分清除，而不影响胶原纤维的三维结构及排列极性，获得完整的真皮胶原纤维三维支架。

本发明反复冻融结合超声振荡法制备的脱细胞真皮材料，是完全通过物理方法充分去除真皮中的细胞成分，降低真皮的免疫原性，而不影响胶原纤维的三维结构及排列极性，并保留完整的基底膜，可作为完整的组织支架，成为真皮再生的模板，脱细胞真皮天然的三维空隙利于成纤维细胞及血管内皮细胞的长入、基质的重建，达到了此发明的目的。

具体实施方式

实施例：

下面结合实施例详述本发明：一种用于皮肤移植脱细胞真皮材料的制备方法，采用反复冻融结合超声振荡法的技术方案，具体工艺步骤如下：

1.取3月龄中华香猪猪背部皮，经清洗、去毛刀去毛后，以取皮鼓切取厚度为0.25-0.35毫米中厚皮片备用；

2.将皮片无菌塑封袋密封标记后置入-85℃超低温冰箱，冷冻7小时后取出，45℃温水复温，至皮片完全融化，低温冷冻及复温过程重复3次；

3.将反复冻融处理过的皮片浸入4％的高渗氯化钠溶液中浸泡35分钟后取出，用蒸馏水反复洗涤后备用；

4.将蒸馏水反复洗涤后的皮片平铺放在网格状金属筐内架空的平面网格托层上，将网格状金属筐整体置入充满庆大霉素阴阳离子洗脱液的KQ-250DB数控超声清洗器内，使皮片完全浸入庆大霉素阴阳离子洗脱液中，进行超声振荡洗涤72小时，超声振荡洗涤过程中每两小时上下颠倒更换金属筐朝向一次，每6小时更换一次洗脱液，当猪皮表皮层已与真皮层松脱后，用镊子将表皮剥除，经反复震荡洗涤72小时后充分脱除细胞；

5.将KQ-250DB数控超声清洗器内的庆大霉素阴阳离子洗脱液置换成庆大霉素蒸馏水进行超声振荡清洗脱除细胞后的皮片，振荡清洗过程中每4小时更换一次蒸馏水，振荡清洗72小时后，使皮片内的洗脱液含量低于万分之一，超声振荡期间洗脱液及蒸馏水的温度控制在30℃；

6.将步骤e..制备的皮片正反面分别以紫外线照射消毒，并使用碘伏及4000U／L庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时后，制备成用于皮肤移植脱细胞真皮材料，经装袋密封并标记后，以-86℃低温冷冻保存备用；

7.在临床使用前将低温冷冻保存的真皮材料再次以稀碘伏及庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时。

Claims (1)

1.一种用于皮肤移植脱细胞真皮材料的制备方法，采用反复冻融结合超声振荡法的技术方案，具体工艺步骤如下：

a.取3月龄中华香猪猪背部皮，经清洗、去毛刀去毛后，以取皮鼓切取厚度为0.25-0.35毫米中厚皮片备用；

b.将皮片无菌塑封袋密封标记后置入-80℃--90℃超低温冰箱，冷冻6-8小时后取出，40℃--50℃温水复温，至皮片完全融化，低温冷冻及复温过程重复3次；

c.将反复冻融处理过的皮片浸入3％-5％-的高渗氯化钠溶液中浸泡30-40分钟后取出，用蒸馏水反复洗涤后备用；

d.将蒸馏水反复洗涤后的皮片平铺放在网格状金属筐内架空的平面网格托层上，将网格状金属筐整体置入充满庆大霉素阴阳离子洗脱液的KQ-250DB数控超声清洗器内，使皮片完全浸入庆大霉素阴阳离子洗脱液中，进行超声振荡洗涤72小时，超声振荡洗涤过程中每两小时上下颠倒更换金属筐朝向一次，每6小时更换一次洗脱液，当猪皮表皮层已与真皮层松脱后，用镊子将表皮剥除，经反复震荡洗涤72小时后充分脱除细胞；

e.将KQ-250DB数控超声清洗器内的庆大霉素阴阳离子洗脱液置换成庆大霉素蒸馏水进行超声振荡清洗脱除细胞后的皮片，振荡清洗过程中每4小时更换一次蒸馏水，振荡清洗72-84小时后，使皮片内的洗脱液含量低于万分之一，超声振荡期间洗脱液及蒸馏水的温度控制在25～35℃；

f.将步骤e.制备的皮片正反面分别以紫外线照射消毒，并使用碘伏及4000U／L庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时后，制备成用于皮肤移植脱细胞真皮材料，经装袋密封并标记后，以-80℃--90℃低温冷冻保存备用；

g.在临床使用前将低温冷冻保存的真皮材料再次以稀碘伏及庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时。