CN101619322A - 皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途，构建方法包括：培养人皮肤成纤维细胞并构建含有CTLA4Ig－CD40Ig双基因腺病毒载体；所述含有CTLA4Ig－CD40Ig双基因腺病毒载体体外转染所述人皮肤成纤维细胞。低免疫原性皮肤组织工程种子细胞，由上述构建方法制成。用于转染人皮肤成纤维细胞的腺病毒载体，是含有与启动子有效连接的CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的Ad5F35嵌合型腺病毒载体。一种采用腺病毒载体在制备修复损伤皮肤的转染人皮肤成纤维细胞中的用途。本发明能有效降低种子细胞的免疫原性，且转染后的人皮肤成纤维细胞不影响其体外增殖性能。

Description

皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别是指皮肤损伤创面修复过程中应用的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途。

背景技术

皮肤是覆盖和保护体表的重要组织器官。由于各种原因造成的皮肤损伤都需要进行及时的修复。对于这种缺损的修复常规多采用自体皮肤移植的方法，但是这种方法不仅造成供皮区新的组织缺损，而且还经常受到供皮区来源的限制。

近年来利用组织工程技术制作组织工程皮肤已成为皮肤缺损移植治疗的热点。组织工程皮肤一般是在体外将种子细胞接种到支架材料上，在体外进行培养形成含有活细胞的皮肤样结构，然后用于临床使用。所用的种子细胞可来源于自体，也可来源于异体。自体细胞由于需要在体外经过相当长时间的培养扩增，容易延误治疗时间，因此目前组织工程皮肤的种子细胞一般来源于异体包皮环切术或手术中废弃的皮肤分离出来的表皮细胞和成纤维细胞。异体来源的种子细胞可以事先在体外进行大规模的扩增，这样就缩短了患者等待自体细胞扩增的时间，为组织工程皮肤的商品化提供了重要的条件。但是异体来源的种子细胞也存在不足：异体来源的种子细胞始终存在免疫原性，移植到患者后不可避免的存在免疫排斥反应，严重影响使用效果。

皮肤移植的免疫排斥反应是典型的细胞性排斥反应，活化的T细胞在皮肤移植排斥反应中起着决定性作用。而近几年的研究表明，T细胞必须在TCR/MHC识别及辅助刺激信号的共同作用下才能完全活化，起到排斥作用；而阻断辅助刺激信号，将会引起T细胞的无反应或细胞凋亡(apoptosis)，抑制排斥作用的发生。迄今为止已发现多种辅助刺激信号系统，如B7/CD28-CTLA4系统，CD40/CD40L系统，CD95(Fas)/FasL系统等，而作为皮肤组织工程的种子细胞---人皮肤成纤维细胞中含有免疫抑制基因CTLA4Ig和/或CD40Ig(包括利用病毒载体、非病毒载体、转基因等各种细胞修饰技术实现人皮肤成纤维细胞含有CTLA4Ig和/或CD40Ig基因，或者实现人皮肤成纤维细胞表达CTLA4Ig和/或CD40Ig蛋白)，因此如何通过CTLA4Ig和CD40Ig基因的表达来阻断T细胞的活化信号通道，并抑制免疫排斥的发生是需要解决的难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种低免疫原性皮肤组织工程种子细胞及其构建方法，有效解决现有异体来源的种子细胞移植后存在免疫排斥反应的缺陷。

为实现上述目的，本发明提供了一种低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，包括：

培养人皮肤成纤维细胞并构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体；

所述含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体体外转染所述人皮肤成纤维细胞。

所述培养人皮肤成纤维细胞具体为：将人皮肤成纤维细胞采用酶消化法将组织消化散开，制备成单个细胞悬液，按5×10³个/厘米²细胞密度接种于培养瓶中，置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂细胞培养箱中以含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM细胞培养液进行培养，当细胞生长至80％融合时进行传代、扩增。

所述构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体具体为：

构建CTLA4Ig融合蛋白表达载体；

构建CD40Ig融合蛋白表达载体；

构建CTLA4Ig和CD40Ig双基因克隆载体；

构建pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体。

所述构建CTLA4Ig融合蛋白表达载体具体为：

分离、活化人外周血单个核细胞；

提取、鉴定所述人外周血单个核细胞的RNA；

设计引物，第一引物包括CTLA-4基因胞外区N末端7个氨基酸残基和抑瘤素M信号肽C端15个氨基酸残基，第二引物对应CTLA-4基因119-125位氨基酸残基，并引入BclI酶切位点，第三引物包括抑瘤素M信号肽其余氨基酸残基并与第一引物的抑瘤素M信号肽部分重叠，在第三引物的5’端引入HindIII酶切位点；

反转录所述人外周血单个核细胞的RNA合成CTLA-4基因胞外区cDNA第一链，以CTLA-4基因胞外区cDNA第一链为模板，采用第一引物和第二引物进行第一轮扩增，以第一轮扩增的反应产物为模板，采用第二引物和第三引物进行第二轮扩增，用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；

构建pUC19-CTLA4融合质粒；

用HindIII和BclI双酶切所述pUC19-CTLA4融合质粒后，与经HindIII和BclI双酶切pX/Ig载体片段混合并连接，用连接后的产物再转化MC1061感受态菌，得到含有质粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表达载体，用HindIII和XbaI酶切鉴定阳性转化克隆插入的片段长度；

测定所述阳性转化克隆插入的片段的序列。

所述构建CD40Ig融合蛋白表达载体具体为：

分离、活化人外周血单个核细胞；

提取所述人外周血单个核细胞的RNA，并反转录为CD40基因胞外区cDNA；

用特异性引物扩增所述CD40基因胞外区cDNA，将扩增产物克隆到T载体上；所述特异性引物为第四引物：5’-CGTCCTCGAGCCACCATGGTTCGTCTGCCTC-3’，第五引物：5’-GCGATGATCAGATCTCAGCCGATCCTGGG-3’；

用HindIII和BclI双酶切pX/Ig载体，将回收的Ig基因的序列与克隆到T载体上的CD40基因的序列连接，得到CD40Ig融合蛋白表达载体。

所述构建CTLA4Ig和CD40Ig双基因克隆载体具体为：

设计重叠延伸的扩增引物，使得所述重叠延伸的扩增引物去除CTLA4Ig基因中末尾的非编码区，保留CD40Ig基因中末尾的非编码区；所述重叠延伸的扩增引物为第六引物：5’-ATATGGCCACAACCATGGTTCGTCTGCCT-3’，第七引物：5’-AGGCTCTAGAAGCATCCTCGTG-3’；

用所述重叠延伸的扩增引物扩增所述含有质粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表达载体中的CTLA4Ig基因和IRES2序列，将产物CTLA4Ig-IRES2序列回收纯化；

用所述重叠延伸的扩增引物扩增所述CTLA4Ig-IRES2和所述CD40Ig融合蛋白表达载体中的CD40-Ig基因，将扩增产物克隆入T载体，得到CTLA4Ig-CD40Ig双基因克隆载体。

所述构建pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒具体为：

用HindIII和BamHI双酶切载体质粒pcDNA3，回收所述载体质粒pcDNA3的酶切产物；

用HindIII和BamHI双酶切所述CTLA4Ig-CD40Ig双基因克隆载体中的目的基因CTLA4Ig-CD40Ig，回收所述目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切产物；

连接所述载体质粒pcDNA3的酶切产物和所述目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切产物，转化，挑取单克隆培养，提取转化后的pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

用HindIII和XhoI双酶切pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒，回收所述pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒的酶切产物；

用HindIII和SalI双酶切载体质粒pDC316，回收所述载体质粒pDC316的酶切产物；

连接所述pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒的酶切产物和所述载体质粒pDC316的酶切产物，转化，挑取单克隆培养，提取转化后的pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

用EcoRI单酶切pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒进行鉴定。

所述构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体具体为：

转染前一天，将293细胞按5×10⁵个/孔细胞密度接种于六孔板中，置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂的培养箱中以含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM培养基培养过夜；

转染当天换液，用新鲜的含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养；当293细胞生长至孔底面积的80-90％时，取嵌合腺病毒Ad5F35和所述pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒，用脂质体进行转染；

转染后第二天，将长满的细胞于细胞培养瓶中进行传代，观察细胞出毒现象，当70-80％细胞出毒并脱落时进行收毒；所述出毒现象为细胞变大、变圆，呈葡萄状，出现明显噬斑；

将出毒的细胞培养瓶冻融三次，将冻融液离心，收集上清液，得到含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体的第一代毒种；

在细胞培养瓶中培养293细胞，当293细胞生长至瓶底面积的90％时，取所述第一代毒种接种于所述293细胞上；当接种后的293细胞完全出毒时，冻融三次，将冻融液离心，收集上清液，得到含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体的第二代毒种；

用Western Blotting方法鉴定CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的表达。

所述含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体体外转染所述人皮肤成纤维细胞具体为：取所述人皮肤成纤维细胞，用DMEM细胞培养液洗涤，按感染复数为50的剂量加入为病毒液转染液，置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂的细胞培养箱中孵育2小时，再加入含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养48小时。

为实现上述目的，本发明还提供了一种采用所述低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法构建的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞。

为实现上述目的，本发明还提供了一种用于转染人皮肤成纤维细胞的腺病毒载体，所述腺病毒载体是含有与启动子有效连接的CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的Ad5F35嵌合型腺病毒载体。在上述技术方案中，所述CTLA4Ig重组基因中的CTLA4是全长的CTLA4或CTLA4片段，重组基因可以不含有Ig片段，优选为含有Ig片段的CTLA4Ig重组基因；所述CD40Ig重组基因中的CD40是全长的CD40或CD40片段，重组基因可以不含有Ig片段，优选为含有Ig片段的CD40重组基因；所述启动子包括CMV、CAG、SV40或K14；

为实现上述目的，本发明还提供了一种采用所述的腺病毒载体在制备修复损伤皮肤的转染人皮肤成纤维细胞中的用途。

本发明提供了一种低免疫原性皮肤组织工程种子细胞及其构建方法，具有以下优点：本发明使用的含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体在体外可对人皮肤成纤维细胞进行有效转染，得到低免疫原性皮肤组织工程种子细胞；本发明低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法能有效降低种子细胞的免疫原性，实验结果表明，转染后的成纤维细胞与未处理的成纤维细胞相比，其免疫原性下降了31.67±2.25％；且转染后的人皮肤成纤维细胞不影响其体外增殖性能，因此，该方法可有效的用于低免疫原性组织工程皮肤的种子细胞。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法实施例的流程图；

图2为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中方法实施例步骤1中构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体流程图；

图3为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中构建CTLA4Ig融合蛋白表达载体流程图；

图4为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中构建CD40Ig融合蛋白表达载体流程图；

图5为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中构建CTLA4Ig和CD40Ig双基因克隆载体流程图；

图6为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中构建pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒流程图；

图7为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体流程图；

图8为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒经HindIII和XhoI双酶切鉴定图，其中，DNA分子量标准(M)从小到大依次为：250bp、1000bp、2500bp、5000bp、7500bp、10000bp、15000bp；1：HindIII和XhoI双酶切pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

图9为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒经EcoRI单酶切鉴定图，其中，DNA分子量标准(M)从小到大依次为：250bp、1000bp、2500bp、5000bp、7500bp、10000bp、15000bp；1：EcoRI单酶切pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

图10A为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中正常293细胞图片；

图10B为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体感染293细胞出毒照片；

图11为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体模式图，其中CMV为启动子，启动子之后依次是CTLA4Ig重组基因、IRES2序列和CD40Ig重组基因；

图12A为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中正常人皮肤成纤维细胞图片；

图12B为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中被含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体转染后的人皮肤成纤维图片。

具体实施方式

方法实施例

图1为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法实施例的流程图，具体为：

步骤1、培养人皮肤成纤维细胞并构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体；

步骤2、含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体体外转染人皮肤成纤维细胞。

本发明步骤1中的培养人皮肤成纤维细胞和构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体在操作上无先后顺序，既可以先培养人皮肤成纤维细胞，也可以先构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体，目的都是为本发明步骤2提供人皮肤成纤维细胞和含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体，以构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体体外转染人皮肤成纤维细胞。

图2为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中方法实施例步骤1中构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体流程图，在图1所示技术方案中，步骤1具体为：

步骤11、构建CTLA4Ig融合蛋白表达载体；

步骤12、构建CD40Ig融合蛋白表达载体；

步骤13、构建CTLA4Ig和CD40Ig双基因克隆载体；

步骤14、构建pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

步骤15、构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体。

图3为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中构建CTLA4Ig融合蛋白表达载体流程图，在图2所示技术方案中，步骤11具体为：

步骤111、分离、活化人外周血单个核细胞；

步骤112、提取、鉴定人外周血单个核细胞的RNA；

步骤113、设计引物，第一引物包括CTLA-4基因胞外区N末端7个氨基酸残基和抑瘤素M信号肽C端15个氨基酸残基，第二引物对应CTLA-4基因119-125位氨基酸残基，并引入BclI酶切位点，第三引物包括抑瘤素M信号肽其余氨基酸残基并与第一引物的抑瘤素M信号肽部分重叠，在第三引物的5’端引入HindIII酶切位点；

步骤114、反转录人外周血单个核细胞的RNA合成CTLA-4基因胞外区cDNA第一链，以CTLA-4基因胞外区cDNA第一链为模板，采用第一引物和第二引物进行第一轮扩增，以第一轮扩增的反应产物为模板，采用第二引物和第三引物进行第二轮扩增，用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；

步骤115、构建pUC19-CTLA4融合质粒；

步骤116、用HindIII和BclI双酶切所述pUC19-CTLA4融合质粒后，与经HindIII和BclI双酶切pX/Ig载体片段混合并连接，用连接后的产物再转化MC1061感受态菌，得到含有质粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表达载体，用HindIII和XbaI酶切鉴定阳性转化克隆插入的片段长度；

步骤117、测定阳性转化克隆插入的片段的序列。

图4为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中构建CD40Ig融合蛋白表达载体流程图，在图2所示技术方案中，步骤12具体为：

步骤121、分离、活化人外周血单个核细胞；

步骤122、提取人外周血单个核细胞的RNA，并反转录为CD40基因胞外区cDNA；

步骤123、用特异性引物扩增CD40基因胞外区cDNA，将扩增产物克隆到T载体上；特异性引物为第四引物：5’-CGTCCTCGAGCCACCATGGTTCGTCTGCCTC-3’，第五引物：5’-GCGATGATCAGATCTCAGCCGATCCTGGG-3’；

步骤124、用HindIII和BclI双酶切pX/Ig载体，将回收的Ig基因的序列与克隆到T载体上的CD40基因的序列连接，得到CD40Ig融合蛋白表达载体。

图5为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中构建CTLA4Ig和CD40Ig双基因克隆载体流程图，在图2所示技术方案中，步骤13具体为：

步骤131、设计重叠延伸的扩增引物，使得重叠延伸的扩增引物去除CTLA4Ig基因中末尾的非编码区，保留CD40Ig基因中末尾的非编码区；重叠延伸的扩增引物为第六引物：5’-ATATGGCCACAACCATGGTTCGTCTGCCT-3’，第七引物：5’-AGGCTCTAGAAGCATCCTCGTG-3’；

步骤132、用重叠延伸的扩增引物扩增含有质粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表达载体中的CTLA4Ig基因和IRES2序列，将产物CTLA4Ig-IRES2序列回收纯化；

步骤133、用重叠延伸的扩增引物扩增CTLA4Ig-IRES2和CD40Ig融合蛋白表达载体中的CD40-Ig基因，将扩增产物克隆入T载体，得到CTLA4Ig-CD40Ig双基因克隆载体。

图6为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中构建pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒流程图，在图2所示技术方案中，步骤14具体为：

步骤141、用HindIII和BamHI双酶切载体质粒pcDNA3，回收载体质粒pcDNA3的酶切产物，

步骤142、用HindIII和BamHI双酶切CTLA4Ig-CD40Ig双基因克隆载体中的目的基因CTLA4Ig-CD40Ig，回收目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切产物；

步骤143、连接载体质粒pcDNA3的酶切产物和目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切产物，转化，挑取单克隆培养，提取转化后的pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

步骤144、用HindIII和XhoI双酶切pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒，回收pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒的酶切产物；

图8为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒经HindIII和XhoI双酶切鉴定图，其中，DNA分子量标准(M)从小到大依次为：250bp、1000bp、2500bp、5000bp、7500bp、10000bp、15000bp；1：HindIII和XhoI双酶切pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒。pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒经HindIII和XhoI双酶切预期能产生大小分别5.4kb和3.1kb两条带，而电泳结果与预期相符，该质粒经酶切鉴定正确；

步骤145、用HindIII和SalI双酶切载体质粒pDC316，回收载体质粒pDC316的酶切产物；

步骤146、连接pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒的酶切产物和载体质粒pDC316的酶切产物，转化，挑取单克隆培养，提取转化后的pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

步骤147、用EcoRI单酶切pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒进行鉴定；

图9皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中为本发明pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒经EcoRI单酶切鉴定图，pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒经EcoRI单酶切鉴定，正确则可切出约3.1kb的一条带和3.9kb的pDC316载体片段，实验结果与预期相符，该质粒经酶切鉴定正确。

图7为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体流程图，在图2所示技术方案中，步骤15具体为：

步骤151、转染前一天，将293细胞按5×10⁵个/孔细胞密度接种于六孔板中，置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂的培养箱中以含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM培养基培养过夜；

步骤152、转染当天换液，用新鲜的含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养；当293细胞生长至孔底面积的80-90％时，取嵌合腺病毒Ad5F35和pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒，用脂质体进行转染；

步骤153、转染后第二天，将长满的细胞于细胞培养瓶中进行传代，观察细胞出毒现象，当70-80％细胞出毒并脱落时进行收毒；出毒现象为细胞变大、变圆，呈葡萄状，出现明显噬斑；如图所示图10A为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中正常293细胞图片和图10B为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体感染293细胞出毒照片；

步骤154、将出毒的细胞培养瓶冻融三次，将冻融液离心，收集上清液，得到含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体的第一代毒种；

步骤155、在细胞培养瓶中培养293细胞，当293细胞生长至瓶底面积的90％时，取第一代毒种接种于293细胞上；当接种后的293细胞完全出毒时，冻融三次，将冻融液离心，收集上清液，得到含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体的第二代毒种；图11为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体模式图，其中CMV为启动子，启动子之后依次是CTLA4Ig重组基因、IRES2序列和CD40Ig重组基因；

步骤156、用Western Blotting方法鉴定CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的表达。

下面通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

第一实施例

步骤1001、将取自包皮环切术的人皮肤移入超净操作台，用双抗PBS(含有100u/ml青霉素和100u/ml链霉素；pH为7.2)溶液漂洗5次，在培养皿中修剪皮下筋膜细胞及多余的皮下脂肪，将修剪后的人皮肤标本剪成0.3cm×2cm皮条，然后放入浓度为2.5g/L的Dispase II酶中浸没，于温度4℃下消化12小时。将Dispase II酶消化后的人皮肤标本揭除表皮，用眼科剪将分离的真皮剪成糊状后，加入浓度为200U/ml胶原酶于温度37℃的孵箱内消化1小时，将组织基本消化散开，以看不到组织块为度，制备成单个细胞悬液。将消化物转移至10ml离心管中，用PBS在1500转/分转速下离心洗涤5次，每次离心5分钟，以除去胶原酶，随后将收集的细胞加入到含有重量百分比为10％胎牛血清(FBS)的DMEM细胞培养液中重悬，按5×10³个/厘米²细胞密度接种于75cm²培养瓶中，再添加10ml含有重量百分比为10％胎牛血清(FBS)的DMEM细胞培养液后置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂细胞培养箱中培养，每3日换1次细胞培养液；当细胞生长至80％融合时，按常规细胞培养方法进行传代、扩增培养。

步骤1002、常规分离健康人外周血单个核细胞(PBMC)，用RPMI1640调节细胞密度为1×10⁶个/毫升，再加入浓度为15nM的PMA和浓度为10微克/毫升的抗CD3单抗，置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂细胞培养箱中培养6小时，使细胞活化，高表达CTLA-4 mRNA；

步骤1003、离心收集活化后的外周血单个核细胞(PBMC)，用PBS(DEPC)漂洗细胞2次，按每1×10⁷个外周血单个核细胞(PBMC)加入1毫升Tripure的比例混匀，RT 5分钟后加入0.2毫升氯仿，剧烈震荡15秒，再RT 5分钟后于10000转/分转速下离心15分钟，将上层无色水相移至另一离心管，加入0.5毫升异丙醇，混匀，于温度-20℃下放置10分钟，再于10000转/分转速下离心15分钟，加入1毫升质量分数为75％乙醇洗涤沉淀，待沉淀干燥后加入200微升DEPC水溶解，于温度-20℃下保存；

用质量分数为1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶到板制胶，凝固后置于1×MOPS电泳液中，将5微升RNA样品和15微升载样缓冲液于温度为95℃水浴中变性2分钟，再于电压50V下电泳，紫外检测RNA完整性；

将RNA样品稀释后再紫外分光光度仪上测O.D.₂₆₀和O.D.₂₈₀值，RNA浓度(微克/毫升)＝O.D.₂₆₀×40×稀释倍数；

步骤1004、通过计算机辅助分析，根据基因库中人CTLA-4基因序列，设计如下三条引物，第一引物包括CTLA-4基因胞外区N末端7个氨基酸残基和抑瘤素M信号肽C端15个氨基酸残基，第二引物对应CTLA-4基因119-125位氨基酸残基，并引入BclI酶切位点，第三引物包括抑瘤素M信号肽其余氨基酸残基并与第一引物的抑瘤素M信号肽部分重叠，在第三引物的5’端引入HindIII酶切位点；以上三条引物由中科院上海细胞所合成，PAGE纯化；第一引物的序列如SEQ ID NO：5，第二引物的序列如SEQ ID NO：6，第三引物的序列如SEQ ID NO：7；

第一引物：CTCAGTCTGGTCCTTGACCTCCTGTTTCCAAGCATGGCGA

           GCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC

第二引物：TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTC

                           ----BclI

第三引物：GCAAGCTTCAATGGGTTGACTGCTCACACAGAGGACGCTG

               ----HindIII

           CTCAGTTCGGTCCTTGCATCT

步骤1005、将10微升提取的RNA、2微升oligo(dT₁₂)和11.5微升ddH₂O(DEPC)混匀后于温度65℃下水浴变性10分钟，然后迅速置于冰上，再加入8微升5×逆转录缓冲液、2微升浓度为100mM DTT、0.5微升RNasin、4微升浓度为2mM dNTP和2微升AMV(总体积共40微升)，于温度42℃下放置1小时，得到CTLA-4基因胞外区cDNA第一链，于温度-20℃保存；

先以cDNA第一链为模板，采用第一引物和第二引物进行第一轮扩增，条件为：将5微升cDNA第一链、5微升10×PCR缓冲液、4微升浓度为10mM dNTP、终浓度为100nM第一引物和第二引物各3微升、29.5微升ddH₂O混匀后于温度95℃下变性7分钟，再加入0.5微升Taq酶(总体积共50微升)，循环条件为：94℃1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环后72℃7分钟；随后以第一轮扩增的反应产物为模板，采用第二引物和第三引物进行第二轮扩增，反应条件同前，用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；

步骤1006、按试剂盒说明书(TAKARA，JAPANESE)操作来构建pUC19-CTLA4融合质粒；参照《分子克隆》(金冬雁，黎孟枫译，《分子克隆实验指南》，第二版北京：科学出版社199 6；P_852-907)CaCl₂制备大肠杆菌感受态，加入终浓度为10-15％甘油，于温度-70℃冻存；取冻存大肠杆菌感受态细菌，加入1微升质粒，轻轻混匀后，冰浴30分钟，再于温度42℃下水浴2分钟，加入900微升LB培养基，于温度37℃下水浴60分钟，取适量涂布于含有浓度为100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂板上，于温度37℃孵箱培养过夜；按DNA片段回收试剂盒说明书操作回收DNA片段；将第二轮扩增的反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，回收所需片段；

步骤1007、用HindIII和BclI双酶切pUC19-CTLA4融合质粒后，与经HindIII和BclI双酶切pX/Ig载体片段按3∶1的比例混合，根据DNA快速连接试剂盒说明连接，用连接后的产物再转化MC1061(ATCC，USA)感受态菌，得到含有质粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表达载体，用HindIII和XbaI酶切鉴定阳性转化克隆插入的片段长度；

步骤1008、酶切鉴定插入片段长度正确的重组质粒，经HindIII和XbaI双酶切后定向插入pUC19质粒(TAKARA，JAPANESE)中，采用Sanger双脱氧测序法，以质粒双链DNA为模版，在pUC19通用引物引导下，ABI Prism377全自动测序仪自动测定插入片段的序列；其中CTLA4Ig重组基因表达系列如SEQ ID NO：1所示；

步骤1009、从人的外周血中分离单个核细胞；

步骤1010、提取人的外周血单个核细胞的RNA，并反转录为CD40基因胞外区cDNA；

步骤1011、用特异性引物扩增CD40基因胞外区cDNA，并将扩增产物克隆到T载体上；第四引物的序列如SEQ ID NO：8，第五引物的序列如SEQ IDNO：9；

第四引物：5’-CGTCCTCGAGCCACCATGGTTCGTCTGCCTC-3’

第五引物：5’-GCGATGATCAGATCTCAGCCGATCCTGGG-3’

步骤1012、用HindIII和BclI双酶切pX/Ig载体，并将回收的Ig基因的序列与克隆到T载体上的CD40基因的序列连接，得到CD40Ig融合蛋白表达载体；其中，CD40Ig重组基因的表达序列如SEQ ID NO：2所示；

步骤1013、设计重叠延伸的扩增引物，使得重叠延伸的扩增引物去除CTLA4Ig基因中末尾的非编码区，保留CD40Ig基因中末尾的非编码区；第六引物的序列如SEQ ID NO：10，第七引物的序列如SEQ ID NO：11；

第六引物：5’-ATATGGCCACAACCATGGTTCGTCTGCCT-3’

第七引物：5’-AGGCTCTAGAAGCATCCTCGTG-3’

步骤1014、用重叠延伸的扩增引物扩增含有质粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表达载体中的CTLA4Ig基因和IRES2序列，将产物CTLA4Ig-IRES2序列回收纯化；CTLA4Ig重组基因如SEQ ID NO：1所示，IRES2序列如SEQ ID NO：3所示；

步骤1015、用重叠延伸的扩增引物扩增CTLA4Ig-IRES2和CD40Ig融合蛋白表达载体中的CD40-Ig基因，将扩增产物克隆入T载体，得到CTLA4Ig-IRES2-CD40Ig基因，其序列如SEQ ID NO：4所示，由于IRES2是一段连接序列，为便于表述，以下的CTLA4Ig-IRES2-CD40Ig都表述为CTLA4Ig-CD40Ig，即为CTLA4Ig-CD40Ig双基因克隆载体；

步骤1016、用HindIII和BamHI(TAKARA，JAPANESE)双酶切载体质粒pcDNA3(invitrogen，USA)，回收载体质粒pcDNA3的酶切产物；

步骤1017、用HindIII和BamHI双酶切CTLA4Ig-CD40Ig双基因克隆载体中的目的基因CTLA4Ig-CD40Ig，回收目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切产物；

步骤1018、连接载体质粒pcDNA3的酶切产物和目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切产物，转化，挑取单克隆培养，提取转化后的pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

步骤1019、用Hind III和XhoI(TAKARA，JAPANESE)双酶切pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒，回收pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒的酶切产物；

步骤1020、用Hind III和SalI(TAKARA，JAPANESE)双酶切载体质粒pDC316(Miscrobix biosystems，Inc)，回收载体质粒pDC316的酶切产物；

步骤1021、连接pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒的酶切产物和载体质粒pDC316的酶切产物，转化，挑取单克隆培养，提取转化后的pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

步骤1022、用EcoRI单酶切pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒进行鉴定；

步骤1023、转染前一天，将293细胞按5×10⁵个/孔细胞密度接种于六孔板中，置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂的培养箱中以含有重量百分比为10％Hyclone胎牛血清的DMEM培养基培养过夜；

步骤1024、转染当天换液，用新鲜的含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养；当293细胞生长至孔底面积的80％时，取嵌合腺病毒Ad5F35和pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒，用Lipofectamine2000脂质体按其所附说明书进行转染。具体步骤为：

1)每个转染孔取骨架质粒4μg，穿梭质粒1μg，混和均匀；

2)质粒用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min；

3)取10μl的脂质体用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min；

4)将两者混和，室温避光放置30min；然后将混合物加入到细胞中；

步骤1025、转染后第二天，将长满的细胞传代于25cm²细胞培养瓶中，用含有重量百分比为5％胎牛血清的DMEM培养基继续培养，每天观察细胞生长情况，当细胞长满瓶底时，再传入75cm²细胞培养瓶中，每天观察细胞出毒现象；出毒现象为细胞变大、变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑；当70％细胞出毒并从底部脱落时进行收毒；

步骤1026、将出毒的细胞培养瓶先置于温度为-70℃冰箱，再置于温度37℃水浴锅中，如此冻融三次，使病毒从出毒细胞中充分释放；将冻融液于3000转/分转速下离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀，该上清液即为含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体的第一代毒种，作为随后大量病毒扩增的毒种；

步骤1027、在25cm²细胞培养瓶中培养293细胞，当293细胞生长至瓶底面积的90％时，取500微升上述第一代毒种接种于293细胞上；当接种后的293细胞完全出毒时，按上述冻融方法冻融细胞三次，将冻融液离心收集病毒上清液，即为含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体的第二代毒种；

步骤1028、用Western Blotting方法鉴定CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的表达；

步骤1029、取生长至80％融合、生长状态良好、增殖活跃的人皮肤成纤维细胞，用DMEM细胞培养液轻轻洗涤细胞2次，按感染复数(MOI)为50的剂量加入为病毒液转染液，使其完全覆盖细胞培养面积，然后置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂的细胞培养箱中孵育2小时，再加入含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养48小时；如图所示图12A为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中正常人皮肤成纤维细胞图片和图12B为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中被含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体转染后的人皮肤成纤维图片。

一种采用上述低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法构建的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞。

一种用于转染人皮肤成纤维细胞的腺病毒载体，腺病毒载体是含有与启动子有效连接的CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的Ad5F35嵌合型腺病毒载体。

一种采用上述腺病毒载体在制备修复损伤皮肤的转染人皮肤成纤维细胞中的用途。

第二实施例

步骤2001、将取自包皮环切术的人皮肤移入超净操作台，用双抗PBS(含有100u/ml青霉素和100u/ml链霉素；pH为7.2)溶液漂洗5次，在培养皿中修剪皮下筋膜细胞及多余的皮下脂肪，将修剪后的人皮肤标本剪成0.3cm×2cm皮条，然后放入浓度为2.5g/L的Dispase II酶中浸没，于温度4℃下消化14小时。将Dispase II酶消化后的人皮肤标本揭除表皮，用眼科剪将分离的真皮剪成糊状后，加入浓度为200U/ml胶原酶于温度37℃的孵箱内消化2小时，将组织基本消化散开，以看不到组织块为度，制备成单个细胞悬液。将消化物转移至10ml离心管中，用PBS在1500转/分转速下离心洗涤5次，每次离心5分钟，以除去胶原酶，随后将收集的细胞加入到含有重量百分比为10％胎牛血清(FBS)的DMEM细胞培养液中重悬，按5×10³个/厘米²细胞密度接种于75cm²培养瓶中，再添加10ml含有重量百分比为10％胎牛血清(FBS)的DMEM细胞培养液后置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂细胞培养箱中培养，每3日换1次细胞培养液；当细胞生长至80％融合时，按常规细胞培养方法进行传代、扩增培养。

步骤2002、常规分离健康人外周血单个核细胞(PBMC)，用RPMI1640调节细胞密度为1×10⁶个/毫升，再加入浓度为15nM的PMA和浓度为10微克/毫升的抗CD3单抗，置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂细胞培养箱中培养6小时，使细胞活化，高表达CTLA-4 mRNA；

步骤2003、离心收集活化后的外周血单个核细胞(PBMC)，用PBS(DEPC)漂洗细胞2次，按每1×10⁷个外周血单个核细胞(PBMC)加入1毫升Tripure的比例混匀，RT 5分钟后加入0.2毫升氯仿，剧烈震荡15秒，再RT 5分钟后于10000转/分转速下离心15分钟，将上层无色水相移至另一离心管，加入0.5毫升异丙醇，混匀，于温度-20℃下放置10分钟，再于10000转/分转速下离心15分钟，加入1毫升质量分数为75％乙醇洗涤沉淀，待沉淀干燥后加入200微升DEPC水溶解，于温度-20℃下保存；

用质量分数为1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶到板制胶，凝固后置于1×MOPS电泳液中，将5微升RNA样品和15微升载样缓冲液于温度为95℃水浴中变性2分钟，再于电压50V下电泳，紫外检测RNA完整性；

将RNA样品稀释后再紫外分光光度仪上测O.D.₂₆₀和O.D.₂₈₀值，RNA浓度(微克/毫升)＝O.D.₂₆₀×40×稀释倍数；

步骤2004、通过计算机辅助分析，根据基因库中人CTLA-4基因序列，设计如下三条引物，第一引物包括CTLA-4基因胞外区N末端7个氨基酸残基和抑瘤素M信号肽C端15个氨基酸残基，第二引物对应CTLA-4基因119-125位氨基酸残基，并引入BclI酶切位点，第三引物包括抑瘤素M信号肽其余氨基酸残基并与第一引物的抑瘤素M信号肽部分重叠，在第三引物的5’端引入HindIII酶切位点；以上三条引物由中科院上海细胞所合成，PAGE纯化；第一引物的序列如SEQ ID NO：5，第二引物的序列如SEQ ID NO：6，第三引物的序列如SEQ ID NO：7；

第一引物：CTCAGTCTGGTCCTTGACCTCCTGTTTCCAAGCATGGCGA

           GCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC

第二引物：TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTC

                          ----BclI

第三引物：GCAAGCTTCAATGGGTTGACTGCTCACACAGAGGACGCTG

               ----HindIII

           CTCAGTTCGGTCCTTGCATCT

步骤2005、将10微升提取的RNA、2微升oligo(dT₁₂)和11.5微升ddH₂O(DEPC)混匀后于温度65℃下水浴变性10分钟，然后迅速置于冰上，再加入8微升5×逆转录缓冲液、2微升浓度为100mM DTT、0.5微升RNasin、4微升浓度为2mM dNTP和2微升AMV(总体积共40微升)，于温度42℃下放置1小时，得到CTLA-4基因胞外区cDNA第一链，于温度-20℃保存；

先以cDNA第一链为模板，采用第一引物和第二引物进行第一轮扩增，条件为：将5微升cDNA第一链、5微升10×PCR缓冲液、4微升浓度为10mM dNTP、终浓度为100nM第一引物和第二引物各3微升、29.5微升ddH₂O混匀后于温度95℃下变性7分钟，再加入0.5微升Taq酶(总体积共50微升)，循环条件为：94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环后72℃ 7分钟；随后以第一轮扩增的反应产物为模板，采用第二引物和第三引物进行第二轮扩增，反应条件同前，用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；

步骤2006、按试剂盒说明书(TAKARA，JAPANESE)操作来构建pUC19-CTLA4融合质粒；参照《分子克隆》(金冬雁，黎孟枫译，《分子克隆实验指南》，第二版北京：科学出版社1996；P_852-907)CaCl₂制备大肠杆菌感受态，加入终浓度为10-15％甘油，于温度-70℃冻存；取冻存大肠杆菌感受态细菌，加入1微升DNA连接产物，轻轻混匀后，冰浴30分钟，再于温度42℃下水浴2分钟，加入900微升LB培养基，于温度37℃下水浴60分钟，取适量涂布于含有浓度为100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂板上，于温度37℃孵箱培养过夜；按DNA片段回收试剂盒说明书操作回收DNA片段；将第二轮扩增的反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，回收所需片段；

步骤2007、用HindIII和BclI双酶切pUC19-CTLA4融合质粒后，与经HindIII和BclI双酶切pX/Ig载体片段按3∶1的比例混合，根据DNA快速连接试剂盒说明连接，用连接后的产物再转化MC1061(ATCC，USA)感受态菌，得到含有质粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表达载体，用HindIII和XbaI酶切鉴定阳性转化克隆插入的片段长度；

步骤2008、酶切鉴定插入片段长度正确的重组质粒，经HindIII和XbaI双酶切后定向插入pUC19质粒(TAKARA，JAPANESE)中，采用Sanger双脱氧测序法，以质粒双链DNA为模版，在pUC19通用引物引导下，ABI Prism377全自动测序仪自动测定插入片段的序列；其中CTLA4Ig重组基因表达系列如SEQ ID NO：1所示；

步骤2009、从人的外周血中分离单个核细胞；

步骤2010、提取人的外周血单个核细胞的RNA，并反转录为CD40基因胞外区cDNA；

步骤2011、用特异性引物扩增CD40基因胞外区cDNA，并将扩增产物克隆到T载体上；第四引物的序列如SEQ ID NO：8，第五引物的序列如SEQ IDNO：9；

第四引物：5’-CGTCCTCGAGCCACCATGGTTCGTCTGCCTC-3’

第五引物：5’-GCGATGATCAGATCTCAGCCGATCCTGGG-3’

步骤2012、用HindIII和BclI双酶切pX/Ig载体，并将回收的Ig基因的序列与克隆到T载体上的CD40基因的序列连接，得到CD40Ig融合蛋白表达载体；其中，CD40Ig重组基因的表达序列如SEQ ID NO：2所示；

步骤2013、设计重叠延伸的扩增引物，使得重叠延伸的扩增引物去除CTLA4Ig基因中末尾的非编码区，保留CD40Ig基因中末尾的非编码区；第六引物的序列如SEQ ID NO：10，第七引物的序列如SEQ ID NO：11；

第六引物：5’-ATATGGCCACAACCATGGTTCGTCTGCCT-3’

第七引物：5’-AGGCTCTAGAAGCATCCTCGTG-3’

步骤2014、用重叠延伸的扩增引物扩增含有质粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表达载体中的CTLA4Ig基因和IRES2序列，将产物CTLA4Ig-IRES2序列回收纯化；CTLA4Ig重组基因如SEQ ID NO：1所示，IRES2序列如SEQ ID NO：3所示；

步骤2015、用重叠延伸的扩增引物扩增CTLA4Ig-IRES2和CD40Ig融合蛋白表达载体中的CD40-Ig基因，将扩增产物克隆入T载体，得到CTLA4Ig-IRES2-CD40Ig基因，其序列如SEQ ID NO：4所示，由于IRES2是一段连接序列，为便于表述，以下的CTLA4Ig-I RES2-CD40Ig都表述为CTLA4Ig-CD40Ig，即为CTLA4Ig-CD40Ig双基因克隆载体；

步骤2016、用HindIII和BamHI(TAKARA，JAPANESE)双酶切载体质粒pcDNA3(invitrogen，USA)，回收载体质粒pcDNA3的酶切产物；

步骤2017、用HindIII和BamHI双酶切CTLA4Ig-CD40Ig双基因克隆载体中的目的基因CTLA4Ig-CD40Ig，回收目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切产物；

步骤2018、连接载体质粒pcDNA3的酶切产物和目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切产物，转化，挑取单克隆培养，提取转化后的pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

步骤2019、用Hind III和XhoI(TAKARA，JAPANESE)双酶切pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒，回收pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒的酶切产物；

步骤2020、用Hind III和SalI(TAKARA，JAPANESE)双酶切载体质粒pDC316(Miscrobix biosystems，Inc)，回收载体质粒pDC316的酶切产物；

步骤2021、连接pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒的酶切产物和载体质粒pDC316的酶切产物，转化，挑取单克隆培养，提取转化后的pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

步骤2022、用EcoRI单酶切pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒进行鉴定；

步骤2023、转染前一天，将293细胞按5×10⁵个/孔细胞密度接种于六孔板中，置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂的培养箱中以含有重量百分比为10％Hyclone胎牛血清的DMEM培养基培养过夜；

步骤2024、转染当天换液，用新鲜的含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养；当293细胞生长至孔底面积的85％时，取嵌合腺病毒Ad5F35和pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒，用Lipofectamine2000脂质体按其所附说明书进行转染。具体步骤为：

1)每个转染孔取骨架质粒4μg，穿梭质粒1μg，混和均匀；

2)质粒用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min；

3)取10μl的脂质体用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min；

4)将两者混和，室温避光放置30min；然后将混合物加入到细胞中；

步骤2025、转染后第二天，将长满的细胞传代于25cm²细胞培养瓶中，用含有重量百分比为5％胎牛血清的DMEM培养基继续培养，每天观察细胞生长情况，当细胞长满瓶底时，再传入75cm²细胞培养瓶中，每天观察细胞出毒现象；出毒现象为细胞变大、变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑；当75％细胞出毒并从底部脱落时进行收毒；

步骤2026、将出毒的细胞培养瓶先置于温度为-70℃冰箱，再置于温度37℃水浴锅中，如此冻融三次，使病毒从出毒细胞中充分释放；将冻融液于3000转/分转速下离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀，该上清液即为含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体的第一代毒种，作为随后大量病毒扩增的毒种；

步骤2027、在25cm²细胞培养瓶中培养293细胞，当293细胞生长至瓶底面积的90％时，取500微升上述第一代毒种接种于293细胞上；当接种后的293细胞完全出毒时，按上述冻融方法冻融细胞三次，将冻融液离心收集病毒上清液，即为含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体的第二代毒种；

步骤2028、用Western Blotting方法鉴定CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的表达；

步骤2029、取生长至80％融合、生长状态良好、增殖活跃的人皮肤成纤维细胞，用DMEM细胞培养液轻轻洗涤细胞2次，按感染复数(MOI)为50的剂量加入为病毒液转染液，使其完全覆盖细胞培养面积，然后置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂的细胞培养箱中孵育2小时，再加入含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养48小时；如图所示图12A为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中正常人皮肤成纤维细胞图片和图12B为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中被含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体转染后的人皮肤成纤维图片。

一种采用上述低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法构建的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞。

一种用于转染人皮肤成纤维细胞的腺病毒载体，腺病毒载体是含有与启动子有效连接的CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的Ad5F35嵌合型腺病毒载体。

一种采用上述腺病毒载体在制备修复损伤皮肤的转染人皮肤成纤维细胞中的用途。

第三实施例

步骤3001、将取自包皮环切术的人皮肤移入超净操作台，用双抗PBS(含有100u/ml青霉素和100u/ml链霉素；pH为7.2)溶液漂洗5次，在培养皿中修剪皮下筋膜细胞及多余的皮下脂肪，将修剪后的人皮肤标本剪成0.3cm×2cm皮条，然后放入浓度为2.5g/L的Dispase II酶中浸没，于温度4℃下消化16小时。将Dispase II酶消化后的人皮肤标本揭除表皮，用眼科剪将分离的真皮剪成糊状后，加入浓度为200U/ml胶原酶于温度37℃的孵箱内消化4小时，将组织基本消化散开，以看不到组织块为度，制备成单个细胞悬液。将消化物转移至10ml离心管中，用PBS在1500转/分转速下离心洗涤5次，每次离心5分钟，以除去胶原酶，随后将收集的细胞加入到含有重量百分比为10％胎牛血清(FBS)的DMEM细胞培养液中重悬，按5×10³个/厘米²细胞密度接种于75cm²培养瓶中，再添加10ml含有重量百分比为10％胎牛血清(FBS)的DMEM细胞培养液后置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂细胞培养箱中培养，每3日换1次细胞培养液；当细胞生长至80％融合时，按常规细胞培养方法进行传代、扩增培养。

步骤3002、常规分离健康人外周血单个核细胞(PBMC)，用RPMI1640调节细胞密度为1×10⁶个/毫升，再加入浓度为15nM的PMA和浓度为10微克/毫升的抗CD3单抗，置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂细胞培养箱中培养6小时，使细胞活化，高表达CTLA-4 mRNA；

步骤3003、离心收集活化后的外周血单个核细胞(PBMC)，用PBS(DEPC)漂洗细胞2次，按每1×10⁷个外周血单个核细胞(PBMC)加入1毫升Tripure的比例混匀，RT 5分钟后加入0.2毫升氯仿，剧烈震荡15秒，再RT 5分钟后于10000转/分转速下离心15分钟，将上层无色水相移至另一离心管，加入0.5毫升异丙醇，混匀，于温度-20℃下放置10分钟，再于10000转/分转速下离心15分钟，加入1毫升质量分数为75％乙醇洗涤沉淀，待沉淀干燥后加入200微升DEPC水溶解，于温度-20℃下保存；

用质量分数为1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶到板制胶，凝固后置于1×MOPS电泳液中，将5微升RNA样品和15微升载样缓冲液于温度为95℃水浴中变性2分钟，再于电压50V下电泳，紫外检测RNA完整性；

将RNA样品稀释后再紫外分光光度仪上测O.D.₂₆₀和O.D.₂₈₀值，RNA浓度(微克/毫升)＝O.D.₂₆₀×40×稀释倍数；

步骤3004、通过计算机辅助分析，根据基因库中人CTLA-4基因序列，设计如下三条引物，第一引物包括CTLA-4基因胞外区N末端7个氨基酸残基和抑瘤素M信号肽C端15个氨基酸残基，第二引物对应CTLA-4基因119-125位氨基酸残基，并引入BclI酶切位点，第三引物包括抑瘤素M信号肽其余氨基酸残基并与第一引物的抑瘤素M信号肽部分重叠，在第三引物的5’端引入HindIII酶切位点；以上三条引物由中科院上海细胞所合成，PAGE纯化；第一引物的序列如SEQ ID NO：5，第二引物的序列如SEQ ID NO：6，第三引物的序列如SEQ ID NO：7；

第一引物：CTCAGTCTGGTCCTTGACCTCCTGTTTCCAAGCATGGCGA

           GCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC

第二引物：TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTC

                          ----BclI

第三引物：GCAAGCTTCAATGGGTTGACTGCTCACACAGAGGACGCTG

              ----HindIII

           CTCAGTTCGGTCCTTGCATCT

步骤3005、将10微升提取的RNA、2微升oligo(dT₁₂)和11.5微升ddH₂O(DEPC)混匀后于温度65℃下水浴变性10分钟，然后迅速置于冰上，再加入8微升5×逆转录缓冲液、2微升浓度为100mM DTT、0.5微升RNasin、4微升浓度为2mM dNTP和2微升AMV(总体积共40微升)，于温度42℃下放置1小时，得到CTLA-4基因胞外区cDNA第一链，于温度-20℃保存；

先以cDNA第一链为模板，采用第一引物和第二引物进行第一轮扩增，条件为：将5微升cDNA第一链、5微升10×PCR缓冲液、4微升浓度为10mM dNTP、终浓度为100nM第一引物和第二引物各3微升、29.5微升ddH₂O混匀后于温度95℃下变性7分钟，再加入0.5微升Taq酶(总体积共50微升)，循环条件为：94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环后72℃7分钟；随后以第一轮扩增的反应产物为模板，采用第二引物和第三引物进行第二轮扩增，反应条件同前，用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；

步骤3006、按试剂盒说明书(TAKARA，JAPANESE)操作来构建pUC19-CTLA4融合质粒；参照《分子克隆》(金冬雁，黎孟枫译，《分子克隆实验指南》，第二版北京：科学出版社1996；P_852-907)CaCl₂制备大肠杆菌感受态，加入终浓度为10-15％甘油，于温度-70℃冻存；取冻存大肠杆菌感受态细菌，加入2微升质粒，轻轻混匀后，冰浴30分钟，再于温度42℃下水浴2分钟，加入900微升LB培养基，于温度37℃下水浴60分钟，取适量涂布于含有浓度为100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂板上，于温度37℃孵箱培养过夜；按DNA片段回收试剂盒说明书操作回收DNA片段；将第二轮扩增的反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，回收所需片段；

步骤3007、用HindIII和BclI双酶切pUC19-CTLA4融合质粒后，与经HindIII和BclI双酶切pX/Ig载体片段按3∶1的比例混合，根据DNA快速连接试剂盒说明连接，用连接后的产物再转化MC1061(ATCC，USA)感受态菌，得到含有质粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表达载体，用HindIII和XbaI酶切鉴定阳性转化克隆插入的片段长度；

步骤3008、酶切鉴定插入片段长度正确的重组质粒，经HindIII和XbaI双酶切后定向插入pUC19质粒(TAKARA，JAPANESE)中，采用Sanger双脱氧测序法，以质粒双链DNA为模版，在pUC19通用引物引导下，ABI Prism377全自动测序仪自动测定插入片段的序列；其中CTLA4Ig重组基因表达系列如SEQ ID NO：1所示；

步骤3009、从人的外周血中分离单个核细胞；

步骤3010、提取人的外周血单个核细胞的RNA，并反转录为CD40基因胞外区cDNA；

步骤3011、用特异性引物扩增CD40基因胞外区cDNA，并将扩增产物克隆到T载体上；第四引物的序列如SEQ ID NO：8，第五引物的序列如SEQ IDNO：9；

第四引物：5’-CGTCCTCGAGCCACCATGGTTCGTCTGCCTC-3’

第五引物：5’-GCGATGATCAGATCTCAGCCGATCCTGGG-3’

步骤3012、用HindIII和BclI双酶切pX/Ig载体，并将回收的Ig基因的序列与克隆到T载体上的CD40基因的序列连接，得到CD40Ig融合蛋白表达载体；其中，CD40Ig重组基因的表达序列如SEQ ID NO：2所示；

步骤3013、设计重叠延伸的扩增引物，使得重叠延伸的扩增引物去除CTLA4Ig基因中末尾的非编码区，保留CD40Ig基因中末尾的非编码区；第六引物的序列如SEQ ID NO：10，第七引物的序列如SEQ ID NO：11；

第六引物：5’-ATATGGCCACAACCATGGTTCGTCTGCCT-3’

第七引物：5’-AGGCTCTAGAAGCATCCTCGTG-3’

步骤3014、用重叠延伸的扩增引物扩增含有质粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表达载体中的CTLA4Ig基因和IRES2序列，将产物CTLA4Ig-IRES2序列回收纯化；CTLA4Ig重组基因如SEQ ID NO：1所示，IRES2序列如SEQ ID NO：3所示；

步骤3015、用重叠延伸的扩增引物扩增CTLA4Ig-IRES2和CD40Ig融合蛋白表达载体中的CD40-Ig基因，将扩增产物克隆入T载体，得到CTLA4Ig-IRES2-CD40Ig基因，其序列如SEQ ID NO：4所示，由于IRES2是一段连接序列，为便于表述，以下的CTLA4Ig-IRES2-CD40Ig都表述为CTLA4Ig-CD40Ig，即为CTLA4Ig-CD40Ig双基因克隆载体；

步骤3016、用HindIII和BamHI(TAKARA，JAPANESE)双酶切载体质粒pcDNA3(invitrogen，USA)，回收载体质粒pcDNA3的酶切产物；

步骤3017、用HindIII和BamHI双酶切CTLA4Ig-CD40Ig双基因克隆载体中的目的基因CTLA4Ig-CD40Ig，回收目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切产物；

步骤3018、连接载体质粒pcDNA3的酶切产物和目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切产物，转化，挑取单克隆培养，提取转化后的pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

步骤3019、用Hind III和XhoI(TAKARA，JAPANESE)双酶切pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒，回收pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒的酶切产物；

步骤3020、用HindIII和SalI(TAKARA，JAPANESE)双酶切载体质粒pDC316(Miscrobix biosystems，Inc)，回收载体质粒pDC316的酶切产物；

步骤3021、连接pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒的酶切产物和载体质粒pDC316的酶切产物，转化，挑取单克隆培养，提取转化后的pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

步骤3022、用EcoRI单酶切pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒进行鉴定；

步骤3023、转染前一天，将293细胞按5×10⁵个/孔细胞密度接种于六孔板中，置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂的培养箱中以含有重量百分比为10％Hyclone胎牛血清的DMEM培养基培养过夜；

步骤3024、转染当天换液，用新鲜的含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养；当293细胞生长至孔底面积的90％时，取嵌合腺病毒Ad5F35和pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒，用Lipofectamine2000脂质体按其所附说明书进行转染。具体步骤为：

1)每个转染孔取骨架质粒4μg，穿梭质粒1μg，混和均匀；

2)质粒用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min；

3)取10μl的脂质体用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min；

4)将两者混和，室温避光放置30min；然后将混合物加入到细胞中；

步骤3025、转染后第二天，将长满的细胞传代于25cm²细胞培养瓶中，用含有重量百分比为5％胎牛血清的DMEM培养基继续培养，每天观察细胞生长情况，当细胞长满瓶底时，再传入75cm²细胞培养瓶中，每天观察细胞出毒现象；出毒现象为细胞变大、变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑；当80％细胞出毒并从底部脱落时进行收毒；

步骤3026、将出毒的细胞培养瓶先置于温度为-70℃冰箱，再置于温度37℃水浴锅中，如此冻融三次，使病毒从出毒细胞中充分释放；将冻融液于3000转/分转速下离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀，该上清液即为含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体的第一代毒种，作为随后大量病毒扩增的毒种；

步骤3027、在25cm²细胞培养瓶中培养293细胞，当293细胞生长至瓶底面积的90％时，取500微升上述第一代毒种接种于293细胞上；当接种后的293细胞完全出毒时，按上述冻融方法冻融细胞三次，将冻融液离心收集病毒上清液，即为含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体的第二代毒种；

步骤3028、用Western Blotting方法鉴定CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的表达；

步骤3029、取生长至80％融合、生长状态良好、增殖活跃的人皮肤成纤维细胞，用DMEM细胞培养液轻轻洗涤细胞2次，按感染复数(MOI)为50的剂量加入为病毒液转染液，使其完全覆盖细胞培养面积，然后置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂的细胞培养箱中孵育2小时，再加入含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养48小时；如图所示图12A为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中正常人皮肤成纤维细胞图片和图12B为本发明皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途中被含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体转染后的人皮肤成纤维图片。

一种采用上述低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法构建的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞。

一种用于转染人皮肤成纤维细胞的腺病毒载体，腺病毒载体是含有与启动子有效连接的CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的Ad5F35嵌合型腺病毒载体。

一种采用上述腺病毒载体在制备修复损伤皮肤的转染人皮肤成纤维细胞中的用途。

下面通过具体的免疫性能实验检测了病毒转染后细胞和未处理细胞的免疫原性。

取培养48小时后转染后的人皮肤成纤维细胞，用质量分数为0.25％胰酶消化，再用含有重量百分比为10％胎牛血清(已灭活)的RPMI1640细胞培养液调整细胞浓度至1×10⁴个/毫升；将人淋巴细胞分离液与健康人全血按1∶1比例先后加入50毫升离心管中，于温度4℃、转速为3000转/分离心20分钟后，吸取中间云雾层细胞，用PBS离心洗涤3次，离心转速分别为2000转/分、1500转/分和1000转/分，每次离心10分钟，重悬细胞并镜下计数，用质量分数为0.4％台盘兰染色计数细胞活率，再用含有重量百分比为10％胎牛血清(已灭活)的RPMI1640细胞培养液调整细胞浓度至1×10⁶个/毫升；将上述淋巴细胞悬液和成纤维细胞悬液各100微升加入96孔板，然后置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂的细胞培养箱中共培养48小时；将96孔板于转速1000转/分下离心5分钟；吸除培养液，每孔加入20微升浓度为0.5mg/ml MTT溶液，于温度37℃下孵育4小时；再加入100微升DMSO溶解振荡20分钟，放入酶标仪570nm下检测。以未经病毒转染的人皮肤成纤维细胞(不含病毒液的DMEM作为转染液)作为阴性对照。

实验结果显示：病毒转染后的人皮肤成纤维细胞和未经病毒转染的人皮肤成纤维细胞相比，其免疫原性下降了31.67±2.25％。

下面通过具体的细胞增殖性能实验检测了病毒转染后细胞和未处理细胞的增殖性能。

取生长至80％左右融合、生长状态良好、增殖活跃的人皮肤成纤维细胞，用质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化，再用含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM培养液调整细胞浓度至1×10⁵个/毫升，按100微升/孔接种于96孔板；按感染复数(MOI)为50的剂量加入为病毒液转染液，使其完全覆盖细胞培养面积，置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂的细胞培养箱中孵育2小时；再加入含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养48小时；吸除培养液，每孔加入20微升浓度为0.5mg/ml MTT液，于温度37℃下孵育4小时后加入100微升DMSO溶解振荡20分钟，放入酶标仪570nm下检测。以未经病毒转染的人皮肤成纤维细胞(不含病毒液的DMEM作为转染液)作为阴性对照。

实验结果显示：对照组成纤维细胞活性值为0.9232±0.0586，病毒转染组成纤维细胞活性值为0.9224±0.0962，两组无显著性差异，说明病毒载体转染后不影响成纤维细胞的增殖性能。

因此，本发明使用的含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体在体外可对人皮肤成纤维细胞进行有效转染，得到低免疫原性皮肤组织工程种子细胞；本发明低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法能有效降低种子细胞的免疫原性，且转染后的人皮肤成纤维细胞不影响其体外增殖性能，因此，该方法可有效的用于低免疫原性组织工程皮肤的种子细胞。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

序列表

<110>重庆宗申军辉生物技术有限公司

<120>皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途

<130>081981GF

<160>11

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1152

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca     60

agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga    120

ggcatcgcca gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg    180

acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg    240

gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa    300

gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg    360

gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca gatttatgta    420

attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac    480

acatccccac cgtccccagcacctgaactc ctggggggat  cgtcagtctt cctcttcccc    540

ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg     600

gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg     660

cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc     720

gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc     780

aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga     840

gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc     900

ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat     960

gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc    1020

ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca    1080

tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct  ctccctgtct   1140

ccgggtaaat ga                                                        1152

<210>2

<211>625

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

ttcgaattct gcagtcgacg gtaccgcggg cccgggatcc gcccctctcc ctcccccccc     60

cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta    120

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aaaacacgat gataatatgg ccaca                                          625

<210>3

<211>1287

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>3

atggttcgtc tgcctctgca gtgcgtcctc tggggctgct tgctgaccgc tgtccatcca     60

gaaccaccca ctgcatgcag agaaaaacag tacctaataa acagtcagtg ctgttctttg    120

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gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag    1260

agcctctccc tgtctccggg taaatga                                        1287

<210>4

<211>3067

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>4

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agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga     120

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tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct    1140

ccgggtaaat gattcgaatt ctgcagtcga cggtaccgcg ggcccgggat ccgcccctct    1200

ccctcccccc cccctaacgt tactggccga agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt    1260

gtctatatgt tattttccac catattgccg tcttttggca atgtgagggc ccggaaacct    1320

ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa    1380

ggtctgttga atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag cttcttgaag acaaacaacg    1440

tctgtagcga ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc    1500

caaaagccac gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg    1560

agttggatag ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg    1620

aaggatgccc agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc    1680

tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaaa cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg    1740

gttttccttt gaaaaacacg atgataatat ggccacaacc atggttcgtc tgcctctgca    1800

gtgcgtcctc tggggctgct tgctgaccgc tgtccatcca gaaccaccca ctgcatgcag    1860

agaaaaacag tacctaataa acagtcagtg ctgttctttg tgccagccag gacagaaact    1920

ggtgagtgac tgcacagagt tcactgaaac ggaatgcctt ccttgcggtg aaagcgaatt    1980

cctagacacc tggaacagag agacacactg ccaccagcac aaatactgcg accccaacct    2040

agggcttcgg gtccagcaga agggcacctc agaaacagac accatctgca cctgtgaaga    2100

aggctggcac tgtacgagtg aggcctgtga gagctgtgtc ctgcaccgct catgctcgcc    2160

cggctttggg gtcaagcaga ttgctacagg ggtttctgat accatctgcg agccctgccc    2220

agtcggcttc ttctccaatg tgtcatctgc tttcgaaaaa tgtcaccctt ggacaagctg    2280

tgagaccaaa gacctggttg tgcaacaggc aggcacaaac aagactgatg ttgtctgtgg    2340

tccccaggat cggctgagat ctgatcagga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatc    2400

cccaccgtcc ccagcacctg aactcctggg gggatcgtca gtcttcctct tccccccaaa    2460

acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt    2520

gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa    2580

tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct    2640

caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa    2700

agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc    2760

acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac    2820

ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca    2880

gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct    2940

ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc    3000

cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg    3060

taaatga                                                              3067

<210>5

<211>65

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR扩增CTLA-4的胞外区的引物

<400>5

ctcagtctgg tccttgacct cctgtttcca agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc      60

cagcc                                                                  65

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR扩增CTLA-4的胞外区的引物

<400>6

tttgggctcc tgatcagaat ctgggcacgg ttc                                  33

<210>7

<211>61

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR扩增CTLA-4的胞外区的引物

<400>7

gcaagcttca atgggttgac tgctcacaca gaggacgctg ctcagttcgg tccttgcatc    60

t                                                                    61

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR扩增CD40的胞外区的引物

<400>8

cgtcctcgag ccaccatggt tcgtctgcct c    31

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR扩增CD40的胞外区的引物

<400>9

gcgatgatca gatctcagcc gatcctggg      29

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>扩增CTLA4-Ig与IRES2的引物

<400>10

atatggccac aaccatggtt cgtctgcct     29

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>扩增CTLA4-Ig与IRES2的引物

<400>11

aggctctaga agcatcctcg tg    22

Claims (12)

1、一种低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，其特征在于，包括：

培养人皮肤成纤维细胞并构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体；

所述含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体体外转染所述人皮肤成纤维细胞。

2、根据权利要求1所述的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，其特征在于，所述培养人皮肤成纤维细胞具体为：将人皮肤成纤维细胞采用酶消化法将组织消化散开，制备成单个细胞悬液，按5×10³个/厘米²细胞密度接种于培养瓶中，置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂细胞培养箱中以含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM细胞培养液进行培养，当细胞生长至80％融合时进行传代、扩增。

3、根据权利要求1所述的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，其特征在于，所述构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体具体为：

构建CTLA4Ig融合蛋白表达载体；

构建CD40Ig融合蛋白表达载体；

构建CTLA4Ig和CD40Ig双基因克隆载体；

构建pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体。

4、根据权利要求3所述的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，其特征在于，所述构建CTLA4Ig融合蛋白表达载体具体为：

分离、活化人外周血单个核细胞；

提取、鉴定所述人外周血单个核细胞的RNA；

设计引物，第一引物包括CTLA-4基因胞外区N末端7个氨基酸残基和抑瘤素M信号肽C端15个氨基酸残基，第二引物对应CTLA-4基因119-125位氨基酸残基，并引入Bc1I酶切位点，第三引物包括抑瘤素M信号肽其余氨基酸残基并与第一引物的抑瘤素M信号肽部分重叠，在第三引物的5’端引入HindIII酶切位点；

反转录所述人外周血单个核细胞的RNA合成CTLA-4基因胞外区cDNA第一链，以CTLA-4基因胞外区cDNA第一链为模板，采用第一引物和第二引物进行第一轮扩增，以第一轮扩增的反应产物为模板，采用第二引物和第三引物进行第二轮扩增，用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；

构建pUC19-CTLA4融合质粒；

用HindIII和Bc1I双酶切所述pUC19-CTLA4融合质粒后，与经HindIII和Bc1I双酶切pX/Ig载体片段混合并连接，用连接后的产物再转化MC1061感受态菌，得到含有质粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表达载体，用HindIII和XbaI酶切鉴定阳性转化克隆插入的片段长度；

测定所述阳性转化克隆插入的片段的序列。

5、根据权利要求3所述的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，其特征在于，所述构建CD40Ig融合蛋白表达载体具体为：

分离、活化人外周血单个核细胞；

提取所述人外周血单个核细胞的RNA，并反转录为CD40基因胞外区cDNA；

用特异性引物扩增所述CD40基因胞外区cDNA，将扩增产物克隆到T载体上；所述特异性引物为第四引物：5’-CGTCCTCGAGCCACCATGGTTCGTCTGCCTC-3’，第五引物：5’-GCGATGATCAGATCTCAGCCGATCCTGGG-3’；

用HindIII和Bc1I双酶切pX/Ig载体，将回收的Ig基因的序列与克隆到T载体上的CD40基因的序列连接，得到CD40Ig融合蛋白表达载体。

6、根据权利要求3所述的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，其特征在于，所述构建CTLA4Ig和CD40Ig双基因克隆载体具体为：

设计重叠延伸的扩增引物，使得所述重叠延伸的扩增引物去除CTLA4Ig基因中末尾的非编码区，保留CD40Ig基因中末尾的非编码区；所述重叠延伸的扩增引物为第六引物：5’-ATATGGCCACAACCATGGTTCGTCTGCCT-3’，第七引物：5’-AGGCTCTAGAAGCATCCTCGTG-3’；

用所述重叠延伸的扩增引物扩增所述含有质粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表达载体中的CTLA4Ig基因和IRES2序列，将产物CTLA4Ig-IRES2序列回收纯化；

用所述重叠延伸的扩增引物扩增所述CTLA4Ig-IRES2和所述CD40Ig融合蛋白表达载体中的CD40-Ig基因，将扩增产物克隆入T载体，得到CTLA4Ig-CD40Ig双基因克隆载体。

7、根据权利要求3所述的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，其特征在于，所述构建pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒具体为：

用HindIII和BamHI双酶切载体质粒pcDNA3，回收所述载体质粒pcDNA3的酶切产物；

用HindIII和BamHI双酶切所述CTLA4Ig-CD40Ig双基因克隆载体中的目的基因CTLA4Ig-CD40Ig，回收所述目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切产物；

连接所述载体质粒pcDNA3的酶切产物和所述目的基因CTLA4Ig-CD40Ig的酶切产物，转化，挑取单克隆培养，提取转化后的pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

用Hind III和XhoI双酶切pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒，回收所述pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒的酶切产物；

用HindIII和Sa1I双酶切载体质粒pDC316，回收所述载体质粒pDC316的酶切产物；

连接所述pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒的酶切产物和所述载体质粒pDC316的酶切产物，转化，挑取单克隆培养，提取转化后的pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

用EcoRI单酶切pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒进行鉴定。

8、根据权利要求3所述的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，其特征在于，所述构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体具体为：

转染前一天，将293细胞按5×105个/孔细胞密度接种于六孔板中，置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂的培养箱中以含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM培养基培养过夜；

转染当天换液，用新鲜的含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养；当293细胞生长至孔底面积的80-90％时，取嵌合腺病毒Ad5F35和所述pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒，用脂质体进行转染；

转染后第二天，将长满的细胞于细胞培养瓶中进行传代，观察细胞出毒现象，当70-80％细胞出毒并脱落时进行收毒；所述出毒现象为细胞变大、变圆，呈葡萄状，出现明显噬斑；

将出毒的细胞培养瓶冻融三次，将冻融液离心，收集上清液，得到含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体的第一代毒种；

在细胞培养瓶中培养293细胞，当293细胞生长至瓶底面积的90％时，取所述第一代毒种接种于所述293细胞上；当接种后的293细胞完全出毒时，冻融三次，将冻融液离心，收集上清液，得到含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体的第二代毒种；

用Western Blotting方法鉴定CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的表达。

9、根据权利要求1所述的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，其特征在于，所述含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体体外转染所述人皮肤成纤维细胞具体为：取所述人皮肤成纤维细胞，用DMEM细胞培养液洗涤，按感染复数为50的剂量加入为病毒液转染液，置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂的细胞培养箱中孵育2小时，再加入含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养48小时。

10、一种采用权利要求1-9中任一权利要求所述低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法构建的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞。

11、一种用于转染人皮肤成纤维细胞的腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒载体是含有与启动子有效连接的CTLA4Ig基因和CD40Ig基因的Ad5F35嵌合型腺病毒载体。

12、一种采用权利要求11所述的腺病毒载体在制备修复损伤皮肤的转染人皮肤成纤维细胞中的用途。

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