JP2009542383A - 架橋治療用組成物を製造するためのゼラチンおよび架橋剤の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
特に本発明は、ヒトまたは動物における椎間板、軟骨、半月板、腱または骨に対する損傷を治療するためのこのような治療用組成物の使用に関する。
i. ゼラチンおよび架橋剤が互いに混合されて架橋治療用組成物を形成し、これが次に標的領域に投与されるか;あるいは
ii. ゼラチンおよび架橋剤が別個の形態で提供され、そして標的領域に同時にまたは連続的に投与されて、架橋治療用組成物の形成を伴う
ことを包含する使用が、本発明に従って提示される。
i. ゼラチンおよび架橋剤が互いに混合されて架橋組成物を形成し、これが次に標的領域に投与されるか;あるいは
ii. ゼラチンおよび架橋剤が別個の形態で提供され、そして標的領域に同時にまたは連続的に投与されて、架橋組成物の形成を伴う
ことを包含する使用にも関する。
コラーゲンに対比して、ゼラチンは限定された且つ再現可能な組成物で、ならびに高純度で得られる。特にそれは、身体の防御反応を誘発し得る免疫原性テロペプチドを実際には含有しない。これに基づいて、ゼラチンは優れた組織および細胞適合性を有し、これはアルギン酸塩またはキトサンのような他の再吸収可能な生体材料により保証され得ない。
非架橋ゼラチンは身体温度(37℃)で可溶性であるが、それは、架橋することにより、すでに言及されているようにこれらの条件で不溶性であるゲル様形態、すなわち架橋ゼラチンゲルに変更され得る。このようなゼラチンゲルは、細胞の成長および分化のための細胞マトリックスとして役立ち得る。
治療用組成物の生体適合性をさらに改善するためには、特に低含量の内毒素を有するゼラチンを用いるのが好ましい。内毒素は、生動物材料中に生じる微生物の代謝産物または断片である。
できるだけ低い内毒素の含量を保持するためには、ゼラチン製造の経過中にできるだけ早く微生物を破壊することが有益である。さらに適切な衛生学標準が、製造工程中に維持されるべきである。
共有結合を形成するゼラチンと反応する化学的架橋剤も、本発明の枠組み内で用いられ得る。これらは、好ましくは、多機能性アルデヒド、イソシアネート、ハロゲン化物またはイミド、特にホルムアルデヒドに関する。しかしながら、化学的架橋剤を選択する場合、これが、例えばグルタルアルデヒドを用いる場合と同様に、身体に如何なる細胞傷害性作用を及ぼさない、ということが保証されるべきである(例えば特許文書DE 101 52 407 A1参照)。用いられるべき架橋剤の質および身体中のそれぞれの標的領域はともに、考え得る有害作用を査定する場合、考慮されるべきである。
固体混合物の溶解は、それぞれの標的領域における予定温度に基づいて、水溶液の投与の直前に、即ち特に前もって10分未満に、好ましくは5分未満に起こるべきである。
本発明の上記変法(ii)の場合、ゼラチンおよび架橋剤が別個の形態で提供され、そして同時にまたは連続的に適用されて、架橋治療用組成物を形成するよう、組成物の適用が生じる。この場合、2つの構成成分の混合は、以下に記載されるように、異なる時点で起こり得る。
代替的には、水性ゼラチン溶液および水性架橋剤溶液を、一方を他方の後に標的領域に投与することも可能である。この場合、ゼラチンのみの架橋が標的領域で起こる、ということも保証される。
本発明の好ましい一実施形態では、減圧での熱前処理を予め受けたゼラチンが用いられる。このような前処理の結果として、ゼラチンの粘度は増大され得るが、この場合、この作用は主にゼラチン分子内の水の熱排除に起因する。
ゲル形成は、付加的に、ゼラチンの分子量によっている。この場合、不溶性ゼラチンゲルは、より低い分子量を有するゼラチンの場合よりも少数の架橋点で早くも得られるため、高平均分子量、特に140kDaまたはそれより大きい分子量を有するゼラチンの使用が好ましい。
この場合、椎間板損傷は、椎間板の、特に髄核(ゼラチン状コア)または繊維輪(椎間板の保護繊維環)の領域における、組織の任意の変性またはその自然の機能に対する損傷を意味すると理解される。加齢に伴って、他の作用因子によって、椎間板のゼラチンコアにおけるおよび/または繊維輪における細胞の活力度の低減が生じ、これは次に、これらの細胞からの細胞外マトリックスの産生低減を生じるだけであるかまたはさらなる産生を全く生じない。しかしながらこの細胞外マトリックスは、多量の水を結合し得るため、弾性に関して、したがって椎間板の緩衝作用に関して決定的に重要である。すでに言及されたように、この変性の結果として、椎間板の機能の実質的損失は慢性疼痛を伴って起こり、あるいは椎間板ヘルニアは繊維輪の擦り切れまたは損傷の結果として起こり得る。
供給および投与のこれらのおよびさらなる変法は、すでに上記されている。両方の場合、投与は注入により最小侵襲的やり方で実行され得るが、この場合、多室注入装置は、好ましくは上記のような第二変法を実行するために用いられる。
単一溶液の投与が生じる場合、成長因子および/または細胞の供給は、特に、適切な液体媒質中の溶液または細胞懸濁液の形態で生じ得る。本発明の好ましい一実施形態では、ゼラチンおよびトランスグルタミナーゼからなる固体混合物は次に、処置医によりこの溶液または細胞懸濁液中に溶解される。すでに記載されたように、ゼラチンは、37℃またはそれ未満の温度で可溶性であるよう、この場合に大部分は非晶質形態で存在する。
用いられる細胞は自系起源のものであり、即ちそれらは患者それ自体から得られたし、同種異系起源のもの、即ちドナーからのものでもあり得た。
同様に、椎間板損傷と関連して記載されているように、本発明の治療用組成物は、半月板あるいは関節または非関節軟骨の領域にも適用され得る。これに基づいて、本発明は、損傷半月板または軟骨の再生のための架橋治療用組成物を製造するためのゼラチンおよび架橋剤の使用にも関する。
本発明のこれらのならびにさらなる利点を、図面を参照しながら以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明する。
本発明による治療用組成物の医学的適用のためのモデル系として、酵素架橋剤トランスグルタミナーゼによるゼラチンの架橋をin vitroで実行し、架橋ゼラチンゲルの形成の動態を確定する。
ヒトケラチノサイトからの組換えトランスグルタミナーゼをこの実施例、ならびに下記の実施例のために用いた。
室温で蒸留水中に対応する量の酵素を溶解することにより、30単位/mlの濃度を有するトランスグルタミナーゼのストック溶液を生成した。溶液を濾過により滅菌し、液体窒素を用いて各々1.5 mlで一部ずつ凍結して、約-18℃で貯蔵した。代替的には、一部を+4℃で貯蔵し得る。
トランスグルタミナーゼによる架橋のために、異なる粘度を有するブタ皮膚ゼラチンを、以下の表1に従って用いた。この場合の粘度の明細は、60℃でのゼラチンの6.7重量%水溶液の粘度に関する。
粉砕形態の約700 gのゼラチンがそれぞれ、回転蒸発器により105℃で4時間、約14 mbarの真空下で保持されるよう、減圧でのゼラチンの熱前処理を実行した。次にゼラチンを閉鎖容器中で一晩冷却させた。
4つのゼラチンA、B、CおよびDの各々に関して、30容量%のPBS緩衝液(pH7.2)および70容量%の蒸留水を含む混合物中にゼラチンの10重量%溶液を生成した。このために、ゼラチンを60℃で溶解し、その結果生じた均質溶液の温度を37℃に調節した。
治療的適用に広く用いられる条件にできるだけ近づくために、37℃の一定温度で架橋反応のすべてを実行した。各バッチに関して、10重量%ゼラチン溶液5 mlを、直径3 cmの円筒形容器中に入れ、その温度を、アルミニウムブロックにより37℃に調節した。0.3 mlのトランスグルタミナーゼストック溶液(30単位/ml)および0.9 mlの蒸留水(各々37℃に予熱)を付加し、その結果生じた反応混合物を直ちに十分に混合することにより、架橋反応を開始させた。これは、ゼラチンに比して18単位/gの酵素量に対応する。
架橋反応の経過中、反応混合物のゲル強度および粘着性を、タイプZwick BZ 2.5/TN1S(メーカー:Zwick GmbH & Co. KG, Ulm)の力/距離測定装置により、50秒の間隔で確定した。
各測定サイクルで、即ち50秒毎に、12.7 mmの直径を有する円形プランジャを、それに直角に反応混合物の表面中に4 mmの深さで押し込むかまたは押し付けて、これに必要な力を測定する。次に研磨ポリメチルメタクリレート表面を有するプランジャを再び上方に引く。架橋ゼラチンゲルがすでに存在する場合、これはその除去中にプランジャに接着する。ゼラチンゲルが分離する程度に上方にプランジャを引張るために必要な力も測定する。
バッチA〜Dの異なるゲル点を以下の表2に列挙するが、この場合、値はそれぞれ3つの実験から平均する。
この実施例では、実施例1からの熱前処理ゼラチンCを、異なるゼラチン濃度で、トランスグルタミナーゼで架橋した。反応混合物の調製およびゲル強度の測定を、実施例1に記載したように実行した。
用いられるゼラチン溶液の濃度、反応混合物の組成およびゲル強度測定から生じるゲル点を、以下の表3に示す。
この実施例では、実施例1からの熱前処理ゼラチンを異なる量のトランスグルタミナーゼで架橋した。
ゼラチンCの5重量%溶液を、実施例1に記載したように生成した。各バッチに関して、この溶液5.9 mlを37℃に予熱し、架橋反応を開始するために、以下の表4に明記した量のトランスグルタミナーゼストック溶液(30単位/ml、37℃に加熱)と混合した。ゲル強度測定によるゲル点の確定は、実施例に記載したように生じた。
この実施例では、実施例1からのゼラチンCを、異なる濃度で、細胞の培養に特に十分に適した緩衝溶液中の異なる量のトランスグルタミナーゼを用いて架橋した。このために、80容量%の細胞培地DMEM/F12(ダルベッコ変法イーグル培地、Bio Whittaker)および20容量%のFB血清(ウシ胎仔血清、PAA Laboratories)の混合物中で、水性ゼラチン溶液を生成した。別の状況では、架橋反応およびゲル強度の測定を、表5にそれぞれ明示した比率で、実施例1に記載したように実行した。
この実施例では、標準部ルーム試験の条件下でゲル化しないゼラチンを用いた。魚皮膚から得られるこのゼラチンは、以下のように特性化される:
ゲル強度: 0 gブルーム
粘度(6.7重量%、60℃) 2.1 mPa・s
伝導度: 115 μS
分子量(GPC): 70,840 Da
実施例1に記載した手順に従って、魚ゼラチンを、異なる濃度で、異なる量のトランスグルタミナーゼと混合した。それぞれの比率、ゲル点およびゲル強度は、以下の表6から明らかである。
異なるゼラチン型の、例えば魚ゼラチンと畜牛骨ゼラチンまたはブタ皮膚ゼラチンとの混合物の使用は、架橋治療用組成物のゲル点およびゲル強度に影響を及ぼすさらなる可能性(ゼラチンおよび架橋剤濃度の変動のほかに)を提供する。
この実施例では、ゼラチンを先ず部分(一次)架橋ステップに付して、ゲル溶液の初期粘度を増大し、実(この場合は二次)架橋ステップにおける有意に速いゲル形成を得た。
ブルーム値250 gおよび粘度6.6 mPa・s(60℃で6.7重量%)を有するブタ骨から作製されるゼラチンを、部分架橋ゼラチンの製造のための出発材料として役立てた。先ず室温で45分間ゼラチンを膨潤させて、次にそれを60℃で1時間溶解することにより、蒸留水中のこのゼラチンの10重量%溶液を調製した。次に溶液の温度を50℃Cに調節して、1.5単位のトランスグルタミナーゼ/ゼラチン1 gの量が存在するよう、対応量のトランスグルタミナーゼストック溶液(30単位/ml)を付加した。部分架橋を実行するために、溶液を撹拌しながら50℃に2時間保持した。
初期ゼラチンP0ならびに部分架橋ゼラチンP2およびP3の60℃および37℃でのブルーム値および粘度を、以下の表7に示す。
測定結果を、以下の表8に列挙する。
本実施例は、6単位のトランスグルタミナーゼ/ゼラチン1 gを含有する固体混合物の製造を記載する。
実施例1からのゼラチンA(290 gブルーム値を有するブタ皮膚ゼラチン)75 gを、425 gの蒸留水中で膨潤させて、60℃で溶解した。溶液を45℃に冷却させて、15 mlのトランスグルタミナーゼストック溶液(30 U/ml、実施例1参照)と混合し、十分に混ぜ合わせた。2つの凍結乾燥トレーを液体窒素で冷却し、ゼラチンおよびトランスグルタミナーゼを含有する溶液をそこに撒き散らして、液体窒素を用いて凍結させた。凍結溶液を、Lyovac GT2凍結乾燥設備(メーカー:AMSCO Finn-Aqua GmbH, Hurth)中で2日間凍結乾燥した。
同一比率で上記の手順を反復することにより、しかしゼラチンAの代わりに冷水溶性インスタントゼラチンを用いることにより、さらなる固体混合物を製造した。このインスタントゼラチンは、その溶解性を改良するための割合の低分子ゼラチン加水分解物を含有する。
ゼラチンおよび架橋剤のこのような凍結乾燥固体混合物は、本発明の枠組み内で有益に用いられ得る。混合物は、室温で提供されるかまたは冷却され、次に、処置医により37℃またはそれ未満で、投与されるべき細胞をおそらくは含有する水溶液中で溶解され得る。
この実施例では、架橋ゼラチンゲル中のブタ軟骨細胞の活力度を、数日間に亘って検査した。
この場合、約17重量%のゼラチン濃度および16単位のトランスグルタミナーゼ/ゼラチン1 gの量を選択した。
35容量%のハンクス緩衝液および75容量%の蒸留水の混合物中に60℃でゼラチンを溶解することにより、実施例1からのゼラチンの20重量%溶液を生成した。ゼラチンの結果として増大される溶液のモル浸透圧濃度を少なくとも部分的に補償するために、水によるハンクス緩衝液の希釈を実行した。
この結果は、本発明による組成物から形成されるゼラチンゲルが哺乳類細胞の細胞成長を手助けするマトリックスとして作用し得る、ということを示す。
この実施例では、ヒト軟骨細胞の成長行動に及ぼす架橋ゼラチンゲルの作用を検査した。この場合、一定濃度の架橋剤トランスグルタミナーゼを用いて、異なるゼラチン濃度を試験した。
5つのバッチの各々に関して、以下の表9によるそれぞれの濃度を有する実施例1からのゼラチンAの溶液250 μlを用いた。48ウエル細胞培養プレートのウエル中で250,000個のヒト軟骨細胞を各溶液に植え付けて、40℃の温度でトランスグルタミナーゼストック溶液(30 U/ml)12.5 μlと混合し、そして37℃で1週間インキュベートした。比較のために、バッチ9-4にはトランスグルタミナーゼを付加せず、そしてバッチ9-5中には、ゼラチン溶液の代わりに緩衝液を用いた。結果を表9に示す。
この試験は、ヒトに冠する好ましい成長および生存条件は、ゼラチン濃度の適切な選択により達成され得る、ということを示す。
Claims (67)
- ヒトまたは動物身体の標的領域における細胞マトリックスとしての架橋ゼラチンゲルを形成する架橋治療用組成物を製造するためのゼラチンおよび架橋剤の使用であって、
i. ゼラチンおよび架橋剤が互いに混合されて架橋治療用組成物を形成し、これが次に標的領域に投与されるか;あるいは
ii. ゼラチンおよび架橋剤が別個の形態で提供され、そして標的領域に同時にまたは連続的に投与されて、架橋治療用組成物の形成を伴う
ことを包含する使用。 - 培養されるべき細胞と混合される、そして標的領域における細胞のin vitro培養のための細胞マトリックスとしての架橋ゼラチンゲルを形成する架橋組成物を製造するためのゼラチンおよび架橋剤の使用であって、
i. ゼラチンおよび架橋剤が互いに混合されて架橋組成物を形成し、これが次に標的領域に投与されるか;あるいは
ii. ゼラチンおよび架橋剤が別個の形態で提供され、そして標的領域に同時にまたは連続的に投与されて、架橋組成物の形成を伴う
ことを包含する使用。 - ゼラチンが豚ゼラチンである請求項1または2記載の使用。
- ゼラチンが魚ゼラチン、特に冷水魚から得られるゼラチンである請求項1または2記載の使用。
- ゼラチンが異なる起源および/または異なる種類のゼラチン材料の混合物である請求項4記載の使用。
- ゼラチンが1200 I.U./gまたはそれ未満、特に200 I.U./gまたはそれ未満のLAL試験により確定される内毒素含量を有する請求項1〜5のいずれか1項に記載の使用。
- 架橋剤が多機能性アルデヒド、イソシアネート、ハロゲン化物およびイミドから選択される請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用。
- 架橋剤が複合架橋剤を含む請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用。
- 複合架橋剤が改質セルロースを含む請求項8記載の使用。
- 架橋剤が酵素を含む請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用。
- 架橋剤がトランスグルタミナーゼを含む請求項10記載の使用。
- トランスグルタミナーゼが細菌トランスグルタミナーゼである請求項11記載の使用。
- トランスグルタミナーゼがヒトトランスグルタミナーゼである請求項11記載の使用。
- トランスグルタミナーゼが組換え遺伝子発現により産生される請求項11〜13のいずれか1項に記載の使用。
- トランスグルタミナーゼが支持材料上に固定される請求項11〜14のいずれか1項に記載の使用。
- 支持材料がオリゴ糖を含む請求項15記載の使用。
- (i)による組成物が水溶液であり、これが架橋剤およびゼラチンを溶液中に含有する請求項1〜16のいずれか1項に記載の使用。
- 水溶液が固体混合物を溶解することにより製造され、これがゼラチンおよび架橋剤を凍結乾燥形態で含む請求項17記載の使用。
- 固体混合物の溶解が10分未満、好ましくは5分未満生じた後、標的領域の予定温度に基づいて水溶液が適用される請求項18記載の使用。
- 固体混合物の溶解が37℃またはそれ未満の温度で生じる請求項18または19記載の使用。
- ゼラチンが少なくとも主として非晶質形態で存在する請求項18〜20のいずれか1項に記載の使用。
- 架橋剤がトランスグルタミナーゼであり、これが0.6〜80単位/ゼラチン1 gの量で固体混合物中に含入される請求項18〜21のいずれか1項に記載の使用。
- トランスグルタミナーゼが5〜40単位/ゼラチン1 gの量で固体混合物中に含入される請求項22記載の使用。
- (ii)による変法が水性ゼラチン溶液および別個の水性架橋剤溶液の形態で提供される請求項1〜16のいずれか1項に記載の使用。
- ゼラチン溶液および架橋剤溶液が投与前に混合される請求項24記載の使用。
- ゼラチン溶液および架橋剤溶液が同時に投与される請求項24記載の使用。
- 同時投与ゼラチン溶液および架橋剤溶液の十分な混合が標的領域に到達する前に生じる請求項26記載の使用。
- ゼラチン溶液および架橋剤溶液の同時投与が多室アプリケーター、特に注射用具による注射により実行される請求項24〜27のいずれか1項に記載の使用。
- アプリケーターが混合素子を含み、これがゼラチン溶液および架橋剤溶液を注射中にしっかり混合させる請求項28記載の使用。
- (ii)による変法が水性ゼラチン溶液および固体形態の架橋剤の形態で提供される請求項1〜16のいずれか1項に記載の使用。
- 架橋剤が投与前にゼラチン溶液に溶解される請求項30記載の使用。
- 水性ゼラチン溶液の投与が37℃またはそれ未満の温度で起こる請求項17〜31のいずれか1項に記載の使用。
- 組成物中のゼラチン濃度が5〜20重量%になる請求項1〜32のいずれか1項に記載の使用。
- 架橋剤がトランスグルタミナーゼであり、これが0.6〜80単位/ゼラチン1 gの量で組成物中に含入される請求項1〜33のいずれか1項に記載の使用。
- トランスグルタミナーゼが5〜40単位/ゼラチン1 gの量で組成物中に含入される請求項34記載の使用。
- 標的領域の予定温度に基づいて架橋ゼラチンゲルのゲル点が架橋反応の開始後5〜180分に到達される請求項1〜35のいずれか1項に記載の使用。
- 標的領域の予定温度に基づいて架橋ゼラチンゲルのゲル点が架橋反応の開始後10〜60分、好ましくは25分までに到達される請求項36記載の使用。
- 細胞マトリックスを形成する架橋ゼラチンゲルが4 mmの浸透深度で12.7 mmの直径を有するプランジャで測定された100 gまたはそれより大きいゲル強度を有する請求項1〜37のいずれか1項に記載の使用。
- ゼラチンが60℃で6.7重量%水溶液中で測定される7 mPa・sまたはそれより大きい粘度を有する請求項1〜38のいずれか1項に記載の使用。
- ゼラチンが減圧での熱前処理を受けた請求項1〜39のいずれか1項に記載の使用。
- 熱前処理が80〜160℃の温度で実行される請求項40記載の使用。
- ゼラチンが140 kDaまたはそれより大きい平均分子量を有する請求項1〜41のいずれか1項に記載の使用。
- ゼラチンが異なる粘度および/またはブルーム値を有する2またはそれより多くのゼラチンを含む請求項1〜43のいずれか1項に記載の使用。
- ゼラチンが部分架橋される請求項1〜43のいずれか1項に記載の使用。
- ゼラチンがトランスグルタミナーゼを用いて部分架橋される請求項44記載の使用。
- ゼラチンが10単位未満のトランスグルタミナーゼ/ゼラチン1 g、特に1〜3単位/ゼラチン1 gを用いて部分架橋される請求項45記載の使用。
- 組成物が成長および/または分化因子を含む請求項1〜46のいずれか1項に記載の使用。
- 組成物が抗炎症物質および/または抗生物質を含む請求項1〜47のいずれか1項に記載の使用。
- 組成物が生きている細胞を含む請求項1〜48のいずれか1項に記載の使用。
- 細胞が椎間板細胞である請求項49記載の使用。
- 細胞が軟骨細胞である請求項49記載の使用。
- 細胞が間充織幹細胞である請求項49記載の使用。
- 細胞が骨または骨膜細胞である請求項49記載の使用。
- 細胞が腱細胞である請求項49記載の使用。
- 細胞が自系または同種異系起源のものである請求項49〜54のいずれか1項に記載の使用。
- 組成物が生きた細胞を含有する粉砕組織を含む請求項49〜55のいずれか1項に記載の使用。
- 細胞がゼラチンおよびおそらくは架橋剤を含有する水溶液中に含入される請求項49〜56のいずれか1項に記載の使用。
- 組成物が成長および/または分化因子を含む請求項1〜57のいずれか1項に記載の使用。
- 組成物が抗炎症物質および/または抗生物質を含む請求項1〜58のいずれか1項に記載の使用。
- 椎間板損傷の治療のための架橋治療用組成物を製造するための請求項1または3〜59のいずれか1項に記載の使用。
- 標的領域が椎間板の髄核および/または繊維輪である請求項60記載の使用。
- 軟骨、半月板、骨または腱損傷の治療のための組成物を製造するための請求項1または3〜59のいずれか1項に記載の使用。
- 凍結乾燥形態でゼラチンおよびトランスグルタミナーゼを含む固体混合物。
- 別個の小室中に水性ゼラチン溶液および水性架橋剤溶液を含有する多室アプリケーター。
- 水性ゼラチン溶液および/または架橋剤溶液が成長および/または分化因子を含有する請求項64記載のアプリケーター。
- 水性ゼラチン溶液および/または架橋剤溶液が抗炎症物質および/または抗生物質を含有する請求項64または65記載のアプリケーター。
- 水性ゼラチン溶液および/または架橋剤溶液が生きている細胞を含有する請求項64〜66記載のアプリケーター。
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