KR20140117216A - 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재 - Google Patents

콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재 Download PDF

Info

Publication number
KR20140117216A
KR20140117216A KR1020130032386A KR20130032386A KR20140117216A KR 20140117216 A KR20140117216 A KR 20140117216A KR 1020130032386 A KR1020130032386 A KR 1020130032386A KR 20130032386 A KR20130032386 A KR 20130032386A KR 20140117216 A KR20140117216 A KR 20140117216A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
collagen
subcutaneous tissue
biomaterial
present
crosslinking
Prior art date
Application number
KR1020130032386A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101590313B1 (ko
Inventor
정종평
박윤정
이주연
김석화
Original Assignee
주식회사 나이벡
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 나이벡 filed Critical 주식회사 나이벡
Priority to KR1020130032386A priority Critical patent/KR101590313B1/ko
Publication of KR20140117216A publication Critical patent/KR20140117216A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101590313B1 publication Critical patent/KR101590313B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/10—Hair or skin implants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/20—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration

Abstract

본 발명은 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재에 관한 것으로, 보다 구체적으로 돼지에서 유래된 콜라겐의 구조를 안정화시켜 피하조직에 주입이 가능한 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법이 제공된다. 상기의 주입형 피하조직재생용 바이오소재는 피부를 구성하고 있는 단백질인 콜라겐으로 구성되어 있어, 피하조직재생 및 주름개선에 효과적이며, 성형외과 또는 피부과에서 사용할 수 있는 주름개선제, 조직증강제, 성형보조물로 이용할 수 있다.

Description

콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재{Injectable collagen biomaterials for subcutaneous tissue regeneration}
본 발명은 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 돼지에서 유래된 콜라겐의 구조를 안정화시켜 피하조직에 주입이 가능한 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법에 관한 것이다.
콜라겐은 힘줄, 뼈, 치아, 피부 및 내부 장기를 지지하는 층(sheet)을 비롯한 신체의 많은 구조를 형성하는 단백질이다. 콜라겐은 삼중 나선으로 감긴 3개의 사슬로 이루어지는데, 이는 3개의 아미노산의 반복부로부터 나온다. 나선에서 모든 3번째 아미노산은 글리신이며, 대부분의 나머지 아미노산은 프롤린 또는 히드록시프롤린이다. 콜라겐은 한동안 상업적 및 임상적으로 사용되어 왔다. 현재, 콜라겐은 경질 또는 연질 결합 조직, 예를 들어 피부, 힘줄, 연골, 뼈 및 세포외기질을 대체하거나 확장하는데 사용될 수 있다. 동물의 다양한 조직으로부터 콜라겐을 분리하여(대한민국 특허등록공보 제10-06762850000호), 그 콜라겐 조성물들이 조직재생용 생체재료로 사용되고 있다(Remi et al., Materials, 1863-1887, 3(3), 2010). 현재, 보다 편리한 투여를 위해 주사가능한 콜라겐 제제가 이용가능한데, 자이덤(Zyderm), 자이플라스트(Zyplast), 코스모덤(Cosmoderm) 및 코스모플라스트(Cosmoplast)를 비롯한 몇몇 주사가능한 콜라겐 조성물이 시판되고 있다(Allergan Corporation, 미국). 각각의 콜라겐 조성물은 특정 기술에 사용하기 위한 이점 또는 단점일 수 있는 특정한 물리적 특성을 가진다. 자이덤과 자이플라스트는 소에서 추출한 콜라겐을 사용하였기 때문에, 사용 전에 과민반응여부를 미리 테스트해야 하는 불편한 점이 있다. 또한 자이덤의 경우, 생체내에서 6개월 이내에 분해된다. 따라서, 유지기간을 증가시키기 위해 글루타르알데하이드로 가교시킨 자이플라스트가 개발되었으나, 잔류 가교제에 의한 생체적합성이 감소될 수 있다는 문제가 있다. 코스모덤과 코스모플라스트는 사람의 섬유아세포를 배양하여 추출한 콜라겐을 사용하였기 때문에, 면역반응을 일으킬 우려는 없으나 가격이 매우 비싸고 생체 내에서 유지기간이 4개월 정도밖에 되지 않는다. 따라서, 상기와 같은 문제점을 해결하여 이용가능한 조성물의 선택을 확대할 필요성이 당업계에 남아 있다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, 기존 소에서 유래한 콜라겐보다 생체적합성이 높은 돼지에서 유래한 콜라겐을 사용하였고, 콜라겐의 구조를 안정화시켜 피하조직에 주입이 가능한 피하조직재생용 바이오소재를 제공하여, 주입의 편리성, 주름개선에 대한 높은 치료효과를 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 돼지에서 유래된 콜라겐의 구조를 안정화시켜 가교율이 5~30%이고 가교된 콜라겐이 총 바이오소재에 대하여 2.0~4.0 ㎎/㎖인 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 콜라겐을 용해하여 중성화시키는 단계; (b) 상기 중성화된 콜라겐을 환원당 또는 디알데하이드계 화합물을 이용하여 가교시키는 단계; (c) 상기 가교된 콜라겐을 균질화시키는 단계; (d) 상기 균질화된 콜라겐의 구조를 안정화시키는 단계; 및 (e) 상기 안정화된 콜라겐을 멸균시키는 단계를 포함하는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의하여 제조되고, 가교율이 5~30%이며, 총 바이오소재에 대한 가교된 콜라겐의 함량이 2.0~4.0 ㎎/㎖인 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재를 제공한다.
본 발명에 따른 주입형 피하조직재생용 바이오소재는 피부를 구성하고 있는 단백질인 콜라겐으로 구성되어 있어, 피하조직재생 및 주름개선에 효과적이며, 성형외과 또는 피부과에서 사용할 수 있는 주름개선제, 조직증강제, 성형보조물 등으로 이용될 수 있다.
도 1은 가교제로 환원당을 사용한 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재 사진이다.
도 2는 수산화인회석 입자가 첨가된 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 사진이다.
도 3은 시료주입 4주 후, 주름이 유발된 무모 마우스의 사진과 주름 유발 부위의 리플리카 사진이다.
도 4는 시료주입 4주 후, 주름 유발 부위의 리플리카의 이미지를 분석하여 전체주름 면적의 변화율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 시료주입 4주 후, 주름 유발 부위의 조직표본을 헤마토자일린-이오신(H&E)으로 염색하여 광학현미경으로 관찰한 사진이다.
도 6은 시료주입 4주 후, 주름 유발 부위의 조직표본의 진피 두께를 측정한 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 돼지에서 유래된 콜라겐의 구조를 안정화시켜 피하조직에 주입이 가능한 피하조직재생용 바이오소재의 제조를 시도하였다. 그 결과 본 발명의 바이오소재는 피부를 구성하고 있는 단백질인 콜라겐으로 구성되어 있어, 피하조직재생 및 주름개선에 효과적이라는 것을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 가교도가 낮을수록 분해율이 높아지며, 가교제로 디알데하이드 계열을 사용하였을 때 환원당 계열을 사용하였을 때보다 분해율이 낮다는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 서로 다른 다섯 부위의 진피층의 두께의 평균을 측정하여 피하조직의 재생정도를 평가한 결과, 본 발명의 바이오소재를 주입한 경우 진피층 두께의 수치가 높은바 피하조직재생과 주름개선에 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 콜라겐을 용해하여 중성화시키는 단계; (b) 상기 중성화된 콜라겐을 환원당 또는 디알데하이드계 화합물을 이용하여 가교시키는 단계; (c) 상기 가교된 콜라겐을 균질화시키는 단계; (d) 상기 균질화된 콜라겐의 구조를 안정화시키는 단계; 및 (e) 상기 안정화된 콜라겐을 멸균시키는 단계를 포함하는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계 후 가교제 중 미반응 가교제를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c)단계 후 균질화된 콜라겐을 충진하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 방법에 의하여 제조된 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 콜라겐은 돼지에서 유래된 텔로펩타이드를 제거한 type Ⅰ 콜라겐인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 가교제는 환원당 계열 또는 디알데하이드 계열을 사용하였으나, 이는 당업자에게 공지된 임의의 가교제일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 환원당 계열은 알도스, 케토스, 알도스의 유도체, 케토스의 유도체, 글리세로스, 트레오스, 에리트로스, 릭소스, 자일로스, 아라비노스, 리보스, 알로스, 알트로스, 글루코스, 프룩토스, 만노스, 글로스(gulose), 아이도스(idose), 갈락토스, 탈로스, 글리세랄 알데하이드, D-리보스-5-포스페이트 또는 글루코사민으로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 한다. 실시예에서 예시된 것뿐만 아니라 다른 환원당을 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 디알데하이드 계열은 글라이옥살, 메틸글라이옥살, 석신디알데하이드, 말론디알데하이드 또는 프탈알데하이드로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 한다. 실시예에서 예시된 것뿐만 아니라 다른 디알데하이드를 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계에 생물유래 골미네랄, 합성 수산화인회석, 탄산인회석, 트리칼슘인산 또는 모노칼슘인산으로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 수산화인회석 입자를 추가하는 것을 특징으로 한다. 실시예에서 예시된 것뿐만 아니라 다른 수산화인회석을 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 중량 기준으로 콜라겐의 양의 0.4~4.0배의 환원당을 추가하는 것을 특징으로 한다. 0.4배 미만일 경우에는 가교반응이 잘 일어나지 않으며, 4.0배를 초과하는 경우에는 가교율이 30%를 초과하여 30게이지로 주입하기에 용이하지 않게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 중량 기준으로 콜라겐의 양의 0.3~3.0배의 디알데하이드를 추가하는 것을 특징으로 한다. 0.3배 미만일 경우에는 가교반응이 잘 일어나지 않으며, 3.0배를 초과하는 경우에는 가교율이 30%를 초과하여 30게이지로 주입하기에 용이하지 않게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계에서 가교율이 5~30%인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 10~20%의 가교율을 가진다. 가교율이 5% 미만인 경우에는 분해효소인 트립신에 의해 쉽게 분해되므로, 원하는 정도의 생체 지속성을 얻기 어려우며, 가교율이 30%를 초과하는 경우에는 점도가 높아 피하조직에 주입이 용이하지 않다. 또한 가교율이 낮은 경우 멸균 후 점도가 감소하여 물리적 성질이 변화될 염려가 있다. 가교율은 전체 콜라겐 함량 중 가교에 참여한 콜라겐 함량의 백분율을 의미하는 것으로, 농도와 반응시간을 조절하여 가교율을 조절할 수 있다. 가교율의 측정은 히드록시프롤린(hydroxyproline) 정량과 같은 당업계에서 공지된 분석법을 통해 용이하게 시행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d)단계에서 동결과 해동을 반복함으로써, 가교된 콜라겐 체인의 배열을 정렬시킨다. 동결과 해동은 5~10회 실시하는 것이 바람직하다. 동결과 해동을 5회 미만으로 실시할 경우, 구조를 안정시키는 작용이 충분치 않아 가교된 콜라겐 용액의 점도가 상승하지 않는다. 또한, 10회를 초과할 경우에는 점도의 증가가 더 이상 일어나지 않는다. 보통 감마선과 전자빔에 의해 고분자의 가교 또는 체인의 절단이 일어나게 되어, 고분자의 물성이 변하는데, 특히 단백질인 콜라겐의 경우, 구조의 변성이 쉽게 일어난다. 본 발명의 (d)단계는 다음 단계인 멸균과정에서 감마선 또는 전자빔에 의해 가교된 콜라겐의 물성이 변하는 것을 막아준다.
본 발명에 있어서, 상기 가교된 콜라겐이 총 바이오소재에 대하여 2.0~4.0 ㎎/㎖인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 2.5~3.5 ㎎/㎖로 포함한다. 2.0 ㎎/㎖미만으로 포함하는 경우에는 원하는 정도의 생체 지속성을 얻을 수 없으며 점도가 낮아 주입이 용이하지 않다. 또한 4.0 ㎎/㎖를 초과하여 포함하는 경우에는 점도가 지나치게 높아져 조직 내 주입이 어려워질 수 있다.
본 발명에 있어서, 리도카인 등과 같은 국소마취제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이로써 본 발명의 바이오소재 주입시 통증을 감소시킬 수 있다. 리도카인 등과 같은 국소마취제는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재 총 중량에 대하여 0.1~0.4%(w/w) 포함된다. 0.1%(w/w) 미만으로 포함될 경우, 국소마취의 효과가 충분하지 않으며, 0.4%(w/w)를 초과하여 포함하는 경우에는 국소마취의 유효농도보다 높기 때문이다. 나머지 성분은 인산염완충액을 첨가한다.
본 발명에 있어서, 상기 (g)단계에서 감마선 또는 전자빔으로 멸균하는 것을 특징으로 한다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예 1 : 콜라겐의 용해 및 중성화
돼지에서 유래한 텔로펩타이드를 제거한 type Ⅰ콜라겐을 2%농도로 0.1M 염산용액에 용해한 후, 1M 수산화나트륨 용액을 가하여 중성으로 조절하였다.
실시예 2 : 가교 반응
2-1 : 환원당을 사용하는 경우
환원당을 사용하는 경우, 콜라겐 양의 0.4배 (0.1 M), 2.0배 (0.5M) 및 4.0배 (1M) 글루코오스를 인산염 완충액에 용해시키고, 37℃에서 7일간 방치하였다. 글루코오스 인산염 완충액을 중성화된 콜라겐 용액에 가하고, 20℃에서 10일간 반응시켰다. 환원당은 알도스, 케토스, 알도스의 유도체, 케토스의 유도체, 글리세로스, 트레오스, 에리트로스, 릭소스, 자일로스, 아라비노스, 리보스, 알로스, 알트로스, 글루코스, 프룩토스, 만노스, 글로스(gulose), 아이도스(idose), 갈락토스, 탈로스, 글리세랄 알데하이드, D-리보스-5-포스페이트 또는 글루코사민으로 구성된 군 중에서 하나 이상을 선택하여 사용하였다(미국등록특허 제4971954호).
2-2 : 디알데하이드 계열을 사용하는 경우
디알데하이드 계열을 사용하는 경우, 콜라겐 양의 0.3배 (1%), 1.5배 (5%) 및 3.0배 (10%) 메틸글라이옥살이 혼합된 인산염 완충액을 중성화된 콜라겐 용액에 가하고, 20℃에서 24시간 반응시켰다. 디알데하이드는 글라이옥살, 메틸글라이옥살, 석신디알데하이드, 말론디알데하이드 또는 프탈알데하이드로 구성된 군 중에서 하나 이상을 선택하여 사용하였다(Chong et al., J. Biol . Chem ., 282, 8510-8520, 2007).
비교예 1 : 글루탈알데히드(glutaraldehyde)를 사용하는 경우
글루탈알데히드(glutaraldehyde)를 사용하는 경우, 10% 글루탈알데히드(glutaraldehyde) 인산염 완충액을 중성화된 콜라겐 용액에 가하고, 20℃에서 24시간 반응시켰다.
실시예 3 : 미반응 가교제의 제거
미리 세척해둔 투석막 (3500Da의 분자량 컷-오프)으로 밀봉하여 0.01 M PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)에 48시간 동안 투석하여 미반응된 가교제를 제거하였다. 투석액에 펠링시약 반응을 하여 침전이 생기지 않을 때까지 투석하였다. 펠링시약과 투석액을 혼합하고 100℃에서 10분간 가열하였을 때, 붉은 침전이 생성되지 않아야 한다.
실시예 4 : 가교된 콜라겐의 균질화
4-1 : 균질화
가교된 콜라겐을 호모게나이저(T-18 basic, IKA)로 8,000 rpm으로 5분간 균질화한 후, 45 μm pore size 체를 통과시키고, 울트라필트레이션 (30kDa의 분자량 컷-오프, Amicon, Millipore, USA)을 사용하여 가교된 콜라겐이 총 바이오소재에 대하여 2.0~4.0 ㎎/㎖로 포함되게 하였다.
4-2 : 수산화인회석 ( hydroxyapatite ) 입자 첨가에 의한 균질화
수산화인회석 입자를 첨가하여 피하조직의 심부에 주입한 후 체내 지속성을 연장할 수 있다. 수산화인회석 입자는 소뼈, 말뼈, 돼지뼈와 같은 생물유래 골미네랄, 합성 수산화인회석, 탄산인회석, 트리칼슘인산 또는 모노칼슘인산에서 선택하여 사용할 수 있다.
5% 메틸글라이옥살로 가교된 콜라겐의 균질화 단계에서 15-30μm 크기의 소뼈에서 유래된 수산화인회석 입자를 콜라겐 중량의 10%, 20% 및 30% 첨가하여 균질화하였다.
실시예 5 : 충진
피하조직에 주입이 용이하도록 시린지에 충진하였다. 주사바늘은 26 내지 30 게이지를 사용하였다.
실시예 6 : 구조 안정화
영하 190℃에서 2시간, 20℃에서 30분을 방치하는 것을 5회 내지 10회 반복하여 가교된 콜라겐 체인의 배열을 정렬시켜 구조를 안정화시켰다. 동결과 해동을 5회 미만으로 실시할 경우, 구조를 안정시키는 작용이 충분치 않아 가교된 콜라겐 용액의 점도가 상승하지 않는다. 또한, 10회를 초과할 경우에는 점도의 증가가 더 이상 일어나지 않는다. 동결과 해동을 반복함으로써, 가교된 콜라겐 체인의 배열을 정렬시키며, 구조가 안정되는 것은 점도와 탄성계수의 증가로 확인이 가능하다(표 4). 이 과정은 그 다음 단계인 멸균과정에서 감마선 또는 전자빔에 의해 가교된 콜라겐의 물성이 변하는 것을 막아준다.
실시예 7: 멸균
멸균단계는 동결된 상태로 5-15kGy의 감마선 또는 전자빔으로 멸균한다. 5kGy 이하일 경우 멸균이 충분하지 않으며, 15kGy 이상일 경우 물성에 변화를 줄 수 있다.
실험예 1 : 가교도, 탄성계수 및 점도의 측정
실시예 2-1과 실시예 2-2의 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 가교도를 히드록시프롤린(hydroxyproline) 정량으로 측정하였다.
시료는 5mg을 칭량하여 5N HCl 1ml을 첨가하여 100℃에서 10시간 가열하여 가수분해하였다. 히드록시프롤린 표준물질을 사용하여 검량선을 측정하였다. 표준물질과 시료에 1% 페놀프탈레인 한 방울을 첨가하고, 0.1 N KOH와 0.8 N KOH로 pH를 조정하여 옅은 핑크색이 되도록 하였다. 0.1M 붕산나트륨 완충액(sodium borate buffer) (pH 8.7)를 각 시료에 0.5ml씩 첨가하고 혼합하였다. 0.2M 클로라민 T 용액(chloramine T solution) 2ml를 첨가하고 상온에서 25분 동안 반응시켰다. 3.6M 티오황산나트륨(sodium thiosulfate) 1.2ml를 첨가하고, 1.5ml KCl과 2.5ml 톨루엔을 첨가하였다. 원심분리하여 상층의 톨루엔 층을 제거하고, 끓는 물에서 30분 동안 중탕한 후, 상온에서 냉각하였다. 2.5 ml 톨루엔을 첨가하고, 원심분리한 후, 상층의 톨루엔 층을 1.5ml을 취해 새로운 튜브에 담았다. 엘리히 시약(Ehrlich’s reagent)을 0.6ml 첨가하고, 30분 동안 반응시켰다. 2개의 층으로 나눠지지 않도록 계속 뒤섞었다(mixing). 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
멸균된 각 조성물에 대해 유변물성 실험을 실시하였다(Ghosh et al., Biomacromolecules, 2857-2865, 2005). AR 2000 controlled stress rheometer(T.A Instruments Ltd., USA) 장비와 4-cm, 2°원뿔-평판(cone and plate) 기하학을 이용하여 1% 변형률(strain) 및 진동 방식(oscillation mode)으로 0.1-20 Hz까지 측정하였으며, 3 Hz에서 측정된 탄성계수(G')값을 하기 표 3에 나타내었다. 장비의 편차는 ±10% 이며, 25℃에서 실험은 진행되었다. 점도는 Brookfield DV-Ⅱ PRO (Brookfield Cone/plate Viscometer)를 사용하여, 온도 20±2℃, 0.5rpm에서 측정하였다.
실시예 2-1 및 2-2의 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 가교도를 각각 표 1 및 표 2에 나타내었다. 또한 실시예 2-1, 2-2 및 4-2의 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 탄성계수 및 점도를 각각 표 1, 표 2 및 표 3에 나타내었다.
실시예 2-1 및 실시예 2-2의 가교제인 환원당과 디알데하이드의 농도가 증가할수록 가교도가 증가하였으며, 가교도가 증가함에 따라 탄성계수와 점도가 증가하였다. 그러나 실시예 4-2의 수산화인회석 입자의 함량이 높아질수록 탄성계수와 점도가 감소하였다.
실시예 2-1의 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재 중 환원당 농도 0.1M을 사용하여 가교하고, 실시예 6의 동결, 해동 횟수를 변화시켜 그에 따른 탄성계수와 점도의 변화를 표 4에 나타내었다.
실시예 2-1의 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 가교도, 탄성계수 및 점도
콜라겐에 대한
환원당의 비율		 가교도 (%) 탄성계수
( G' , Pa at 3 Hz ) 		점도
( cps : centipoise stoke )
4 7 210 21000
20 16 440 29000
40 25 580 32000
80 38 740 40000
비교예 1 100 1500 142000
실시예 2-2의 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 가교도, 탄성계수 및 점도
콜라겐에 대한
메틸글라이옥살의 비율		 가교도 (%) 탄성계수
( G' , Pa at 3 Hz ) 		점도
( cps : centipoise stoke )
3 10 330 23000
15 24 590 33000
30 29 630 39000
60 42 840 58000
실시예 4-2의 수산화인회석이 첨가된 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 탄성계수 및 점도
수산화인회석 입자의 함량 (%) 탄성계수
( G' , Pa at 3 Hz ) 		점도
( cps : centipoise stoke )
10 340 31000
20 280 27000
30 210 22000
실시예 6의 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 탄성계수 및 점도
동결 해동 횟수 탄성계수
( G' , Pa at 3 Hz ) 		점도
( cps : centipoise stoke )
0 320 21000
3 332 21600
5 320 28500
10 490 30000
13 500 30500
실험예 2 : 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 생체 외 분해시험
본 발명의 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 생체 내 지속성을 예측하기 위하여, 실시예 2-1 및 실시예 2-2의 콜라겐으로 구성된 바이오소재 조성물에 대해 트립신에 의한 분해시험을 수행하였다.
실시예 2-1 및 실시예 2-2의 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재를 각 시약병(vial)에 동일한 질량으로 담았다. 여기에 20% 트립신(trypsin, Sigma-Aldrich)을 포함한 0.2 M PBS(=pH 6.2)를 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 48시간 동안 반응시켰다. 그 후, 상등액을 완전히 제거하고 잔류하는 콜라겐의 질량을 측정하였다. 가교물의 분해정도는 48시간 후의 잔류하는 가교물과 본래의 가교물의 질량비율 (%)로 산출하고, 분해율(degradation, %)을 측정하였다. 비교예 1의 분해율을 0%로 정하고, 나머지 실시예의 분해율을 하기 표 5에 나타내었다.
가교도가 낮을수록 분해율이 높아지는 경향을 보였으며, 실시예 2-1보다는 실시예 2-2의 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 분해율이 낮았다. 가교제의 종류와 농도에 따라 가교율을 변화시켜, 분해를 조절할 수 있다.
콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 분해율
콜라겐 함량 (㎎/㎖) 가교도 (%) 상대적 분해율 (%)
실시예 2-1 30 16 78-81
실시예 2-2 30 24 52-55
비교예 1 30 98 0-3
실험예 3 : 주름개선 효과 및 생체적합성 평가
본 발명의 실시예 2-1 및 실시예 2-2의 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 주름개선 효과 및 생체적합성을 시판 주름개선용 성형외과 충전제인 레스틸렌(Restylane)(제조사: Q-Med AB; 20mg/ml)과 비교하여 평가하였다.
Cho 등(Chon et al., Journal for Plastic , Reconstructive & Aesthetic Surgery, 2011 ;64; e31-39)의 방법에 따라 6주령의 암컷 무모 마우스(hairless mouse type SKH; Jung-Ang Lab Animal Inc., Korea)를 UVB 조사량이 총 6930 mJ/cm2 이 되게 4주간 조사하여 인위적으로 주름을 유발시켰다. UVB 조사를 중단하고, 본 발명의 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재 0.4ml을 상기 주름이 유발된 목덜미 피하에 30 게이지 주사기 바늘을 통해 주입하였다. 양성 대조군으로써 레스틸렌 0.4 ml를 30 게이지 주사바늘을 이용하여 주입하였다. 주름개선 정도는 실리콘으로 된 물질 (Flextime, Heraeus Kulzer, NY, USA)을 이용하여 주름에 의해 생성된 목덜미 피부 부분의 리플리카를 만들고, 4주 동안 1주에 한 번 이미지 분석기 (SV600 skin visiometer, Courage & Khasaka, Cologne, Germany)를 사용하여 각각의 주름개선 면적을 측정 및 계산하여 평균을 산출하였다.
4주 후 마우스의 사진과 리플리카의 이미지를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예 2-1 및 실시예 2-2의 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재를 주입한 마우스는 주름 유발 후 아무것도 처리하지 않은 마우스(negative control)에 비해 주름개선 효과가 현저한 것으로 나타났다. 또한 레스틸렌을 주입한 마우스보다도 주름개선 효과가 높은 것으로 나타났다. 이러한 우수한 주름개선 효과는 본 발명 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 우수한 탄성 및 점도, 피하 재생효과에 기인하는 것으로 사료된다.
또한 상기의 리플리카를 이미지 분석기를 이용하여 주름 정도를 측정하여 분석 및 확인한 결과를 도 4 및 표 6에 나타내었다. 본 발명의 실시예 2-1 및 실시예 2-2의 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재를 주입한 무모 마우스는 등쪽 표피의 주름이 현저하게 개선되었으며, 레스틸렌보다 더 우수한 주름 개선효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
실시예 2-1 및 실시예 2-2에 의한 전체주름면적의 변화율
전체주름면적 변화율 (%) Baseline 4주 후
실시예 2-1 100 42.351
실시예 2-2 100 31.18146
Restylane 100 76.3108
음성대조군
(Negative control)		 100 193.8474
도 3, 도 4 및 표 6을 통해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재는 레스틸렌보다 더 우수한 주름개선효과를 나타내었다.
조직학적 검사는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재 투여 4주 후에 헤마토자일린-이오신(H&E)을 염색하여 시행하였다. 각 마우스로부터 피부 샘플을 취한 후 10 부피% 완충 포름알데히드에 고정시키고, 에탄올로 탈수한 후, 파라핀에 보관하여 표본을 만들고, 이들을 4 μm 부분으로 얇게 자르고 H&E로 염색하였다. 염색된 시료를 광학현미경을 이용하여 촬영한 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 2-1 및 실시예 2-2의 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재를 투여한 마우스는 레스틸렌 및 음성 대조군(negative control)과 동일하게 아무런 염증반응을 나타내지 않았다(H&E의 경우, 헤마토자일린은 염증 반응시 파란색으로 염색이 되며, 이오신은 헤마토자일린과는 대조 염색으로써 붉게 염색이 된다).
다섯 개의 서로 다른 부위를 측정하여 진피층(dermal layer)의 두께의 평균을 측정하고, 피하조직의 재생정도를 평가하여 도 6 및 표 7에 나타내었다. 진피의 두께가 증가한 것은 피하조직재생과 주름개선에 효과가 있는 것을 증명하는 것이다. 진피의 두께는 주름유발 음성 대조군(negative control)에서 가장 낮았다. 반면, 본 발명의 실시예 2-1 및 2-2의 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재를 주입한 경우 레스틸렌보다 진피층 두께의 수치가 높았다.
실시예 2-1 및 실시예 2-2에 의한 진피층 두께의 측정
진피층 두께 (㎛)
실시예 2-1 190
실시예 2-2 200
Restylane 150
음성대조군 (Negative control) 130
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 다음 단계를 포함하는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법
    (a) 콜라겐을 용해하여 중성화시키는 단계;
    (b) 상기 중성화된 콜라겐을 환원당 또는 디알데하이드계 화합물을 이용하여 가교시키는 단계;
    (c) 상기 가교된 콜라겐을 균질화시키는 단계;
    (d) 상기 균질화된 콜라겐의 구조를 안정화시키는 단계; 및
    (e) 상기 안정화된 콜라겐을 멸균시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계 후 가교제 중 미반응 가교제를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (c)단계 후 균질화된 콜라겐을 충진하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐은 돼지에서 유래된 텔로펩타이드를 제거한 type Ⅰ 콜라겐인 것을 특징으로 하는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 환원당은 알도스, 케토스, 알도스의 유도체, 케토스의 유도체, 글리세로스, 트레오스, 에리트로스, 릭소스, 자일로스, 아라비노스, 리보스, 알로스, 알트로스, 글루코스, 프룩토스, 만노스, 글로스(gulose), 아이도스(idose), 갈락토스, 탈로스, 글리세랄 알데하이드, D-리보스-5-포스페이트 및 글루코사민으로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상 것을 특징으로 하는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 환원당은 중량 기준으로 콜라겐의 양의 0.4~4.0배를 추가하는 것을 특징으로 하는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 디알데하이드는 글라이옥살, 메틸글라이옥살, 석신디알데하이드, 말론디알데하이드 및 프탈알데하이드로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 디알데하이드는 중량 기준으로 콜라겐의 양의 0.3~3.0배를 추가하는 것을 특징으로 하는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 균질화는 호모게나이제 또는 수산화인회석 입자에 의해서 수행되는 것을 특징으로 하는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 가교율이 5~30%인 것을 특징으로 하는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, 가교된 콜라겐의 함량이 총 바이오소재에 대하여 2.0~4.0 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, 추가로 국소마취제를 총 중량에 대하여 0.1~0.4%(w/w)로 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 (d)단계의 구조 안정화는 동결과 해동을 5~10회 반복하는 것을 특징으로 하는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 (e)단계의 멸균을 감마선 또는 전자빔으로 수행하는 것을 특징으로 하는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재의 제조방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 의하여 제조되고, 가교율이 5~30%이며, 총 바이오소재에 대한 가교된 콜라겐의 함량이 2.0~4.0 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재.
KR1020130032386A 2013-03-26 2013-03-26 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재 KR101590313B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130032386A KR101590313B1 (ko) 2013-03-26 2013-03-26 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130032386A KR101590313B1 (ko) 2013-03-26 2013-03-26 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140117216A true KR20140117216A (ko) 2014-10-07
KR101590313B1 KR101590313B1 (ko) 2016-02-01

Family

ID=51990640

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130032386A KR101590313B1 (ko) 2013-03-26 2013-03-26 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101590313B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017196051A1 (ko) * 2016-05-09 2017-11-16 송석진 다공성의 생분해성 미세입자 및 수용성 천연고분자를 포함하는 성형 필러용 주사제 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4837285A (en) * 1984-03-27 1989-06-06 Medimatrix Collagen matrix beads for soft tissue repair
KR20100101715A (ko) * 2009-03-10 2010-09-20 김민 피부 충전제 조성물
KR101085940B1 (ko) * 2011-09-05 2011-11-23 (주)유바이오시스 콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액 제조방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4837285A (en) * 1984-03-27 1989-06-06 Medimatrix Collagen matrix beads for soft tissue repair
KR20100101715A (ko) * 2009-03-10 2010-09-20 김민 피부 충전제 조성물
KR101085940B1 (ko) * 2011-09-05 2011-11-23 (주)유바이오시스 콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액 제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PARENTEAU-BAREIL, et al., MATERIALS (2010) Vol.3, pp.1863-1887 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR101590313B1 (ko) 2016-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Fish scale-derived collagen patch promotes growth of blood and lymphatic vessels in vivo
KR101382083B1 (ko) 상호침투성 망상구조, 및 관련 방법 및 조성물
RU2683286C2 (ru) Способ поперечного сшивания гиалуроновой кислоты, способ приготовления инъекционного гидрогеля, гидрогель и его применение
DK2666462T3 (en) RADIATION COLLAGEN-GEL, METHOD OF PRODUCING THEREOF
KR102275105B1 (ko) 고밀도 망상구조로 가교된 히알루론산 및 그의 제조방법
JP6164782B2 (ja) 細胞外マトリックス材料から生理活性ゲルを製造する方法
US20200237956A1 (en) Homogeneous Aqueous Solution of Injectable Chitosan
CN107708675A (zh) 假塑性微凝胶基质的组合物和试剂盒
JPH01265970A (ja) ヒアルロン酸を含有させたコラーゲン水溶液又は水分散液
JP7242553B2 (ja) 基質の調製のための方法及び組成物
EP3021881B1 (en) Cross-linked hyaluronic acid, process for the preparation thereof and use thereof in the aesthetic field
EP3511029B1 (en) Dermal layer for grafting having improved graft survival rate and method for producing same
KR101710639B1 (ko) 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 조직 증강용 충전 조성물 및 이의 제조방법
Zhang et al. Radiation cross-linked collagen/dextran dermal scaffolds: effects of dextran on cross-linking and degradation
KR101590313B1 (ko) 콜라겐으로 구성된 주입형 피하조직재생용 바이오소재
US20200282107A1 (en) Sterile clear concentrated solution of biocompatible collagen, process for the preparation and use thereof
KR20190096946A (ko) 지방 세포에 활성인 신규 조성물
Kim et al. Liquid-type plasma-controlled in situ crosslinking of silk-alginate injectable gel displayed better bioactivities and mechanical properties
KR102222782B1 (ko) 한천 또는 아가로오스를 포함하는 젤란검 하이드로겔 조성물, 이의 제조방법 및 이의 용도
CN113301927A (zh) 生物相容性材料
KR20190086419A (ko) 신규한 재흡수 생분해성 의약 및 화장료 조성물
ES2688324T3 (es) Composiciones de cemento bioactivo autoendurecible con quitina parcialmente desacetilada como sustituyentes de los injertos óseos
Lee et al. Subcutaneous toxicity of a dual ionically cross-linked atelocollagen and sodium hyaluronate gel: Rat in vivo study for biological safety evaluation of the injectable hydrogel
RU2778054C2 (ru) Гидрогель, содержащий в качестве субстрата производное гиалуроновой кислоты, модифицированное галлольной группой, и его применение
CN117122737A (zh) 一种可注射组合物及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191231

Year of fee payment: 5