KR20210065970A - 간 오가노이드를 포함하는 간 지원 시스템 및 이의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

간 오가노이드를 포함하는 간 지원 시스템 및 이의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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KR20210065970A
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KR
South Korea
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liver
organoid
organoids
vivo
bioprosthetic
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Application number
KR1020217011541A
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English (en)
Inventor
다카노리 다케베
조지 에이. 베제라
Original Assignee
칠드런즈 호스피탈 메디칼 센터
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Abstract

간 오가노이드를 이용하는 생체인공 간 시스템("BAL" 또는 "간 보조 장치")이 개시된다. 상기 개시된 시스템은 치료적 이점을 필요로 하는 개체에게 제공하기 위해 사용될 수 있고, 특히 상기 개체는 간 기능이 손상되어 있다. 상기 시스템은 생체내 또는 생체외 구성요소를 포함할 수 있고, 간 기능은 개시된 시스템을 사용하여 개체에게 제공된다.

Description

간 오가노이드를 포함하는 간 지원 시스템 및 이의 제조 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2018년 9월 27일자로 출원된 US 가출원 일련 번호 62/737,261, 명칭 "Liver Support System Comprising Liver Organoids and Methods of Making and Using Same"에 대한 우선권 및 그의 이점을 주장하고, 상기의 내용은 전체적으로 그리고 모든 목적을 위해 본 명세서에 포함되어 있다.
간부전으로 집중 치료실에 입원한 대부분의 환자는 생존하지 못한다. 80 내지 90 %의 높은 사망률이 보고되었다. 현재까지 이용가능한 유일한 치료는 간 이식이다. 그러나 이식을 위한 간이 즉시 이용가능하지 않거나 특정 상황에서 환자가 이식 자격이 없을 수도 있다.
급성 간부전 및 만성 간 질환(예컨대 간세포 암종 및 간경변증)과 같은 간 질환을 치료하기 위해, 간세포 이식, 간 지원 시스템 및 3D 기관 프린팅을 포함한 다양한 접근법이 제안되었다. 현재, 간세포는 필요로 하는 환자에서 손상된 간 기능을 돕기 위해 체외 장치에 사용되는 가장 유망한 간 세포 출처이었다. 그러나 현재까지 간세포의 사용은 불충분한 것으로 입증되었다. 간세포는 기존 장치와 함께 사용하여 간 기능을 지원할 때 수명이 짧아서, 이러한 세포 유형의 유용성을 제한한다. 생물학적 기반 세포 시스템의 결여는 그러한 시스템의 광범위한 임상 적용을 지연시키고 간 지원 시스템을 제공하기 위한 개선된 방법에 대한 필요성을 창출하였다.
다양한 유형의 간 지원 시스템이 제안되거나 기재되었지만 생물학적 성분을 포함하는 장치는 현재 부족하다. 본 개시내용은 당업계에서 전술한 요구 중 하나 이상을 다룬다.
본 명세서에는 필요로 하는 개체, 특히 간 기능이 손상된 개체에서 간 오가노이드(organoid)를 손상된 간 기능에 이용할 수 있는 생체인공 간 시스템("BAL" 또는 "간 보조 장치")이 개시된다. 개시된 시스템은 치료적 이점을 필요로 하는 개체에게 제공하기 위해 사용될 수 있고, 특히 상기 개체는 손상된 간 기능을 가지고 있다. 시스템은 생체내 또는 생체외 구성요소를 포함할 수 있고, 개체에서 손상된 간 기능은 간 오가노이드를 포함하는 개시된 시스템에 의해 제공된다.
당업자는 이하에 설명되는 도면이 단지 예시 목적임을 이해할 것이다. 도면은 어떤 식으로든 본 교시의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
도 1은 iPSC로부터의 오가노이드 생성 및 오가노이드 성장 배지를 사용한 개선된 세포 증식, 및 iPSC로부터 형성된 오가노이드에서의 다양한 유전자의 발현을 위한 예시적인 프로토콜을 예시한다.
도 2는 오가노이드 성장 배지를 사용하여 일차 샘플로부터 오가노이드 생성을 도시한다.
도 3은 일차 세포로부터 오가노이드의 유전자 발현 분석을 도시한다.
도 4는 매트리겔 포매(embedding) 방법 및 마이크로웰 메쉬 방법을 사용하여 iPSC로부터 오가노이드 형성을 도시한다.
정의
달리 언급되지 않는 한, 용어는 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상적인 요법에 따라 이해되어야 한다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 문서가 우선한다. 예시적인 방법 및 물질이 아래에 설명되지만, 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 본 명세서에 개시된 물질, 방법 및 예는 단지 예시적이고, 제한하려는 의도가 아니다.
본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 다수의 이러한 방법을 포함하고 "용량"에 대한 언급은 당업자에게 알려진 하나 이상의 용량 및 이의 등가물에 대한 언급 등을 포함한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오류 범위 내를 의미하며, 이는 값이 측정 또는 결정되는 방법, 예를 들어 측정 시스템의 제한에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 당업계의 실행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20 %, 또는 최대 10 %, 또는 최대 5 %, 또는 최대 1 %의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 용어는 값의 한 자릿수, 바람직하게는 5배 이내, 더욱 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기재되어있는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하는 것으로 가정되어야 한다.
용어 "개체", "숙주", "대상체" 및 "환자"는 치료, 관찰 및/또는 실험의 대상인 동물을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로, 용어는 인간 환자를 지칭하지만, 방법 및 조성물은 다른 포유동물과 같은 비인간 대상체에도 동일하게 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 용어는 인간을 지칭한다. 추가 구현예에서, 용어는 소아를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "전분화능(totipotent) 줄기 세포"(전능성(omnipotent) 줄기 세포라고도 함)는 배아 및 배아외 세포 유형으로 분화할 수 있는 줄기 세포이다. 이러한 세포는 완전하고 생존가능한 유기체를 구성할 수 있다. 이 세포는 알(egg)과 정자 세포의 융합으로 생성된다. 수정란의 처음 몇 부분에 의해 생성된 세포도 전분화능이 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "다분화능(pluripotent) 줄기 세포(PSC)"는 신체의 거의 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 모든 세포, 즉, 내배엽 (내측 위 라이닝, 위장관, 폐), 중배엽 (근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기), 및 외배엽 (표피 조직 및 신경계)를 포함하는 3개의 배엽층 (배아 상피)중 임의의 것으로부터 유래된 세포를 포함한다. PSC는 착상전 배반포의 내부 세포 덩어리 세포의 후손이거나 특정 유전자의 발현을 강제함으로써 성체 체세포와 같은 비-다분화능 세포의 유도를 통해 얻을 수 있다. 다분화능 줄기 세포는 임의의 적절한 출처에서 유래할 수 있다. 다분화능 줄기 세포의 출처의 예에는 인간, 설치류, 돼지 및 소를 포함한 포유류 출처가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "유도 다분화능 줄기 세포(iPSC)"는 일반적으로 iPS 세포로도 약칭되며, 일반적으로 특정 유전자의 "강제된" 발현을 유도함으로써 비-다분화능 세포, 예를 들어 성체 체세포로부터 정상적으로 유래된 다분화능 줄기 세포의 유형을 의미한다. hiPSC는 인간 iPSC를 지칭한다. 일부 구현예에서, iPSC는 특정 줄기 세포 관련 유전자를 성인 섬유아세포와 같은 비-다분화능 세포로 형질 감염시킴으로써 유래된다. 형질감염은 일반적으로 레트로바이러스와 같은 바이러스 벡터를 통해 이루어집니다. 형질 감염된 유전자는 마스터 전사 조절인자 Oct-3/4 (Pouf51) 및 Sox2가 포함되지만 다른 유전자가 유도 효율을 향상시키는 것으로 제안된다. 3 내지 4 주 후, 소수의 형질 감염된 세포는 다분화능 줄기 세포와 형태적으로 그리고 생화학적으로 유사해지기 시작하며 일반적으로 형태적 선택, 배가 시간 또는 리포터 유전자 및 항생제 선택을 통해 분리된다. 본 명세서에 사용된 iPSC는 1 세대 iPSC, 마우스의 2세대 iPSC 및 인간 유도 다분화능 줄기 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 시스템은 4 개의 중추적 유전자: Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc를 사용하여 인간 섬유아세포를 다분화능 줄기 세포로 형질 전환시키는 데 사용된다. 대안적인 구현예에서, 렌티바이러스 시스템은 OCT4, SOX2, NANOG, 및 LIN28로 체세포를 형질전환시키는 데 사용된다. iPSC에서 발현이 유도되는 유전자는 비제한적으로 Oct-3/4(예를 들어, Pou5fl); 특정 멤버의 Sox 유전자 계열(예를 들어, Sox1, Sox2, Sox3, 및 Sox15); 특정 멤버의 Klf 계열(예를 들어, Klf1, Klf2, Klf4, 및 Klf5), 특정 멤버의 Myc 계열(예를 들어, C-myc, L-myc, 및 N-myc), Nanog, 및 LIN28을 포함한다. 일부 구현 예에서, 비-바이러스 기반 기술이 iPSC를 생성하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스를 사용하여 필수 4 개의 유전자를 마우스의 피부 및 간 세포의 DNA로 수송하여 배아 줄기 세포와 동일한 세포를 생성할 수 있다. 아데노바이러스는 임의의 자신의 유전자를 표적 숙주와 결합하지 않기 때문에 종양 생성 위험이 제거된다. 일부 구현예에서, 매우 낮은 효율이지만, 임의의 바이러스 형질감염 시스템 없이 플라스미드를 통해 재프로그래밍을 수행할 수 있다. 다른 구현예에서, 단백질의 직접 전달은 iPSC를 생성하기 위해 사용되며, 따라서 바이러스 또는 유전자 변형의 필요성을 제거한다. 일부 구현예에서, 유사한 방법론을 사용하여 마우스 iPSC의 생성이 가능하다. 폴리-아르기닌 앵커를 통해 세포 내로 채널링된 특정 단백질로 세포를 반복적으로 처리하면 다분화능을 유도하기에 충분하였다. 일부 구현예에서, 다분화능 유도 유전자의 발현은 또한 낮은 산소 조건 하에 FGF2로 체세포를 처리함으로써 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, 예시적인 iPS 세포주는 비제한적으로 iPS-DF19-9; iPS-DF19-9; iPS-DF4-3; iPS-DF6-9; iPS(포피); iPS(IMR90); 및 iPS(IMR90)을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 통상적으로 약칭 ES 세포로도 약칭되는 용어 "배아 줄기 세포(ESC)"는 다분화능이고 초기 단계 배아인 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래된 세포를 의미한다. 본 개시 내용의 목적을 위해, 용어 "ESC"는 배아 생식 세포도 포함하기 위해 광범위하게 때때로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "전구 세포"는 본 명세서에 기재된 방법에서 사용될 수 있은 임의의 세포를 포괄하며, 이를 통해 하나 이상의 전구체 세포가 자체 재생하거나 하나 이상의 특화된 세포 유형으로 분화하는 능력을 획득한다. 일부 구현예에서, 전구체 세포는 다분화능이거나 다분화능이 되는 능력을 갖는다. 일부 구현예에서, 전구체 세포는 다분화능을 획득하기 위해 외부 인자(예를 들어, 성장 인자)의 처리를 거친다. 일부 구현예에서, 전구체 세포는 전분화능 (또는 전능성) 줄기 세포일 수 있고; 다분화능 줄기 세포(유도 또는 비유도); 다능성 줄기 세포; 협능성 줄기 세포 및 단분화능 줄기 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 전구체 세포는 배아, 유아, 아동 또는 성인으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 전구체 세포는 유전적 조작 또는 단백질/펩타이드 처리를 통해 다분화능이 부여되도록 처리되는 체세포 대상일 수 있다.
인공 간 지원 시스템은 신장 투석 시스템의 개념과 유사하게 손상되거나 기능하지 않는 간에 의해 제거되지 않은 축적된 독소를 여과하고 흡수하여 급성 또는 만성 간 부전을 치료할 수 있다. 간 지원 시스템은 알부민 투석 또는 혈장 분리 및 여과를 통해 혈액을 정화하는 데 사용할 수 있으며 수용성 물질, 뿐만 아니라 친유성, 알부민 결합 물질, 예컨대 빌리루빈, 담즙산, 방향족 아미노산의 대사산물, 중간-사슬 지방산 및/또는 사이토카인을 제거하는 데 사용할 수 있다. 인공 간은 간 독소를 어느 정도 제거할 수 있지만 요소 생성, 단백질 합성, 포도당신생성, 효소 해독 및 면역 조절과 같은 간의 대사 기능을 수행하는 능력이 부족하다.
현재 이용 가능한 비생물학적 간 지원 시스템은 단지 해독의 역할을 수행하도록 설계되었으며 간의 합성 및 대사 기능을 제공하지 않는다. 대조적으로, 생물인공 시스템은 일반적으로 이러한 추가 역할을 수행할 수 있는 살아있는 세포를 함유한다. 현재까지 섬유아세포 또는 간 구상체는 이러한 시스템과 함께 사용되었다 (참고, 예를 들어, Glorioso 등, J. Hepatol, 2015 August; 63(2): 388-398. doi:10.1016/j.jhep.2015.03.021, 이는 돼지 모델에서 구상체 저장소 생체인공 간을 개시함), 그러나, 간 구상체 또는 원발성 간세포의 기능은 매우 일시적으로 지속된다. 간 구상체 또는 원발성 간세포(일반적으로 24 시간 미만)의 기능이 매우 제한되어 있기 때문에, 이러한 시스템의 유용성은 제한적이다. 불멸화된 간세포 세포주는 더 오래 생존할 수 있지만 담즙산 청소능 및 암모늄 대사와 같은 중요한 간 기능이 부족하므로 그러한 필요가 있는 환자의 간 지원에 이상적이지 않다.
본 명세서에 기술된 생체인공 간 시스템("BAL 또는 "간 보조 장치")은 간 오가노이드 기술을 이용하고, 특히 기존의 생체인공 시스템에서 간세포 및/또는 구상체의 결핍과 같은 당업계의 전술한 요구 중 하나 이상을 해결하는 데 유용한다. 개시된 시스템 및 방법은 루멘화(lumenized) (또는 "캐비테이션(cavitation)") 구조를 갖는 간 오가노이드를 사용하며, 이는 필요로 하는 개체에게 중요한 간 기능을 추가로 제공할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 간 오가노이드를 사용하는 시스템은 개시된 간 오가노이드는 60일 이상의 지속성을 가지며, 섬유아세포 및 구상체의 24 시간 생존력보다 훨씬 더 긴 지속성을 갖는다는 점에서 구상체 또는 섬유아세포를 사용하는 시스템의 결핍을 추가로 해결한다. 이러한 간 오가노이드는 담즙 청소능 기능 및 간 고유의 대사 기능, 섬유아세포 및/또는 구상체에는 존재하지 않는 특징을 제공할 수 있다.
개시된 간 지원 시스템은 비생물학적 또는 생체인공 간 지원 시스템으로 분류된 체외 장치를 포함할 수 있으며 필요로 하는 개체에서 간 기능을 지원하는 데 사용될 수 있다. 개시된 간 지원 시스템은 필요로 하는 환자에서 간 기능을 지원하거나 실질적으로 대체하는 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 개시된 간 지원 시스템은 급성, 만성 및/또는 말기 만성 간부전을 갖는 개체의 간 기능을 보조하기 위해 사용될 수 있다. 시스템은 그러한 개체에 국한되지 않지만, 개체가 간 기능이 손상되지 않았으나, 급성 또는 만성 상태이든지 강화된 간 기능이 바람직할 수 있는 조건으로 인해 추가 지원이 필요한 사용을 추가로 포함할 수 있다.
일 측면에서, 생체인공 간 시스템("BAL" 또는 "간 보조 장치")이 개시된다. BAL은 간 오가노이드 및 간 오가노이드 지지체를 포함할 수 있으며, 상기 간 오가노이드는 상기 간 오가노이드 지지체에 부착되거나 상기 지지체 내에 함유된다. 일 측면에서, 생체인공 간 시스템은 생체외 간 대사 기능을 제공할 수 있으며, 구형체적으로 시스템은 신체의 외부에 적어도 부분적으로 또는 실질적으로 위치한다. 일 측면에서, 생체인공 간 시스템은 구형체적으로 시스템이 신체 내부에 적어도 부분적으로 또는 실질적으로 위치하는 생체내 간 대사 기능을 제공할 수 있다. 일 측면에서, 시스템에 사용되는 간 오가노이드는, 간 오가노이드는 생물학적 유체로부터 단방향으로 담즙을 흡수할 수 있다는 것을 특징으로 할 수 있다. 생물학적 유체는 예를 들어 혈액 또는 혈장 또는 이들의 조합일 수 있다. 일 측면에서, 생물학적 유체는 혈액일 수 있고, 생체인공 간 시스템은 시스템이 이식된 개체에게 간 기능을 제공하기 위해 생체내 이식될 수 있다.
특정 상황에서, 구상체가 시스템의 간 오가노이드 집단에 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 일 측면에서, 간 오가노이드 대 간 구상체의 비율은 1:1을 초과하여 대부분의 구상체/오가노이드 집단이 오가노이드를 포함한다. 예를 들어, 생체인공 간 시스템은 약 10 % 미만의 간 구상체, 또는 약 5 % 미만의 간 구상체, 또는 약 1 % 미만의 간 구상체, 또는 실질적으로 간 구상체가 없는 간 오가노이드/간 구상체 집단을 포함할 수 있다.
개시된 시스템에 유용한 개시된 간 오가노이드는 전구체 세포, 예를 들어 배아 줄기 세포 및/또는 다분화능 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 간 오가노이드는 그 기능을 특징으로 할 수 있다. 특히, 간 오가노이드는 적어도 30일, 또는 적어도 45일, 또는 적어도 50일, 또는 적어도 60일 동안, 또는 60일 초과 동안 지속되는 담즙 청소 기능을 가질 수 있다.
간 지원 시스템
간 오가노이드가 수용/부착/함유되는 지원 시스템은 다양한 다른 형태를 취할 수 있으며, 이러한 특징의 수정은 당업자의 기술 내에 있을 것이다. 예를 들어, 일 측면에서, 지원 시스템은 복수의 간 오가노이드를 수용하도록 구성된 저장 챔버를 포함할 수 있다. 지원 시스템은 양방향 또는 단방향 유체 유동을 허용하도록 막에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다른 측면에서, 지원 시스템은 혈액 분리 카트리지, 목탄 칼럼, 수지 칼럼 및 투석 막 중 하나 이상을 포함하는 알부민 투석 시스템과 함께 사용될 수 있다. 지원 시스템은 챔버 또는 저장소를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 간 오가노이드는 자유 유동이고, 상기 간 오가노이드는 약 106 내지 약 1010, 또는 약 107 내지 약 109의 농도로, 약 500 mL의 부피로 존재할 수 있다. 일 측면에서, 간 오가노이드 농도는 약 500 mL에서 약 1×106 내지 약 5×106, 또는 약 3×106일 수 있다. 지원 시스템은 현탁액에 간 오가노이드를 수용하는 챔버를 포함할 수 있으며 상기 간 오가노이드 현탁액을 혼합할 수 있는 메커니즘을 추가로 포함할 수 있다. 간 오가노이드 지지 시스템은 투과성 매체에 의해 분리된 2개의 유체 경로를 포함할 수 있고, 상기 2 개의 유체 경로 사이의 연통은 투과성 매체를 가로 지르고, 상기 투과성 매체는 간 오가노이드를 포함하고, 간 오가노이드는 상기 투과성 매체와 결합된다. 일 측면에서, 투과성 매체는 중공 섬유를 포함할 수 있다. 일 측면에서, 지원 시스템은 임상 등급 재료 (즉, 생물학적 물질과 반응하지 않는 것)를 포함할 수 있고 전체적으로 또는 부분적으로 비면역성 재료를 포함할 수 있다.
추가 측면에서, 간부전을 가지고 있는 개체를 치료하는 방법이 개시된다. 특정 측면에서, 본 방법은 (생물학적 기능이 손상되었는지 여부에 관계없이) 필요로 하는 개체를 본 명세서에 개시된 생체인공 간 시스템으로 치료하는 것을 포함할 수 있다. 치료는 의료 전문가에 의해 결정된 기간 동안 수행될 수 있지만 일반적으로 필요로 하는 개체에게 유리한 치료 반응을 제공하기에 충분한 기간 동안 수행된다. 일 측면에서, 지원 시스템은 투석 시스템과 조합하여 개체에게 제공될 수 있다.
간 오가노이드
개시된 방법 및 생체인공 간 시스템과 함께 사용하기에 적합한 간 오가노이드가 본 명세서에 기재되어 있다. 일 측면에서, 본 개시내용에 유용한 간 오가노이드는 간 조직에 의해 발현되는 것으로 알려진 특정 유전자의 발현을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 간 오가노이드는 PROX1, RBP4, CYP2C9, CYP3A4, ABCC11, CFH, C3, C5, ALB, FBG, MRP2, ALCAM, CD68, CD34, CD31에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 추가 측면에서, 간 오가노이드는 특정 단백질 예컨대 알파-태아단백 (AFP), 알부민 (ALB), 레티놀 결합 단백질 (RBP4), 사이토케라틴 19 (CK19), 간세포 핵 인자 6 (HNF6), 및 사이토크롬 P450 3A4 (CYP3A4), HNF4a, E-카드헤린, DAPI, 및 Epcam을 발현시킬 수 있다. 이러한 발현은 예를 들어 발달 간 오가노이드의 40일 내지 50일에 발생할 수 있다. 상기 언급된 유전자/단백질의 발현 수준은 인간 간 세포, 예를 들어 성인 간 세포에서 관찰되는 것과 유사할 수 있다. 일 측면에서, 간 오가노이드는 적어도 10,000 ng/mL 1xe6 세포/24 시간의 총 간 단백질 발현을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 개시내용에 유용한 간 오가노이드는 또한 그 구조를 특징으로 할 수 있다. 간 오가노이드는 내재화된 미세융모 및 간엽 세포를 추가로 포함하는 내강 구조를 포함할 수 있다. 간 오가노이드의 내강 구조는 분극화된 간세포와 기저막으로 둘러싸일 수 있다. 간 오가노이드는 기능성 성상 세포 및 기능성 쿠퍼 세포를 포함할 수 있다. 일 측면에서, 간 오가노이드는 약물 대사 사이토크롬 변이체, 예를 들어 CY2C9*2 변이체를 포함하는 세포를 포함할 수 있다. 간 오가노이드는 US 20160177270에 기재된 것과 같은 맥관계통을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 간 오가노이드는, 간 오가노이드는 염증 세포, 예를 들어 T-세포 또는 다른 염증성 분비 단백질을 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 개시내용에 유용한 간 오가노이드는 또한 그 기능을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 간 오가노이드는 다음 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다: 담즙 생산 능력, 담즙 수송 활성, 적어도 50 ng/mL/1xe6 세포/24hr의 보체 인자 H 발현, 적어도 40 ng/mL/1xe6 세포/24hr의 보체 인자 B, 적어도 1000 ng/mL/1xe6 세포/24hr의의 C3 발현; 적어도 1000 ng/mL/1xe6 세포/24hr의 C4 발현, 적어도 1,000 ng/mL/1xe6 세포/24hr의의 피브리노겐 생산 및 적어도 1,000 ng/mL/1xe6 세포/24hr의 알부민 생산. 일 측면에서, 간 오가노이드는 생물학적 유체로부터 단방향으로 담즙을 흡수할 수 있으며, 바람직하게는 상기 생물학적 유체는 혈액 또는 혈장으로부터 선택된다. 3D 응집된 간 세포가 보고되었지만, 개시된 조성물은 알부민 생산과 같은 매우 높은 기능적 활성 (iPSC 유래 간세포를 사용하는 기존의 최고 표준 모델에 비해 최대 10배 증가)을 가지며 개선된 산소 및/또는 내부 내강 구조로 인한 영양 공급으로 훨씬 더 긴 배양이 가능하다 (일부 경우 최소 60일 초과). 일 측면에서, 본 명세서에 사용된 간 오가노이드는 적어도 30일, 또는 적어도 45일, 또는 적어도 50일, 또는 적어도 60일, 또는 60일 초과 동안 담즙 청소 기능을 갖는다.
개시된 간 오가노이드는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 전구체 세포, 바람직하게는 다분화능 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 전구체 세포는 본 명세서에 기술된 방법에 사용될 수 있은 임의의 세포를 포함 하나 이에 제한되지 않으며, 이를 통해 하나 이상의 전구체 세포가 자체 재생하거나 하나 이상의 특화된 세포 유형으로 분화하는 능력을 획득한다. 일부 측면에서, 전구체 세포는 다분화능이거나 다분화능이 되는 능력을 갖는다. 일부 구현예에서, 전구체 세포는 다분화능을 획득하기 위해 외부 인자(예를 들어, 성장 인자)의 처리를 받는다. 일부 구현예에서, 전구체 세포는 전분화능 (또는 전능성) 줄기 세포; (유도된 또는 비-유도된) 다분화능 줄기 세포; 다능성 줄기 세포; 협능성 줄기 세포 및 단분화능 줄기 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 전구체 세포는 배아, 유아, 아동 또는 성인으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 전구체 세포는 유전적 조작 또는 단백질/펩타이드 처리를 통해 다분화능이 부여되도록 처리되는 체세포일 수 있다. 또한, 상이한 세포주의 전구체 세포의 혼합물, 정상 세포와 유전적 변형 세포의 혼합물 또는 둘 이상의 종 또는 조직 출처의 세포 혼합물이 간부전 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 세포는 당업계에 공지된 CRISPR 방법을 포함하는 자발적, 화학적 또는 바이러스 방법을 사용하여 제한없이 유전적으로 변형될 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 불멸, 동종성 감소 또는 분화된 간세포 기능과 같은 특성을 나타낼 수 있다.
일 측면에서, 간 오가노이드는 담즙산을 단방향으로 흡수하는 상기 간 오가노이드의 능력을 향상시키기에 충분한 시간 동안 기저막 매트릭스에서 배양될 수 있다. 그 다음, 배양된 간 오가노이드를 생체인공 간 시스템에 이식할 수 있다. 개시된 시스템을 위한 개시된 간 오가노이드를 제조할 때, 간 오가노이드가 담즙산을 단방향으로 흡수할 수 있을 때까지 MatrigelTM과 같은 개시된 간 오가노이드 기저막 매트릭스를 배양하는 것이 유리할 수 있다.
간 오가노이드를 제조하는 방법
간 오가노이드를 제조하는 방법은 출원인에 의해 기재되었다. 예를 들어, WO2018085615A1(Takebe, "간 오가노이드 조성물 및 이의 제조 및 사용 방법")을 참조한다. 일 측면에서, iPSC 세포로부터 간 오가노이드의 형성을 유도하는 방법이 개시된다. 이 방법은 a) 구상체를 형성하기에 충분한 시당, 바람직하게는 약 1일 내지 약 3일의 기간 동안 iPSC 세포로부터 유래된 최종 내배엽 (DE)을 FGF 경로 활성제 및 GSK3 억제제(이는 Wnt 신호 전달 경로 활성제로서 역할을 함)와 접촉시키는 단계 및 b) 간 오가노이드를 형성하기에 충분한 시간 동안, 바람직하게는 약 1 내지 약 5 일의 기간, 바람직하게는 약 4일 동안 레틴산 (RA)의 존재에서 단계 a의 생성된 후측 전장(posterior foregut) 구상체를 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 간 오가노이드는 예를 들어 PCT/US2018/027585에 개시된 방법을 사용하여 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 특히, 일 측면에서, iPSC 유래 전장은 오가노이드 형성 전에 동결 조건, 예를 들어 약 -80℃에 적용될 수 있다. 일 측면에서, iPSC 유래 전장은 단일 세포로서 (세포 클러스터와 대조적으로) 동결 조건에 적용될 수 있다.
오가노이드 형성 효율은 냉동된 단일 세포에서 형성될 때 개선되는 것으로 출원인에 의해 입증되었다. 예를 들어, PCT/US2018/027585를 참조한다. 이러한 방법은 본 명세서에 개시된 간 지원 시스템과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 출원인은 iPSC 유래 전장 세포로부터 간 오가노이드를 얻는 동결 방법을 발명하였다. 동결 및 해동 결과, 단세포 단리 세포의 생존율은 클러스터 조건 세포보다 상당히 높았다. 특히, iPSC 유래 전장 세포를 동결하면 단리된 단일 세포에서보다 효율적인 오가노이드 형성이 가능하다. 이러한 방법은 본 명세서에 기재된 간 오가노이드 및/또는 시스템의 제조를 개선하기 위해 본 개시내용과 함께 사용될 수 있다.
섬유아세포 성장 인자 (FGF)는 혈관형성, 상처 치유 및 배아 발생에 관여하는 성장 인자의 계열이다. FGF는 헤파린 결합 단백질이며 세포 표면 관련 헤파 란 설페이트 프로테오글리칸과의 상호 작용은 FGF 신호 전달에 필수적인 것으로 밝혀졌다. 적합한 FGF 경로 활성제는 당업자에 의해 쉽게 이해될 것이다. 예시적인 FGF 경로 활성제는 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, 및 FGF23으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 분자를 비제한적으로 포함한다. 일부 구현예에서, FGF 신호 전달 경로와 관련된 세포 구성성분을 표적화하는 siRNA 및/또는 shRNA는 이들 경로를 활성화하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, DE 배양은 10 ng/ml 이상; 20 ng/ml 이상; 50 ng/ml 이상; 75 ng/ml 이상; 100 ng/ml 이상; 120 ng/ml 이상; 150 ng/ml 이상; 200 ng/ml 이상; 500 ng/ml 이상; 1,000 ng/ml 이상; 1,200 ng/ml 이상; 1,500 ng/ml 이상; 2,000 ng/ml 이상; 5,000 ng/ml 이상; 7,000 ng/ml 이상; 10,000 ng/ml 이상; 또는 15,000 ng/ml 이상의 농도에서 본 명세서에 기재된 FGF 신호전달 경로의 하나 이상의 분자로 처리된다. 일부 구현예에서, 신호전달 분자의 농도는 치료 내내 일정하게 유지된다. 다른 구현예에서, 신호전달 경로의 분자 농도는 치료 과정 동안 변한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 신호전달 분자는 DMEM 및 태아 소 세린 (FBS)을 포함하는 배지에 현탁된다. FBS는 2% 이상; 5% 이상; 10% 이상; 15% 이상; 20% 이상; 30% 이상; 또는 50% 이상의 농도일 수 있다. 당업자는 본 명세서에 기재된 레지멘이 FGF 신호전달 경로의 임의의 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 조합으로 본 명세서에 기재된 신호전달 경로의 임의의 공지된 분자에 적용될 수 있음을 이해할 것이다.
적합한 GSK3 억제제는 당업자에 의해 쉽게 이해될 것이다. 예시적인 GSK3 억제제는 예를 들어 GSK3β를 억제하는 Chiron/CHIR99021을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 당업자는 개시된 방법을 수행하기에 적합한 GSK3 억제제를 인식할 것이다. GSK3 억제제는 약 1 μM 내지 약 100 μM, 또는 약 2 μM 내지 약 50 μM, 또는 약 3 μM 내지 약 25 μM의 양으로 투여될 수 있다. 당업자는 적당한 양 및 지속기간을 쉽게 인정할 것이다. Wnt 신호전달 경로 활성제는 개시된 GSK3 억제제를 대체할 수 있다. 이러한 치환은 당업계에서 이해되고 있으며, 당업자에 의한 일상적인 실험에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
일 측면에서, 줄기 세포는 포유류 또는 인간 iPSC일 수 있다. 전술한 바와 같이, 예를 들어, 상표명 매트리겔로 판매되는 상업적으로 입수가능한 기저막 매트릭스와 같은 기저막 매트릭스에 전장 구상체가 매립될 수 있다.
생체인공 간 시스템
일 측면에서, 생체인공 간 시스템은 필요로 하는 개체에게 간 대사 기능을 제공할 수 있으며, 상기 간 대사 기능은 생체인공 간 시스템을 사용하여 제공되며, 상기 생체인공 간 시스템은 필요한 개체에게 생체외에 적어도 부분적으로 위치한다. 일 측면에서, 생체인공 간 시스템은 필요로 하는 개체에게 간 대사 기능을 제공할 수 있으며, 상기 생체인공 간 시스템은 필요로 하는 개체에 대해 적어도 부분적으로 생체내에 위치한다. 이러한 기능은, 예를 들어 간 보조 장치와 함께 기재된 간 오가노이드의 통합에 의해 수행될 수 있다. 간 보조 장치 당업계에 알려진 임의의 장치의 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 생체인공 간 시스템(간 보조 장치)은 다양한 상이한 형태, 예를 들어, US 9650609, US20120009086, WO1992007615A1, US20030228685A1에 기재된 것을 취할 수 있고, 상기 생물학적 기능은 적어도 부분적으로 간 오가노이드 조성물에 의해 제공된다. 예를 들어, 간 보조 장치는 본 명세서에 기재된 바와 같은 간 오가노이드 조성물을 포함하는 생물 반응기를 포함할 수 있으며, 간 오가노이드는 세포 구획 및/또는 세포 저장소 내에 위치하며, 선택적으로 추가 세포 유형 및/또는 구상체로 보충된다. 간세포 또는 간에 존재 하는 다른 세포는 내피 세포, Ito 세포, 쿠퍼 세포 및 섬유아세포와 같은 간 오가노이드 외에도 시스템에 포함될 수 있다. 이들 또는 다른 유형의 세포 중 하나 이상과 간세포의 공동 배양은 또한 생체인공 간 시스템/간 보조 장치에서 사용될 수 있다.
기재된 간 오가노이드 시스템과 함께 사용될 수 있은 시스템의 추가 예에는 분자 흡착제 재순환 시스템 또는 "MARS"시스템(Gambro Americas, Lakewood, CO), 혈장 분리 흡착 및 투석 시스템(Prometheus, Fresenius Medical Care, Bad Homburg, Germany), 단일 통과 알부민 투석 (SPAD) 및 선택적 혈장 여과 요법 (SEPET). 다른 시스템에는 단일 통과 알부민 투석 (SPAD), 혈액으로부터의 환자 혈장의 체외 분리 및 제거 및 대체 유체가 있는 혈구를 환자에게 반환하는 것을 수반하는 치료용 혈장 교환 (TPE), 체외 간 보조 장치 (ELAD), AMC-BAL 장치, 구상체 저장소 생체인공 장치 (SRBAL), 헤파 세정(Hepa Wash), Li-ALS, 및 University College London-간 투석 장치 (UCL-LDD)를 포함한다.
일 측면에서, 개시된 간 오가노이드와 함께 사용되는 시스템은 MARS 장치이다. MARS는 이중 회로 시스템으로 구성되어 있다. 한 회로에는 혈액투과여과기가 있고 다른 회로에는 알부민 결합 독소의 수용체로 알부민이 포함되어있어 수용성 및 친유성 분자를 모두 제거할 수 있다. 분별된 혈장 분리 및 흡착 시스템(Prometheus)도 이중 회로 시스템이며 알부민 투과성 폴리설폰 막으로 분리된 혈액 회로와 혈장 회로로 구성된다. 혈장 분획은 음이온 교환기 및 알부민 결합 독소가 직접 정제되는 중성 수지를 포함하는 흡수제로 전달되는 반면, 혈액 회로는 수용성 독소를 제거하기 위해 고유량 투석에 노출된다.
일 측면에서, 간 오가노이드는 혈장 관류를 위해 설계된 중공 섬유의 3D 네트워크에 배치될 수 있다. 간 오가노이드는, 환자의 혈장이 미세 다공성 막을 통해 간 오가노이드와 만나도록 투석 카트리지와 함께 간 오가노이드를 사용하여 가장 널리 사용되는 BAL 장치인 HepatAssistTM 시스템(Alliqua Inc., Langhorne, PA, USA)과 함께 사용될 수 있다.
일 측면에서, 간 오가노이드는 체외 간 보조 장치 (ELAD®; Vital Therapies Inc., 미국 캘리포니아 주 샌디에이고)와 함께 사용될 수 있으며, 상기 간 오가노이드는 간 효소 활성을 제공할 수 있다. 다른 본 명세서에 기재된 간 오가노이드와 함께 사용될 수 있는 다른 디자인은 Amsterdam Medical Center 생체인공 간, "AMC-BAL" (Center, Amsterdam, Netherlands) 및 MELS (Modular Extracorporeal Liver Support System,
Figure pct00001
, Berlin, Germany)를 포함한다.
일 측면에서, 간 오가노이드는 Excorp Meical (Minneapolis, MN)에 의해 생체인공 간 지원 시스템(BLSSTM)과 함께 사용될 수 있고, 단일 중공 카트리지 중 일차 돼지 간세포는 본 명세서에서 기재된 간 오가노이드로(전체적으로 또는 부분적으로) 치환될 수 있다.
상기 언급된 시스템은 McKenzie 등 "Artificial and Bioartificial Liver Support," Seminars, Liver Disease, Vol. 28, No. 2 (2008)에 기재되어 있고, 이는 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
일 측면에서, 본 명세서에 기재된 간 오가노이드는 US 9,650,609(Nyberg, 2014년 6월 17일 출원); US2012/0009086 (Nyberg, 2010년 3월 12일 출원, PCT/US91/07952 (Shatford 등, 1992년 5월 14일 공개)에 기재된 장치와 함께 사용될 수 있고, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 예를 들어, 간 기능을 돕는 섬유아세포 또는 다른 세포 유형이 기재된 경우, 본 명세서에 기재된 간 오가노이드는 대체될 수 있다.
일반적으로, 개시된 시스템은 간 오가노이드 지지체와 함께 간 오가노이드 ("복수의 오가노이드"를 포함함)를 사용할 수 있으며, 조합은 간 기능을 보조하기 위해 생체인공 간 지원 시스템에서 이용된다. "간 오가노이드 지지체"란 상기 언급된 시스템 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 카트리지 또는 중공 섬유의 형태로, 또는 간 지원 시스템의 일부로서 간 오가노이드를 제공하기 위한 기질 역할을 하는 대체 형태로, 간 오가노이드 (들)가 간 기능을 돕기에 충분한 생물학적 유체와 접촉할 수 있도록 하는 방식으로 간 오가노이드를 부착, 함유 또는 어떤 방식으로 배향할 수 있는 임의의 기질 또는 용기를 의미한다. 간 오가노이드 지지체의 예는, 비제한적으로, 중공 섬유 예컨대 US 2011/0218512, 카트리지에 기재된 것을 포함하고, 원하는 임의의 형상, 예컨대 원통형 형상, 실질적으로 평면 형상, 또는 이의 임의의 변형을 취할 수 있다. 일 측면에서, 간 오가노이드 지지체는 간 오가노이드 (들)를 원하는 구성으로 유지한다. 일 측면에서, 간 오가노이드 지지체는 간 오가노이드를 수용하도록 구성된 저장 챔버를 포함할 수 있다. 간 오가노이드 지지체는 특정 측면에서 양방향 유체 유동을 가능하게 하기 위해 막에 작동가능하게 연결될 수 있고/있거나 단방향 유체 유동을 가능하게 하기 위해 멤브레인에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
일 측면에서, 본 명세서에 기재된 생체인공 간 시스템은 혈액 분리 카트리지, 목탄 칼럼, 수지 칼럼, 및 투석 막 중 하나 이상을 포함하는 알부민 투석 시스템과 함께 사용될 수 있다.
일 측면에서, 간 오가노이드 지지체는 챔버 또는 저장소를 포함할 수 있으며, 상기 간 오가노이드는 챔버 내에서 자유롭게 유동하거나 이동할 수 있다. 간 오가노이드 지지체는 현탁액에 간 오가노이드를 수용하는 챔버를 포함할 수 있고 상기 간 오가노이드 현탁액을 혼합할 수 있는 메커니즘을 추가로 포함할 수 있다.
일 측면에서, 간 오가노이드 지지체는 투과성 매체에 의해 분리된 2 개의 유체 경로를 포함할 수 있으며, 상기 2 개의 유체 경로 사이의 연통은 투과성 매체를 가로 지르고, 상기 투과성 매체는 간 오가노이드를 포함할 수 있고, 간 오가노이드는 투과성 매체와 연관될 수 있다. 일 측면에서, 투과성 매체는 중공 섬유 예컨대 US20150273127A1 (Flieg 등, 2012년 11월 26일 출원)에 기재된 것을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 간 오가노이드 지지체는 임상 등급 및 비-면역원성일 수 있다.
일 측면에서, 생체인공 간 시스템은 간 오가노이드 및 생체재료를 포함할 수 있다. 생체재료는 하이드로겔일 수 있다. 일 측면에서, 생체재료는 콜라겐, 알기네이트, 피브린, 젤라틴, 알기네이트-피브린 하이드로겔, 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔, 콜라겐-알기네이트 하이드로겔, 피브로겐-알기네이트 하이드로겔, 콜라겐-알기네이트-피브린 (CAF) 하이드로겔, 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 개시된 시스템과 사용될 수 있는 예시적인 물질에 대해, 예를 들어, Montalbano 등, Synthesis of bioinspired collagen/alginate/fibrin-based hydrogels for soft tissue engineering, Materials Science and Engineering, Volume 91, 1 October 2018, 페이지 236-246를 참조한다.
오가노이드 성장 배지
일 측면에서, 간 오가노이드의 성장 및/또는 간 장치 시스템 내에서 사용하기 위해 사용되는 배지는 다음을 포함하는 고급 DMEM/F12를 포함할 수 있다: B27(예를 들어, 약 1-5%, 또는 약 2% B27), N2 보충물(예를 들어, 약 0.1 내지 약 5%, 또는 약 1% N2 보충물), Gultamaz(예를 들어, 약 0.1% 내지 약 10%, 또는 약 1% Gultamaz), HEPES(예를 들어, 약 0.1% 내지 약 10%, 또는 약 1% HEPES), 아스코르브산(예를 들어, 약 5 내지 약 100 ug/mL 아스코르브산, 또는 약 50ug/mL 아스코르브산), FGF2(예를 들어, 약 1 내지 약 100 ng/mL, 또는 약 5ng/mL FGF2), VEGF(예를 들어, 약 1mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 또는 약 10mg/mL VEGF), EFG(예를 들어, 약 1 ng/mL 내지 약 100 nm/mL, 또는 약 20 ng/mL EGF), CHIR99021 또는 다른 FGF 신호전달 경로 활성제(예를 들어, 약 1-50 μM CHIR99021, 또는 약 3uM CHIR99021), 및 A83-01(예를 들어, 약 0.01 내지 약 1 μM, 또는 약 0.5 μM A83-01). 일 측면에서, 오가노이드 성장 배지는 상기 열거된 양의 약 절반 내지 상기 열거된 양의 약 2 배, 또는 상기 열거된 양의 약 1/4 내지 약 3 배의 양으로 상기 열거된 성분 각각일 수 있다.
치료 방법
일 측면에서, 선택적으로 손상된 간 기능 예를 들어, 간부전을 가지고 있는 개체를 치료하는 방법이 개시되되, 상기 방법은 추가로 투석 시스템과 함께, 본 명세서에 기재된 생체인공 간 시스템(본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되는, "BAL" 또는 "간 보조 장치")을 필요로 하는 개체에게 제공하는 단계를 포함한다. 용어 "간부전"은 간이 정상적인 생리학의 일부로서 정상적인 합성 및 대사 기능을 수행할 수 없는 것을 의미한다. 따라서 간부전은 예를 들어 알부민의 불충분한 해독으로 이어지며, 그 후 알부민의 결합 능력이 고갈되고 그렇지 않은 경우 알부민에 결합된 독소, 예를 들어 비접합 빌리루빈이 풍부해진다. 치료는 예를 들어 빌리루빈 농도가 >10 mg/dL에서 나타난다. 그러나 간 투석 치료가 지시되지만, 증가된 빌리루빈 수준을 특징으로 하지 않는 간 장애가 있다. 사용된 "간부전"이라는 표현과 관련된 장애는 간신장 증후군, 보상되지 않은 만성 간 질환, 급성 간부전, 간 이식 후 이식편 기능 장애, 간 수술 후 간부전, 이차 간부전, 다기관 부전, 외인성 중독 또는 담즙정체증의 난치성 가려움증 등을 비제한적으로 포함한다.
실시예
간 오가노이드 제조 방법
간 오가노이드로의 분화. DE를 간 오가노이드로 분화시키기 위해 세 가지 방법을 사용할 수 있다: 각각이 아래에 기재되어 있는 "매트리겔 드롭 방법", "매트리겔 샌드위치 방법", 및 매트리겔-무함유 방법".
매트리겔 드롭 방법: 7 내지 8일째에, 플레이팅된 세포가 있는 최종 내배엽 오가노이드를 부드럽게 피펫팅하여 접시에서 적층분리하였다. 단리된 구상체를 800rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거한 후, 접시 상의 100 % 매트리겔 드롭에 포매시켰다. 플레이트 5 내지 15분 동안 5 % CO2/95% 공기의 분위기 하에 37℃에서 넣었다. 매트리겔이 고형화된 후 고급 DMEM/F12에 B27, N2 및 레틴산 (RA; Sigma, St. Louis, MO) 2μM을 1 내지 5일 동안 첨가하였다. 배지를 격일로 교체하였다. RA 처리 후, 매트리겔 방울에 포매된 오가노이드를 10 ng/mL 간세포 성장 인자 (HGF; PeproTech, Rocky Hill, NJ), 0.1 μM 덱사메타손 (Dex; Sigma) 및 20ng/mL 온코스타틴 M (OSM; R&D Systems)과 함께 간세포 배양 배지 (HCM Lonza, Walkersville, MD)에서 배양하였다. 세포 분화를 위한 배양을 5% CO2/95% 공기의 분위기에서 37℃로 유지하였고 배지를 3일마다 교체하였다. 20 내지 30일째에, 매트리겔 방울에 포매된 오가노이드를 모든 분석을 위해 스크래치 및 온화한 피펫팅으로 단리하였다.
매트리겔 방울 방법을 사용하는 예
매트리겔 방울을 사용하여 다수의 기능적 HLO를 생성할 수 있다. 인간 iPSC 계통은 최종 내배엽 (DE), 그 다음 후측 전장 (PFG)로 분화될 수 있다. 다음으로, 분화된 세포는 50 내지 70ul 매트리겔 방울 (3D)에 포매될 수 있다. 간세포 배양 배지 (HCM)를 사용하는 성숙 단계에서 2주 후에, 각 매트리겔 방울은 약 100 개의 HLO를 생성한다. 이러한 HLO는 ALB, AFP 및 RBP4를 고도로 발현시킨다 (도 4, 패널 A). HLO의 생산을 더 확대하기 위해, 마이크로웰-메쉬 플레이트는 사용되어 균일한 크기의 구상체를 생성할 수 있다. 이 마이크로웰-메쉬 플레이트는 직경이 500um이고 깊이가 100um인 마이크로웰이 포함되어 있어 다수의 구상체를 효율적으로 형성할 수 있다. 구상체는 HCM과 함께 회전 벽 용기 생물반응기 (RWV)로 옮겨질 수 있다. 도 4, 패널 B는 오가노이드 형성을 보여준다.
예시적인 프로토콜은 아래와 같다:
PFG 단일 세포를 EZSPHERETM 6개의 웰 마이크로웰-메쉬 플레이트에 씨딩한다. (이는 다른 마이크로웰 플레이트 예컨대 AggrewellTM, Elplasia 등에 의해 대체될 수 있다). 2x10^6 세포/웰을 고급 DMEM+RA+Rock 억제제로 씨딩한다. 접시를 160g에서 1분 동안 부드럽게 회전시킨다. 플레이트를 37C, 5% CO2에서 밤새 인큐베이터에 넣는다.
둘째 날에, 구형체는 관찰되어야 한다. 배지를 상하로 피펫팅한 후, 구형체를 15ml 튜브에 수집한다. 6 웰 플레이트 내의 각각의 웰은 대략 2000개의 구형체를 생성할 수 있다. 전체 플레이트에 대해, 약 12000개의 구형체가 생성될 것이다.
구형체 모두가 바닥으로 침강될 때까지 구형체 및 배지 혼합물이 5분 동안 벤치 상에 안착되게 한다. 모든 배지를 흡인한다. 매질을 변화시키고, 10%의 매트리겔과 혼합한다. 모든 구형체 및 배지를 회전 벽 용기 생물반응기(RWV) (RWV 또는 동등 시스템은 다수 판매인 예컨대 JTEC corporation, Synthecon, SATAKE, 및 ABLE로부터 상업적으로 입수가능함)로 옮긴다. 37C에서 5% CO2로 인큐베이션하였다. 3일마다 배지를 변화시킨다. 간 오가노이드는 14일 후에 형성될 것이다.
매트리겔 샌드위치 방법: 7 내지 8일째에, 플레이팅된 세포가 있는 최종 내배엽 오가노이드를 부드럽게 피펫팅하여 접시에서 적층분리하였다. 단리된 구상체를 800rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거한 후, 100 % 매트리겔과 혼합하였다. 동시에, 모든 보충물을 갖는 간세포 배양 배지를 동일한 부피의 100 % 매트리겔과 혼합하였다. HCM 및 매트리겔 혼합물을 접시의 바닥에 플레이팅하여 플레이트 상에 두꺼운 코팅(0.3 내지 0.5 cm)을 만들었고, 15분 내지 30분 동안 5% CO2/95% 공기의 분위기에서 37℃에서 넣었다. 매트리겔이 고형화된 후, 매트리겔과 혼합된 구상체를 두꺼운 코팅 플레이팅된 매트리겔 상에 씨딩하였다. 플레이트를 5분 동안 5% CO2/95% 공기의 분위기에서 37℃에서 넣었다. 고급 DMEM/F12에 B27, N2 및 레틴산 (RA; Sigma, 미주리 주 세인트루이스) 2μM을 1 내지 5일 동안 첨가하였다. 배지를 격일로 교체하였다. RA 처리 후, 매트리겔 방울에 포매된 오가노이드를 10 ng/mL 간세포 성장 인자 (HGF; PeproTech, Rocky Hill, NJ), 0.1 μM 덱사메타손 (Dex; Sigma) 및 20ng/mL 온코스타틴 M (OSM; R&D Systems)과 함께 간세포 배양 배지 (HCM Lonza, Walkersville, MD)에서 배양하였다. 세포 분화를 위한 배양을 5 % CO2/95 % 공기의 분위기에서 37℃로 유지하였고 배지를 3일마다 교체하였다. 20 내지 30일째에, 매트리겔 방울에 포매된 오가노이드를 모든 분석을 위해 스크래치 및 온화한 피펫팅으로 단리하였다.
매트리겔-무함유 방법: 7 내지 8일째에, 플레이딩된 세포가 있는 최종 내배엽 오가노이드를 4일 동안 B27 (Life Technologies) 및 N2 (Gibco, Rockville, MD) 레틴산 (RA; Sigma, 미주리 주 세인트루이스) 2 μM와 함께 고급 DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific Inc.)에서 계속 평면 배양하였다. 배지를 격일로 대체하였다. 4일 동안 평면 배양 후, 오가노이드는 출아하기 시작하는 반면, 2D 세포는 간세포로 분화한다. 오가노이드 및 간세포 둘 다는 10일 동안 10 ng/mL 간세포 성장 인자 (HGF; PeproTech, Rocky Hill, NJ), 0.1 μM 덱사메타손 (Dex; Sigma) 및 20 ng/mL 온코스타틴 M (OSM; R&D Systems)과 함께 간세포 배양 배지 (HCM Lonza, Walkersville, MD) 하에 10일 초과 동안 유지될 수 있다. 오가노이드 검정에 대해, 부유 오가노이드는 초저 부착 멀티웰 플레이트 6 웰 플레이트에서 수집될 수 있고, 적절할 때마다 후속 분석을 위해 사용될 수 있다. 세포 분화를 위한 배양을 5% CO2/95% 공기의 분위기에서 37℃에서 유지하였고, 배지를 3일마다 대체하였다.
실시예: 분극된 간 오가노이드의 생성 및 특성화
BMP 및 액티빈 A는 이전에 기재한 대로 최종 내배엽으로의 분화를 촉진하는 데 사용된다 (D'Amour 등, 2005). 다분화능 세포(예를 들어, iPSC 또는 ESC)로부터 최종 내배엽을 생산하기 위한 임의의 방법이 본 명세서에 기재된 방법에 적용 가능하다. 예시적인 방법은, 예를 들어, "Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation", US9719068B2(Wells 등), 및 "Methods and systems for converting precursor cells into gastric tissues through directed differentiation", US20170240866A1(Wells 등)에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 다분화능 세포는 상실배로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 다분화능 줄기 세포는 줄기 세포이다. 이러한 방법에 사용되는 줄기 세포는 배아 줄기 세포를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 배아 줄기 세포는 배아 내부 세포 덩어리 또는 배아 생식선 융기에서 유래할 수 있다. 배아 줄기 세포 또는 생식세포는 인간을 포함한 다양한 포유류 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 동물 종으로부터 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 배아 줄기 세포를 사용하여 최종 내배엽을 생성한다. 일부 구현예에서, 인간 배아 생식 세포를 사용하여 최종 내배엽을 생성한다. 일부 구현예에서, iPSC는 사용하여 최종 내배엽을 생성한다. 본 발명에서 사용될 수 있은 DE 세포를 획득하거나 생성하기 위한 추가 방법은 미국 특허 번호 7,510,876 (D'Amour 등); 미국 특허 번호 7,326,572 (Fisk 등); Kubo1 등, 2004, "Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture," Development 131:1651-1662; D'Amour 등, 2005, "Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm," Nature Biotechnology 23:1534-1541; 및 Ang 등, 1993, "The formation and maintenance of the definitive endoderm lineage in the mouse: involvement of HNF3/forkhead proteins," Development 119:1301-1315에 기재된 것을 비제한적으로 포함하고, 이들 모두는 본 명세서에 전체가 참조로 포함된다.
FGF4, 및 GSK3 억제제 (CHIR99021)는 전장 구상체 및 발아된 구상체를 유도하는 데 사용된다. 오가노이드는 온화한 피펫팅으로 접시에 플레이딩된 간엽 세포로 적층분리 후 매트리겔에 포매된다. 담즙 수송 모델링에 적합한 분극된 오가노이드를 생성하기 위해, 오가노이드는 RA로 처리된다. 오가노이드 생성 방법을 최적화하기 위해, RA 처리가 다양할 수 있다. 알부민 분비 수준에 기초한 4 일의 RA 지속기간이 일반적으로 사용된다. RA 처리 약 10일 후에, 상피 세포로 덮인 300 개 초과의 오가노이드가 성공적으로 생성될 수 있으며 루멘화된 구조를 갖는 오가노이드의 비율은 약 70 %이다. 생성된 오가노이드는 상피 세포에서 알부민 양성이며, 유형 IV 콜라겐은 외부 표면에 국한되고 ZO-1 (폐쇄 소대)은 내강내 벽을 염색한다.
수득한 오가노이드의 세포는 분화 동안 간 마커 유전자 예컨대 알파-태아단백 (AFP), 알부민 (ALB), 레티놀 결합 단백질 4 (RBP4), 사이토케라틴 19 (CK19), 담관세포 분화를 조절하는 간세포 핵 인자 6 (HNF6), 및 사이토크롬 P450 3A4 (CYP3A4)의 발현의 상당한 증가를 갖는다. 세포의 약 30 %는 간질 세포 마커 (미공개 관찰)에 의해 확인된 비간질 세포이며, 이는 오가노이드가 원발성 간세포보다 생체내 간 조직과 더 유사하게 한다.
간 오가노이드를 사용한 간 지원 시스템의 실시예
오가노이드 (HLO)는 특수 배지(부착된 제형)에서 3D 회전 생물반응기 (JTEC corporation (비제한적으로 JTEC 시스템))에서 무한정으로 성장될 수 있다. 마지막으로, 약 3×109　인간 간세포 등가 HLO는 반응기에서 수확되어 HLO-BAL 처리에 사용된다.
BAL 시스템
BAL 시스템은 세포 회로와 혈액 회로로 구성된다. BAL 시스템의 구성요소는 롤러 펌프, 헤파린 펌프, 혈장 필터 (Sorin Group　Italia, Mirandola, Italy), 혈장 구성요소 분리기 (Kawasumi Laboratories　Inc,　Tokyo, Japan), 및 폴리카보네이트 스캐폴드를 갖는 다층 평판 생물반응기를 포함한다. 이전에 보고된 바와 같이 (Han 등, 2012;　Shi 등, 2011), 혈장 구성요소 분리기 내의 막은 우수한 생체 적합성을 가진 에틸렌 비닐 알코올 공중합체 수지로 만들어진다. 막의 기공 크기는 10 nm (~200 KD)이다. 막 분자량 컷오프는 IgG, IgM 감소에 있어서 높은 성능을 나타내었으며, 이의 침착은 심각한 이종반응성 항체 반응을 감소시킬 수 있고 표적 물질을 또한 효과적으로 제거할 수 있다 (Han 등, 2012; Shi 등, 2011).
보고된 바와 같이 (Shi 등, 2012), 다층 생물반응기는 중공 컬럼 스텐트와 65-층 원형 평판의 스택으로 구성되며, 이들 모두는 폴리카보네이트로 만들어진다. 인접한 플레이트 사이의 채널 높이는 각 플레이트의 바닥에 부착된 스페이서와 함께 0.5mm로 유지된다. HLO는 연동 펌프에 의해 작은 구멍을 통해 생물 반응기에 이식된다. 생물반응기의 높이는 약 10cm이고 유효 부피는 480ml이다. 새로 수확된 hiHep 세포를 HMM으로 운반하였다. 세포는 플레이트의 표면에 부착하고 BAL 처리를 위한 준비가 될 때까지 전체 생물 반응기를 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양되었다.
본 명세서 전반에 걸쳐 주어진 모든 최대 수치 제한은 마치 그러한 더 낮은 수치 제한이 여기에 명시적으로 쓰여진 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서 전반에 걸쳐 주어진 모든 최소 수치 제한은 마치 그러한 더 높은 수치 제한이 여기에 명시적으로 쓰여진 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함할 것이다. 본 명세서 전반에 걸쳐 주어진 모든 수치 범위는 마치 그러한 더 좁은 수치 범위가 모두 여기에 명시적으로 쓰여진 것처럼 그러한 더 넓은 수치 범위 내에 속하는 모든 더 좁은 수치 범위를 포함할 것이다.
본 명세서에 개시된 치수 및 값은 인용된 정확한 수치로 엄격하게 제한되는 것으로 이해되어서는 안 된다. 대신, 달리 명시되지 않는 한, 각각의 그러한 차원은 언급된 값과 해당 값을 둘러싼 기능적으로 동등한 범위를 모두 의미한다. 예를 들어, "20 mm"로 개된 치수는 "약 20mm"를 의미한다.
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본 발명의 특정 구현예가 예시되고 설명되었지만, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 다른 변경 및 수정이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위 내에 있는 그러한 모든 변경 및 수정을 첨부된 청구범위에서 포함하도록 의도된다.

Claims (22)

  1. 간 오가노이드 및 간 오가노이드 지지체를 포함하는 생체인공 간 시스템("BAL" 또는 "간 보조 장치")으로서, 상기 간 오가노이드는 상기 간 오가노이드 지지체에 부착되거나 그 지지체 내에 함유되는, 생체인공 간 시스템.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 생체인공 간 시스템은 생체외 간 대사 기능을 제공하는, 생체인공 간 시스템.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 생체인공 간 시스템은 간 대사 기능을 제공하는, 생체인공 간 시스템.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 오가노이드는 생물학적 유체로부터 단방향으로 담즙을 흡수하고, 바람직하게는 상기 생물학적 유체는 혈액 또는 혈장 중 하나 또는 둘 모두인, 생체인공 간 시스템.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 유체는 혈액이고, 그리고 상기 생체인공 간 시스템은 생체내 이식되는, 생체인공 간 시스템.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체인공 간 시스템은 약 10% 미만의 간 구상체, 또는 약 5% 미만의 간 구상체, 또는 약 1% 미만의 간 구상체를 갖거나, 간 구상체가 실질적으로 없는 간 오가노이드 집단을 포함하는, 생체인공 간 시스템.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 오가노이드는 내강을 포함하는, 생체인공 간 시스템.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 오가노이드는 전구체 세포, 바람직하게는 배아 줄기 세포 및 다분화능 줄기 세포 중 하나 또는 둘 모두로부터 유래되는, 생체인공 간 시스템.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 오가노이드는 적어도 30일, 또는 적어도 45일, 또는 적어도 50일, 또는 적어도 60일 동안, 또는 60일 초과 동안 담즙 청소능 기능을 갖는, 생체인공 간 시스템.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 오가노이드는 담즙산을 단방향으로 흡수할 수 있을 때까지 기저막 매트릭스에서 배양되는, 생체인공 간 시스템.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 오가노이드 지지체는 상기 간 오가노이드를 원하는 구성으로 유지할 수 있는, 생체인공 간 시스템.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 오가노이드 지지체는 간 오가노이드를 수용하도록 구성된 저장소 챔버를 포함하는, 생체인공 간 시스템.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 오가노이드 지지체는 양방향 유체 유동을 허용하도록 막에 작동가능하게 연결되는, 생체인공 간 시스템.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 오가노이드 지지체는 단방향 유체 유동을 허용하도록 막에 작동가능하게 연결되는, 생체인공 간 시스템.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체인공 간 지지체는 혈액 분리 카트리지, 목탄 칼럼, 수지 칼럼 및 투석막 중 하나 이상을 포함하는 알부민 투석 시스템과 함께 사용되는, 생체인공 간 시스템.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 오가노이드 지지체는 챔버 또는 저장소를 포함하고, 상기 간 오가노이드는 자유-유동이고, 바람직하게는 상기 간 오가노이드는 약 106 내지 약 1010, 또는 약 107 내지 약 109의 농도로, 약 500 mL의 부피로 존재하는, 생체인공 간 시스템.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 오가노이드 지지체는 현탁액에 상기 간 오가노이드 수용 챔버를 포함하고, 상기 간 오가노이드 현탁액을 혼합할 수 있는 메카니즘을 추가로 포함하는, 생체인공 간 시스템.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 오가노이드 지지체는 투과성 매체에 의해 분리된 2개의 유체 경로를 포함하고, 상기 2개의 유체 경로 사이의 연통은 상기 투과성 매체를 가로지르고, 상기 투과성 매체는 간 오가노이드를 포함하고, 상기 간 오가노이드는 상기 투과성 매체와 관련되는, 생체인공 간 시스템.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투과성 매체는 중공 섬유를 포함하는, 생체인공 간 시스템.
  20. 청구항 1 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 오가노이드 지지체는 임상 등급의 것이고 상기 간 오가노이드 지지체는 비-면역원성의 것인, 생체인공 간 시스템.
  21. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체인공 간 시스템은 추가로 투석 시스템과 함께 필요로 하는 개체에게 제공되는, 생체인공 간 시스템.
  22. 간부전을 가지고 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항의 생체인공 간 시스템으로 상기 개체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
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