RU2628697C2 - Способ получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки - Google Patents
Способ получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки Download PDFInfo
- Publication number
- RU2628697C2 RU2628697C2 RU2013143307A RU2013143307A RU2628697C2 RU 2628697 C2 RU2628697 C2 RU 2628697C2 RU 2013143307 A RU2013143307 A RU 2013143307A RU 2013143307 A RU2013143307 A RU 2013143307A RU 2628697 C2 RU2628697 C2 RU 2628697C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- retinal pigment
- cell
- pigment epithelial
- collagen
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 333
- 210000000844 retinal pigment epithelial cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 109
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 80
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 17
- 210000003583 retinal pigment epithelium Anatomy 0.000 claims abstract description 55
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims abstract description 38
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 22
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 claims description 66
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 claims description 56
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 50
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 50
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 50
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 46
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 46
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 46
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 42
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 27
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 20
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 7
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000007747 plating Methods 0.000 claims description 7
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000049 pigment Substances 0.000 claims description 5
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 claims description 2
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 16
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 147
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 41
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 21
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 20
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 19
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 15
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 12
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 9
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 8
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 6
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 6
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 6
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 6
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 5
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 5
- 206010025421 Macule Diseases 0.000 description 5
- 239000000823 artificial membrane Substances 0.000 description 5
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 238000012014 optical coherence tomography Methods 0.000 description 5
- 239000000790 retinal pigment Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 4
- 210000001775 bruch membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 238000004299 exfoliation Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 4
- 102100022794 Bestrophin-1 Human genes 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 3
- 101000903449 Homo sapiens Bestrophin-1 Proteins 0.000 description 3
- 101001078886 Homo sapiens Retinaldehyde-binding protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000729271 Homo sapiens Retinoid isomerohydrolase Proteins 0.000 description 3
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100028001 Retinaldehyde-binding protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 102100031176 Retinoid isomerohydrolase Human genes 0.000 description 3
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 3
- 102100022356 Tyrosine-protein kinase Mer Human genes 0.000 description 3
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- -1 and the like Substances 0.000 description 3
- 108010018804 c-Mer Tyrosine Kinase Proteins 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 238000013534 fluorescein angiography Methods 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 3
- 230000000649 photocoagulation Effects 0.000 description 3
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101000883515 Homo sapiens Chitinase-3-like protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 102100035846 Pigment epithelium-derived factor Human genes 0.000 description 2
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 2
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 102000054350 human CHI3L1 Human genes 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 108090000102 pigment epithelium-derived factor Proteins 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000001164 retinal progenitor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 11-cis-retinal Chemical compound O=C/C=C(\C)/C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KXGFMDJXCMQABM-UHFFFAOYSA-N 2-methoxy-6-methylphenol Chemical compound [CH]OC1=CC=CC([CH])=C1O KXGFMDJXCMQABM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JMMZCWZIJXAGKW-UHFFFAOYSA-N 2-methylpent-2-ene Chemical compound CCC=C(C)C JMMZCWZIJXAGKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000178 Acrylic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000004925 Acrylic resin Substances 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091016585 CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101100421200 Caenorhabditis elegans sep-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 description 1
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 102100030074 Dickkopf-related protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710099518 Dickkopf-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000193159 Hathewaya histolytica Species 0.000 description 1
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 101000984042 Homo sapiens Protein lin-28 homolog A Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 229920000877 Melamine resin Polymers 0.000 description 1
- 239000004640 Melamine resin Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- OGKYMFFYOWUTKV-UHFFFAOYSA-N N-(2-aminoethyl)-5-chloroisoquinoline-8-sulfonamide Chemical compound C1=NC=C2C(S(=O)(=O)NCCN)=CC=C(Cl)C2=C1 OGKYMFFYOWUTKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000003940 Occludin Human genes 0.000 description 1
- 108090000304 Occludin Proteins 0.000 description 1
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 101150081664 PAX6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 102100025460 Protein lin-28 homolog A Human genes 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 206010038848 Retinal detachment Diseases 0.000 description 1
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 1
- 102100040756 Rhodopsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000820 Rhodopsin Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241001312734 Streptomyces parvulus Species 0.000 description 1
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 1
- 208000031737 Tissue Adhesions Diseases 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 101100068489 Vicia faba AGPC gene Proteins 0.000 description 1
- BZHJMEDXRYGGRV-UHFFFAOYSA-N Vinyl chloride Chemical compound ClC=C BZHJMEDXRYGGRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000122 acrylonitrile butadiene styrene Polymers 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010045569 atelocollagen Proteins 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Inorganic materials [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 1
- ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N fluorescamine Chemical compound C12=CC=CC=C2C(=O)OC1(C1=O)OC=C1C1=CC=CC=C1 ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001973 fluoroelastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000004410 intraocular pressure Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N lucigenin Chemical compound [O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.C12=CC=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C2)C2=C1C1=C(C=CC=C2)C2=[N+](C)C2=CC=CC=C12 KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 101150087532 mitF gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001568 phenolic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000005011 phenolic resin Substances 0.000 description 1
- 238000002428 photodynamic therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000608 photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920005668 polycarbonate resin Polymers 0.000 description 1
- 239000004431 polycarbonate resin Substances 0.000 description 1
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920001225 polyester resin Polymers 0.000 description 1
- 239000004645 polyester resin Substances 0.000 description 1
- 229920013716 polyethylene resin Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920005749 polyurethane resin Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000004264 retinal detachment Effects 0.000 description 1
- 210000001210 retinal vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
- A61F2/02—Prostheses implantable into the body
- A61F2/14—Eye parts, e.g. lenses, corneal implants; Implanting instruments specially adapted therefor; Artificial eyes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/54—Collagen; Gelatin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Botany (AREA)
- Dermatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки, что может быть использовано в медицине. Получают пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки на геле за счет индуцирования дифференциации стволовых клеток и клеток-предшественников ex vivo и базальную мембрану, секретированную из клеток полученного пигментного эпителия сетчатки. Изобретение позволяет получать эффективный для трансплантации и скрининга пласт клеток пигментного эпителия сетчатки. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 6 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу получения клеточного пласта, включающему высевание клеток пигментного эпителия сетчатки на коллагеновом геле. Настоящее изобретение также относится к клеточному пласту для трансплантации, содержащему слой клеток, сформированный из клеток пигментного эпителия сетчатки, и базальную мембрану.
Уровень техники
В настоящее время, возрастная дегенерация желтого пятна (AMD) представляет собой одно из главных заболеваний, вызывающих практическую слепоту в развитых странах, и наблюдается в основном у пожилых граждан в возрасте больше 50. Возрастная дегенерация желтого пятна вызывается возрастными изменениями в макуле, и разделятся в основном на экссудативную форму и атрофическую форму. Экссудативная возрастная дегенерация желтого пятна представляет собой заболевание, связанное с развитием новообразовавшихся сосудов из сосудистой оболочки глаза, в макуле пожилых граждан, затем с кровотечением и экссудативным повреждением под пигментным эпителием сетчатки или под сетчаткой, и наконец, с формированием рубцовой ткани. Атрофическая возрастная дегенерация желтого пятна представляет собой заболевание, сопровождаемое атрофией макулярной области и накоплением друзов. Предшествующее повреждение, приводящее к экссудативной и атрофической возрастной дегенерации желтого пятна, иногда упоминается, в частности, как ранняя возрастная дегенерация желтого пятна, и это повреждение также рассматривается как одна из патологий возрастной дегенерации желтого пятна.
Для лечения возрастной дегенерации желтого пятна, когда она находится в легкой экссудативной форме, может выбираться хирургическое лечение, такое как фотодинамическая терапия, лазерная фотокоагуляция, отслоение новообразовавшихся сосудов, и тому подобное, или способ лечения, имеющий целью регрессию и удаление новообразовавшихся сосудов с помощью лекарственной терапии, такой как введение ингибитора фактора роста сосудов эндотелия (VEGF), вовлеченного в ангиогенез, и тому подобное. Однако рассмотренные выше средства не могут обеспечить терапевтическую эффективность для экссудативной или атрофической формы, которая прогрессирует до запущенной атрофии или до отсутствия пигментного эпителия сетчатки (RPE). В таком случае, эффективный способ лечения представляет собой трансплантацию клеток пигментного эпителия сетчатки или самого пигментного эпителия сетчатки на место, где он отсутствует, под сетчаткой.
Опробованы разнообразные способы лечения посредством трансплантации клеток пигментного эпителия сетчатки. Сообщается, что трансплантация клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных от эмбриона человека, в форме клеточной суспензии демонстрирует плохую приживаемость трансплантируемых клеток. В случаях, когда трансплантируется клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки, содержащий также оболочку Бруха и сосудистую оболочку глаза, отсоединенную в виде пласта из глаза трупа, происходит постоперационное отторжение и не получается достаточное воздействие лечения (непатентный документ 1). В дополнение к этому, способ, использующий глаз трупа, как отмечено, включает этическую проблему. С другой стороны, сообщается о случае улучшения зрения у пациента с возрастной дегенерацией желтого пятна, когда используют способ, включающий отбор собственных нормальных клеток пигментного эпителия сетчатки пациента и сосудистой оболочки глаза и трансплантацию их в то место, где их нет, под макулой. Однако этот способ доставляет исключительно большое неудобство для пациентов и имеет исключительно высокий риск при операции. Хотя была сделана попытка использования собственных клеток пигментного эпителия радужной оболочки глаза пациента, отобранных у пациента с возрастной дегенерацией желтого пятна, для трансплантации вместо клеток пигментного эпителия сетчатки, верхний предел конечного зрения является низким и достаточное воздействие не получается, и кроме того, неудобства и риск использования собственных клеток пациента являются большими (непатентный документ 2). Таким образом, обычные способы лечения с использованием клеток, отобранных из глаза трупа, или собственных клеток пациента являются непрактичными с точки зрения этики, безопасности, воздействия, и тому подобное, и клетки пигментного эпителия сетчатки, действительно пригодные для использования при трансплантационном лечении, являются желательными.
В качестве одного из способов получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки, может быть рассмотрен способ, включающий нанесение на субстрат клеточной культуры внеклеточного матрикса, и тому подобное, и культивирование клеток пигментного эпителия сетчатки на нем с формированием пласта. Например, клеточный пласт может быть сформирован посредством культивирования клеток пигментного эпителия сетчатки на материале, покрытом фибронектином, но о формировании базальной мембраны не сообщалось, и способ отбора пласта из контейнера, в котором формируется пласт, вообще не описывался (непатентный документ 3). При рассмотрении таких проблем, способ формирования заранее клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки посредством использования искусственной мембраны вместо базальной мембраны разрабатывался многими лабораториями. Однако искусственная мембрана вызывает опасения относительно расстройства при приживлении во время трансплантации и функциональной поддержки организма. Хотя разработана также искусственная мембрана с меньшей биологической реакцией, она непригодна для трансплантации, поскольку она доставляет проблемы, вызывая воспаление и отторжение, связанные с ней, которые вызываются отличиями от базальной мембраны, производимой самими клетками, по композиции, свойствам, жесткости, и тому подобное. Однако повсеместно известен способ культивирования клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки, имеющих полярность. Однако он предназначается только для использования на экспериментальных моделях, где клетки пигментного эпителия сетчатки и иммортализованная линия, полученная из живого организма, формируются в виде пласта в контейнере и используются непосредственно, и это еще не дает возможности реального извлечения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки, снабженного базальной мембраной, как в живых организмах, из контейнера (непатентный документ 4). Имеется способ получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки посредством отслаивания клеток пигментного эпителия сетчатки, непосредственно культивируемых на чашке для культивирования, без использования внеклеточного матрикса, и тому подобное. Такой способ отсоединения клеток посредством отслаивания не может стабилизировать форму и размер пласта, базальной мембраны, и тому подобное, вызывает большие повреждения на клетках пигментного эпителия сетчатки при отслаивании и вызывает, в большинстве случаев, разрушение формы пласта и отдельных клеток из-за отслаивания, таким образом, он не может обеспечить клеточный пласт, пригодный для трансплантации, и тому подобное (непатентный документ 5). В дополнение к этому, хотя сообщалось о нанесении покрытия на субстрат культуры клеток покрытия из коллагена и культивирования клеток на коллагене, клетки пигментного эпителия сетчатки человека не использовали. Кроме того, для повышения прочности геля, должен отдельно добавляться агент для поперечной сшивки, что делает способ далеким от удобства и скорости (патентный документ 1). В соответствии с современной ситуацией, получение клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки, который является терапевтически эффективным для заболеваний сетчатки, таких как возрастная дегенерация желтого пятна, и тому подобное, и удобным и стабильным с точки зрения приготовления, по-прежнему представляет собой проблему.
[Список документов]
[Патентный документ]
Патентный документ 1: JP-A-2005-261292
[Непатентные документы]
Непатентный документ 1: Ophthalmic Surg. 1991 Feb; 22(2): 102-8.
Непатентный документ 2: Tohoku J Exp Med. 1999 Dec; 189(4): 295-305.
Непатентный документ 3: Nat. Protoc., 4(5), 2009, 662-673.
Непатентный документ 4: Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 47, 2006, 3612-3624.
Непатентный документ 5: Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36(2), 1995, 381-390.
Сущность изобретения
Проблемы, которые должны решаться изобретением
Задачей настоящего изобретения является разработка нового способа получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки удобным и стабильным образом без использования искусственной мембраны и обеспечение пациентов с заболеванием, связанным с отсутствием пигментного эпителия сетчатки, таким как возрастная дегенерация желтого пятна, и тому подобное, клеточным пластом из клеток пигментного эпителия сетчатки для трансплантации, который демонстрирует высокую скорость приживления и является превосходным при функционировании.
Средства решения проблем
Авторы настоящего изобретения получают клеточный пласт посредством формирования слоя коллагенового геля на субстрате культуры клеток и высевания и культивирования на нем клеток пигментного эпителия сетчатки. Клеточный пласт, полученный с помощью такого способа, поддерживает базальную мембрану между коллагеновым гелем и клеточным пластом из клеток пигментного эпителия сетчатки, имеет способность секреции цитокинов и адгезивность между клетками, сходные со свойствами клеток пигментного эпителия сетчатки in vivo, и делает возможным легкое отсоединение клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки от субстрата культуры клеток, в то же время, поддерживая базальную мембрану посредством разложения коллагенового геля с помощью коллагеназы. В дополнение к этому, клетки, составляющие клеточный пласт, поддерживают экспрессирование специфичного маркера клеток пигментного эпителия сетчатки. Авторы настоящего изобретения осуществили интенсивные исследования и завершили настоящее изобретение на основе этих данных. Соответственно, настоящее изобретение предлагает:
[1] способ получения клеточного пласта, включающий следующие стадии
(1) высевания и культивирования клеток пигментного эпителия сетчатки на коллагеновом геле с формированием клеточного пласта, состоящего из клеток пигментного эпителия сетчатки, и
(2) деградации коллагенового геля с помощью коллагеназы для отсоединения клеточного пласта, состоящего из клеток пигментного эпителия сетчатки;
[2] способ получения клеточного пласта из рассмотренного выше [1], где клетки пигментного эпителия сетчатки представляют собой клетки, полученные посредством индуцирования дифференциации стволовых клеток или клеток-предшественников;
[3] способ получения клеточного пласта из рассмотренного выше [2], где стволовые клетки представляют собой ES клетки или iPS клетки;
[4] способ получения клеточного пласта из рассмотренного выше [1], где концентрация коллагена в коллагеновом геле составляет 0,1%-0,5%;
[5] способ получения клеточного пласта по любому из рассмотренных выше [1]-[4], дополнительно включающий следующую далее стадию (3)
(3) подтверждение присутствия или отсутствия базальной мембраны на поверхности контакта между отсоединенным клеточным пластом и коллагеновым гелем;
[6] клеточный пласт, полученный с помощью способа по любому из рассмотренных выше [1]-[5];
[7] клеточный пласт для трансплантации, содержащий слой клеток, сформированный из клеток пигментного эпителия сетчатки, полученный посредством индуцирования дифференциации стволовых клеток или клеток-предшественников ex vivo, и базальную мембрану, секретированную из указанных клеток; и
[8] клеточный пласт для скрининга, содержащий слой клеток, сформированный из клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных посредством индуцирования дифференциации стволовых клеток или клеток-предшественников ex vivo, и базальную мембрану, секретированную из указанных клеток.
Воздействие изобретения
В соответствии с настоящим изобретением, клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки, имеющий конституцию, имеющую базальную мембрану, образующуюся на поверхности, может быть получен легким и стабильным образом. Поскольку клеточный пласт по настоящему изобретению является превосходным по скорости приживления и функциональности и исключительно пригодным для использования для трансплантации, пласт, состоящий из базальной мембраны и клеток пигментного эпителия сетчатки, может быть получен и применен на пациентах с офтальмологическими заболеваниями, такими как пациенты с возрастной дегенерацией желтого пятна, и тому подобное, посредством трансплантации. Конкретно, когда клетка, которая должна использоваться для культивирования, представляет собой клетку пигментного эпителия сетчатки, полученную из iPS клетки, отторжение при трансплантации может быть предотвращено посредством использования собственной клетки пациента в качестве источника.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 показывает результаты исследования секреторной емкости цитокинов клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки.
Описание вариантов осуществления
Настоящее изобретение поясняется подробно далее.
Настоящее изобретение предлагает способ получения клеточного пласта, включающий следующие стадии:
(1) высевания и культивирования клеток пигментного эпителия сетчатки на коллагеновом геле с формированием клеточного пласта, состоящего из клеток пигментного эпителия сетчатки, и
(2) деградации коллагенового геля с помощью коллагеназы для отсоединения клеточного пласта, состоящего из клеток пигментного эпителия сетчатки.
Хотя клетка пигментного эпителия сетчатки, которая должна высеваться на стадии (1), может представлять собой клетку, полученную от любого млекопитающего, постольку, поскольку она получается от млекопитающих (например, человека, обезьяны, мыши, крысы, собаки, коровы, лошади, свиньи, овцы, козы, кошки, кролика, хомяка, морской свинки, и тому подобное), предпочтительно, она представляет собой клетку, полученную от человека.
Клетка пигментного эпителия сетчатки, которая должна высеваться может представлять собой первичную клетку, непосредственно отобранную из глазного яблока, или клетку, полученную после нескольких пассажей. Первичные клетки пигментного эпителия сетчатки могут изолироваться с помощью известного способа. Например, в случае клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных из глазного яблока, глазное яблоко трупа изолируют, быстро разделяют в экваториальной области, стекловидное тело и сетчатку удаляют и обрабатывают коллагеназой, гиалуронидазой, и тому подобное, по необходимости, клетки собирают посредством соскребывания с помощью лезвия для сбора клеток или обработки в растворе трипсина или EDTA для освобождения клеток от оболочки Бруха, выдерживают в культурной среде для индуцирования адгезии к чашке, для культивирования и роста, и клетки, выращенные в необходимом количестве, соответствующим образом пассажируют с помощью обработки трипсином, и тому подобное, для фиксации количества клеток.
Кроме того, эти клетки могут также представлять собой клетки, полученные посредством индуцирования дифференциации недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток, таких как эмбриональная стволовая клетка (ES клетка), индуцированная плюрипотентная стволовая клетка (iPS клетка), и тому подобное, стволовые клетки, включая соматические стволовые клетки, такие как нейронная стволовая клетка, и тому подобное, или клетки-предшественники, включая нейронную клетку-предшественник и клетку-предшественник сетчатки. ES Клетка может также представлять собой ES клетку, полученную посредством перепрограммирования ядра соматической клетки. В дополнение к этому, в качестве стволовой клетки, целевая клетка может быть получена посредством индуцирования дифференциации индуцированной плюрипотентной стволовой клетки (iPS клетки), о котором сообщалось в последние годы. iPS Клетка представляет собой индуцированную стволовую клетку, полученную из соматической клетки, имеющую свойства, эквивалентные свойствам ES клетки, которая может быть получена посредством введения конкретного вещества, перепрограммирующего ядро (нуклеиновых кислот, белка, низкомолекулярного соединения, и тому подобное) в соматическую клетку [Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006); Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)]. Условия и среда, используемые для дифференциации рассмотренной выше стволовой клетки в целевую дифференцированную клетку, могут воспроизводить повсеместно известные условия и среду, или могут соответствующим образом определяться специалистами в данной области. В настоящем изобретении, клетка, полученная посредством индуцирования дифференциации стволовой клетки или клетки-предшественника, предпочтительно, плюрипотентной стволовой клетки, используется предпочтительно в качестве клетки пигментного эпителия сетчатки, которая должна использоваться для клеточного пласта, поскольку клетка пигментного эпителия сетчатки может быть получена на соответствующей стадии созревания, и в частности, могут быть получены сравнительно незрелые клетки пигментного эпителия сетчатки, и может быть преимущественно сформирован клеточный пласт. В дополнение к этому, когда клеточный пласт, который должен быть получен в соответствии с настоящим изобретением, предназначен для трансплантации, использование iPS клетки является предпочтительным, поскольку клеточный пласт, полученный с использованием соматической клетки субъекта, который принимает трансплантацию, в качестве источника iPS клетки, не имеет антигенности против субъекта. Когда стволовая клетка индуцируется для дифференциации, например, ES клетка человека или плюрипотентная стволовая клетка, такая как iPS клетка, и тому подобное, культивируется в среде для ES дифференциации, в которую добавляют антагонист Wnt, такой как Dkk-1, CKI-7, и тому подобное, и антагонист Nodal, такой как Lefty A, SB-431542, и тому подобное. Когда их культивируют в течение заданного периода, экспрессируются Rx, Pax6 и Mitf, которые представляют собой маркеры клеток-предшественников сетчатки, и клетки пигментного эпителия сетчатки человека могут быть получены посредством морфологического наблюдения с помощью оптического микроскопа посредством подтверждения присутствия клеток, имеющих многоугольную форму и пигмент [Neuroscience Letters 2009 Jul 24 458(3) 126-31, Journal of Cell Science 2009 Sep 1 122(Pt 17) 3169-79].
Клетки пигментного эпителия сетчатки по настоящему изобретению культивируют посредством высевания на коллагеновом геле. Коллаген, используемый для коллагенового геля, может быть любым постольку, поскольку его получают от млекопитающего (например, человека, обезьяны, мыши, крысы, собаки, коровы, лошади, свиньи, овцы, козы, кошки, кролика, хомяка, морской свинки, и тому подобное) и, например, используют коллаген, полученный от человека или свиньи. Примеры ткани, полученной из коллагена, включают сухожилие, кожу, и тому подобное. Хотя вид коллагена может быть любым, предпочтительным является коллаген иной, чем коллаген, составляющий базальную мембрану человека, и коллаген иной, чем коллаген типа IV является особенно предпочтительным. Среди них предпочтительно используют коллаген типа I. Хотя коллагеновый гель может быть получен с помощью, например, повсеместно известного способа получения, в настоящем изобретении, гель, состоящий из сетки коллагеновых волокон, получают посредством индуцирования фиброгенеза коллагена, как описано в рассмотренном ниже примере. Поскольку фиброзный коллаген имеет прочность и гибкость в сочетании, он является простым при манипулировании, показывает хорошую поддержку пролиферации клеток и дифференциации клеток, и является предпочтительным в качестве коллагенового геля для использования в настоящем изобретении. В дополнение к этому, коллаген, который используют в настоящем изобретении, требуется для поддержания клеток, которые высевают на коллагеновом геле, на поверхности геля, не позволяя им погружаться в слой геля. Следовательно, в качестве коллагена предпочтительным является коллаген, где гель имеет прочность, необходимую для пролиферации клеток, предпочтительным является, например, и коллаген, имеющий большую величину межмолекулярной поперечной сшивки. В качестве такого коллагена может рассматриваться коллаген, полученный из сухожилий.
Хотя концентрация коллагена у рассмотренного выше коллагенового геля может находиться в любом диапазоне постольку, поскольку она может давать гель, имеющий прочность, дающую возможность для приживления и роста клеток пигментного эпителия сетчатки, и удовлетворяющий требованиям к растворимости, облегчающим деградацию с помощью коллагеназы, к вязкости, делающей возможными простые манипуляции, и тому подобное, она предпочтительно составляет 0,1% (масс/объем) - 0,5% (масс/объем), более предпочтительно, 0,2% (масс/объем) - 0,3% (масс/объем). Когда концентрация коллагена коллагенового геля меньше чем 0,1% (масс/объем), прочность коллагенового геля становится недостаточной, и по этой причине, скорость образования колоний и скорость пролиферации клеток для клеток пигментного эпителия сетчатки уменьшаются. Когда концентрация коллагена коллагенового геля превышает 0,5% (масс/объем), время обработки коллагеназой для деградации коллагенового геля становится продолжительным, что вызывает опасения относительно оказания отрицательного воздействия на клетки.
Хотя объем смешанного раствора коллагенового геля, используемого для получения рассмотренного выше коллагенового геля, изменяется в зависимости от площади культивирования и формы субстрата культуры, который должен использоваться для клеточной культуры, предпочтительно, он составляет примерно 100 мкл - примерно 250 мкл, более предпочтительно, примерно 150 мкл - примерно 200 мкл, на единицу площади (см2). Когда количество смешанного раствора коллагенового геля является слишком малым, формируется слой коллагенового геля, имеющий тонкую центральную часть, из-за влияния поверхностного натяжения, прикладываемого к поверхности геля, и имеется тенденция к повреждению пласта во время вырезания клеточного пласта, поскольку клетки непосредственно вступают в контакт с субстратом культуры, когда культивируются клетки пигментного эпителия сетчатки. Когда количество смешанного раствора коллагенового геля является избыточным, формируется толстый слой коллагенового геля на субстрате культуры, что значительно сокращает количество среды для культивирования, и по этой причине, осуществление поддержания культуры не является легким, обработка коллагеназой занимает время, и имеются опасения относительно появления повреждений на клеточном пласте.
На стадии (1), клеточный пласт может быть получен посредством высевания и культивирования рассмотренных выше клеток пигментного эпителия сетчатки на коллагеновом геле субстрата клеточной культуры. Субстрат клеточной культуры по настоящему изобретению не является как-либо ограниченным постольку, поскольку он предназначен для культивирования клеток. Его примеры включают контейнеры для культур, имеющие пористую мембрану, такие как трансвел, и тому подобное, колба, колба для культур тканей, чашка, чашка Петри, чашка для культур тканей, многоцелевая чашка, микропланшет, рамка для микролунок, многоцелевой планшет, многолуночный планшет, предметное стекло с лункой и покровным стеклом, чашка Петри, пробирка, поддон, культуральный мешок и вращающийся флакон. Контейнеры для культур, имеющие пористую мембрану, являются предпочтительными, поскольку удобно осуществлять обработку коллагеназой и операцию отрезания клеточного пласта. Например, предпочтительно используют коммерчески доступный трансвел. Примеры материала субстрата клеточной культуры в настоящем описании включают, но, не ограничиваясь этим, неорганические материалы, такие как металл, стекло, керамика, силикон, и тому подобное, органические материалы, представленные эластомером, пластиком (например, полиэфирной смолой, полиэтиленовой смолой, полипропиленовой смолой, ABS смолой, нейлоном, акриловой смолой, фторкаучуком, поликарбонатной смолой, полиуретановой смолой, метилпентеновой смолой, фенольной смолой, меламиновой смолой, эпоксидной смолой, винилхлоридной смолой).
Количество клеток пигментного эпителия сетчатки, которые должны высеваться, может находиться в любом диапазоне постольку, поскольку оно соответствует плотности клеток, которые могут образовывать клеточный пласт. Однако когда плотность клеток является слишком низкой, форма клеток является плохой, время культивирования до достижения конфлюэнтности является продолжительным, и кроме того, время, необходимое для созревания и окрашивания клеток, является продолжительным. Когда плотность клеток является слишком высокой, подобным же образом, подавляется пролиферация клеток, время культивирования до достижения конфлюэнтности имеет тенденцию к увеличению и клетки могут погибать от перенаселенности. По этой причине, плотность клеток, которые должны высеваться, предпочтительно составляет примерно 4,5×104 клеток/см2 - примерно 8,5×105 клеток/см2, более предпочтительно, примерно 8,5×104 клеток/см2 - примерно 8,5×105 клеток/см2, наиболее предпочтительно, примерно 4,5×105 клеток/см2.
Однослойная популяция клеток (клеточный пласт), состоящий из клеток пигментного эпителия сетчатки, может формироваться посредством культивирования клеток пигментного эпителия сетчатки, высеваемых на коллагеновом геле, в среде для культивирования. Среда для культивирования может использоваться без какого-либо ограничения постольку, поскольку это среда для культивирования клеток, используемая, как правило, в данной области. Например, можно использовать базальные среды, описанные в “Japan tissue culture conference ed., Technique of Tissue Culture 3rd edition” page 581, опубликованной Asakura Shoten, такая как среда F-10, среда F12, MEM, среда BME, DMEM, αMEM, среда IMD, среда ES, среда DM-160, среда Фишера, среда WE, среда RPMI1640, и тому подобное. Кроме того, к базальной среде может добавляться сыворотка (фетальная сыворотка теленка и тому подобное), различные факторы роста (EGF, FGF, HGF, PDGF и тому подобное), антибиотик, аминокислота, и тому подобное. pH среды предпочтительно составляет примерно 6 - примерно 8. Относительно культуры, например, первичное культивирование осуществляют, как правило, примерно при 30 - примерно 40°C в течение примерно 15 - примерно 60 час, пока клетки пигментного эпителия сетчатки не станут конфлюэнтными. После этого осуществляют вторичное культивирование в течение примерно 1 недели - примерно 2 месяцев, заменяя при этом среду, после чего культивирование осуществляют, в то же время, аэрируя и перемешивая по необходимости, до образования клеточного пласта. Клетки, составляющие клеточный пласт, полученные с помощью такого культивирования, поддерживаются как клетки пигментного эпителия сетчатки. Поддерживание клеток в качестве клеток пигментного эпителия сетчатки может подтверждаться посредством детектирования BEST1, RPE65, MERTK, CRALBP или чего-либо подобного в качестве специфичного маркера дифференциации.
Поскольку клеточный пласт, сформированный на стадии (1), прилипает к коллагеновому гелю, например, когда его непосредственно используют для трансплантации, и тому подобное, имеется опасение, что коллагеновый гель будет мешать приживлению трансплантата у реципиента. Если коллагеновый гель может удаляться заранее, это является благоприятным для решения такой проблемы. На стадии (2) настоящего изобретения, коллагеновый гель, прилипший к клеточному пласту, сформированному на стадии (1), деградирует под действием коллагеназы. Специалисты в данной области могут выбрать соответствующую коллагеназу в соответствии с видом коллагена, используемого для получения коллагенового геля. Хотя коллагеназа, которая должна использоваться для деградации коллагенового геля, не является конкретно ограниченной постольку, поскольку она имеет активность переваривания коллагенового геля, предпочтительной является коллагеназа, которая не деградирует легко коллаген, составляющий базальную мембрану человека (например, коллаген Типа IV, и тому подобное). Например, можно использовать коллагеназу, полученную от микроорганизма, происходящего из Clostridium (Clostridium histolyticum) или Streptomyces (Streptomyces parvulus), которые являются доступными на коммерческом уровне, безопасны и имеют высокую ферментативную активность.
В качестве активности рассмотренной выше коллагеназы, важна удельная активность по отношению к массе коллагена в коллагеновом геле, а не активность на единицу массы коллагеназы и активность на единицу объема водного раствора коллагеназы. Удельная активность коллагеназы, которая должна использоваться для растворения коллагенового геля (активность коллагеназы/масса коллагена), предпочтительно не меньше чем 0,1 Ед./мг. Когда удельная активность коллагеназы меньше чем 0,1 Ед./мг, растворение коллагенового геля может быть нежелательно продолжительным или же гель может растворяться нежелательно недостаточно. Более предпочтительно, она находится в пределах 0,1-10000 Ед./мг, более предпочтительно, 1-3000 Ед./мг.
В способе получения клеточного пласта по настоящему изобретению, способ действия коллагеназы на коллагеновый гель не является конкретно ограниченным. Раствор коллагеназы, полученный с использованием, в качестве растворителя, среды или изотонического раствора, имеющего буферную емкость, может добавляться в среду, или же соединенный с клетками коллагеновый гель, отсоединенный от чашки для культивирования клеток, может быть погружен в рассмотренный выше раствор коллагеназы. Поскольку в настоящем изобретении используют трансвел в качестве субстрата культуры клеток, слой коллагенового геля может экспонироваться посредством извлечения вставки и удаления мембраны на дне вставки, и экспонируемый коллагеновый гель предпочтительно погружают непосредственно в рассмотренный выше раствор коллагеназы.
В способе получения клеточного пласта по настоящему изобретению, время растворения коллагенового геля с помощью коллагеназы не является конкретно ограниченным. Когда время действия коллагеназы является слишком большим, функции клеток, такие как способность к адгезии, способность к пролиферации, и тому подобное, могут деградироваться нежелательным образом. Хотя время растворения посредством коллагеназы может изменяться под действием изменения удельной активности коллагеназы, температуры, формы коллагенового геля, способа обработки коллагеназой, и тому подобное, как правило, оно составляет 15 мин - 60 мин. Обработка коллагеназой может представлять собой одну обработку или осуществляться множество раз.
Температура во время обработки коллагенового геля с помощью коллагеназы в способе получения клеточного пласта по настоящему изобретению предпочтительно устанавливается в пределах 10-42°C, более предпочтительно, 30-40°C, еще более предпочтительно, 36-38°C, поскольку текучесть цитоплазмы клетки, как правило, уменьшается и способность к метаболизму уменьшается, когда температура внутри живых организмов становится не выше чем 10°C (примерно 30°C у людей), белок денатурирует и функционирование клеток ухудшается, когда температура превышает 42°C, и оптимальная температура коллагеназы составляет в основном 37°C, а температура ниже этого уровня продлевает время растворения.
В способе получения клеточного пласта по настоящему изобретению, когда происходит растворение коллагенового геля, клеточный пласт постепенно отсоединяется от геля и, наконец, освобождается в растворе коллагеназы. Для извлечения клеточного пласта, клеточный пласт может механически отсоединяться от остального геля или может извлекаться после полного растворения геля. Хотя механическое отсоединение сокращает время до извлечения клеточного пласта, поскольку клеточный пласт может быть поврежден, его предпочтительно извлекают после полного растворения геля.
Хотя клеточный пласт, извлеченный, как рассмотрено выше, может непосредственно использоваться для различных применений, поскольку оставшаяся коллагеназа может ингибировать адгезивность между клеточными пластами или адгезивность по отношению к тканям, его предпочтительно промывают средой или изотоническим раствором, имеющим буферную емкость. Температура во время промывки может определяться в соответствии с видом обработки для растворения коллагенового геля с помощью коллагеназы. Для достаточного удаления оставшейся коллагеназы, пласт предпочтительно промывают один или несколько раз средой или изотоническим раствором, имеющим буферную емкость.
В клеточном пласте, полученном с помощью способа по настоящему изобретению, секретируется цитокин, специфичный для клеток пигментного эпителия сетчатки, с полярностью сходной с полярностью в живых организмах, и трансэпителиальное электрическое сопротивление (TER), которое должно быть показателем прочной адгезионной связи между клетками, повышается, как в живых организмах. По этой причине, он имеет барьерную функцию клеточного слоя, сходную с функцией в живых организмах. В соответствии со способом по настоящему изобретению, может быть получен клеточный пласт, имеющий функции, сходные с функциями в живых организмах.
В клеточном пласте, полученном с помощью способа по настоящему изобретению, образуется плотное соединение между клетками пигментного эпителия сетчатки и формируется базальная мембрана на стороне контакта с коллагеновым гелем. В настоящем описании, “базальная мембрана” представляет собой мембрану, сформированную из компонентов, продуцируемых клетками пигментного эпителия сетчатки, и означает мембрану, содержащую, по меньшей мере, часть компонентов базальной мембраны (ниже должна упоминаться как “базальная мембрана клеток пигментного эпителия сетчатки”). Базальная мембрана клеток пигментного эпителия сетчатки в живых организмах присутствует как тонкая пленка между слоем клеток пигментного эпителия сетчатки и внутренним слоем коллагена, составляющим оболочку Бруха, и представляет собой внеклеточный матрикс, имеющий коллаген Типа IV, ламинин, гепаран сульфат протеогликан (перлекан), нидоген, и тому подобное, в качестве репрезентативных компонентов. Оболочка Бруха представляет собой тонкую пленку между слоем клеток пигментного эпителия сетчатки и сосудистой оболочкой глаза и имеет 5-слойную структуру базальной мембраны клеток пигментного эпителия сетчатки, внутренний слой коллагена, слой эластина, наружный слой коллагена и базальную мембрану капиллярного слоя сосудистой оболочки глаза. Клеточный пласт по настоящему изобретению содержит часть (базальную мембрану клеток пигментного эпителия сетчатки) структуры оболочки Бруха. Образование плотного соединения может быть подтверждено посредством наблюдения формы плотно слипшихся клеток гексагональной формы и экспрессирования окклюдина, ZO-1, и тому подобное, между клетками с помощью иммунного окрашивания. Образование базальной мембраны может быть подтверждено посредством наблюдения экспрессирования маркеров базальной мембраны, таких как ламинин, гепаран сульфат протеогликан (перлекан), нидоген или коллаген Типа IV, и тому подобное, на поверхности клеток с помощью иммунного окрашивания или наблюдения с помощью сканирующего электронного микроскопа.
Как правило, клетки пигментного эпителия сетчатки, культивируемые в чашке для культивирования, продуцируют компоненты базальной мембраны, но является исключительно сложным отсоединение клеток в форме пригодного для использования клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки, отсоединенного от чашки для культивирования (Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36(2), 1995, 381-390). В соответствии со способом по настоящему изобретению, клетки пигментного эпителия сетчатки вместе с базальной мембраной, полученной из клеток пигментного эпителия сетчатки, могут извлекаться как пласт без использования искусственной мембраны. Поскольку клетки пигментного эпителия сетчатки образуют однослойную структуру, когда ими манипулируют по отдельности, структура пласта разрушается, и клетки распадаются на единичные клетки. Таким образом, трансплантация их в виде пласта является исключительно сложной. С другой стороны, поскольку клеточный пласт по настоящему изобретению сопровождается базальной мембраной и имеет достаточную жесткость, он не сморщивается легко во время извлечения, что делает манипуляции с ним исключительно простыми. Как следствие, поскольку установка в устройстве для трансплантации клеток и операция трансплантации могут осуществляться плавно, трансплантация клеток может осуществляться с минимальным вмешательством, и как воздействие, так и прогноз, как ожидается, должны улучшиться. В дополнение к этому, поскольку клеточный пласт сопровождается базальной мембраной, это является исключительно преимущественным для трансплантации при заболевании, когда базальная мембрана при этом разрушается. Например, возрастная дегенерация желтого пятна иногда сопровождается разрушениями оболочки Бруха. Базальная мембрана в клеточном пласте по настоящему изобретению компенсирует разрушенную часть, при этом скорость приживления клеточного пласта может быть улучшена, а также можно ожидать его терапевтического воздействия. Следовательно, клеточный пласт по настоящему изобретению является предпочтительным в качестве пласта для трансплантации, нацеленного на заболевание с нарушенной базальной мембраной, и может предпочтительно использоваться в качестве пласта для трансплантации, конкретно нацеленного на возрастную дегенерацию желтого пятна.
Способ получения клеточного пласта по настоящему изобретению может дополнительно включать следующую стадию (3):
(3) подтверждения присутствия или отсутствия базальной мембраны на поверхности контакта между отсоединенным клеточным пластом и коллагеновым гелем.
На стадии (3), образование клеточного пласта, имеющего клеточный слой, состоящий из клеток пигментного эпителия сетчатки и базальную мембрану, может определяться посредством подтверждения присутствия или отсутствия базальной мембраны в клеточном пласте. Присутствие или отсутствие базальной мембраны может подтверждаться с помощью способа, сходного с рассмотренным выше, подтверждением образования базальной мембраны, например, экспрессии маркера базальной мембраны, наблюдения с помощью сканирующего электронного микроскопа, и тому подобное. Для детектирования базальной мембраны, экспрессирование маркера базальной мембраны может подтверждаться в любой области клетки (например, в цитоплазме, на клеточной мембране, на ядерной мембране, и тому подобное). Предпочтительно, целевым является маркер, экспрессируемый на стороне контакта с коллагеновым гелем.
Маркер базальной мембраны в настоящем описании включает продукт транскрипции, продукт трансляции или продукт деградации гена, специфично экспрессируемого в базальной мембране. Примеры такого гена включают ламинин, гепаран сульфат протеогликан (перлекан), нидоген, коллаген Типа IV, и тому подобное. Среди них, ламинин, коллаген Типа IV, и тому подобное, которые представляют собой главные компоненты базальной мембраны, используются предпочтительно.
Образец, который должен использоваться для “подтверждения присутствия или отсутствия базальной мембраны на поверхности контакта между отсоединенным клеточным пластом и коллагеновым гелем”, не является конкретно ограниченным постольку, поскольку он содержит маркер базальной мембраны (например, РНК, белок, продукт его деградации, и тому подобное), полученный из клеточного пласта (или клетки), отсоединенного на стадии (2).
Экспрессирование гена маркера базальной мембраны, когда рассмотренный выше образец представляет собой РНК, может быть исследовано посредством получения фракции РНК (например, РНК, мРНК в целом) из клеток клеточного пласта, отсоединенного на стадии (2), и детектирования продукта транскрипции гена маркера, содержащегося во фракции, или прямого детектирования продукта гена маркера в клетке без извлечения РНК из клетки.
Когда фракцию РНК (например, РНК, мРНК, в целом) приготавливают из клеток, она может быть приготовлена с использованием известного способа, такого как способ ультрацентрифугирования в гуанидине–CsCl, способ AGPC (водной гель-проникающей хроматографии), и тому подобное. Используя коммерчески доступный набор для извлечения РНК (например, RNeasy Mini Kit; производимый QIAGEN, и тому подобное), РНК в целом с высокой чистотой может быть получена быстрым и удобным образом из микроскопического количества образца. Примеры способа детектирования продукта транскрипции гена маркера базальной мембраны во фракции РНК включают способ с использованием гибридизации (Нозерн блот, дот блот, анализ с помощью ДНК чипов и тому подобное), способ с использованием PCR (RT-PCR, конкурентной PCR, PCR в реальном времени, и тому подобное) и тому подобное. Количественные способы PCR, такие как конкурентная PCR, PCR в реальном времени, и тому подобное, являются предпочтительными, поскольку изменение экспрессии гена маркера базальной мембраны может детектироваться быстрым и удобным способом из микроскопического количества образца, и анализ с помощью ДНК чипов является предпочтительным, поскольку изменение экспрессии множества генов маркеров может детектироваться коллективно и рабочие характеристики количественного определения могут также быть улучшены с помощью выбора способа детектирования, и тому подобное.
Когда используют гибридизацию Нозерн блот или дот блот, ген маркера базальной мембраны может детектироваться с использованием нуклеиновой кислоты (зонда), которая может гибридизироваться с продуктом транскрипции гена. Примеры такой нуклеиновой кислоты включают нуклеиновую кислоту, которая может гибридизироваться с продуктом транскрипции гена маркера базальной мембраны при очень жестких условиях. Примеры “очень жестких условий” включают реакцию гибридизации при 45°C в 6×SSC (хлорид натрия/цитрат натрия), с последующей промывкой один или несколько раз при 65°C в 0,2×SSC/0,1% SDS, и тому подобное. Специалисты в данной области могут легко установить желательные жесткие условия посредством соответствующего изменения концентрации соли раствора для гибридизации, температуры реакции гибридизации, концентрации зонда, длины зонда, количества несовпадений, времени реакции гибридизации, концентрации соли при промывке, температуры промывки, и тому подобное. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК, РНК или химеру ДНК/РНК, при этом предпочтение отдается ДНК.
Нуклеиновая кислота, которая должна использоваться в качестве зонда, может быть двухнитевой или однонитевой. Когда она двухнитевая, она может представлять собой двухнитевую ДНК, двухнитевую РНК или гибрид ДНК:РНК. Когда она однонитевая, можно использовать антисмысловую нить. Хотя длина нуклеиновой кислоты не является как-либо ограниченной постольку, поскольку она может специфично гибридизироваться с целевой нуклеиновой кислотой, она составляет, например, не меньше примерно, чем 15 оснований, предпочтительно, не меньше примерно, чем 30 оснований. Чтобы сделать возможным детектирование и количественное определение целевой нуклеиновой кислоты, нуклеиновую кислоту предпочтительно метят. Примеры метки включают радиоактивный изотоп, фермент, флуоресцентное вещество, люминесцентное вещество, и тому подобное. Примеры радиоактивного изотопа включают [32P], [3H], [14C], и тому подобное. В качестве фермента является предпочтительным стабильный фермент, имеющий высокую удельную активность, например, β-галактозидаза, β-глюкозидаза, щелочная фосфатаза, пероксидаза, дегидрогеназа яблочной кислоты, и тому подобное. Примеры флуоресцентного вещества включают флуорескамин, флуоресцеин изотиоцианат, и тому подобное. Примеры люминесцентного вещества включают люминол, производное люминола, люциферин, люцигенин, и тому подобное. Кроме того, биотин-(стрепт)авидин также можно использовать для связывания зонда и метки.
Когда используют Нозерн гибридизацию, фракцию РНК, полученную, как рассмотрено выше, разделяют с помощью гель-электрофореза, переносят на мембрану из нитроцеллюлозы, нейлона, поливинилидена дифторида, и тому подобное, гибридизируют при рассмотренных выше “очень жестких условиях” в буфере для гибридизации, содержащем метящий зонд, полученный, как рассмотрено выше, и измеряют количество метки, связанной с мембраной, для каждой полосы с помощью соответствующего способа, при этом можно измерить уровень экспрессирования каждого гена маркера базальной мембраны. Также и в случае дот блота, мембрану, на которую нанесена фракция РНК, подвергают сходному воздействию реакции гибридизации (осуществляемой для каждого гена маркера), и измеряют количество метки в пятне, при этом можно измерить уровень экспрессирования каждого гена маркера.
Когда используют анализ с помощью ДНК чипов, например, кДНК, вводимую вместе с соответствующим промотором, таким как T7 промотор, и тому подобное, посредством реакции обратной транскрипции, синтезируют из фракции РНК, полученной, как рассмотрено выше, кРНК синтезируют с использованием РНК полимеразы (в этом случае, меченую кРНК получают с использованием мононуклеотида, меченного биотиномом, и тому подобное, в качестве субстрата). Меченую кРНК приводят в контакт с чипом, имеющим рассмотренный выше зонд, иммобилизованный на нем, для осуществления реакции гибридизации, и измеряют количество метки, связанной с каждым зондом на твердой фазе, при этом может быть измерен уровень экспрессирования каждого гена маркера базальной мембраны. Этот способ является преимущественным с точки зрения быстроты и удобства, поскольку увеличивается количество детектируемых дифференцированных генов маркеров (для этого зонды должны находиться на твердой фазе).
С другой стороны, когда ген маркера детектируется без извлечения РНК из клетки, в качестве среды детектирования можно использовать гибридизацию in situ. В этом способе, клетку иммобилизуют посредством обработки клеток фиксирующим агентом, предпочтительно, преципитационным фиксирующим агентом, например, ацетоном, или инкубирования клеток в течение короткого времени в буферном растворе формальдегида, вместо извлечения РНК из клеток. После иммобилизации, клетку погружают в парафин с получением блока, и срез, срезанный с него, можно использовать в качестве образца. Хорошо приготовленный образец, погруженный в парафин, может сохраняться при комнатной температуре в течение многих лет. В качестве нуклеиновой кислоты, которая должна использоваться в качестве зонда, можно использовать соединения сходные с рассмотренными выше примерами. Гибридизацию in situ предпочтительно используют в настоящем изобретении, поскольку экспрессирование маркера базальной мембраны на поверхности контакта между клеткой и коллагеновым гелем может подтверждаться непосредственно.
Альтернативно, экспрессию маркера базальной мембраны в отсоединенном клеточном пласте на стадии (2) можно подтвердить посредством приготовления фракции белков из клеточного пласта (или клеток) и детектирования продукта трансляции (то есть, маркерного белка) гена маркера, содержащегося во фракции, или непосредственного детектирования продукта трансляции гена маркера в клеточном пласте (или клетке), без извлечения белка из клеточного пласта (или клетки). Маркерный белок может детектироваться посредством иммунологического способа измерений (например, ELISA, FIA, RIA, Вестерн блот, и тому подобное) с использованием антитела к каждому белку, и в случае белка, показывающего заметную физиологическую активность, такого как фермент, и тому подобное, его можно детектировать посредством измерения физиологической активности каждого маркерного белка с помощью известного способа. Альтернативно, маркерный белок может также детектироваться с помощью способа масс-спектрометрии, такого как MALDI-TOFMS, и тому подобное.
Антитело к каждому маркерному белку может быть получено в соответствии с повсеместно используемой методикой получения поликлональных антител или моноклональных антител и использования маркерного белка или белка или его частичного пептида в качестве антигена для иммунизации.
Когда соответствующие иммунологические способы измерений применяются к способу исследования по настоящему изобретению, установление специальных условий, операций, и тому подобное, не является необходимым. Система измерения маркерного белка базальной мембраны может быть построена посредством добавления общего технического рассмотрения специалистами в данной области общих условий и методов работы в каждом способе. Относительно подробностей этих общих технических средств можно сослаться на руководства, книги, и тому подобное. Например, можно сослаться на “Radioimmunoassay” edited by Hiroshi Irie (Kodansha, published in 1974), “cont. Radioimmunoassay” edited by Hiroshi Irie (Kodansha, published in 1979), “Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al. (Igaku-Shoin, published в 1978), “Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al. (2nd edition) (Igaku-Shoin, published в 1982), “Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al. (3rd edition) (Igaku-Shoin, published в 1987), “Methods in ENZYMOLOGY”, Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), ibidem, Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), ibidem, Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), ibidem, Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibidem, Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibidem, Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (все опубликованы Academic Press), и тому подобное.
Настоящее изобретение также относится к клеточному пласту, полученному в соответствии с рассмотренным выше способом получения клеточных пластов, предпочтительно, к клеточному пласту для трансплантации, содержащему слой клеток, сформированных из клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных посредством индуцирования дифференциации ex vivo, и базальной мембраны. Клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой материал для трансплантации с целью лечения сетчатки у пациентов с офтальмологическими заболеваниями. Примеры офтальмологического заболевания включают дегенеративные заболевания сетчатки, такие как возрастная дегенерация желтого пятна, пигментная дистрофия сетчатки, диабетическая ретинопатия, отслоение сетчатки, и тому подобное. Поскольку клеточный пласт по настоящему изобретению содержит базальную мембрану, он может трансплантироваться с высокой долей приживления для заболевания, одновременно включающего повреждение оболочки Бруха. В дополнение к этому, поскольку клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки по настоящему изобретению имеет базальную мембрану, полученную из компонентов сходных с компонентами в живых организмах, его можно также использовать для различных целей скрининга, таких как скрининг эффективности, оценка токсичности, и тому подобное, при рассмотренных выше офтальмологических заболеваниях. Для скрининга эффективности относительно рассмотренных выше офтальмологических заболеваний, например, клеточный пласт по настоящему изобретению может применяться для скрининга вещества, имеющего эффективность при рассмотренных выше офтальмологических заболеваниях, в соответствии со способом, описанным в JP-A-2007-500509. Чтобы быть конкретным, клеточный пласт по настоящему изобретению культивируют в присутствии или в отсутствие вещества кандидата, имеющего эффективность при стрессовых условиях, возможно, вызывающих рассмотренные выше офтальмологические заболевания (например, света (например, белого света, голубого света; свет вызывает гибель клеток сетчатки, в частности, фоторецепторных клеток, и может представлять собой фактор, вызывающий дегенерацию желтого пятна), A2E [ретиноида N-ретинилиден-N-ретинил-этаноламина] (накопление A2E, как считается, вносит вклад в возрастную нейродегенерацию клеток сетчатки, в частности, экспрессирование дегенерации желтого пятна), агрегатов сигаретного дыма (курение, как считается, представляет собой фактор риска при дегенерации желтого пятна), внешнего давления (например, гидростатического давления; повышение внутриглазного давления, как ожидается, причастно к возникновению глаукомы)), и оценку можно осуществить на основе количества фоторецепторов, которые экспрессируют родопсин, и с помощью иммунного окрашивания с использованием антитела анти-каспеаза 3. Для оценки токсичности, клеточный пласт по настоящему изобретению может применяться для скрининга токсичного вещества в соответствии со способом, описанным в JP-A-2007-517210. Чтобы быть конкретным, клеточный пласт по настоящему изобретению культивируют в присутствии или в отсутствие кандидата в токсичные вещества и с использованием маркерного пептида интегрина, описанного в JP-A-2007-517210, возбуждаемого с помощью лазера на длине волны 488 нм, и для оценки детектируется флуоресценция на 520 нм. Кроме того, клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки по настоящему изобретению может также использоваться как модель in vitro для оценки различных функций in vivo клеток пигментного эпителия сетчатки, таких как функция, относящаяся к поддержанию зрительных клеток, таких как фагоцитарная способность наружного сегмента фоторецептора, нейропротекторное действие, и тому подобное, барьерная функция кровеносных сосудов сетчатки, такая как функция насоса, плотное соединение, и тому подобное.
Клеточный пласт для трансплантации по настоящему изобретению может использоваться для лечения рассмотренных выше заболеваний у людей и млекопитающих иных, чем люди (например, обезьяна, мышь, крыс, собака, корова, лошадь, свинья, овца, коза, кошка, кролик, хомяк, морская свинка, и тому подобное).
Диапазон областей заболеваний, при которых может применяться клеточный пласт для трансплантации по настоящему изобретению, определяют соответствующим образом в зависимости от целевого заболевания, вида, возраста, пола, массы тела животного и симптомов субъекта введения, и тому подобное.
Клеточный пласт для трансплантации по настоящему изобретению может трансплантироваться за один раз или несколькими частями. Количество применений трансплантации определяется профессионалами здравоохранения в соответствии с заболеванием и инструкциями. Например, когда заболевание представляет собой заболевание возрастной дегенерации желтого пятна, клеточный пласт для трансплантации по настоящему изобретению может трансплантироваться два или более раз в зависимости от его тяжести. Когда трансплантацию осуществляют множество раз, интервал не является конкретно ограниченным, и может быть положен период от нескольких дней до нескольких недель.
Клеточный пласт для трансплантации по настоящему изобретению трансплантируется профессионалами здравоохранения в соответствии с соответствующим способом трансплантации в соответствии с инструкциями. Когда клеточный пласт для трансплантации по настоящему изобретению трансплантируют под сетчатку, можно использовать способ трансплантации, включающий доставку пласта на потоке воды из полой иглы для инъекций до места трансплантации под сетчаткой глазного яблока, или можно также использовать терапевтическое устройство, предназначенное только для трансплантации.
Примеры
Настоящее изобретение объясняется более подробно в дальнейшем посредством ссылок на примеры, которые представляют собой иллюстрации и не ограничивают рамок настоящего изобретения каким-либо образом.
Пример получения 1. Приготовление клеток пигментного эпителия сетчатки
В качестве клеток пигментного эпителия сетчатки, которые должны использоваться для получения клеточных пластов, в следующем далее примере 1, используют зрелые клетки пигментного эпителия сетчатки (253G1, K11PD2, 59M8, 59SV2, 59SV3, 59SV9, 46a, K21EV15, 101EV3, K11EV9, 454E2), полученные посредством индуцирования дифференциации iPS клеток, и клетки пигментного эпителия сетчатки (hES, CMK6), полученные посредством индуцирования дифференциации ES клеток, в соответствии со способом, описанным в Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131.
<Клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные из iPS человека>
253G1 представляет собой клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные посредством индуцирования дифференциации iPS клеток человека, полученных у здоровых людей, и K11PD2 и 59M8 представляют собой клетки пигментного эпителия сетчатки, у которых индуцируют дифференциацию из iPS клеток человека, полученных от пациентов с пигментной дистрофией сетчатки, отличных друг от друга. iPS клетки устанавливают с помощью способа, включающего введение генов Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc в фибробласты, полученные из кожи человека с использованием ретровируса, в соответствии со способом, описанным в Cell 131, 861-872, 2007.
59SV2, 59SV3 и 59SV9 представляют собой клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные посредством индуцирования дифференциации iPS клеток человека, полученных от одного и того же пациента с пигментной дистрофией сетчатки. iPS клетки устанавливают с помощью способа, включающего введение Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc в фибробласты, полученные из кожи человека, с использованием вируса Sendai, в соответствии со способом, описанным в Proc. Jpn. Acad., Ser. B 85 (2009) 348-362.
K21EV15, 101EV3, K11EV9 и 454E2 представляют собой клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные посредством индуцирования дифференциации iPS клеток человека, полученных от пациентов с пигментной дистрофией сетчатки, отличных друг от друга. iPS клетки устанавливают с помощью способа, включающего введение Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc и LIN28 человека в фибробласты, полученные из кожи человека, с использованием эписомного вектора, в соответствии со способом, описанным в Nat Methods. 2011 May; 8(5): 409-12.
<Клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные из iPS обезьяны>
46a представляет собой клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные посредством индуцирования дифференциации iPS клеток обезьяны (макака циномолгус) в соответствии со способом, описанным в Jpn. J. Transplant. 44, 231-235.
<Клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные из ES клеток человека>
hES представляет собой клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные посредством индуцирования дифференциации линии ES клеток человека khES-1. CMK6 представляет собой клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные посредством индуцирования дифференциации ES клеток обезьяны в соответствии со способом, описанным в Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131.
Пример 1. Способ получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки
<Приготовление смешанного раствора коллагенового геля>
Приготавливают A: Полученный из сухожилий свиньи растворимый в кислоте коллаген Типа I Cellmatrix I-A (Nitta Gelatin, 3,0 мг/мл), B: концентрированную среду для культивирования при 5-кратной концентрации [DMEM/F12 (Invitrogen, 12500-062, 3 г) растворяют в воде MilliQ, и общий объем (50 мл) обрабатывают на фильтре], и C: буфер для разбавления [1 н NaOH (50 мМ, 5 мл), NaHCO3 (260 мМ, 2,2 г) и HEPES (200 мМ, 4,77 г) растворяют в воде MilliQ, и общий объем (100 мл) обрабатывают на фильтре]. При охлаждении (бледно-желтый) B (2 объема) смешивают с A (7 объемов) без образования пузырьков. Затем, добавляют C (1 объем), и (бледно-розовую) смесь перемешивают с получением 0,21% смешанного раствора коллагенового геля.
<Приготовление клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки>
0,21% смешанного раствора коллагенового геля (200 мкл) добавляют во вставку 12 мм вставки трансвел (0,4 мкм мембрана Pore Polyester; Cornig, 3460), и смесь инкубируют при 37°C в течение 30 мин. Затем F10-10% FBS [F-10 (Sigma, N6908, 445 мл), FBS (50 мл), пенициллин-стрептомицин (Invitrogen, 15140-122, 5 мл)] добавляют по 1500 мкл снаружи вставки и 500 мкл внутрь вставки, и трансвел инкубируют при 37°C в течение 24 час. После этого, вставки промывают внутри и снаружи один раз F10-10% FBS, соответствующие клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные в примере получения 1, высевают при 5×105 клеток (F10-10% FBS, 500 мкл) внутри вставки и F10-10% FBS (1500 мкл) добавляют снаружи вставки. Клетки пигментного эпителия сетчатки культивируют в F10-10% FBS до конфлюэнтности. После достижения конфлюэнтности, среду заменяют на SFRM-B27 [DMEM (Sigma, D6046, 350 мл), F12 HAM (Sigma, N6658, 150 мл), B27 (Invitrogen, 17504-044, 10 мл), 200 мМ L-глютамин (Sigma, G7513, 5 мл), пенициллин-стрептомицин (Invitrogen, 15140-122, 5 мл), bFGF (Wako, 060-04543, 10 нг/мл)] (1500 мкл снаружи вставки, 500 мкл внутрь вставки, замену среды осуществляют 3 раза/неделю), и клетки пигментного эпителия сетчатки культивируют, пока они не будут показывать соответствующий цвет и форму.
<Вырезание>
По прохождении 6 недель от начала культивирования, мембрану вставки удаляют, добавляют коллагеназу L (Nitta Gelatin, PBS(+): Sigma, 2600 Ед./мл, 100 мкл) под вставку, и инкубируют вставку при 37°C в течение 60 мин и промывают 3 раза PBS(+). Добавляют SFRM-B27 по каплям, так, чтобы клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки не высыхал, и вырезают с желаемыми размерами с помощью PALM MicroBeam (ZEISS).
Пример 2. Способ получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки (вид коллагена)
Таким же способом, как и в примере 1, за исключением того, что на стадии получения клеточного пласта с использованием 253G1 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) в примере 1, (A) полученный из кожи свиньи коллаген TE Типа I (специально заказанный продукт: в основном содержит коллаген Типа I, малое количество коллагена Типа III, Nitta Gelatin, 5 мг/мл) используют в качестве 0,35% смешанного раствора коллагена/лунка, (B) полученный из сухожилий свиньи коллаген Типа I T-1002 (специально заказанный продукт: коллаген Типа I, Nitta Gelatin, 5,1 мг/мл) используют в качестве 0,35% смешанного раствора коллагена/лунка, (C) меченый FITC коллаген I (Chondrex, 1 мг/мл) используют в качестве 0,07% смешанного раствора коллагена/лунка, (D) меченый FITC коллаген I (специальный заказ, Chondrex, 3 мг/мл) используют в качестве 0,21% смешанного раствора коллагена/лунка, (E) ателоколлаген (KOKEN, 3 мг/мл) используют в качестве 0,21% смешанного раствора коллагена/лунка и (F) проницаемую коллагеновую мембрану для клеточной культуры (KOKEN) используют, соответственно, вместо полученного из сухожилий свиньи растворимого в кислоте коллагена Типа I Cellmatrix I-A (Nitta Gelatin, 3 мг/мл), в качестве 0,21% смешанного раствора коллагена/лунка, клеточные пласты получают и вырезают с получением клеточных пластов из клеток пигментного эпителия сетчатки.
Результаты исследований примера 1 и случаев с использованием каждого из рассмотренных выше коллагенов сравнивают и оценивают в терминах 4 пунктов [1. прочности геля; 2. адгезии клеток; 3. роста клеток; 4. безопасности]. В результате, (A) {1. хуже; 2. эквивалентно; 3. хуже; 4. хорошо}, (B) {1. хорошо (5,1 мг/мл); 2. эквивалентно; 3. хуже; 4. хорошо}, (C) {1. хуже (1 мг/мл); 2. хуже; 3. неизвестно; 4. неизвестно}, (D) {1. эквивалентно (3 мг/мл); 2. эквивалентно; 3. хуже; 4, неизвестно}, (E) {1. эквивалентно (3 мг/мл); 2. хуже; 3. неизвестно; 4, хорошо} и (F) {не лизируется с помощью коллагеназы, то есть непригоден}. Относительно прочности геля, определенный уровень прочности необходим, чтобы сделать возможным рост клеток пигментного эпителия сетчатки. В этом аспекте особенно предпочтительный вид и концентрация коллагена представляют собой полученный из сухожилий свиньи растворимый в кислоте коллаген Типа I Cellmatrix I-A примера 1 и (B) полученный из сухожилий свиньи коллаген Типа I T-1002, используемые при рассмотренной выше концентрации. Когда субстрат не имеет определенного уровня прочности, пигментный эпителий сетчатки не растет и не может использоваться для настоящего изобретения.
Пример 3. Способ получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки (количество коллагена)
Таким же способом, как в примере 1, за исключением того, что на стадии получения клеточного пласта с использованием 253G1 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) из примера 1, количество смешанного раствора коллагенового геля, которое должно использоваться, изменяют до 100 мкл или 300 мкл от 200 мкл, получают и вырезают клеточные пласты, при этом извлекают клеточные пласты из клеток пигментного эпителия сетчатки.
По сравнению с примером 1, когда количество используемого смешанного раствора коллагенового геля составляет 100 мкл, в центральной части образуется тонкий слой коллагенового геля из-за влияния поверхностного натяжения, связанного с малым количеством смешанного раствора коллагенового геля, и когда осуществляют культивирование, высеваемые клетки пигментного эпителия сетчатки с легкостью вступают в непосредственный контакт с мембраной в нижней части, это вызывает разрыв клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки во время операции вырезания пласта. Когда количество используемого смешанного раствора коллагенового геля составляет 300 мкл, поскольку количество смешанного раствора коллагенового геля является большим, образуется толстый слой коллагенового геля, что относительно уменьшает количество среды, которое могло бы удерживаться во вставке, и по этой причине, осуществлять поддержание культуры нелегко, обработка коллагеназой занимает время, и появляется опасение относительно появления более значительных повреждений клеточного пласта. Когда количество используемого смешанного раствора коллагенового геля составляет 100 мкл, клетки непосредственно вступают в контакт с мембраной и клеточный пласт отрывается от этой части при удалении мембраны.
Пример 4. Способ получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки (количество коллагеназы и время обработки)
Таким же способом, как в примере 1, за исключением того, что на стадии получения клеточного пласта с использованием 253G1 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) из примера 1, 1% коллагеназа L (Nitta Gelatin) или коллагеназа Типа I (Roche) вступает в контакт с клеточным пластом из клеток пигментного эпителия сетчатки в течение 10 мин в количестве 10 мкл, 20 мин в количестве 10 мкл, 30 мин в количестве 10 мкл, 20 мин в количестве 20 мкл, 60 мин в количестве 20 мкл, и 50 мин в количестве 30 мкл, вместо 30 мин в количестве 30 мкл, клеточные пласты получают и вырезают, при этом извлекают клеточные пласты из клеток пигментного эпителия сетчатки.
В результате, когда обработку коллагеназой осуществляют в течение 60 мин в количестве 10 мкл или 60 мин в количестве 20 мкл, наблюдают деградацию коллагена на таком же уровне, как для 30 мкл в течение 30 мин.
Пример 5. Способ получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки (количество высеваемых клеток)
Таким же способом как в примере 1, за исключением того, что на стадии получения клеточного пласта с использованием 253G1 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) из примера 1, количество клеток, которые должны высеваться внутри вставки, изменяют до (A) 5×104 клеток/500 мкл, (B) 1×105/500 мкл или (C) 1×106/500 мкл от 5×105 клеток/500 мкл, получают и вырезают клеточные пласты, при этом извлекают клеточные пласты из клеток пигментного эпителия сетчатки.
По сравнению с примером 1, (A) и (B) требуют большего времени для достижения конфлюэнтности клеток из-за малого количества клеток и (C) показывает медленный рост, а также тенденцию к возникновению необходимости в большем времени для достижения конфлюэнтности клеток.
Пример 6. Базальная мембрана, формируемая на клеточном пласте из клеток пигментного эпителия сетчатки
Криогенный срез (замороженный срез) получают из клеточного пласта, полученного из 253G1 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) в примере 1, и подвергают воздействию иммуногистохимического окрашивания. Образование плотного соединения подтверждается экспрессированием ZO-1, и образование базальной мембраны подтверждается экспрессированием ламинина и коллагена Тип IV. Для детектирования каждого белка используют соответствующие антитела кролика анти-ZO-1, производимые Zymed (разбавления 1:100), ламинин кролика, производимый Abcam (разбавления 1:200) и антитела мыши против коллагена человека Тип IV, производимые Calbiochem (1:40). Кроме того, подтверждается, что клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки имеет однослойную эпителиальную форму по состоянию окрашивания ядер с использованием 4’,6-диамидино-2-фенилиндола, производимого Molecular Probes (DAPI; 1 мкг/мл).
Оценка 1. Профиль экспрессии гена, специфичного к пигментному эпителию сетчатки для клеточного пласта
На стадии получения клеточного пласта из 59SV3, 59SV9 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) в примере 1, экспрессирование BEST1, RPE65, MERTK, CRALBP в клетках, составляющих пласты, по прохождении 1 недели, 4 недель, 2 месяцев, где день, когда среду заменяют на SFRM-B27 после достижения конфлюэнтности клеток, представляет собой день 0, подтверждают с помощью RT-PCR. В результате, наблюдают экспрессирование на таком же уровне, как для положительного контроля (РНК клеток пигментного эпителия сетчатки человека в целом (производится ScienCell, Cat NO. 6545)). Здесь, BEST1, RPE65, MERTK представляют собой гены, специфично экспрессируемые в клетках пигментного эпителия сетчатки. CRALBP представляет собой ген, экспрессируемый в клетках пигментного эпителия сетчатки и в клетках Muller.
Оценка 2. Измерение остаточного коллагена в пласте клеток пигментного эпителия сетчатки
Криогенные срезы (замороженные срезы) получают посредством вырезания, до и после обработки коллагеназой, из соответствующих клеточных пластов, полученных из 253G1 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) в примере 1, и подвергают воздействию иммуногистохимического окрашивания. Ядро окрашивают с помощью 4’,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI; 1 мкг/мл), производимого Molecular Probes, и Коллаген Типа I окрашивают антителом кролика против коллагена человека Типа I (разбавления 1:40), производимым Calbiochem. В результате, коллаген не детектируется в пластах после обработки коллагеназой, и подтверждается, что коллагеназа удаляет коллаген, нанесенный в виде покрытия на чашку для культивирования. С другой стороны, коллаген детектируют на пластах, вырезанных до обработки коллагеназой.
Оценка 3. Способность к секретированию цитокинов клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки
Культурные среды на апикальной стороне и на базальной стороне трансвела извлекают до стадии вырезания клеточных пластов из клеток пигментного эпителия сетчатки из клеточных пластов, полученных из 253G1 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) и 454E2 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) в примере 1, и продуцируемые количества VEGF и PEDF детектируют с помощью ELISA в соответствии со способом, описанным в Arvydas M, IOVS. 2006; 47: 3612-3624. В результате подтверждается, что подобно пигментному эпителию сетчатки, полученному от эмбриона человека, как сообщает Arvydas M, IOVS. 2006; 47: 3612-3624, VEGF в основном секретируется на базальной стороне, а PEDF в основном секретируется на апикальной стороне (Фиг.1). Показано, что клеточный пласт по настоящему изобретению имеет способность секретирования цитокинов, сходную с параметрами живых организмов, и является превосходным по функциональности.
Оценка 4. Трансэпителиальное электрическое сопротивление клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки
Наблюдается сильная корреляция между барьерной функцией клеточного слоя и электрическим импедансом, а именно, удельным поверхностным трансэпителиальным/трансэндотелиальным электрическим сопротивлением (TER). Зонд помещают в среды внутри и снаружи вставки в соответствии со способом, описанным MILLIPORE (с использованием Millicell ERS-2), перед стадией вырезания клеточного пласта клеток пигментного эпителия сетчатки, полученного из 454E2 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) в примере 1, и электрически измеряют TER. В результате, TER составляет 640 Ом·см2 и показывает высокое значение TER, подобно пигментному эпителию сетчатки, полученному от эмбриона человека, как сообщается в Nature Protocols vol 4, No 5 662-673 (2009), Fig 10. Показано, что клеточный пласт по настоящему изобретению имеет высокую барьерную функцию, сходную с параметрами живых организмов.
Оценка 5. Трансплантация клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки, полученного от ES клеток обезьяны
Клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки обезьяны, полученный из клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных из ES клеток обезьяны, CMK6 в примере 1, трансплантируют в один глаз обезьяны в соответствии со способом, описанным в Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995 Feb; 36(2): 381-90. Перед трансплантацией, осуществляют фотокоагуляцию сетчатки для нарушения сетчатки глаза, который должен подвергаться воздействию трансплантации. В день 28 от трансплантации в один глаз обезьяны, имеющей макулу с фотокоагуляцией сетчатки, сформированную в нем, фотографируют глазное дно, и изображения срезов глазного дна получают как гистологические срезы с использованием OCT (оптического когерентного томографа), на основании которых подтверждается состояние сетчатки. В результате, утечки флуоресценции при флуоресцеиновой ангиографии не обнаружено, трансплантат приживается, и расстройства, такие как утончение чувствительной сетчатки, и тому подобное, не наблюдаются.
Оценка 6. Трансплантация клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки, полученной из iPS клеток обезьяны
Клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки обезьяны, полученный из клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных из iPS клеток обезьяны, 46a в примере 1, трансплантируют под сетчатку одного глаза для аутологичной трансплантации и трех глаз для перекрестной трансплантации в соответствии со способом, описанным в Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995 Feb; 36(2): 381-90. В течение одного года после трансплантации, фотографировали глазное дно, и срезы изображений глазного дна получали как гистологические срезы с использованием OCT (оптического когерентного томографа), на их основании наблюдали состояние сетчатки с ходом времени. При перекрестной трансплантации обнаруживали четкие реакции отторжения, такие как фиброзные изменения на периферии трансплантата, утечки флуоресценции при флуоресцеиновой ангиографии и повреждения с высокой яркостью под сетчаткой, с помощью OCT. С другой стороны, при аутологичной трансплантации не наблюдается такого явного отторжения, не обнаруживается утечек при флуоресцеиновой ангиографии, трансплантат приживается и не обнаружено таких расстройств как утончение чувствительной сетчатки, и тому подобное.
Промышленное применение
При использовании способа по настоящему изобретению, клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки, который должен применяться посредством трансплантации пациентам с возрастной дегенерацией желтого пятна, может быть получен сравнительно удобным образом. В частности, когда клетки, которые должны использоваться для культивирования, представляют собой клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные из iPS клеток, можно использовать собственные клетки пациента, что может предотвратить отторжение при трансплантации. Кроме того, поскольку клеточный пласт, полученный с помощью способа по настоящему изобретению, имеет базальную мембрану, состоящую из таких же компонентов, как в живых организмах, может быть воспроизведен клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки, более близкий к состоянию в живом организме, что является полезным для различных целей скрининга.
Настоящая заявка основывается на заявке на патент № 2011-040130, поданной в Японии (дата подачи: 25 февраля 2011 года), содержание которой включается в настоящий документ во всей ее полноте.
Claims (10)
1. Способ получения пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки, включающий следующие стадии:
(1) высевание и культивирование клеток пигментного эпителия сетчатки на геле из полученного из сухожилий свиньи фиброзного коллагена с образованием клеточного пласта, состоящего из клеток пигментного эпителия сетчатки, где указанные клетки пигментного эпителия сетчатки не являются эмбриональными клетками человека, и
(2) деградация указанного коллагенового геля с помощью коллагеназы для отсоединения клеточного пласта, состоящего из клеток пигментного эпителия сетчатки.
2. Способ получения клеточного пласта по п. 1, в котором клетки пигментного эпителия сетчатки представляют собой клетки, полученные посредством индуцирования дифференциации стволовых клеток или клеток-предшественников.
3. Способ получения клеточного пласта по п. 2, в котором стволовые клетки представляют собой ES клетки или iPS клетки.
4. Способ получения клеточного пласта по п. 1, в котором концентрация коллагена в коллагеновом геле составляет 0,1-0,5%.
5. Способ получения клеточного пласта по любому из пп. 1-4, дополнительно включающий следующую стадию (3):
(3) подтверждение присутствия или отсутствия базальной мембраны на поверхности контакта между отсоединенным клеточным пластом и коллагеновым гелем.
6. Пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки для трансплантации, содержащий слой клеток, сформированный из клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных посредством индуцирования дифференциации стволовых клеток или клеток-предшественников ex vivo, и базальную мембрану, секретированную из клеток пигментного эпителия сетчатки, где указанные клетки пигментного эпителия сетчатки не являются эмбриональными клетками человека.
7. Пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки для скрининга вещества, имеющего эффективность при офтальмологических заболеваниях, содержащий слой клеток, сформированных из клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных посредством индуцирования дифференциации стволовых клеток или клеток-предшественников ex vivo, и базальную мембрану, секретированную из указанных клеток пигментного эпителия сетчатки, где указанные клетки пигментного эпителия сетчатки не являются эмбриональными клетками человека.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011040130 | 2011-02-25 | ||
| JP2011-040130 | 2011-02-25 | ||
| PCT/JP2012/054631 WO2012115244A1 (ja) | 2011-02-25 | 2012-02-24 | 網膜色素上皮細胞シートの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013143307A RU2013143307A (ru) | 2015-03-27 |
| RU2628697C2 true RU2628697C2 (ru) | 2017-08-21 |
Family
ID=46721016
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013143307A RU2628697C2 (ru) | 2011-02-25 | 2012-02-24 | Способ получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9902933B2 (ru) |
| EP (1) | EP2679673B1 (ru) |
| JP (1) | JP6011979B2 (ru) |
| KR (1) | KR101994492B1 (ru) |
| CN (2) | CN103459593A (ru) |
| AU (1) | AU2012222255B2 (ru) |
| BR (1) | BR112013021514A2 (ru) |
| CA (1) | CA2828197C (ru) |
| ES (1) | ES2726804T3 (ru) |
| IL (1) | IL228087A0 (ru) |
| MX (1) | MX348269B (ru) |
| RU (1) | RU2628697C2 (ru) |
| SG (2) | SG192878A1 (ru) |
| WO (1) | WO2012115244A1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021257092A1 (en) | 2020-06-19 | 2021-12-23 | Endogena Therapeutics, Inc. | New compounds and their use as therapeutically active substances in the treatment and/or prevention of diseases involving the retinal pigment epithelium |
| WO2022076417A1 (en) | 2020-10-08 | 2022-04-14 | Endogena Therapeutics, Inc. | New compounds and their use as therapeutically active substances in the treatment and/or prevention of diseases involving the retinal pigment epithelium |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2882802C (en) * | 2012-08-24 | 2021-07-06 | Riken | Method for producing retinal pigment epithelial cell sheet |
| US10072242B2 (en) | 2013-03-25 | 2018-09-11 | Foundation For Biomedical Research And Innovation At Kobe | Cell sorting method |
| WO2015009941A1 (en) * | 2013-07-17 | 2015-01-22 | The Regents Of The University Of California | Highly conductive nanocomposite, biological and small molecule materials for enhanced resin conductivity |
| JP6518878B2 (ja) * | 2013-10-09 | 2019-05-29 | 株式会社ヘリオス | 網膜色素上皮細胞の製造方法 |
| JP6495176B2 (ja) | 2013-11-11 | 2019-04-03 | 住友化学株式会社 | 網膜色素上皮細胞の製造方法 |
| SG10202103834VA (en) * | 2014-02-21 | 2021-05-28 | Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd | Eye disease treatment agent, screening method therefor, and method for predicting rejection response associated with retinal pigment epithelial cell transplant |
| EP3108891B1 (en) * | 2015-02-20 | 2021-01-06 | Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. | Eye disease treatment agent, screening method therefor, and method for predicting rejection response associated with retinal pigment epithelial cell transplant |
| JP6799248B2 (ja) * | 2016-09-28 | 2020-12-16 | 澁谷工業株式会社 | 細胞シートの切断方法 |
| MX2019006576A (es) | 2016-12-07 | 2019-08-21 | Mayo Found Medical Education & Res | Metodos y materiales para usar soportes de fibrina para trasplante de epitelio de pigmento retiniano. |
| CN108728413A (zh) * | 2017-06-13 | 2018-11-02 | 中山大学中山眼科中心 | 一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法 |
| CN110106147B (zh) * | 2018-04-18 | 2021-04-13 | 浙江大学 | 一种诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的方法及其应用 |
| CN108642014B (zh) * | 2018-05-17 | 2019-10-08 | 山东兴瑞生物科技有限公司 | 利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法 |
| EP3957366A4 (en) * | 2019-04-26 | 2023-01-04 | Riken | COMPOSITE WITH NEURAL RETINA, RETINAL PIGMENTAL EPITHIAL CELLS AND HYDROGEL AND METHOD OF PRODUCTION |
| CN111714698A (zh) * | 2020-05-18 | 2020-09-29 | 北京奥泰康医药技术开发有限公司 | 含有细胞的生物凝胶组合物、其制备方法及应用 |
| US20230220336A1 (en) * | 2020-06-01 | 2023-07-13 | Figene, Llc | Fibroblasts as a regenerative cellular source for the treatment of blindness |
| WO2023166762A1 (ja) * | 2022-03-04 | 2023-09-07 | 四国計測工業株式会社 | 細胞培養基材、細胞培養容器および接着細胞の細胞剥離方法 |
| JP7333573B1 (ja) * | 2022-03-04 | 2023-08-25 | 四国計測工業株式会社 | 接着細胞の細胞剥離方法、接着細胞の培養方法および接着細胞培養用のキット |
| CN117625536B (zh) * | 2024-01-26 | 2024-04-30 | 中国人民解放军总医院第三医学中心 | 一种人视网膜色素上皮细胞的纯化、培养方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005261292A (ja) * | 2004-03-18 | 2005-09-29 | Ihara Suisan Kk | 細胞シートおよびその製造方法 |
| RU2279886C2 (ru) * | 2004-06-10 | 2006-07-20 | Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца Минздрава РФ | Способ улучшения функциональной активности сетчатки при ее патологии различного генеза |
| WO2009127809A1 (en) * | 2008-04-14 | 2009-10-22 | Ucl Business Plc | Membrane |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2018228C (en) | 1989-06-05 | 1996-02-27 | Nancy L. Parenteau | Cell culture systems and media |
| CN1252001A (zh) * | 1997-02-13 | 2000-05-03 | 博士伦外科公司 | 破坏视网膜色素上皮细胞的方法 |
| EP1723974A4 (en) | 2004-02-25 | 2010-09-01 | Ihara & Company Ltd | COLLAGENGEL AND METHOD FOR ITS MANUFACTURE |
| US20060153815A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-07-13 | Agnieszka Seyda | Tissue engineering devices for the repair and regeneration of tissue |
| US8242093B2 (en) * | 2008-02-07 | 2012-08-14 | Ceregene, Inc. | Rescue of photoreceptors by intravitreal administration of an expression vector encoding a therapeutic protein |
| EP2570139B1 (en) | 2010-05-10 | 2019-08-07 | Tsutomu Yasukawa | Method for producing cell sheet |
| EP2593117B1 (en) * | 2010-07-12 | 2019-03-20 | University of Southern California | Biocompatible substrate for facilitating interconnections between stem cells and target tissues and methods for implanting same |
| CA2882802C (en) | 2012-08-24 | 2021-07-06 | Riken | Method for producing retinal pigment epithelial cell sheet |
-
2012
- 2012-02-24 US US14/001,108 patent/US9902933B2/en active Active
- 2012-02-24 EP EP12748831.0A patent/EP2679673B1/en active Active
- 2012-02-24 KR KR1020137024768A patent/KR101994492B1/ko active IP Right Grant
- 2012-02-24 SG SG2013063375A patent/SG192878A1/en unknown
- 2012-02-24 CN CN2012800101656A patent/CN103459593A/zh active Pending
- 2012-02-24 SG SG10201704505TA patent/SG10201704505TA/en unknown
- 2012-02-24 RU RU2013143307A patent/RU2628697C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2012-02-24 BR BR112013021514-3A patent/BR112013021514A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2012-02-24 JP JP2013501148A patent/JP6011979B2/ja active Active
- 2012-02-24 AU AU2012222255A patent/AU2012222255B2/en active Active
- 2012-02-24 CN CN201711285649.2A patent/CN107937341A/zh active Pending
- 2012-02-24 ES ES12748831T patent/ES2726804T3/es active Active
- 2012-02-24 WO PCT/JP2012/054631 patent/WO2012115244A1/ja active Application Filing
- 2012-02-24 MX MX2013009770A patent/MX348269B/es active IP Right Grant
- 2012-02-24 CA CA2828197A patent/CA2828197C/en active Active
-
2013
- 2013-08-22 IL IL228087A patent/IL228087A0/en unknown
-
2018
- 2018-02-14 US US15/896,699 patent/US20180171292A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005261292A (ja) * | 2004-03-18 | 2005-09-29 | Ihara Suisan Kk | 細胞シートおよびその製造方法 |
| RU2279886C2 (ru) * | 2004-06-10 | 2006-07-20 | Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца Минздрава РФ | Способ улучшения функциональной активности сетчатки при ее патологии различного генеза |
| WO2009127809A1 (en) * | 2008-04-14 | 2009-10-22 | Ucl Business Plc | Membrane |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CARR A.J. et all., Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat, PLoS One, 2009, v.4, is.12, e8152. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021257092A1 (en) | 2020-06-19 | 2021-12-23 | Endogena Therapeutics, Inc. | New compounds and their use as therapeutically active substances in the treatment and/or prevention of diseases involving the retinal pigment epithelium |
| WO2022076417A1 (en) | 2020-10-08 | 2022-04-14 | Endogena Therapeutics, Inc. | New compounds and their use as therapeutically active substances in the treatment and/or prevention of diseases involving the retinal pigment epithelium |
| US11541039B2 (en) | 2020-10-08 | 2023-01-03 | Endogena Therapeutics, Inc. | Compounds and their use as therapeutically active substances in the treatment and/or reducing signs or symptoms of diseases involving the retinal pigment epithelium |
| US11844755B2 (en) | 2020-10-08 | 2023-12-19 | Endogena Therapeutics, Inc. | Compounds and their use as therapeutically active substances in the treatment and/or reducing signs or symptoms of diseases involving the retinal pigment epithelium |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107937341A (zh) | 2018-04-20 |
| EP2679673A1 (en) | 2014-01-01 |
| RU2013143307A (ru) | 2015-03-27 |
| CA2828197A1 (en) | 2012-08-30 |
| IL228087A0 (en) | 2013-09-30 |
| AU2012222255B2 (en) | 2017-04-13 |
| BR112013021514A2 (pt) | 2020-09-29 |
| MX2013009770A (es) | 2014-01-23 |
| US9902933B2 (en) | 2018-02-27 |
| KR101994492B1 (ko) | 2019-06-28 |
| AU2012222255A1 (en) | 2013-10-10 |
| EP2679673A4 (en) | 2014-11-12 |
| US20140057281A1 (en) | 2014-02-27 |
| MX348269B (es) | 2017-06-05 |
| US20180171292A1 (en) | 2018-06-21 |
| SG10201704505TA (en) | 2017-06-29 |
| CN103459593A (zh) | 2013-12-18 |
| KR20140033008A (ko) | 2014-03-17 |
| WO2012115244A1 (ja) | 2012-08-30 |
| ES2726804T3 (es) | 2019-10-09 |
| JPWO2012115244A1 (ja) | 2014-07-07 |
| CA2828197C (en) | 2019-11-12 |
| JP6011979B2 (ja) | 2016-10-25 |
| EP2679673B1 (en) | 2019-02-20 |
| SG192878A1 (en) | 2013-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2628697C2 (ru) | Способ получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки | |
| JP6292557B2 (ja) | 網膜色素上皮細胞シートの製造方法 | |
| US20190032020A1 (en) | Differentiation of pluripotent stem cells to form renal organoids | |
| KR20190112090A (ko) | 다능성줄기세포의 분화 제어 방법 | |
| EP2570139B1 (en) | Method for producing cell sheet | |
| US20240271089A1 (en) | Methods to generate macular, central and peripheral retinal pigment epithelial cells | |
| US20240261474A1 (en) | Biodegradable tissue scaffold with secondary matrix to host weakly adherent cells | |
| Rolev | Evaluation of corneal endothelial cell therapy using an in vitro human corneal model |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190225 |