CN103495204A - 负载细胞外全基质的壳聚糖/纳米羟基磷灰石缓释微球及其制备方法 - Google Patents

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本发明公开了负载细胞外全基质的/壳聚糖/纳米羟基磷灰石缓释微球及其制备方法。该方法包括如下步骤：1)将细胞外全基质溶液与壳聚糖溶液和纳米羟基磷灰石混合，得到细胞外全基质/壳聚糖/纳米羟基磷灰石溶液；2)将液体石蜡、Span-80和所述细胞外全基质/壳聚糖/纳米羟基磷灰石溶液混合，乳化，得到乳化液；3)将所述乳化液与异丙醇、戊二醛溶液混合，分散并交联固定，得到负载细胞外全基质的壳聚糖/纳米羟基磷灰石缓释微球。实验证明，该微球将壳聚糖作为细胞外全基质和纳米羟基磷灰石缓慢释放的载体，能够实现细胞外全基质的缓慢释放，同时纳米羟基磷灰石也将缓慢释放。负载细胞外全基质的壳聚糖/纳米羟基磷灰石缓释微球，是很有潜力的骨组织工程修复材料。

Description

负载细胞外全基质的壳聚糖/纳米羟基磷灰石缓释微球及其制备方法
技术领域
本申请涉及一种负载细胞外全基质的/壳聚糖/纳米羟基磷灰石缓释微球及其制备方法。
背景技术
很多异种细胞外基质材料已经应用于临床治疗中，比如：异种心脏瓣膜、小肠黏膜下层、膀胱基质等。骨组织工程中非常有潜力的修复材料是细胞外基质，经研究猪膀胱源性的细胞外全基质具有非常高的进化保守性，其成份主要包括：胶原(I、III和Ⅳ-Ⅶ)、糖蛋白(纤连蛋白、层粘连蛋白)、糖胺多糖和各种生长因子(包括TGF-β、b-FGF、VEGF等)，从仿生学角度看该细胞外全基质更接近细胞生长所需的天然微环境状态，可以作为骨组织工程的细胞外基质材料。
骨组织由24％的有机成份和75％的无机成份组成，无机成份则主要是羟基磷灰石。纳米羟基磷灰石具有更好的理化性能和生物学效应，比如比表面积大、生物活性度高、吸附能力强、生物相容性好等优点，是极具潜力的人体硬组织修复材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种负载细胞外全基质的壳聚糖/纳米羟基磷灰石缓释微球及其制备方法。
本发明所提供的制备负载细胞外全基质的壳聚糖/纳米羟基磷灰石缓释微球的方法，包括如下步骤：
1)将细胞外全基质溶液与壳聚糖溶液和纳米羟基磷灰石混合，得到细胞外全基质/壳聚糖/纳米羟基磷灰石溶液；
2)将液体石蜡、Span-80和所述细胞外全基质/壳聚糖/纳米羟基磷灰石溶液混合，乳化，得到乳化液；
3)将所述乳化液与异丙醇、戊二醛溶液混合，分散并交联固定，抽滤、高速离心、冷冻干燥后得到负载细胞外全基质的壳聚糖/纳米羟基磷灰石缓释微球。
上述方法中，步骤1)中，所述细胞外全基质溶液与壳聚糖和纳米羟基磷灰石的质量比为2：2：1。
上述方法中，所述细胞外全基质溶液中细胞外全基质的浓度为100g/L。
上述方法中，步骤2)中，液体石蜡和所述细胞外全基质/壳聚糖/纳米羟基磷灰石溶液的配比为200mL：20mL。
上述方法中，步骤2)中，所述乳化的时间为1.5h，乳化的温度为40℃。
上述方法中，步骤3)中，所述混合的方法为：向所述乳化液中加入20mL异丙醇分散10min，再逐滴加入0.5mL250g/L戊二醛溶液交联固定。
上述方法中，步骤3)中，所述交联固化的时间是4h。
上述方法中，所述纳米羟基磷灰石按照如下方法制备：将100mL0.1mol/LCa(NO3)2.4H2O溶液加入到100mL0.06mol/L Na2HPO4溶液中，搅拌10min，调pH至7；将溶液放入微波炉中，在260W功率下反应10min，然后用去离子水洗涤，直至滤液pH值为7，取过滤后的产物，即为纳米羟基磷灰石。
由上述任一所述方法制备得到的负载细胞外全基质的壳聚糖/纳米羟基磷灰石微球也属于本发明的保护范围。
所述微球的粒径范围为3.52～29.65μm。
实验证明，利用本发明方法能够成功制备得到具有缓释效果的负载细胞外全基质的壳聚糖/纳米羟基磷灰石微球。该微球将壳聚糖作为细胞外全基质和纳米羟基磷灰石缓慢释放的载体，通过模拟细胞生长的天然微环境，更持久更全面的促进成骨细胞的成骨作用和血管内皮细胞的血管化，同时纳米羟基磷灰石也将缓慢释放，弥补了生物支架材料强度不足的弊端。负载细胞外全基质的壳聚糖/纳米羟基磷灰石缓释微球，能够持久缓慢的释放细胞外全基质和纳米羟基磷灰石，更贴近成骨细胞生长的微环境，增加了骨的强度，是很有潜力的骨组织工程材料。
具体实施方式
实施例1、缓释微球的制备及性能检测
一、制备
1、纳米羟基磷灰石的制备：将100mL0.1mol/L Ca(NO3)2.4H2O溶液加入到100mL0.06mol/L Na2HPO4溶液中，搅拌10min，其pH＝7。将溶液放入微波炉中，在260W功率下反应10min，然后用去离子水洗涤，直至滤液pH值为7.0，将过滤后的产物在70℃下烘干后备用。
2、猪膀胱源性细胞外全基质制备：将重约100～120kg猪，取其膀胱并剪掉外面的结缔组织包括脂肪组织。膀胱残余尿液通过自来水反复冲洗干净。将膀胱浸泡在1mol/L Nacl溶液中，其浆膜层、肌层、黏膜下层剥落。剩余的黏膜基底层、固有层即猪膀胱源性的细胞外全基质(P-UBM)，通过0.1％(v/v)过氧乙酸；4％(v/v)酒精和96％(v/v)无菌水进行脱细胞和消毒处理2小时。随后P-UBM用PH7.4PBS冲洗两次约15分钟；用去离子水冲洗两次约15分钟，隔离干燥。将组织剪成小块并浸没在液氮中。将P-UBM在冷冻干燥机中脱水干燥处理，将干燥处理的P-UBM放入搅拌机中破碎以获得足够小的颗粒，将这些颗粒填入旋转的刀型磨粉机中研磨，然后通过过滤器过滤后得到直径约20um的粉末。最后的P-UBM颗粒需检查是否有残留细胞的内容物，通过10％中性福尔马林缓冲液固定、石蜡包埋、DAPI和苏木精-伊红染色切片显微镜下观察发现无细胞残留。
3、负载细胞外全基质的壳聚糖/纳米羟基磷灰石缓释微球的制备：将细胞外全基质粉末加入双蒸水中加热至40℃得到100g/L的细胞外全基质溶液，冷却至10℃；100mL2％(质量分数)乙酸水溶液中加入1g壳聚糖粉末，磁力搅拌溶解，去气泡后得到稳定溶液。按细胞外全基质溶液、壳聚糖、羟基磷灰石质量比为2：2：1通过超声和磁力搅拌混合。在500mL烧杯中加入200mL液体石蜡，1mL Span-80，磁力搅拌下逐滴加入细胞外全基质/壳聚糖/纳米羟基磷灰石溶液20mL，使水油比达1：10(水油比是指细胞外全基质/壳聚糖/纳米羟基磷灰石溶液与液体石蜡的体积比)，40℃下搅拌，超声细胞粉碎仪下超声乳化1.5h后，得到乳白色乳化液，迅速在0～5℃冰浴15min，加入20mL异丙醇分散10min，逐滴加入0.5mL250g/L戊二醛于乳液中，使微球交联固定4h。反应完成后用异丙醇、无水乙醚反复冲洗，用3号砂芯漏斗真空抽滤，高速离心机中离心，所得微球置于冷冻干燥仪中干燥即得复合微球。
二、性能表征
1、缓释微球的形态特征：扫描电镜观察缓释微球表面形态显示：微球分散均匀，无粘连现象，形态呈球形，体表面光滑，粒径比较均匀，粒径范围3.52～29.65μm，微球粒径分布较窄。
2、缓释微球缓释率测定并绘制缓释曲线。检测方法：采用动态透析法，在透析袋中加入适量复合微球，透析袋外放100mL生理盐水，置37℃恒温水浴振荡器内保温振荡，按5min，30min，6h，12h，24h，36h，48h，60h，72h等定时取样，从透析袋外容器中取0.5mL样品，并及时补充同温生理盐水。采用高效液相色谱法测定样品中细胞外全基质浓度，代入标准曲线方程，计算释放度。
结果，前36h内全细胞外基质累计释放率达50％，其后释放逐渐平稳，至第10天释放率达95％。
3、缓释微球浸提液细胞毒性实验：参照《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》所要求方法MTT实验证实微球浸提液培养成骨细胞I、3和5天后，细胞相对增殖率均大于90％。根据ISO和医学材料生物学标准，材料毒性分级I级，表明材料无细胞毒性，均为合格。

Claims (10)

1.一种制备负载细胞外全基质的壳聚糖/纳米羟基磷灰石微球的方法，包括如下步骤：
1)将细胞外全基质溶液与壳聚糖溶液和纳米羟基磷灰石混合，得到细胞外全基质/壳聚糖/纳米羟基磷灰石溶液；
2)将液体石蜡、Span-80和所述细胞外全基质/壳聚糖/纳米羟基磷灰石溶液磁力搅拌下混合，超声乳化，得到乳化液；
3)将所述乳化液与异丙醇、戊二醛溶液混合，分散并交联固定，得到负载细胞外全基质的壳聚糖/纳米羟基磷灰石。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述细胞外全基质溶液与壳聚糖和纳米羟基磷灰石的质量比为2：2：1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述细胞外全基质溶液中细胞外全基质的浓度为100g/L。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：步骤2)中，液体石蜡和所述细胞外全基质/壳聚糖/纳米羟基磷灰石溶液的配比为200mL：20mL。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述乳化的时间为1.5h，乳化的温度为40℃。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述混合的方法为：向所述乳化液中加入20mL异丙醇分散10min，再逐滴加入0.5mL250g/L戊二醛溶液。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述交联固化的时间是4h。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述纳米羟基磷灰石按照如下方法制备：将100mL0.1mol/L Ca(NO3)2.4H2O溶液加入到100mL0.06mol/LNa2HPO4溶液中，搅拌10min，调pH至7；将溶液放入微波炉中，在260W功率下反应10min，然后用去离子水洗涤，直至滤液pH值为7，取过滤后的产物，即为纳米羟基磷灰石。
9.由权利要求1-8中任一所述方法制备得到的负载细胞外全基质的壳聚糖/纳米羟基磷灰石微球。
10.根据权利要求9所述的微球，其特征在于：所述微球的粒径范围为3.52～29.65μm。
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