CN117298327A - 一种止血微球颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
一种止血微球颗粒及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种止血微球颗粒及其制备方法和应用。止血微球颗粒的制备包括如下步骤：胶原蛋白溶液、聚合物粘性水溶液混合，滴加戊二醛水溶液，经化学交联和核辐射交联，核辐射交联的吸收剂量单位为8～25kGy；胶原蛋白溶液的浓度为5‰～20‰；胶原蛋白中I型胶原蛋白的浓度为90％以上；聚合物粘性水溶液包括葡聚糖水溶液和/或普鲁兰多糖水溶液；葡聚糖水溶液的浓度为15％～45％，葡聚糖的数均分子量为8万～120万；普鲁兰多糖水溶液的浓度为2％～8％，普鲁兰多糖的数均分子量为10万～60万；戊二醛水溶液的浓度为0.05％～0.5％。本申请采用双水相乳化法制备止血微球颗粒，细胞毒性小，力学性能和止血效果优异。
Description
技术领域
本申请涉及医用材料领域，具体涉及一种止血微球颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
出血是创伤发生后最常见的临床表现之一，而出血失控被认为是导致患者或伤员死亡的首要原因。目前止血方法主要包括按压止血和局部使用止血材料止血两种，但是这两种方法对内出血均很难起效。相比较而言，止血粉因其能够处理大的血流，而且能够完整的覆盖伤口之上，受到人们的关注。止血粉放置于伤口后会吸收血液或者吸附血细胞形成胶状体，浓缩血细胞和止血因子从而达到止血的目的。
胶原止血材料有很好的止血性能，而且还有引导组织修复再生的作用，是目前研究发现的最好的可吸收止血材料之一，但现有工艺制作的胶原止血材料主要存在制备过程复杂，材料交联时需要使用大量化学交联剂，会造成交联剂残留，产生细胞毒性，制备过程中会破坏胶原蛋白活性，影响止血效果等缺陷。
例如，申请号为201511015505.6的中国专利申请以胶原蛋白为原料，胶原蛋白通过紫外线辐射交联，再经喷雾干燥制备止血颗粒，虽然制得的材料可以快速吸水止血，但喷雾干燥过程的温度过高(110℃)容易导致胶原蛋白变性，降低胶原蛋白的生物活性。
因此，本领域亟需研发一种止血性能良好，细胞毒性小，使用安全性高，力学性能优异，且可保持胶原蛋白生物活性的止血材料。
发明内容
本申请所要解决的技术问题是克服现有技术中止血粉在制备过程中影响胶原蛋白活性，交联剂残留量高，细胞毒性大等缺陷，而提供一种止血微球颗粒及其制备方法和应用。本申请以胶原蛋白为原料，采用双水相乳化法制备止血微球颗粒，制备过程中温度低，并减少有机试剂的加入量，可以保证胶原蛋白的生物活性；采用核辐射和化学相协同的交联方法也可减少终产品中交联剂的残留，进而减小细胞毒性，还具有优异的力学性能。本申请制得的止血微球颗粒可以起到快速止血作用，也可为组织细胞提供良好的再生修复微环境。
本申请采用以下技术方案解决上述技术问题：
本申请提供一种止血微球颗粒的制备方法，其包括如下步骤：胶原蛋白溶液、聚合物粘性水溶液混合，制得物料A；向所述物料A中滴加戊二醛水溶液进行化学交联，所述化学交联的过程中还进行核辐射交联，所述核辐射交联的吸收剂量单位为8～25kGy，制得所述止血微球颗粒；
其中，所述胶原蛋白溶液中胶原蛋白的质量千分比为5‰～20‰；所述胶原蛋白中I型胶原蛋白的质量百分比为90％以上；所述聚合物粘性水溶液包括葡聚糖水溶液和/或普鲁兰多糖水溶液；所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为15％～45％，葡聚糖的数均分子量为8万～120万；所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的质量百分比为2％～8％，普鲁兰多糖的数均分子量为10万～60万；所述戊二醛水溶液中戊二醛的质量百分比为0.05％～0.5％。
在一些实施方案中，所述胶原蛋白溶液中胶原蛋白的质量千分比为8‰～15‰。在一些具体实施方案中，所述胶原蛋白溶液中胶原蛋白的质量千分比为5‰、6‰、7‰、8‰、9‰、10‰、11‰、12‰、13‰、14‰、15‰、16‰、17‰、18‰、19‰或20‰。
在一些实施方案中，所述胶原蛋白中I型胶原蛋白的质量百分比为95％以上。在一些具体实施方案中，所述胶原蛋白中I型胶原蛋白的质量百分比为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.3％、97％、98％或99％。
在一些实施方案中，所述胶原蛋白溶液中溶剂可包括酸性溶液。在一些具体实施方案中，所述胶原蛋白溶液中溶剂包括醋酸水溶液和/或盐酸。
其中，所述酸性溶液的pH值可为1.8～5。在一些具体实施方案中，所述酸性溶液的pH值为1.8～2.5。在一些更具体实施方案中，所述酸性溶液的pH值为1.8、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5。
在一些实施方案中，所述聚合物粘性水溶液的粘度可为3000～8000mPa.s，较佳地为5000～6000mPa.s。所述聚合物粘性水溶液的粘度的测试方法包括如步骤：将所述聚合物粘性水溶液温度调节至25℃，使用B型粘度计以30rpm进行测量。
在一些实施方案中，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为18％～42％。在一些具体实施方案中，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为20％～40％。在一些具体实施方案中，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为15％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％、32％、34％、36％、38％、40％、42％、44％或45％。
在一些实施方案中，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量为8万～110万。在一些具体实施方案中，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量为10万～100万。在一些更具体实施方案中，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量为8万、10万、20万、30万、40万、50万、60万、70万、80万、90万、100万、110万或120万。
在一些具体实施方案中，当所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量为8万～20万时，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为35％～45％。当所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量大于20万，小于等于70万时，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为20％～35％。当所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量大于70万，小于等于120万时，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为15％～25％。
在一些更具体实施方案中，当所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量为8万～15万时，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为38％～42％。当所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量为40万～60万时，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为25％～35％。当所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量为90万～110万时，所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为18％～22％。
在一些实施方案中，所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的质量百分比为2.5％～5.5％。在一些具体实施方案中，所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的质量百分比为3％～5％。在一些更具体实施方案中，所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的质量百分比为2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％或8％。
在一些实施方案中，所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的数均分子量为15万～55万。在一些具体实施方案中，所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的数均分子量为20万～50万。在一些具体实施方案中，所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的数均分子量为10万、12万、15万、20万、25万、30万、35万、40万、45万、50万、55万或60万。
在一些实施方案中，所述胶原蛋白溶液和所述聚合物粘性水溶液的质量比可为1:(2～10)。在一些具体实施方案中，所述胶原蛋白溶液和所述聚合物粘性水溶液的质量比为1:(2～5)。在一些更具体实施方案中，所述胶原蛋白溶液和所述聚合物粘性水溶液的质量比为1:2、1:2.3、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。
在一些实施方案中，所述混合可按照本领域常规在涡旋仪上进行。
在一些实施方案中，所述混合的时间可为本领域常规，一般可为2～10min。在一些具体实施方案中，所述混合的时间为2～5min。在一些具体实施方案中，所述混合的时间为2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min。
在一些实施方案中，所述混合的温度可为室温。
在一些实施方案中，所述混合的过程中还可进一步添加止血活性成分。
其中，所述止血活性成分可包括本领域常规使用的具有止血功能的物质，一般可包括凝血酶、bFGF、止血敏、止血芳酸和维生素K中至少一种。
其中，所述止血活性成分的用量可按照本领域常规根据各止血活性成分的常规添加量添加。
当所述止血活性成分为bFGF时，所述胶原蛋白溶液与所述bFGF的质量比可为1:(10-6～10-5)。在一些具体实施方案中，当所述止血活性成分为bFGF时，所述胶原蛋白溶液与所述bFGF的质量比1:(5×10-6～8×10-5)。在一些更具体实施方案中，当所述止血活性成分为bFGF时，所述胶原蛋白溶液与所述bFGF的质量比为1:10-6、1:(2×10-6)、1:(3×10-6)、1:(4×10-6)、1:(5×10-6)、1:(6×10-6)、1:(6.7×10-6)、1:(7×10-6)、1:(8×10-6)、1:(9×10-6)或1:10-5。
当所述止血活性成分为凝血酶时，所述胶原蛋白溶液与所述凝血酶的质量比可为1:(10-6～10-5)。在一些具体实施方案中，当所述止血活性成分为凝血酶时，所述胶原蛋白溶液与所述凝血酶的质量比为1:(5×10-6～8×10-5)。在一些更具体实施方案中，当所述止血活性成分为凝血酶时，所述胶原蛋白溶液与所述凝血酶的质量比为1:10-6、1:(2×10-6)、1:(3×10-6)、1:(4×10-6)、1:(5×10-6)、1:(6×10-6)、1:(6.7×10-6)、1:(7×10-6)、1:(8×10-6)、1:(9×10-6)或1:10-5。
在一些实施方案中，所述戊二醛水溶液中戊二醛的质量百分比为0.08％～0.3％。在一些具体实施方案中，所述戊二醛水溶液中戊二醛的质量百分比为0.1％～0.2％。在一些具体实施方案中，所述戊二醛水溶液中戊二醛的质量百分比为0.05％、0.08％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％。当所述戊二醛水溶液中所述戊二醛的质量百分比高于0.5％时，会导致终产品中戊二醛的残留量过高，增加细胞毒性，降低使用安全性。
在一些实施方案中，所述胶原蛋白水溶液与所述戊二醛水溶液的质量比可为(10～100)：1。在一些具体实施方案中，所述胶原蛋白水溶液与所述戊二醛水溶液的质量比为(20～40)：1。在一些更具体实施方案中，所述胶原蛋白水溶液与所述戊二醛水溶液的质量比为15：1、20：1、25：1、30：1、45：1、50：1、60：1、70：1、80：1或90：1。
在一些实施方案中，所述化学交联和所述核辐射交联同时开始进行。
在一些实施方案中，所述化学交联的时间可为5～24h。在一些具体实施方案中，所述化学交联的时间为5～8h。在一些更具体实施方案中，所述化学交联的时间为5h、7h、8h、9h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h或24h。
在一些实施方案中，所述化学交联的温度可为15～30℃。
在一些实施方案中，所述核辐射交联的过程中采用的核辐射包括电子束、γ射线、中子束、粒子束中至少一种。在一些具体实施方案中，所述核辐射交联的过程中采用的核辐射包括电子束和/或γ射线。在一些更具体实施方案中，所述γ射线包括基于钴60放射源的γ射线。所述核辐射交联是利用各种核辐射引发交联反应的技术手段。
在一些实施方案中，所述核辐射交联的吸收剂量单位为8～15kGy。在一些具体实施方案中，所述核辐射交联的吸收剂量单位为8～12kGy。在一些更具体实施方案中，所述核辐射交联的吸收剂量单位为8kGy、9kGy、10kGy、11kGy、12kGy、13kGy、14kGy、15kGy、16kGy、17kGy、18kGy、19kGy、20kGy、21kGy、22kGy、23kGy、24kGy或25kGy。
在一些实施方案中，所述核辐射交联的时间可为20～60min。在一些具体实施方案中，所述核辐射交联的时间为20～40min。在一些更具体实施方案中，所述核辐射交联的时间为20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min。
在一些实施方案中，所述化学交联的操作后还可进一步包括离心并收集固体颗粒、清洗和冻干中至少一种的操作。
其中，所述离心的条件和方法可为本领域常规，所述离心的目的为去除体系中未参与交联的聚合物，并收集所述止血微球颗粒。
其中，所述清洗的过程中采用的清洗剂可包括磷酸盐缓冲液、生理盐水和纯化水中至少一种。
其中，所述清洗的过程中，所述固体颗粒与清洗液的体积比可为1:(2～10)。在一些实施方案的所述清洗的过程中，所述固体颗粒与所述清洗液的体积比为1：(2～5)。在一些实施方案的所述清洗的过程中，所述固体颗粒与所述清洗液的体积比为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。
其中，所述清洗的次数可为2～5次。在一些实施方案中，所述清洗的次数为2～4次。在一些具体实施方案中，所述清洗的次数为3次。
在一些实施方案中，所述胶原蛋白可包括猪肠膜胶原蛋白和/或牛跟腱胶原蛋白。
在一些实施方案中，所述胶原蛋白的制备方法可包括如下步骤：猪大肠膜和/或牛跟腱经灭活、脱脂、脱细胞、冻干和酶解，制得所述胶原蛋白。
其中，所述灭活的条件和方法可为本领域常规，一般采用灭活溶剂浸泡，即可；
所述灭活的过程中，所述灭活溶剂可包括乙醇和/或乙醇水溶液。
当所述灭活溶剂包括所述乙醇水溶液时，所述乙醇占所述乙醇水溶液的质量百分比可为大于等于45％，小于100％。在一些具体实施方案中，所述乙醇占所述乙醇水溶液的质量百分比为50％～90％。在一些具体实施方案中，所述乙醇占所述乙醇水溶液的质量百分比为45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
当所述灭活溶剂包括所述乙醇和所述乙醇水溶液时，所述灭活溶剂至少包括4个浓度，且采用每个浓度的所述灭活溶剂时的浸泡时间可为1～3h。在一些具体实施方案中，当所述灭活溶剂包括所述乙醇和所述乙醇水溶液时，所述灭活溶剂至少包括4个浓度，且采用每个浓度的所述灭活溶剂时的浸泡时间为2h。
其中，所述脱脂的条件和方法可为本领域常规，一般采用脱脂液浸泡所述灭活后的物料，即可。
所述脱脂的过程中，所述灭活后的物料与所述脱脂液的质量体积比可为0.1～0.5g/mL。在一些具体实施方案中，所述灭活后的物料与所述脱脂液的质量体积比为0.1～0.3g/mL。在一些具体实施方案中，所述灭活后的物料与所述脱脂液的质量体积比为0.2g/mL或0.4g/mL。
所述脱脂的过程中，所述脱脂液可包括本领域常规使用的溶剂脱脂液，一般可包括烷烃类溶剂脱脂液和/或酮类溶剂脱脂液。在一些具体实施方案中，所述脱脂液包括正己烷和/或丙酮。
所述脱脂的过程中，所述脱脂的次数可为2～4次。在一些具体实施方案中，所述脱脂的次数为3次。
所述脱脂的过程中，所述脱脂的时间可为6～30h/每次。在一些具体实施方案中，所述脱脂的时间为20～26h/每次。在一些具体实施方案中，所述脱脂的时间为10h/每次、15h/每次、24h/每次或28h/每次。
所述脱脂的操作后还可进一步包括清洗的操作。
所述脱脂后的所述清洗的次数可为3～7次。在一些具体实施方案中，所述脱脂后的所述清洗的次数为4～6次。在一些具体实施方案中，所述脱脂后的所述清洗的次数为5次。
所述脱脂后的所述清洗的时间可为不少于20min/每次。在一些具体实施方案中，所述脱脂后的所述清洗的时间不少于30min/每次。
所述脱脂后的所述清洗使用的清洗剂可包括水。
其中，所述脱细胞的条件和方法可为本领域常规，一般采用表面活性剂浸泡所述脱脂后物料，即可。
所述脱细胞过程中，所述表面活性剂可包括非离子表面活性剂和/或阴离子表面活性剂。在一些具体实施方案中，所述非离子表面活性剂可包括醚类非离子表面活性剂。在一些具体实施方案中，所述非离子表面活性剂包括聚乙二醇辛基苯基醚。在一些具体实施方案中，所述阴离子表面活性剂可包括C12～C18脂肪醇硫酸盐类表面活性剂。在一些具体实施方案中，所述阴离子表面活性剂包括十二烷基硫酸钠。
在一较佳实施方案的所述脱细胞过程中，将所述脱脂后的物料依次浸泡在质量百分比为0.5％～2％的聚乙二醇辛基苯基醚水溶液中、浸泡在质量百分比为0.5％～2％的十二烷基硫酸钠水溶液中和浸泡在水中。
在一更佳实施方案的所述脱细胞过程中，具体包括如下步骤：
(A)将25～35g所述脱脂后的物料浸泡在140～160mL质量百分比为0.5％～2％的聚乙二醇辛基苯基醚水溶液中0.5～3h，所述浸泡在摇动的条件下进行；
(B)将步骤(A)制得的物料浸泡在150～200mL质量百分比为0.5％～2％的十二烷基硫酸钠水溶液中6～24h，所述浸泡在摇动的条件下进行；
(C)将步骤(B)制得的物料浸泡在150～200mL质量百分比为0.8％～1.2％的十二烷基硫酸钠水溶液中5～10h，所述浸泡在摇动的条件下进行；
(D)将步骤(C)制得的物料浸泡在水中，所述浸泡的次数至少为5次，所述浸泡的时间不少于30min/每次。
上述步骤(A)、步骤(B)和步骤(C)中，所述摇动的转速可各自独立的为100～300rpm。
其中，所述冻干的条件和方法可为本领域常规，一般可在冻干机中进行。
其中，所述冻干的操作后还可进一步包括粉碎的操作。
其中，所述酶解的条件和方法可为本领域常规，一般将所述冻干后的物料溶解在盐酸乙醇溶液中，再与胃蛋白酶混合，即可。
所述酶解过程中，所述盐酸乙醇溶液中盐酸的浓度为0.005～0.015mol/L，乙醇的质量百分比为4％～10％；在一些具体实施方案中，所述盐酸乙醇溶液中，盐酸的浓度为0.01mol/L，乙醇的质量百分比为5％。
所述酶解过程中，所述冻干后的物料与所述盐酸乙醇溶液的质量体积比为0.005～0.05g/mL。在一些具体实施方案中，所述冻干后的物料与所述盐酸乙醇溶液的质量体积比为0.005～0.02g/mL。在一些具体实施方案中，所述冻干后的物料与所述盐酸乙醇溶液的质量体积比为0.01g/mL、0.03g/mL或0.04g/mL。
所述酶解过程中，所述冻干后的物料与所述胃蛋白酶的质量比可为(8～15)：1。一些具体实施方案中，所述冻干后的物料与所述胃蛋白酶的质量比为(9～12)：1。一些具体实施方案中，所述冻干后的物料与所述胃蛋白酶的质量比为10：1或11：1。
所述酶解过程中，所述酶解的时间可为70～80h。一些具体实施方案中，所述酶解的时间为72h、74h、76h或78h。
其中，所述酶解的操作后还可进一步包括透析和/或二次冻干的操作。所述透析的目的是去除端肽。
在一些实施方案中，所述透析采用的透析袋的截留分子量可为40～60kD。在一些具体实施方案中，所述透析采用的透析袋的截留分子量为45kD、50kD或55kD。
在一些实施方案中，所述透析的时间为40～100h。在一些具体实施方案中，所述透析的时间为48～96h。在一些更具体的实施方案中，所述透析的时间为50h、60h、70h、72h、80h或90h。
本申请还提供一种止血微球颗粒，其由如上所述的止血微球颗粒的制备方法制得。
本申请还提供一种如上所述的止血微球颗粒作为原料在制备止血材料中的应用。
其中，所述止血材料的剂型可为本领域常规使用的粉剂。
本申请还提供一种如上所述的止血微球颗粒在止血治疗中的应用。
本申请还提供一种止血治疗方法，其包括将如上所述的胶原蛋白多孔微球施用于有此需要的个体的出血部位。
在本发明中，“个体”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括但不限于脊椎动物例如非人类灵长类、羊、狗和啮齿类，例如小鼠、大鼠和豚鼠。在优选的实施方案中，所述个体是人。当个体是人类时，所述个体在本文中可称为患者。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本申请各较佳实例。
本申请所用试剂和原料均市售可得。
本申请的积极进步效果在于：本申请以胶原蛋白为原料，采用双水相乳化法制备止血微球颗粒，制备过程中温度低，并减少有机试剂的加入，可以保证胶原蛋白的生物活性；采用物理和化学相协同的交联方法也可减少终产品的细胞毒性，还具有优异的力学性能；本申请制得的止血微球颗粒还可用于包覆止血活性成分，对止血活性成分具有良好的包覆能力和释放能力。本申请制得的止血微球颗粒可以起到快速止血作用，也可为组织细胞提供良好的再生修复微环境。
附图说明
本申请可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本申请的优选实施例和解释本申请的原理和优点。
其中：
图1为实施例2制得止血微球颗粒的光镜图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本申请，但并不因此将本申请限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中所用试剂和原料均市售可得，所用试剂的纯度均为分析纯，在其他实施例中也可用色谱纯试剂。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中的猪大肠膜购自宜宾五尺道集团有限公司。
下述实施例和对比例中使用的含止血活性因子bFGF的扶济复购自北京双鹭药业股份有限公司。
下述实施例中使用的凝血酶购自上海麦克林生化科技有限公司。
下述效果实施例中采用的光镜的厂家为尼康株式会社，设备型号为E200LED。
下述实施例中，胶原蛋白的制备工艺如下：
(1)猪大肠膜预处理和清洗：取猪大肠膜，去除表面脂肪和异物杂质，选光泽度好、韧性强的部位，不锈钢钉耙打孔，随后对其进行清洗；
(2)灭活：采用质量百分比分别为50％、75％、90％的乙醇水溶液和乙醇浸泡步骤(1)制得的物质，每个浓度浸泡的时间为2h；
(3)脱脂：将30g步骤(2)制得的灭活后的物料加入150mL脱脂液中，脱脂液为正己烷，脱脂3次，每次24h，脱脂后用纯化水清洗5次，每次30min；
(4)脱细胞：将30g步骤(3)中脱脂后的物料浸泡在150mL浓度为1wt％的Triton-100(聚乙二醇辛基苯基醚，表面活性剂)溶液中，浸泡1h；再浸泡在150mL浓度为1wt％的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中，摇动浸泡18h；再浸泡在150mL浓度为1wt％的SDS溶液中，摇动浸泡8h；浸泡后用纯化水清洗5次，每次30min；
(5)冻干、酶解：将步骤(4)制得的脱细胞后物料冻干、粉碎；取2g粉碎后的物料加入200mL含盐酸0.01mol/L和含乙醇5wt％的混合溶液，加入200mg胃蛋白酶进行酶解72h，采用截留分子量为50kD的透析袋透析72h，纯化去除端肽，得到胶原蛋白溶液，并冻干，制得胶原蛋白，胶原蛋白中I型胶原蛋白的质量百分比为96.3％(胶原蛋白中I型胶原蛋白的浓度的测试方法参照《YY/T 1453-2016组织工程医疗器械产品I型胶原蛋白表征方法》中附录A)。
下述对比例4中，胶原蛋白的制备工艺如下：
(1)猪大肠膜预处理和清洗：取猪大肠膜，去除表面脂肪和异物杂质，选光泽度好、韧性强的部位，不锈钢钉耙打孔，随后对其进行清洗；
(2)灭活：采用质量百分比分别为50％、75％、90％的乙醇水溶液和乙醇浸泡步骤(1)制得的物质，每个浓度浸泡的时间为2h；
(3)脱脂：将30g步骤(2)制得的灭活后的物料加入150mL脱脂液中，脱脂液为正己烷，脱脂3次，每次24h，脱脂后用纯化水清洗5次，每次30min；
(4)脱细胞：将30g步骤(3)中脱脂后的物料浸泡在150mL浓度为1wt％的Triton-100(聚乙二醇辛基苯基醚,表面活性剂)溶液中，浸泡1h；再浸泡在150mL浓度为1wt％的SDS溶液中，摇动浸泡18h；再浸泡在150mL浓度为1wt％的SDS溶液中，摇动浸泡8h；浸泡后用纯化水清洗5次，每次30min；
(5)冻干、酶解：将步骤(4)制得的脱细胞后物料冻干、粉碎；取2g粉碎后的物料加入200mL含盐酸0.01mol/L和含乙醇5wt％的混合溶液，加入200mg胃蛋白酶进行酶解24h，采用截留分子量为10kD的透析袋透析72h，纯化去除端肽，得到胶原蛋白溶液，并冻干，制得胶原蛋白，胶原蛋白中I型胶原蛋白的质量百分比为83％(胶原蛋白中I型胶原蛋白的浓度的测试方法参照《YY/T 1453-2016组织工程医疗器械产品I型胶原蛋白表征方法》中附录A)。
实施例1
止血微球颗粒的制备：
(1)将上述制得的胶原蛋白(胶原蛋白中I型胶原蛋白的浓度为96.3wt％)溶解到0.01mol/L盐酸(pH值为2)中，制得胶原蛋白的质量千分比为10‰的胶原蛋白溶液；
(2)向0.75g步骤(1)制得的胶原蛋白溶液中加入8mg扶济复(外用重组人碱性成纤维细胞生长因子，实际含有5μg bFGF)，混匀，加入1.75g浓度为30wt％的葡聚糖水溶液，葡聚糖的数均分子量为50万，在室温下涡旋混合3min，再向体系中滴加30mg质量百分比为0.2％的戊二醛水溶液，进行化学交联6h，开始滴加戊二醛水溶液时，对体系进行核辐射交联，核辐射交联的过程中采用的核辐射为电子束(核辐射装置为BFT-II型辐照装置，厂家北京核二院比尼新技术有限公司)，核辐射交联的吸收剂量单位为10kGy，核辐射交联的时间为30min，交联后采用纯净水清洗，离心，去除上清液，收集固体颗粒，固体颗粒与纯净水的体积比为1：3，清洗3遍后冻干，制得止血微球颗粒。
实施例2
(1)将上述制得的胶原蛋白(胶原蛋白中I型胶原蛋白的浓度为96.3wt％)溶解到pH值为2的醋酸水溶液中，制得胶原蛋白的质量千分比为10‰的胶原蛋白溶液；
(2)向0.75g步骤(1)制得的胶原蛋白溶液中加入8mg扶济复(外用重组人碱性成纤维细胞生长因子，实际含有5μg bFGF(碱性成纤维细胞生长因子))混匀，加入1.75g浓度为30wt％的葡聚糖水溶液，葡聚糖的数均分子量为50万，在室温下涡旋混合3min，再向体系中滴加30mg质量百分比为0.1％的戊二醛水溶液，进行化学交联6h，开始滴加戊二醛水溶液时，对体系进行核辐射，核辐射交联的过程中采用的核辐射为电子束(核辐射装置为BFT-II型辐照装置，厂家北京核二院比尼新技术有限公司)，核辐射交联的吸收剂量单位为10kGy，核辐射交联的时间为30min，交联后采用纯净水清洗，离心，去除上清液，收集固体颗粒，固体颗粒与纯净水的体积比为1：3，清洗3遍后冻干，制得止血微球颗粒。
实施例3～6
实施例3～6与实施例2相比，区别仅在于聚合物粘性水溶液不同，具体为将浓度为30wt％葡聚糖水溶液替换为其他类型的聚合物粘性水溶液，其他条件参数同实施例2，具体可参见下方表1。
表1
对比例1
与实施例2相比，区别仅在于，葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为10％，其他条件参数同实施例2。
对比例2
与实施例2相比，区别仅在于，葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为50％，其他条件参数同实施例2。
对比例3
与实施例2相比，区别仅在于，胶原蛋白溶液中胶原蛋白的质量千分比为2‰，其他条件参数同实施例2。
对比例4
与实施例2相比，区别仅在于，胶原蛋白中I型胶原蛋白的质量百分比为83％，其他条件参数同实施例2。
对比例5
与实施例2相比，区别仅在于只采用化学交联的方法，不采用核辐射交联，其他条件参数同实施例2。
对比例6～8
对比例6～8与实施例2相比，区别仅在于将核辐射交联替换为光辐射交联的方法，或核辐射交联(核辐射装置为BFT-II型辐照装置，厂家北京核二院比尼新技术有限公司)的条件参数不同，其他条件参数同实施例2，具体请参见表2。
表2
| 交联方法 | 时间 | 温度 | 辐射量 | |
| 对比例6 | 光辐射交联(紫外线) | 4h | 常温 | / |
| 对比例7 | 光辐射交联(紫外线) | 12h | 常温 | / |
| 对比例8 | 核辐射交联(电子束) | 30min | 常温 | 4kGy |
对比例9
与实施例2相比，区别仅在于，步骤(2)中戊二醛水溶液的浓度为1wt％，其他条件参数同实施例2。
效果实施例1成球性
观察上述实施例1～6和对比例1～9制得产品的成球性能，结果见表3；实施例2制得止血微球颗粒的光镜图见图1。本效果实施例中，采用的光镜厂家为尼康株式会社，设备型号为E200LED。
表3
根据上述对比例1～4的结果可知，聚合物粘性水溶液的浓度、胶原蛋白溶液的浓度和胶原蛋白中I型胶原蛋白的浓度对体系的成球性均具有较大影响，当不在本申请限定范围时，无法成功制得止血微球颗粒。根据上述对比例5～8的结果可知，当不采用核辐射交联，或者将核辐射交联替换为光辐射交联方法，再或者核辐射交联的吸收剂量单位过低时，均会影响体系的成球性，会导致体系部分成球甚至是不成球。
效果实施例2戊二醛残留量测定
戊二醛属于易致毒交联剂，药典规定疫苗中戊二醛残留含量不超过0.01mg/mL。采用液相色谱法对上述实施例1～6和对比例1～4和对比例9制得的产品中戊二醛的残留量进行测定，结果如下表4。
表4
| 编号 | 戊二醛残留(mg/mL) |
| 实施例1 | 0.0078 |
| 实施例2 | 0.0073 |
| 实施例3 | 0.0074 |
| 实施例4 | 0.0073 |
| 实施例5 | 0.0071 |
| 实施例6 | 0.0073 |
| 对比例1 | 0.0077 |
| 对比例2 | 0.0072 |
| 对比例3 | 0.0076 |
| 对比例4 | 0.0068 |
| 对比例9 | 0.0127 |
注：对比例5～8无法交联成球或部分成球，因此未测试戊二醛含量。
结果表明，对比例9中当添加的戊二醛水溶液浓度过高时，终产品中戊二醛含量超标，产品毒性大。
效果实施例3吸水性
测试上述实施例1～6和对比例4～5制得产品的吸水性能(质量溶胀率)，结果如下表5。
质量溶胀率的测试方法包括：分别称量上述实施例1～6或对比例4～5制得的产品，记为初始质量G1，加入纯化水直至不再吸水，称量吸水后物料的质量，记为G2，质量溶胀率＝(G2-G1)/G1。
表5
结果表明，采用上述实施例方法制得的止血微球颗粒的吸水性能均较好，且显著优于对比例4和对比例5制得的产品的吸水性能。可见，实施例制得的止血微球颗粒的止血性能更优异。
效果实施例4力学性能测试
参考GB 23101.1-2008《外科植入物羟基磷灰石第1部分：羟基磷灰石陶瓷》4.4中规定的方法，测试上述实施例和对比例所制得产品的机械性能，结果见表6。
待测样与上述各组实施例和对比例制备方法相比，区别仅在于涡旋过程中不添加聚合物粘性水溶液，其他条件参数同上述实施例或对比例。并且在直径为1cm，高度为1.5cm的圆柱体模具中制备，交联后冷冻干燥，制得待测样。
以实施例1为例，待测样的制备工艺为：
(1)将胶原蛋白(胶原蛋白中I型胶原蛋白的浓度为96.3wt％)溶解到0.01mol/L盐酸(pH值为2)中，制得胶原蛋白的质量千分比为10‰的胶原蛋白溶液；
(2)向0.75g步骤(1)制得的胶原蛋白溶液中加入8mg扶济复(外用重组人碱性成纤维细胞生长因子，实际含有5μg bFGF)，混匀，在室温下涡旋混合3min，再向体系中滴加30μL质量百分比为0.2％的戊二醛水溶液，进行化学交联6h，开始滴加戊二醛水溶液时，对体系进行核辐射，核辐射交联的过程中采用的核辐射为电子束(核辐射装置为BFT-II型辐照装置，厂家北京核二院比尼新技术有限公司)，核辐射交联的吸收剂量单位为10kGy，核辐射交联的时间为30min，交联后采用纯净水清洗，离心，去除上清液，收集固体颗粒，固体颗粒与纯净水的体积比为1：3，清洗3遍后冻干，制得实施例1待测样。
采用微机控制电子试验机(UTM4204，三思纵横科技股份有限公司)进行抗压强度测试，使用圆柱形样品轴向加载，压缩速率为0.5mm/min，测量开始破裂瞬间记录的加载力的平均值。
表6
| 编号 | 抗压强度(kPa) |
| 实施例1 | 92 |
| 实施例2 | 85 |
| 对比例3 | 57 |
| 对比例4 | 68 |
| 对比例5 | 54 |
| 对比例6 | 58 |
| 对比例7 | 60 |
| 对比例8 | 64 |
结果表明，采用化学交联结合核辐射交联的方法，再结合特定浓度的原料，制得产品的抗压强度均较理想。
效果实施例5止血因子的包覆能力和释放能力
将上述实施例1～6中扶济复替换为40μg凝血酶，其他条件参数不变，制得止血微球颗粒，分别命名为实施例1-1～实施例6-1，测试制得止血微球颗粒的包覆率和累计释放率，结果如表7。上述对比例制得产品未成球或部分未成球，因此未测试包覆率和累计释放率。
(1)包覆率测试方法为：
止血微球颗粒在制备过程中，凝血酶的添加质量为m1，交联后，收集清洗止血微球颗粒的清洗液，采用ELISA法测量收集的清洗液中凝血酶的含量为m2，差量法计算包覆率＝(m1-m2)/m1×100％。
(2)累积释放率测试方法：将采用上述方法制得的包覆有凝血酶的止血微球颗粒实施例1-1～实施例6-1分别放入PBS溶液中，按照1:10000质量加入PBS溶液，分别于1d(天)、3d、5d、7d，取PBS测量其凝血酶含量，并补充相同PBS，于7d测量其累计释放率。
表7
| 编号 | 包覆率 | 累计释放率 |
| 实施例1-1 | 93.2％ | 88.6％ |
| 实施例2-1 | 89.6％ | 90.8％ |
| 实施例3-1 | 90.2％ | 89.1％ |
| 实施例4-1 | 88.3％ | 91.2％ |
| 实施例5-1 | 88.9％ | 90.7％ |
| 实施例6-1 | 89,2％ | 91.0％ |
结果表明，上述实施例制得的止血微球颗粒对止血活性成分具有较高的包覆能力和释放性能。
最后，还需要说明的是，在本申请中术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管上面已经通过本申请的具体实施例的描述对本申请进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本申请的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本申请所要求保护的范围内。
Claims (10)
1.一种止血微球颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：胶原蛋白溶液、聚合物粘性水溶液混合，制得物料A；向所述物料A中滴加戊二醛水溶液进行化学交联，所述化学交联的过程中还进行核辐射交联，所述核辐射交联的吸收剂量单位为8～25kGy，制得所述止血微球颗粒；
其中，所述胶原蛋白溶液中胶原蛋白的质量千分比为5‰～20‰；所述胶原蛋白中I型胶原蛋白的质量百分比为90％以上；所述聚合物粘性水溶液包括葡聚糖水溶液和/或普鲁兰多糖水溶液；所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为15％～45％，葡聚糖的数均分子量为8万～120万；所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的质量百分比为2％～8％，普鲁兰多糖的数均分子量为10万～60万；所述戊二醛水溶液中戊二醛的质量百分比为0.05％～0.5％。
2.如权利要求1所述的止血微球颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中至少一种：
所述胶原蛋白溶液中胶原蛋白的质量千分比为8‰～15‰；
所述胶原蛋白中I型胶原蛋白的质量百分比为95％以上；
所述胶原蛋白溶液中溶剂包括酸性溶液；
所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为18％～42％；
所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量为8万～110万；
所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的质量百分比为2.5％～5.5％；
所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的数均分子量为15万～55万；
所述胶原蛋白溶液和所述聚合物粘性水溶液的质量比为1:(2～10)；
所述混合的过程中还进一步添加止血活性成分；
所述戊二醛水溶液中戊二醛的质量百分比为0.08％～0.3％；以及
所述胶原蛋白水溶液与所述戊二醛水溶液的质量比为(10～100)：1。
3.如权利要求2所述的止血微球颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中至少一种：
所述胶原蛋白溶液中溶剂包括醋酸水溶液和/或盐酸；
所述酸性溶液的pH值为1.8～5；
所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为20％～40％；
所述葡聚糖水溶液中葡聚糖的数均分子量为10万～100万；
所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的质量百分比为3％～5％；
所述普鲁兰多糖水溶液中普鲁兰多糖的数均分子量为20万～50万；
所述胶原蛋白溶液和所述聚合物粘性水溶液的质量比为1:(2～5)；
所述止血活性成分包括凝血酶、bFGF、止血敏、止血芳酸和维生素K中至少一种；
所述戊二醛水溶液中戊二醛的质量百分比为0.1％～0.2％；以及
所述胶原蛋白水溶液与所述戊二醛水溶液的质量比为(20～40)：1。
4.如权利要求1～3中任意一项所述的止血微球颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中至少一种：
所述混合的时间为2～10min；
所述化学交联和所述核辐射交联同时开始进行；
所述化学交联的时间为5～24h；
所述化学交联的温度为15～30℃；
所述核辐射交联的过程中采用的核辐射包括电子束、γ射线、中子束、粒子束中至少一种；
所述核辐射交联的吸收剂量单位为8～15kGy；
所述核辐射交联的时间为20～60min；以及
所述化学交联的操作后还进一步包括离心并收集固体颗粒、清洗和冻干中至少一种的操作。
5.如权利要求4所述的止血微球颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中至少一种：
所述混合的时间为2～5min；
所述化学交联的时间为5～8h；
所述核辐射交联的过程中采用的核辐射包括电子束和/或γ射线；较佳地，所述γ射线包括基于钴60放射源的γ射线；
所述核辐射交联的吸收剂量单位为8～12kGy；
所述核辐射交联的时间为20～40min；
所述清洗的过程中采用的清洗剂包括磷酸盐缓冲液、生理盐水和纯化水中至少一种；
所述清洗的过程中，所述固体颗粒与清洗液的体积比为1:(2～10)；以及
所述清洗的次数为2～5次。
6.如权利要求1～5中任意一项所述的止血微球颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中至少一种：
所述胶原蛋白包括猪肠膜胶原蛋白和/或牛跟腱胶原蛋白；以及
所述胶原蛋白的制备方法包括如下步骤：猪大肠膜和/或牛跟腱经灭活、脱脂、脱细胞、冻干和酶解，制得所述胶原蛋白。
7.如权利要求6所述的止血微球颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中至少一种：
所述灭活的方法包括如下步骤：采用灭活溶剂浸泡所述猪大肠膜和/或所述牛跟腱；
所述脱脂的方法包括如下步骤：采用脱脂液浸泡所述灭活后的物料；
所述脱脂的次数为2～4次；
所述脱脂的时间为6～30h/每次；
所述脱脂的操作后还进一步包括清洗的操作；
所述脱细胞的方法包括如下步骤：采用表面活性剂浸泡所述脱脂后物料；
所述冻干的操作后还进一步包括粉碎的操作；
所述酶解的方法包括如下步骤：将所述冻干后的物料溶解在盐酸乙醇溶液中，再与胃蛋白酶混合；以及
所述酶解的操作后还进一步包括透析和/或二次冻干的操作。
8.如权利要求7所述的止血微球颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中至少一种：
所述灭活的过程中，所述灭活溶剂包括乙醇和/或乙醇水溶液；
所述脱脂的过程中，所述灭活后的物料与所述脱脂液的质量体积比为0.1～0.5g/mL，较佳地为0.1～0.3g/mL；
所述脱脂的过程中，所述脱脂液包括烷烃类溶剂脱脂液和/或酮类溶剂脱脂液，较佳地包括正己烷和/或丙酮；
所述脱脂后的所述清洗的次数为3～7次；
所述脱脂后的所述清洗的时间为不少于20min/每次；
所述脱脂后的所述清洗使用的清洗剂包括水；
所述脱细胞过程中，所述表面活性剂包括非离子表面活性剂和/或阴离子表面活性剂；较佳地，所述非离子表面活性剂包括醚类非离子表面活性剂，更佳地包括聚乙二醇辛基苯基醚；较佳地，所述阴离子表面活性剂包括C12～C18脂肪醇硫酸盐类表面活性剂，更佳地包括十二烷基硫酸钠；
所述酶解过程中，所述盐酸乙醇溶液中盐酸的浓度为0.005～0.015mol/L，乙醇的质量百分比为4％～10％；
所述酶解过程中，所述冻干后的物料与所述盐酸乙醇溶液的质量体积比为0.005～0.05g/mL，较佳地为0.005～0.02g/mL；
所述酶解过程中，所述冻干后的物料与所述胃蛋白酶的质量比为(8～15)：1，较佳地为(9～12)：1；
所述酶解过程中，所述酶解的时间为70～80h；
所述酶解后的所述透析过程中，所述透析采用的透析袋的截留分子量为40～60kD；以及
所述酶解后的所述透析过程中，所述透析的时间为40～100h。
9.一种止血微球颗粒，其特征在于，由如权利要求1～8中任意一项所述的止血微球颗粒的制备方法制得。
10.一种如权利要求9所述的止血微球颗粒作为原料在制备止血材料中的应用；
所述止血材料的剂型为粉剂。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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