JP2016052314A - 放射線架橋化されたコラーゲンゲルの製造方法と使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
Y−;Glycineは継続反復的に、X、Yは変わる構成)連結されている。
されて現在までも使われている。
ップと、水溶化されたコラーゲンに酵素としてパパインを0.5〜1%添加し、0.5〜4時間の間処理して分子量が各々10,000〜5,000dalton、5,000〜3,000dalton、3,000〜1,000daltonの合わせ型オリゴペプチドに分画させるステップとを含むことを特徴とする、放射線照射による豚皮コラーゲンの水溶性オリゴペプチドの製造方法を提供する。
(第1ステップ;豚皮コラーゲンの水溶化技術)
豚皮コラーゲンの水溶化は豚皮に付いている挟雑物(過度な脂肪及び不純物)を除去した後に水洗する工程と、水洗した豚皮を適当なサイズに細切して超音波を用いて粗粉砕する工程と、粗粉砕された豚皮を50〜300kGyで放射線照射して試料の5〜10倍量(W/V)の0.10MのNaCl溶液、以下、好ましくは0.05〜0.1MのNaCl溶液の塩濃度で湧出する工程で構成される。この際、水溶化の適正条件は100kGy以上で表れた。既存の方法は多量の酸とアルカリの化学物質を使用しなければならないことに反して、酸または塩を使用しなくても非常に高い収率(既存の4倍以上)の水溶性低分子物質を生産することができる。
放射線処理した豚皮にパパインのような加水分解酵素を添加して水溶化成分を分離するものである。放射線処理した豚皮に0.5〜1%のパパインを添加して0.5〜4時間の間処理すれば、従来の方法より低分子化が早く起こるようにする工程と、低分子化された成分は限外濾過法を用いて分子量別に分画する工程と、各々の分画されたペプチド成分を凍結乾燥して豚皮コラーゲン由来合わせ型オリゴペプチドを製造する工程とを含む。
信頼性を大幅向上させて消費者をしてよいイメージを植え付けることができるようにした放射線架橋化されたコラーゲンゲル及びその製造方法と使用方法を提供することにある。
線を用いたコラーゲン架橋が可能である。
るものと知られている。
要求される物性への剤形化等により、創傷被覆、化粧品、及び再生医学など、多様な分野でバイオティッシュ(Bio-Tissue)概念として使われている。物理的架橋により形成されたゲルは人体に有害な化学的架橋剤を使用しないので、医療用材料として注目されている。このような方法により製造された製品は、製品化し易く、人間及び環境に安全な物質形態であり、多様な剤形化が可能であるという長所がある。
ン架橋物質を製造することを特徴とする。
(W/V)、及びハイドロキシアパタイト(Hydroxyapatite)3%(W/V)を各々混合後、ガンマ線を照射して架橋させて製造することができる。
)(M.W.=2,000K)3%(W/V)、コンドロイチンサルフェート(Chondroitin sulfate)3%(W/V)を各々混合後、ガンマ線を照射して架橋させて製造できる
ことは勿論である。
(W/V)グリセリンとコラーゲン、6%(W/V)コラーゲンとPBSを各々混合した後、ガンマ線を照射して架橋させ、かつ前記PBS成分は最終体積の1mL当たり燐酸ナトリウム(2.8mg)と塩化ナトリウム(7.6mg)が含まれて放射線架橋化されたコラーゲンゲルを製造できるようになる。
(第1実施形態)
A.放射線照射量、5−40kGyに従う3%〜10%コラーゲンの架橋化程度分析
目的:コラーゲン濃度とガンマ線照射線量に従う物性分析
[方法]
1)濃度3%、6%、10%のコラーゲンをコンテナ(container)に用意する。
2)各々のコラーゲンは5、25、40kGyの線量でガンマ線照射する。
3)各条件別の架橋化されたコラーゲンの物性分析を進行する。
A)性状(透明度、ゲル化傾向)を肉眼確認する。
B)ハイドロゲルの収縮率(体積減少率)を確認する。
C)物性測定機を用いてゲル強度(最大応力)を確認する。
−機器:レオメータ(Rheo meter CR-500DX)
−条件:測定項目(ゲル強度)、進入距離(2.5mm)、テーブルスピード(50mm/min)、アダプタ(No.1φ15mm)
D)分解性をコラーゲナーゼ条件で残留日数にて確認する。
−コラーゲナーゼ濃度:0.1mg/mL in PBS
E)架橋されたコラーゲンを凍結乾燥後の重量と水化させた後の重量とを比較して水分含有量(含水可溶比)を分析する。
1)性状:透明なゲル状(40kGyでは弱い黄色を帯びる)
2)収縮率(体積減少率)(%)=(ガンマ照射された検体の総重量(g)−ゲル塊りの重量(g))/ガンマ照射された検体の総重量(g)×100
B.放射線照射量、5〜40kGyに従う3%−10%ゼラチンの架橋化程度分析
目的:ゼラチン濃度とガンマ線照射線量に従う物性を分析しようとする。
[方法]
1)濃度3%、6%、10%のゼラチンをコンテナ(container)に用意する。
2)各々のゼラチンは5、25、40kGyの線量でガンマ線照射する。
3)各条件別の架橋化されたゼラチンの物性分析を進行する。
A)性状(透明度、ゲル化傾向)を肉眼確認する。
B)ハイドロゲルの収縮率(体積減少率)を確認する。
C)物性測定機を用いてゲル強度(最大応力)を確認する。
−機器:レオメータ(Rheo meter CR-500DX)
−条件:測定項目(ゲル強度)、進入距離(2.5mm)、テーブルスピード(50mm/min)、アダプタ(No.1φ15mm)
D)分解性をコラーゲナーゼ条件で残留日数にて確認する。
−コラーゲナーゼ濃度:0.1mg/mL in PBS
E)架橋されたゼラチンを凍結乾燥後の重量と水化させた後の重量とを比較して水分含有量(含水可溶比)を分析する。
1)性状(透明度)
C.コラーゲンと合成高分子の混合物質の放射線架橋製造物
目的:コラーゲンと合成高分子の混合物質を混合して剤形化可能性を確認しようとする。
[方法]
1)コラーゲン3%と3%(w/v)プルロニック(pluronic)(F−127)、PEO(Polyethylen oxide、M.W.=100,000)1%及び3%ハイドロキシアパタイト(Hydroxyapatite)を各々混合後、ガンマ線(5、25kGy)架橋させる。
2)架橋化された混合物の物性分析を進行する。
A)性状(透明度、ゲル化傾向)を肉眼確認する。
B)ハイドロゲルの収縮率(体積減少率)を確認する。
C)物性測定機を用いてゲル強度(最大応力)を確認する。
−機器:レオメータ(Rheo meter CR−500DX)
−条件:測定項目(ゲル強度)、進入距離(2.5mm)、テーブルスピード(50mm/min)、アダプタ(No.1φ15mm)
D)分解性をコラーゲナーゼ条件で残留日数にて確認する。
−コラーゲナーゼ濃度:0.1mg/mL in PBS
E)架橋された混合物を凍結乾燥後の重量と水化させた後の重量とを比較して水分含有量(含水可溶比)を分析する。
1)性状(透明度)
D.コラーゲンと生体高分子の混合物質の放射線架橋製造物
目的:コラーゲンと生体高分子の混合物質を混合して剤形化可能性を確認しようとする。
[方法]
1)コラーゲン3%と3%ヒアルロン酸(Hyaluronic acid)(M.W.=2,000K
)と3%コンドロイチンサルフェート(Chondroitin sulfate)を各々混合後、ガンマ線
(5、25kGy)架橋させる。
2)架橋化された混合物の物性分析を進行する。
A)性状(透明度、ゲル化傾向)を肉眼確認する。
B)ハイドロゲルの収縮率(体積減少率)を確認する。
C)物性測定機を用いてゲル強度(最大応力)を確認する。
−機器:レオメータ(Rheo meter CR−500DX)
−条件:測定項目(ゲル強度)、進入距離(2.5mm)、テーブルスピード(50mm/min)、アダプタ(No.1φ15mm)
D)分解性をコラーゲナーゼ条件で残留日数にて確認する。
−コラーゲナーゼ濃度:0.1mg/mL in PBS
E)架橋された混合物を凍結乾燥後の重量と水化させた後の重量とを比較して水分含有量(含水可溶比)を分析する。
1)性状(透明度)
E.コラーゲンと化学物質の混合物質の放射線架橋製造物
目的:コラーゲンと化学物質の混合物質を混合して剤形化可能性を確認しようとする。[方法]
1)コラーゲン3%と1Xシリコーン原液(Dow corning、7−9800)、3%グリセ
リンとコラーゲン6%とPBSを混合後、ガンマ線(5kGy)架橋させる。PBS成分は最終体積の1mL当たり燐酸ナトリウム(2.8mg)と塩化ナトリウム(7.6mg)が含まれている。
2)架橋化された混合物の物性分析を進行する。
A)性状(透明度、ゲル化傾向)を肉眼確認する。
B)ハイドロゲルの収縮率(体積減少率)を確認する。
C)物性測定機を用いてゲル強度(最大応力)を確認する。
−機器:レオメータ(Rheo meter CR−500DX)
−条件:測定項目(ゲル強度)、進入距離(2.5mm)、テーブルスピード(50mm/min)、アダプタ(No.1φ15mm)
D)分解性をコラーゲナーゼ条件で残留日数にて確認する。
−コラーゲナーゼ濃度:0.1mg/mL in PBS
E)架橋された混合物を凍結乾燥後の重量と水化させた後の重量とを比較して水分含有量(含水可溶比)を分析する。
1)性状(透明度)
F.電子線を用いたコラーゲン架橋
目的:低線量を用いたコラーゲンの放射線架橋を通じた部分架橋化を誘導しようとする。部分架橋化されたコラーゲンを用いてゲル化溶液を混合して濃度及び線量に従う条件別にゲル化されることを確認する( 図9乃至図11)。
[方法]
1)0.5、1.0%濃度のコラーゲン溶液(pH3.0)を用意する。
2)1.0%コラーゲンは、0.1、0.5、1.0kGy電子線量を照射する。
3)0.5%コラーゲンは、0.5、1.0、3.0kGy電子線量を照射する。
4)電子線照射された検体の性状を比較する。
5)部分架橋された溶液とゲル化溶液とを混合してゲル化現象を観察する。
(ゲル化溶液:2.2g NaHCO3 0.05N NaOHを100mLとHEPESを200mM中)
A)ゲル化性状を肉眼及び分光測光器(Spectrophotometer)(410nm)で確認する。
B)物性測定機を用いてゲル強度(最大応力)を確認する。
G.電子線を用いたコラーゲン部分架橋化傾向確認
目的:電子線を用いてコラーゲンの部分架橋化されて高分子化されることを確認しようとする。
[方法]
1)1.0%濃度のコラーゲンを0.1、0.5kGy電子線量を照射する。
2)次のような条件で各検体をHPLC分析する。
A)機器:waters HPLC system
B)コラム:Ultrahydrogel 250、1000
C)サンプル濃度:0.1%(1mg/mL)
D)注入容量:50uL
E)流れ速度:1mL/min
F)分析時間:15分
H.放射線架橋されたコラーゲンのハイドロゲル化及び回復率、創傷被覆剤、化粧品(マスクパック)用途などへの使用可能性
目的:放射線架橋されたコラーゲンがハイドロゲル化に製造されることと、乾燥時、フィルム型に製造可能であることを確認しようとする。また、フィルム型に製造された剤形が水分を含まれて回復されることを確認しようとする。本実験はハイドロゲルの形態に適用するための基礎実験として進行しようとする。
[方法]
1)3%、6%コラーゲンをdishに用意する。
2)各々のコラーゲンは5、25kGyの線量でガンマ線照射する。
3)ハイドロゲル化されたコラーゲンを室温乾燥させる。
4)フィルム形態の弾性確認後、蒸溜水を含めてハイドロゲル化させて回復率を確認する。
[結果]
I.放射線架橋されたコラーゲンの移植材としての使用
目的:放射線架橋されたハイドロゲル剤形をパーティクル化して移植材として剤形化するか否かを確認しようとする。
[方法]
1)放射線架橋されたハイドロゲル剤形をホモゲナイザーを用いて粉砕する。
2)ハイドロゲルを粉砕する条件は、次の通りである。
A)機器:Homogenizer(IKA T25 digaital ultra-turrax)
B)粉砕条件:rpm=4.0−240.0、1/min×100
3)シリンジに充電させた後、注射針を装着して注射する。
J.放射線架橋化されたコラーゲンの熱安全性
目的:放射線架橋されたコラーゲンの熱による安全性を確認しようとする。この際、熱
による変性及び熱処理後、ハイドロゲルの特性を維持程度も確認する。
[材料及び実験条件]
1)材料:3%コラーゲン(pH3.0)
2)架橋条件:コラーゲン溶液、5kGy、25kGy、40kGy(ガンマ架橋)
3)熱処理条件:40、60、80℃(熱処理時間:1時間)
[方法]
1)放射線架橋されたコラーゲンを適当サイズに用意して重量測定する。
2)適当サイズに用意した架橋化コラーゲンを容器に入れて水槽で1時間の間各々の温度条件を加える。
3)温度加熱後、コラーゲンゲルの性状及び重量を確認する。
4)熱処理に従う重量変化を確認する。但し、架橋化されないコラーゲンの変性したか否かは冷蔵温度条件でゲル化されることによって確認する。
(残存率(%)−100−{(最初重量−熱処理重量)/最初重量*100})
5)変形されたコラーゲンゲルの水化したか否かを確認する。水化条件は水で1時間及び24時間の間進行する。
(回復含水率(%)=回復含水重量/コラーゲンハイドロゲル最初重量*100)
6)60℃条件では水が含まれた状態でゲル性状が変化したか否かを確認する。
[結果]
化を誘導し、かつ部分架橋化されたコラーゲンとゲル化溶液、そして細胞を相互混合して培養し、以後、前記培養された製造物を細かく粉砕して注射容器に入れて注入状の皮膚または骨の移植材に使用できるようにすることは勿論である。
ましい。
Claims (4)
- 化粧品成分と混合してハイドロゲルに使用したり、または化粧品成分をハイドロゲルに混合してマスクパックに使用したり、またはハイドロゲル創傷被覆剤に使用したり、または損傷された皮膚に使用したり、または皮膚移植に使用するための培養された製造物の製造方法において、
液状のコラーゲンに電子線を照射して、低線量を用いたコラーゲンの放射線架橋を通じて部分架橋化を誘導し、かつ部分架橋化されたコラーゲンとゲル化溶液を鋳型に注いでゲル化させた後、前記ゲル化させたゲルに細胞と培養液を注いでゲルの上に細胞を培養することを特徴とする、放射線架橋化されたコラーゲンゲルの使用方法。 - 膜に培養して眼球に移植して使用するための培養された角膜細胞の製造方法において、液状のコラーゲンに電子線を照射して、低線量を用いたコラーゲンの放射線架橋を通じて部分架橋化を誘導し、かつ部分架橋化されたコラーゲンはゲル化溶液と混合してゲルを形成し、前記ゲルを乾燥してフィルムのような薄膜を形成し、以後、前記膜に細胞と培養液を注いで細胞培養することを特徴とする、放射線架橋化されたコラーゲンゲルの使用方法。
- 注射容器に入れて注入状の皮膚または骨の移植材に使用するための培養された製造物の製造方法において、液状のコラーゲンに電子線を照射して、低線量を用いたコラーゲンの放射線架橋を通じて部分架橋化を誘導し、かつ部分架橋化されたコラーゲンとゲル化溶液、そして細胞を相互混合して培養し、以後、前記培養された製造物を細かく粉砕することを特徴とする、放射線架橋化されたコラーゲンゲルの使用方法。
- 前記ゲル化溶液は、炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)、水酸化ナトリウム(NaOH)、及びヘペス(HEPES)が混合されたものであることを特徴とする、請求項1乃至3のいずれかに記載の放射線架橋化されたコラーゲンゲルの使用方法。
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