MX2013009770A - Metodo para producir lamina celular epitelial de pigmento retinal. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para producir una lámina celular, que comprende los pasos de: (1) sembrar células epiteliales de pigmento retinal en un gel de colágeno y cultivar las células epiteliales de pigmento retinal en el gel de colágeno para formar así una lámina celular compuesta de las células epiteliales de pigmento retinal, y (2) descomponer el gel de colágeno con una colagenasa para remover la lámina celular compuesta de las células epiteliales de pigmento retinal; y otros.

Description

M ETODO PARA PRODUCI R LAMI NA C E LU LAR E PITELIAL DE PIG M ENTO RETI NAL Cam po técnico La presente invención se refiere a un método de producción de una lámina celular, que comprende sembrar células epiteliales de pigmento retinal sobre un gel de colágeno. La presente invención también se refiere a una lámina celular para trasplante, que comprende una capa celular formada a partir de células epiteliales de pigmento retinal y una membrana basal.

Antecedentes de la técnica En la actualidad, la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es una de las principales enfermedades causantes de ceguera legal en países avanzados, y principalmente es vista en ciudadanos mayores arriba de 50 años de edad. La degeneración macular relacionada con la edad es provocada por cambios relacionados con la edad en la mácula, y en gran parte dividida en una forma exudativa y una forma atrófica. La degeneración macular relacionada con la edad exudativa es una enfermedad asociada con el desarrollo de vasos neovasculares de la coroides, en la mácula de ciudadanos mayores, entonces lesión sangrante y exudativa bajo el epitelio de pigmento retinal o retina, y finalmente, formación de un tejido cicatricial. La degeneración macular relacionada con la edad atrófica es una enfermedad acompañada por atrofia del área macular y acumulación de drusa. Una lesión precursora que conduce a degeneración macular relacionada co.n la edad exudativa y atrófica es algunas veces referida particularmente como degeneración macular relacionada con edad temprana y esta lesión también es considerada una patología de degeneración macular relacionada con la edad.

Para el tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad cuando es una forma exudativa suave, una terapia quirúrgica tal como terapia fotodinámica, fotocoagulación láser, extracción de vasos neovasculares y similares, o un método de tratamiento que se dirige a la regresión y remoción de vasos neovasculares mediante una terapia de fármacos tal como administración de un inhibidor de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) involucrado en la angiogénesis y similares puede seleccionarse. Sin embargo, los medios antes mencionados no pueden proporcionar efectividad terapéutica para la forma exudativa o atrófica que ha progresado a la atrofia avanzada o falta de epitelio de pigmento retinal (RPE). En tal caso, un método de tratamiento efectivo es el trasplante de células epiteliales de pigmento retinal o epitelio de pigmento retinal al sitio deficiente bajo la retina.

Se han intentado varios métodos de tratamiento por el trasplante de células epiteliales de pigmento retinal. Se ha reportado que el trasplante de células epiteliales de pigmento retinal obtenidas de fetos humanos en la forma de una suspensión celular muestra pobre injerto de las células trasplantadas. En casos donde se trasplantó una lámina de células epiteliales de pigmento retinal también conteniendo membrana de Bruch y coroides separada como una lámina de un ojo de cadáver, ocurrió el rechazo post-operatorio y un efecto de tratamiento suficiente no fue obtenido (documento no de patente 1 ). Además, se ha señalado que el método que utiliza un ojo de cadáver incluye un problema ético. Por otra parte, se ha reportado un caso de visión mejorada de un paciente con degeneración macular relacionada con la edad, en donde se usó un método que incluye recolectar las células epiteliales de pigmento retinal normales y coroides del propio paciente y trasplantarlas al sitio deficiente bajo la mácula. Sin embargo, este método coloca una carga extremadamente alta sobre los pacientes y un riesgo de cirug ía extremadamente alto. Aunque se ha hecho un intento de utilizar las propias células epiteliales de pigmento de iris del paciente recolectadas del paciente con degeneración macular relacionada con la edad para el trasplante en lugar de células epiteliales de pigmento retinal, el límite superior de la visión final es bajo y no se ha obtenido un efecto suficiente, y más aún, la carga y riesgo de utilizar las propias células del paciente son altos (documento no de patente 2) . De esta manera, métodos de tratamiento convencionales que usan células recolectadas de un ojo de cadáver o las propias células del paciente no son prácticos en términos de ética, seguridad, efecto y similares, y se ha deseado una célula epitelial de pigmento retinal verdaderamente utilizable para un tratamiento de trasplante.

Como uno de los métodos de producción de una lámina" de células epiteliales de pigmento retinal, puede mencionarse un método que incluye un substrato de cultivo celular con una matriz extracelular y similares, y cultivar células epiteliales de pigmento retinal sobre la misma para formar una lámina. Por ejemplo, una lámina celular puede formarse al cultivar células epiteliales de pigmento retinal sobre un material recubierto con fibronectina, pero la formación de una membrana basal no es reportada, y un método para extraer una lámina a partir de un recipiente en el cual la lámina se formó no es descrita en absoluto (documento no de patente 3). En consideración de tales problemas, un método para formar, por adelantado, una lámina de células epiteliales de pigmento retinal al usar una membrana artificial en lugar de una membrana basal ha sido desarrollada por varios laboratorios. Sin embargo, se teme que una membrana artificial sea un desorden para injerto en trasplante y mantenim iento funcional del cuerpo. Aunque una membrana artificial con una respuesta menos biológica tam bién ha sido desarrollada, no es adecuada para trasplante debido a que induce problemáticamente inflamación y rechazo asociado con la misma, los cuales son provocados por las diferencias de la membrana basal producida por la célula por sí misma en la composición, propiedades, rigidez y similares. Más aún, de manera convencional , un método para cultivar una lámina de células epiteliales de pigmento retinal teniendo polaridad ha sido conocido. Sin embargo, no es solo para uso de modelo experimental en donde las células epiteliales de pigmento retinal y línea inmortalizada derivada de un organismo vivo se convierten en una lámina en un recipiente y se utilizan directamente, y todavía no ha habilitado la recuperación real de una lámina de células epiteliales de pigmento retinal provista con una membrana basal como en organismos vivos a partir de un recipiente (documento no de patente 4) . Existe un método para obtener una lámina de células epiteliales de pigmento retinal al exfoliar células epiteliales de pigmento retinal cultivadas directamente en un plato de cultivo, sin usar una matriz extracelular y similares. Tal método para separar células mediante exfoliación no puede estabilizar la forma y tamaño de la lámina, membrana basal y similares, provoca mucho daño sobre las células epiteliales de pigmento retinal mediante exfoliación, y provoca, en la mayoría de los casos, la desintegración de la forma de la lámina y células dispersas debido a la exfoliación, fallando así en proporcionar una lámina de células utilizable para trasplante y similares (documento no de patente 5) . Además, aunque se ha reportado recubrir un substrato de cultivo celular con colágeno y cultivar células sobre el colágeno, no se usan células epiteliales de pigmento retinal humanas. Más aún , para aumentar la fuerza de gel, se necesita adicionar por separado un agente reticulante, el cual hace al método lejos de conveniente y rápido (documento de patente 1 ). En la situación actual, la producción de una lámina de células epiteliales de pigmento retinal , la cual sea terapéuticamente efectiva par enfermedades retínales tal como degeneración macular relacionada con la edad y similares, y conveniente y estable de preparar, todavía es un problema.

Lista de documentos Documentos de patente Documento de patente 1 : JP-A-2005-261292 Documentos no de patente Documento no de patente 1: Ophtalmic Surg. 1991 Feb; 22(2): 102-8.

Documento no de patente 2: Tohoku J Ex Med. 1999 DEC; 189(4): 295-305.

Documento no de patente 3: Nat. Protoc, 4(5), 2009, 662-673.

Documento no de patente 4: Invest. Ophtalmol. Vis. Sci., 47, 2006, 3612-3624.

Documento no de patente 5: Invest. Ophtalmol. Vis. Sci., 36(2), 195, 381-390.

Breve descripción de la invención Problemas a ser resueltos por la invención El problema de la presente invención es desarrollar un nuevo método para producir una lámina de células epiteliales de pigmento retinal de manera conveniente y estable sin usar una membrana artificial, y proporcionar a los pacientes con una enfermedad asociada con la falta de epitelio de pigmento retinal, tal como degeneración macular relacionada con la edad y similares, una lámina de células epiteliales de pigmento retinal para trasplante, el cual muestra una alta tasa de injerto y es superior en función.

Medios para resolver los problemas Los presentes inventores produjeron una lámina celular al formar una capa de gel de colágeno sobre un substrato de cultivo celular, y sembrar y cultivar células epiteliales de pigmento retinal sobre la misma una lámina celular obtenida mediante tal método mantiene una membrana basal entre el gel de colágeno y la lámina de células epiteliales de pigmento retinal, tiene capacidad de secreción de citocina y adhesividad entre las células similares a aquéllas de células epiteliales de pigmento retinal in vivo, y permite la fácil separación de la lámina de células epiteliales de pigmento retinal a partir del substrato de cultivo celular mientras que mantiene la membrana basal al descomponer el gel de colágeno con colagenasa. Además, las células que constituyen la lámina celular mantuvo la expresión de un marcador específico de células epiteliales de pigmento retinal. Los presentes inventores han conducidos estudios intensivos y completaron la presente invención a partir de estos hallazgos. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona [1 ] un método para producir una lámina celular que comprende los siguientes pasos (1 ) sembrar y cultivar células epiteliales de pigmento retinal sobre un gel de colágeno para formar una lámina celular compuesta de las células epiteliales de pigmento retinal, y (2) degradar el gel de colágeno con colagenasa para separar la lámina celular compuesta por las células epiteliales de pigmento retinal; [2] el método de producción de la lámina celular de [1 ] antes mencionado, en donde las células epiteliales de pigmento retinal son células obtenidas al inducir diferenciación de células madre o células progenitoras; [3] el método de producción de la lámina cel ular de [2] antes mencionado, en donde las células madre son células ES o células iPS; [4] el método de producción de la lámina celular de [1 ] antes mencionado, en donde la concentración de colágeno en el gel de colágeno es 0. 1 % - 0.5% ; [5] el método de producción de la lámina cel ular de cualq uiera de [1 ] a [4] antes mencionados, que com prende además el sig uiente paso (3) (3) confirmar la presencia o ausencia de una membrana basal sobre la superficie de contacto entre la lám ina celular separada y el gel de colágeno; [6] una lámina celular producida mediante el método de cualq uiera de los [ 1 ] a [5] antes mencionados; [7] una lámina celular para traspla nte, que comprende una capa celular formada con células epiteliales de pigmento retinal obtenidas al inducir la diferenciación de células madre o células progenitoras ex vivo, y u na membrana basal secretada a partir de dichas cél ulas; y [8] una lám ina celu lar para clasificación, com prend iendo una capa celular formada con células epiteliales de pigmento retinal obtenidas al inducir la diferenciación de cél ulas madre o células progenitoras ex vivo, y una mem brana basal secretada para dichas célu las.

Efecto de la invención De acuerdo con la presente invención , una lám ina de células epiteliales de pigmento retina l teniendo una constitución teniendo una membrana basal que aparece sobre una superficie, puede prepararse de manera fácil y estable. Debido a que la lámina celular de la presente invención es superior en la tasa de injerto y funcionalidad, y es extremadamente útil para trasplante, una lámina compuesta de una membrana basal y células epiteliales de pigmento retinal puede ser producida y aplicada a pacientes con enfermedades oftálmicas, tal como pacientes con degeneración macular relacionada con la edad y similares mediante trasplante. En particular, cuando la célula a ser usad apara cultivo es una célula epitelial de pigmento retinal derivada de una célula iPS, el rechazo en trasplante puede ser evitado al utilizar la propia célula del paciente como una fuente.

Breve descripción de los dibujos La Fig. 1 muestra los resultados de la prueba de la capacidad secretoria de citocina de la lámina de células epiteliales de pigmento retinal.

Descripción de las modalidades La presente invención es explicada a detalle a continuación.

La presente invención proporciona un método de producción de una lámina celular, que incluye los siguientes pasos: (1 ) Sembrar y cultivar células epiteliales de pigmento retinal sobre un gel de colágeno para formar una lámina celular compuesta de las células epiteliales de pigmento retinal, y (2) degradar el gel de colágeno con colagenasa para separar la lámina celular compuesta de las células epiteliales de pigmento retinal.

Aunque la célula epitelial de pigmento retinal a ser sembrada en el paso (1 ) puede ser una célula derivada de cualquier mam ífero siempre y cuando sea derivada de un mam ífero (por ejemplo, humano, mono, ratón, rata, perro, bovino, caballo, cerdo, borrego, cabra, gato, conejo, hámster, conejillo de I ndias, etc.), e de preferencia una célula derivada de humano.

La célula epitelial de pigmento retinal a ser sembrada puede ser una célula primaria recolectada directamente de un globo ocular, o una célula después de varios pasos. Las células epiteliales de pigmento retinal primarias pueden ser aisladas mediante un método conocido. Por ejemplo en el caso de células epiteliales de pigmento retinal derivadas de globo ocular, un globo ocular de cadáver es aislado, dividido rápidamente en el segmento ecuatorial, el cuerpo vitreo y la retina son removidos y tratados con colagenasa, hialuronidasa y similares según sea necesario, las células son recolectadas mediante raspado con un raspador celular, o tratamiento en solución de EDTA o tripsina para liberar las células de la membrana de Bruch, mantenidas en medio de cultivo para inducir adhesión al plato de cultivo y crecimiento, y las células cultivadas en el número requerido son pasadas apropiadamente con un tratamiento de tripsina etc. para asegurar el número celular.

Adicionalmente, estas células también pueden ser las células obtenidas al inducir la diferenciación de células madre pluripotentes no diferenciadas, tal como célula madre embriónica (célula ES), célula madre pluripotente inducida (célula iPS) y similares, células madre incluyendo células madre somáticas tal como célula madre neural y similares, o células progenitoras incluyendo célula progenitora neural y célula progenitora retina. La .célula ES también puede ser una célula ES producida mediante reprogramación nuclear de una célula somática. Además, como la célula madre, la célula objeto puede ser preparada al inducir diferenciación de célula madre pluripotente inducida (célula iPS) reportada en años recientes. La célula iPS es una célula madre inducida derivada de célula somática teniendo propiedades equivalentes para aquéllas de célula ES, las cuales pueden ser producidas al introducir una substancia de reprogramación nuclear particular (ácido nucleico, proteína, compuesto de bajo peso molecular, etc. ) en una célula somática [Takahashi, K. y Yamanaka, S. , Cell, 1 26: 663-676 (2006); Takahashi, K. et al. , Cell, 1 31 : 861 -872 (2007)]. Las condiciones y medio usados para diferenciación de la célula madre antes mencionada en la célula diferenciada objeto puede seguir condiciones y medio convencionalmente conocidos, o pueden determinarse apropiadamente por aquéllos de habilidad ordinaria en la técnica. En la presente invención, una célula obtenida al inducir diferenciación de células madre o células progenitoras, de preferencia célula madre pluripotente, es usada de preferencia con la célula epitelial de pigmento retinal a ser usada para lámina celular, debido a que una célula epitelial de pigmento retinal en una etapa de maduración apropiada puede ser preparada, y en particular, células epiteliales de pigmento retinal comparativamente inmaduras pueden ser preparadas y una lámina celular puede ser formada ventajosamente. Además, cuando la lámina celular a ser producida mediante la presente invención es para trasplante, el uso de una célula iPS es preferible debido a que una lámina celular obtenida usando una célula somática del sujeto, quien recibe trasplante, como una fuente de célula iPS no tiene antigenicidad contra el sujeto. Cuando una célula madre es inducida para diferenciarse, por ejemplo la célula ES humana o célula madre pluripotente, tal como célula iPS y similares es cultivada en un medio de diferenciación ES adicionado con antagonista Wnt tal como Dkk-1 , CKI-7 y similares, y antagonista Nodal tal como Lefty A, SB-431 542 y similares. Cuando se cultiva durante un periodo dado, Rx, Pax6 y Mitf, los cuales son marcadores de células progenitoras retínales, son expresados, y células epiteliales de pigmento retinal humanas pueden ser obtenidas mediante observación morfológica con un microscopio óptico, al confirmar células teniendo una forma poligonal y pigmento [Neuroscience Letters 2009 Jul 24 458(3) 126-31 , Journal of Cell Science 2009 Sep 1 1 22(Pt 17) 3169-79].

Las células epiteliales de pigmento retinal de la presente invención son cultivadas al sembrarse sobre un gel de colágeno. El colágeno usado para el gel de colágeno puede ser cualquiera siempre y cuando sea derivado de un mam ífero (por ejemplo, humano, mono, ratón, rata, perro, bovino, caballo, cerdo, borrego, cabra, gato, conejo, hámster, conejillo de I ndias, etc.) y, por ejemplo, el colágeno derivado de humano o cerdo es usado. Ejemplos del tejido derivado de colágeno incluyen tendón, piel y similares. Aunque la clase del colágeno puede ser cualquiera uno que no sea el colágeno que constituyente la membrana basal humana es preferible, uno que no sea colágeno tipo IV es específicamente preferible. De éstos, el colágeno tipo I es de preferencia usado. Aunque un gel de colágeno puede ser producido mediante, por ejem plo, u n método de producción convencionalmente conocido, en la presente invención , u n gel compuesto de una red de fibra de colágeno es producido al inducir fibrogénesis de colágeno, como se describe en el Ejemplo a ntes mencionado. Debido a q ue el colágeno fibrótico tiene fuerza y flexibi lidad en combi nación , es fácil de manejar, muestra buen mantenim iento de proliferación celu lar y diferenciación celu lar, y es preferible q ue el gel de colágeno sea usado en la presente invención . Además, se requiere que el colágeno a ser usado en la presente invención mantenga células , las cuales son sembradas en el gel de colágeno, sobre la superficie de gel sin permitirles hu ndirse en la capa de gel . Por lo tanto, como el colágeno preferido es uno en donde el gel tiene la fuerza necesaria para la proliferación celu lar y, por ejem plo, es preferible el colágeno teniendo una gran cantidad de reticulación intermolecular. Como tal colágeno, puede mencionarse colágeno derivado de tendón .

Aunque la concentración de colágeno del gel de colágeno antes mencionado puede estar en cualquier rango siem pre y cuando pueda dar un gel teniendo fuerza que permite el injerto y crecimiento de célu las epiteliales de pigment retinal, y que satisface la sol ubilidad facilitando la degradación por colagenasa , la viscosidad perm itiendo el manejo fácil y similares, es preferible 0.1 % (p/v) - 0.5% (p/v) , más preferiblemente 0.2% (p/v) - 0.3% (p/v) . Cuando la concentración de colágeno del gel de colágeno es menor que 0.1 % (p/v), la fuerza del gel de colágeno se vuelve insuficiente, y por lo tanto, la tasa de colonización y la tasa de proliferación celular de células epiteliales de pigmento retinal disminuyen. Cuando la concentración de colágeno del gel de colágeno excede 0.5% (p/v), el tiempo de un tratamiento de colagenasa para degradar el gel de colágeno se vuelve largo, lo cual se teme que ejerza una influencia adversa sobre las células.

Aunque el volumen de una solución mixta de gel de colágeno usada para la producción del gel de colágeno antes mencionado varía dependiendo del área de cultivo y forma de un substrato de cultivo a ser usado para el cultivo celular, es preferible aproximadamente 1 00 µ? -aproximadamente 250 pl, más preferiblemente aproximadamente 1 50 µ? - aproximadamente 200 µ?, por unidad de área (cm2). Cuando la cantidad de solución mezclada de gel de colágeno es demasiado pequeña, se forma una capa de gel de colágeno teniendo una parte central delgada debido a la influencia de una tensión superficial aplicada a la superficie de gel, y la lámina tiende a ser dañada durante el corte de la lámina celular, debido a que las células entran en contacto directo con un substrato de cultivo para cuando las células epiteliales de pigmento retinal son cultivadas. Cuando la cantidad de solución mezclada de gel de colágeno está en exceso, una capa de gel de colágeno gruesa es formada sobre un substrato de cultivo, lo cual reduce relativamente la cantidad del medio de cultivo, y por lo tanto, el mantenimiento de cultivo no es fácil de realizar, el tratamiento de colagenasa tarda, y se temen daños sobre la lámina celular.

En el paso (1 ), puede producir una lámina celular al sembrar y cultivar las células epiteliales de pigmento retinal antes mencionadas sobre el gel de colágeno de un substrato de cultivo celular. El substrato de cultivo celular en la presente invención es particularmente limitado siembre y cuando sea para cultivo celular. Ejemplos de los mismos incluyen recipientes de cultivo teniendo una membrana porosa, tal como transwell y similares, matraz, matraz de cultivo de tejido, plato, caja de petri, plato de cultivo de tejido, multi-plato, microplaca, placa de microcavidades, multiplaca, placa de múltiples cavidades, portaobjeto de cámara, tubo, charola, bolsa de cultivo o botella de rodillo. Los recipientes de cultivo teniendo una membrana porosa son preferibles, debido a un tratamiento de colagenasa y una operación de corte de la lámina celular son convenientemente realizados. Por ejemplo, se usa de preferencia una transwell comercialmente disponible. Ejemplos del material del substrato de cul-tivo celular en la presente especificación incluyen, pero no están limitados a, materiales inorgánicos, tales como materiales de metal, vidrio, cerámica, silicio y similares, materiales orgánicos representados por elastómero, plástico (por ejemplo, resina de poliéster, resina de polietileno, resina de polipropileno, resina ABS, nylon, resina acrílica, fluoro-resina, resina de policarbonato, resina de poliuretano, resina de metilpenteno, resina de fenol, resina de melanina, resina epoxi, resina de cloruro de vinilo).

El número de las células epiteliales de pigmento retinal a ser sembradas pueden estar en cualquier rango siempre y cuando sea una densidad celular capaz de formar una lámina celular. Sin embargo, cuando la densidad celular es demasiado baja, la forma celular es mala, el tiempo de cultivo antes de alcanzar la confluencia es largo, y además, el tiempo necesario para la maduración celular y coloración es largo. Cuando la densidad celular es demasiado alta, de manera similar, la proliferación celular es suprimida, el tiempo de cultivo antes de alcanzar la confluencia tiende a ser largo, y las células pueden morir por estar sobrepobladas. Por lo tanto, la densidad de las células a ser sembradas es de preferencia aproximadamente 4.5x1 04 células/cm2 aproximadamente 8.5x105 células/cm2, más preferiblemente aproximadamente 8.5x104 células/cm2 - aproximadamente 8.5x1 05 células/cm2, muy preferiblemente 4.5x1 05 células/cm2. Üna población de células de capa simple (lámina celular) compuesta por células epiteliales de pigmento retinal pueden formarse al cultivar las células epiteliales de pigmento retinal sembradas sobre gel de colágeno en un medio de cultivo un medio de cultivo puede ser usado sin limitación particular siempre y cuando sea un medio de cultivo celular generalmente usado en el campo pertinente. Por ejemplo, medio basal descrito en "Japan tissue culture conference ed. , Technique of Tissue Culture 3a edición", página 581 , publicada por Asakura Shoten, tal como medio F-1 0, medio F12, MEM, medio BME, DM EM, aMEM, medio I MD; medio ES, medio DM-1 60, medio Fisher, medio WE, medio RPMI 1640 y similares, puede ser usado. Adicionalmente, suero (suero bovino fetal, etc. ), varios factores de crecimiento (EGF, FGF, HGF, PDGF etc.), antibióticos, aminoácidos y similares pueden adicionarse al medio basal. El pH del medio es de preferencia aproximadamente 6 a aproximadamente 8. En cuanto al cultivo, por ejemplo, un cultivo primario es realizado generalmente a aproximadamente 30 -aproximadamente 40°C durante aproximadamente 1 5 - a aproximadamente 60 h hasta que las células epiteliales de pigmento retinal se hacen confluentes. Posteriormente, un cultivo secundario es realizado durante aproximadamente 1 semana - aproximadamente 2 meses mientras se cambia el medio, después de lo cual el cultivo es realizado mientras que se aireada y agita donde sea necesario hasta la formación de una lámina celular. Las células que constituyen la lámina celular obtenida mediante tal cultivo son mantenidas como células epite l ia les de pig me nto reti na l . E l m a nteni m ie nto de las cél u l as como células epiteliales de pigmento retinal puede confirmarse al detectar BEST1 , RPE65, MERTK, CRALBP o similares como un marcador de diferenciación específica.

Debido a que la lámina celular formada en el paso (1 ) es adherida al gel de colágeno, por ejemplo, cuando se usa directamente para trasplante y similares, se teme que el gel de colágeno evite el injerto en un receptor de trasplante. Si el gel de colágeno puede ser removido por adelantado, es conducible a la solución de tal problema. En el paso (2) de la presente invención, el gel de colágeno que se adhiere a la lámina celular formada en el paso (1 ) es degradado por colagenasa. Aquéllos de habilidad ordinaria en la técnica pueden seleccionar la colagenasa apropiada de acuerdo con la clase de colágeno usada para preparar el gel de colágeno. Aunque la colagenasa a ser usada para la degradación del gel de colágeno no es particularmente limitada siempre y cuando tenga una actividad para digerir el gel de colágeno, se prefiere uno que no degrade fácilmente el colágeno que constituye la membrana basal humana (por ejemplo, colágeno tipo IV). Por ejemplo, pueden usarse la colagenasa derivada de un microorganismo inducido por Clostridium (Clostridum histolyticum) o Streptomyces (Streptomyces parvulus), las cuales están disponibles a un nivel comercial, son seguras y tienen una alta actividad enzimática.

. Como la actividad de la colagenasa antes mencionada, la actividad específica en relación al peso de colágeno en el gel de colágeno es importante en lugar de la actividad por unidad de peso de colagenasa y la actividad por unidad de volumen de una solución acuosa de colagenasa. La actividad específica de la colagenasa a ser usada para disolver el gel de colágeno (actividad de colagenasa/peso de colágeno) es de preferencia no menos de 0.1 U/mg. Cuando la actividad específica de la colagenasa es menor que 0. 1 U/mg , la disolución del gel de colágeno puede tomar no preferiblemente demasiado tiempo o el gel puede disolverse no preferiblemente de manera insuficiente. Es más preferible de preferencia en el rango de 0.1 - 1 0, 000 U/mg, además preferiblemente 1 - 3,000 U/mg .

En el método de producción de la lámina celular de la presente invención, un método para que actúe la colagenasa sobre gel de colágeno no es particularmente limitado. Una solución de colagenasa preparada usando, como un solvente, un medio o una solución isotónica teniendo una capacidad amortiguadora puede adicionarse al medio, o un gel de colágeno unido a células separado de un plato de cultivo celular puede ser sumergido en la solución de colagenasa antes mencionada. Debido a que se usa una transweil como un substrato de cultivo celular en la presente invención, una capa de gel de colágeno puede ser expuesta al recuperar una inserción y remover la membrana en el fondo de la inserción, y el gel de colágeno expuesto es sumergido de preferencia directamente en la solución de colagenasa antes mencionado.

En el método de producción de la lámina celular de la presente invención, el tiempo para disolver el gel de colágeno por colagenasa no es particularmente limitado. Cuando el tiempo de acción de la colagenasa es demasiado largo, las funciones celulares tales como capacidad de adhesión, capacidad proliferativa y similares pueden degradarse no preferiblemente. Aunque el tiempo de disolución por colagenasa está sometido a cambio debido a la actividad específica de colagenasa, temperatura, la forma de gel de colágeno, método de tratamiento de colagenasa y similares, generalmente es 1 5 - min - 60 min. El tratamiento de colagenasa puede ser un tratamiento simple o tiempos plurales realizados.

La temperatura durante el tratamiento de gel de colágeno por colagenasa en el método de producción de lámina celular de la presente invención es fijada de preferencia dentro del rango de 1 0 - 42°C, más preferiblemente 30 - 40°C, además preferiblemente 36 - 38°C, debido a que la capacidad para fluir del citoplasma de la célula generalmente disminuye y la capacidad metabólica disminuye cuando la temperatura dentro de los organismos vivos se v elve no más de 10°C (aproximadamente 30°C en humanos), la proteína es desnaturalizada y la función celular disminuye cuando la temperatura excede 42°C, y al temperatura óptima de la colagenasa es principalmente 37°C y una temperatura por debajo de este nivel prolonga el tiempo de disolución.

En el método de producción de lámina celular de la presente invención, cuando la disolución de gel de colágeno procede, la lámina celular es separada gradualmente del gel , y finalmente es liberada en la solución de colagenasa. Para recuperar la lámina celular, la lámina celular puede ser separada mecánicamente del gel restante, o puede recuperarse después de la disolución completa del gel. Aunque la separación mecánica acorta el tiempo hasta la recuperación de la lámina celular, debido a que la lámina celular puede ser destruida, es recuperada de preferencia después de la disolución completa del gel.

Aunque la lámina celular recuperada como se menciona antes puede ser usada directamente para varias aplicaciones, debido a que la colagenasa residual puede inhibir la adhesividad entre las láminas celulares o adhesividad a un tejido, de preferencia se lava con un medio o una solución isotónica teniendo una capacidad amortiguadora. La temperatura durante la limpieza puede ser determinada de acuerdo con el tratamiento de disolución de gel de colágeno mediante colagenasa. Para remover suficientemente la colagenasa residual, el término es lavado de preferencia una o más veces con un medio o una solución isotónica teniendo una capacidad amortiguadora.

En la lámina celular obtenida mediante el método de la presente invención, la citocina específica para una célula epitelial de pigmento retinal es secretada con la polaridad similar a aquélla en organismos vivos, y la resistencia eléctrica transepitelial (TER) a ser un índice de enlace de adhesión cercano entre células elevadas como en organismos vivos. Por lo tanto, tiene una función de barra de capa celular similar a aquélla en organismos vivos. De acuerdo con el método de la presente invención, una lámina celular teniendo funciones similares a aquéllas en organismos vivos puede ser obtenida.

En la lámina celular obtenida mediante el método de la presente invención, una unión estrecha es formada entre células epiteliales de pigmento retinal, y una membrana basal es formada sobre una cara de contacto con el gel de colágeno. En la presente especificación, la "membrana basal" es una membrana formada a partir de los componentes producidos a partir de células epiteliales de pigmento retinal, y significa una membrana conteniendo al menos una parte del componente de membrana basal (de aquí en adelante referido como una "membrana basal de células epiteliales de pigmento retinal"). La membrana basal de las células epiteliales de pigmento retinal en organismos vivos está presente como una película delgada entre una capa de células epiteliales de pigmento retinal y una capa de colágeno interior que constituyente la membrana de Bruch, y es una matriz extracelular teniendo colágeno tipo IV, laminina, proteglicano de sulfato de heparano (perlecan), nidogen y similares como componentes representativos. La membrana de Bruch es una película delgada entre la capa de células epiteliales de pigmento retinal y coroides, y tiene una estructura de 5 capas de una membrana basal de células epiteliales de pigmento retinal, una capa de colágeno interior, una capa de elastina, una capa de colágeno exterior, y una membrana basal de lámina capilar de coroides. La lámina celular de la presente invención contiene una parte (membrana basal de células epiteliales de pigmento retinal) de la estructura de la membrana de Burch. La formación de unión estrecha puede confirmarse al observar la forma de células adheridas estrechamente con forma hexagonal, y la expresión de ocludin, ZO-1 y similares entre las células mediante inmunomanchado. La formación de membrana basal puede confirmarse al observar la expres ión de marcadores de membrana basal, tales como laminina, proteoglicano de su lfato de hepa ra no (perleca n ) , n idogen , o co lág e n o tipo IV y s im i l a res sobre una superficie celular mediante inmunomanchado, u observación con un microscopio electrónico de barrido.

En general , las células epiteliales de pigmento retinal cultivadas en una placa de cultivo producen componentes de membrana basal, pero es extremadamente difícil separar las células en la forma de una lámina de células epiteliales de pigmento retinal utilizable separada de un plato de cultivo (Invest. Ophtalmol. Vis. Scie. , 36(2), 1 95, 381 -390). De acuerdo con el método de la presente invención, las células epiteliales de pigmento retinal junto con una membrana basal producida a partir de células epiteliales de pigmento retinal pueden recuperarse como una lámina sin utilizar una membrana artificial. Debido a que las células epiteliales de pigmento retinal forman una estructura de capa simple, cuando son manejadas solas, la estructura de lámina es desintegrada y las células son dispersadas en unidades celulares. Así, el trasplante de las mismas como una lámina es extremadamente difícil. Por otra parte, debido a que la lámina celular de la presente invención acompaña una membrana basal y tiene suficiente rigidez, no es arrugada fácilmente durante la recuperación, lo cual hace el manejo de la misma extremadamente fácil. En consecuencia, debido a que el montaje en un dispositivo de trasplante celular y una operación de trasplante puede realizarse suavemente, el trasplante celular puede ser realizado con invasión mínima, y se espera que tanto el efecto como la prognosis mejoren. Además, debido a que la lámina celular acompaña una membrana basal, es extremadamente ventajoso para trasplante en una enfermedad en donde la membrana basal es simultáneamente desordenada. Por ejemplo, la degeneración macular relacionada con la edad algunas veces acompaña el desorden de membrana de Bruch. La membrana basal en la lámina celular de la presente invención compensa la parte desordenada, por ello la tasa de injerto de las láminas celulares puede ser mejorada, y un efecto de tratamiento de la misma también puede esperarse. De ahí, la lámina celular de la presente invención es preferible como una lámina para trasplante que enfoca una enfermedad con una membrana basal desordenada, y puede ser utilizada preferiblemente como una lámina para trasplante que enfoca particularmente degeneración macular relacionada con la edad.

El método de producción de la lámina celular de la presente invención puede contener además el siguiente paso (3): (3) confirmar la presencia o ausencia de una membrana basal sobre la superficie de contacto entre la lámina celular separada y el gel de colágeno.

En el paso (3), la formación de una lámina celular teniendo una capa celular compuesta por células epiteliales de pigmento retinal y una membrana basal puede determinarse al confirmar la presencia o ausencia de la membrana basal de la lámina celular. La presencia o ausencia de la membrana basal puede confirmarse mediante un método similar a la confirmación antes mencionada de la formación de la membrana basal, por ejemplo, expresión de un marcador de membrana basal, observación con un microscopio electrónico de barrido y similares. Para la detección de la membrana basal, la expresión de un marcador de membrana basal puede confirmarse en cualquier sitio de la célula (por ejemplo, citoplasma, membrana celular, membrana nuclear y similares). De preferencia, un marcador expresado sobre una cara de contacto con gel de colágeno es enfocado.

El marcador de membrana basal en la presente especificación incluye un producto de transcripción, un producto de traducción o un producto de degradación e un ene expresado específicamente en la membrana basal. Ejemplos de tal gene incluyen laminina, proteglicano de sulfato de heparano (perlecan), nidogen, colágeno tipo IV y similares, de éstos, la laminina, colágeno tipo IV y similares, los cuales son componentes principales de la membrana basal, son de preferencia usados.

Una muestra a ser usada para "confirmar la presencia o ausencia de una membrana basal sobre la superficie de contacto entre la lámina celular separada y el gel de colágeno" no es particularmente limitada siempre y cuando contenga un marcador de membrana basal (por ejemplo, RNA, proteína, producto de degradación de la misma y similares) derivado de la lámina celular (o célula) separada en el paso (2).

La expresión del gene marcador de membrana basal cuando la muestra antes mencionada es RNA puede ser examinada al preparar una fracción de la célula de la lámina celular separada en el paso (2) y detectar un producto de transcripción del gene marcador contenido en la fracción, o detectar directamente un producto de gene marcador en la célula sin extraer RNA de la célula.

Cuando una fracción de RNA (por ejemplo, RNA total, mRNA) es preparada de la célula, puede prepararse usando un método conocido, tal como método de ultracentrifugación de guanidina-CsCI, método de AGPC y similares. Usando un kit de extracción de RNA comercialmente disponible (por ejemplo, mini kit RNeasy; fabricado por Qiagen etc.), RNA total con alta pureza puede prepararse rápida y convenientemente de una cantidad en trazas de una muestra. Ejemplos del método para detectar un producto de transcripción de un gene marcador de membrana basal en una fracción de RNA incluyen un método que usa hibridación (Northernblot, dot blot, análisis de chip de DNA, etc.), un método que usa PCR (RT-PCR; PCR competitivo, PCR de tiempo real, etc.) y similares. Los métodos de PCR cuantitativos tales como PCR competitiva, PCR de tiempo real y similares, son preferibles debido a que la variación de expresión de un gene marcador de membrana basal puede detectarse rápida y convenientemente a partir de una cantidad en trazas de una muestra, y un análisis de chip de DNA es preferible debido a que la variación de expresión de genes marcadores plurales puede detectarse colectivamente y el desempeño de cuantificación también puede mejorarse al seleccionar un método de detección y similares.

Cuando se emplea Northerblot o hibridación de dot blot, el gene marcador de membrana basal puede detectarse usando un ácido nucleico (sonda) capaz de hibridarse con un producto de transcripción del gene. Ejemplos de tal ácido incluyen ácido nucleico capaz de hibridar con un producto de transcripción de un gene marcador de membrana basal bajo condiciones de alta rigurosidad. Ejemplos de las "condiciones de alta rigurosidad" incluyen reacción de hibridación a 45°C en 6xSSC (cloruro de sodio/citrato de sodio), seguido por lavar una o más veces a 65°C en 0.2xSSC/0.1 % SDS y similares. Aquéllos de habilidad ordinaria en la técnica pueden ajustarse fácilmente a una rigurosidad deseada al cambiar apropiadamente la concentración de sal de una solución de hibridación, temperatura de reacción de hibridación, concentración de sonda, longitud de sonda, número de desajuste, tiempo de reacción de hibridación, concentración de sal de lavado, temperatura de lavado y similares. El ácido nucleico puede ser DNA, RNA o quimera de DNA/RNA, con preferencia otorgada a DNA.

El ácido nucleico a ser usado como una sonda puede ser de doble filamento o filamento simple. Cuando es de doble filamento, puede ser DNA de doble filamento, RNA de doble filamento o híbrido de DNA: RNA. Cuando es de filamento simple, puede usarse un filamento antisentido.

Cuando la longitud del ácido nucleico no es particularmente limitada siempre y cuando pueda hibridar específicamente con el ácido nucleico objetivo, es, por ejemplo, no menos de aproximadamente 1 5 bases, de preferencia no menos de aproximadamente 30 bases. Para permitir la detección y cuantificación del ácido nucleico objetivo, el ácido nucleico es de preferencia etiquetado. Ejemplos de la etiqueta incluyen radioisótopo, enzima, substancia fluorescente, substancia de luminiscencia y similares. Ejemplos del radioisótopo incluyen [32P], [3H], [14C] y similares. Como la enzima, es preferible una enzima estable teniendo una alta actividad específica, por ejemplo, ß-galactosidasa, ß-glucosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa, dehidrogenasa de ácido málico y similares. Ejemplos de la substancia fluorescente incluyen fluorescamina, isotiocianato de fluoresceína y similares. Ejemplos de la substancia de luminiscencia incluyen luminol, derivado de luminol, luciferina, lucigenina y similares. Además, la biotina(estrept)avidina pueden usarse también para unir una sonda y una etiqueta.

Cuando se emplea una hibridación Northern, una fracción de RNA preparada como se menciona antes es separada mediante electroforesis en gel, transferida a una membrana de nitrocelulosa, nylon, difluoruro de polivinilideno y similares, hibridado bajo las "condiciones de alta rigurosidad" antes mencionadas en un amortiguador de hibridación conteniendo una sonda de etiquetado como se menciona antes, y la cantidad de la etiqueta unida a la membrana es medida para cada banda mediante un método adecuado, por lo cual el nivel de expresión de cada gene marcador de membrana basal puede ser medido. También en el caso de dot blot, una membrana manchada con una fracción de RNA es sometida a una reacción de hibridación similares (realizada para cada gene marcador), y la cantidad de la etiqueta en la mancha es medida, por lo cual el nivel de expresión de cada gene marcador puede medirse.

Cuando se emplea análisis de chip de DNA, por ejemplo, cDNA introducido con un promotor adecuado, tal como promotor T7 y similares mediante reacción de transcripción inversa es sintetizado a partir de una fracción de RNA preparad como se menciona antes, el cRNA es sintetizado usando RNA polimerasa (en este caso, el cRNA etiquetado es obtenido al usar un mononucleótido etiquetado con biotina y similares como un substrato). El cRNA etiquetado es contactado con un chip teniendo la sonda antes mencionada inmovilizada sobre la misma para realizar una reacción de hibridación, y la cantidad de la etiqueta unida con cada sonda sobre la fase sólida es medida, por lo cual el nivel de expresión de cada gene marcador de membrana basal puede medirse. Este método es ventajoso en términos de rapidez y conveniencia conforme aumenta el número de los genes marcadores diferenciados detectados (por lo tanto, sondas para estar en fase sólida).

Por otra parte, cuando un ene marcador es detectado sin extraer RNA de la célula, puede usarse hibridación in situ como el medio de detección. En este método, la célula es inmovilizada al tratar la célula con un agente fijador, de preferencia, un agente fijador de precipitación, por ejemplo, acetona, o incubar la célula durante un periodo corto en una solución de formaldehido amortiguadora, en lugar de extraer RNA de la célula. Después de la inmovilización, la célula es incrustada en parafina para formar un bloque, y una rebanada cortada de la misma puede ser usada como una muestra. Una muestra incrustada con parafina de cavidad preparada puede ser conservada a temperatura ambiente durante muchos años. Como ácido nucleico a ser usado como una sonda, esos similares a los ejemplos antes mencionados pueden ser usados. La hibridación in situ es usada de preferencia en la presente invención, debido a que la expresión de un marcador de membrana basal sobre la superficie de contacto entre la célulay gel de colágeno puede confirmarse directamente.

De manera alternativa, la expresión de un marcador de membrana basal en la lámina de células separadas en el paso (2) pueden confirmarse al preparar una fracción de proteina de la lámina celular (o célula), y detectar un producto de traducción (es decir, proteína marcadora) del gene marcador contenido en la fracción, o detectar directamente un producto de traducción del gene marcador en la lámina celular (o célula) , sin extraer la proteína de la lámina celular (o célula). Una proteína marcadora puede ser detectada por un método de medición inmunológica (por ejemplo, ELISA, FIA, RIA, Western blot, etc. ) usando un anticuerpo para cada proteína y, en el caso de una proteína que muestra una actividad fisiológica medible, tal como una enzima y similares, puede detectarse al medir la actividad fisiológica de cada proteína marcadora por un método conocido. De manera alternativa, una proteína marcadora también puede ser detectada por un método de espectrometría de masa, tal como MALDI-TOFMS y similares.

Un anticuerpo para cada proteína marcadora puede ser obtenido de acuerdo con una técnica de producción de anticuerpo monoclonal o anticuerpo policlonal generalmente usado o y usar una proteína o proteína marcadora, o un péptido parcial del mismo como un antígeno de inmunización.

Cuando los métodos de medición inmunológica respectiva son aplicados al método de examen de la presente invención , no es necesario el ajuste de condiciones especiales, operaciones y similares. Un sistema de medición de la proteína marcadora de membrana basal puede ser construido al adicionar consideración técnica general de aquéllos de habilidad ordinaria en la técnica a condiciones generales y métodos de operación en cada método. En cuanto al detalle de estos medios técnicos generales, compendios, libros y similares pueden hacer referidos. Por ejemplo, "Radioimmunoassay" editado por Hiroshi Irie (Kodansha, publicado en 1 974), "cont. Radioimmunoassay" editado por Hiroshi Irie (Kodansha, publicado en 1979), "Enzyme Immunoassay". editado por Eiji Ishikawa et a. (2a edición) (Igaku-Shoin, publicado en 1982), "Enzyme Immunoassay" editado por Eiji Ishikawa et al. (3a edición) (Igaku-Shoin, publicado en 1 987), "Methods in Enzymology", vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), ibidem , Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), ibidem, Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), ibidem , Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibidem, Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibidem, Vol. 1 21 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (todo publicado por la Academic Press) y similares pueden ser referidos.

La presente invención también se refiere a una lámina celular obtenida de acuerdo con el método de producción de lámina celular antes mencionado, de preferencia, una lámina celular para trasplante comprendiendo una capa celular formada a partir de células epiteliales de pigmento retinal obtenidas mediante inducción de diferenciación ex vivo, y una membrana basal. La lámina de células epiteliales de pigmento retinal de la presente invención es preferible como un material de trasplante para el tratamiento retinal de pacientes con enfermedades oftálmicas. Ejemplos de la enfermedad oftálmica incluyen enfermedades degenerativas retínales, tales como enfermedad de degeneración macular relacionada con la edad, retinitis pigmentosa, retinopatía diabética, separación retinal y similares. Debido a que la lámina celular de la presente invención contiene una membrana basal, puede ser trasplantada con una tasa de injerto alta para una enfermedad que involucra simultáneamente membrana de Bruch desordenada. Además, debido a que la lámina de células epiteliales de pigmento retinal de la presente invención tiene una membrana basal hecha a partir de componentes similares a aquéllos en organismos vivos, también puede ser utilizada para varios fines de clasificación, tales como clasificación de eficacia, evaluación de toxicidad y similares en las enfermedades oftálmicas antes mencionadas. Para la clasificación de eficacia hacia para las enfermedades oftálmicas antes mencionadas, por ejemplo, la lámina celular de la presente invención puede ser aplicada a la clasificación para una substancia que tiene eficacia para las enfermedades oftálmicas antes mencionadas, de acuerdo con el método descrito en JP-A-2007-500509. Para ser específicos, la lámina celular de la presente invención es cultivada en la presencia o ausencia de una substancia candidato teniendo eficacia bajo las condiciones de tensión provocando posiblemente las enfermedades oftálmicas antes mencionadas (por ejemplo, luz (por ejemplo, luz blanca, luz azul; la luz induce muerte de células retínales, en particular células foto-receptoras, y puede ser un factor incitador de degeneración macular), A2E [N-retiniliden-N-retiníl-etanolamina retinoide] (la acumulación de A2E es considerada por contribuir a la neurodegeneración relacionada con la edad de células retínales, en particular la expresión de degeneración macular), agregado de humo de cigarrillos (fumar es considerado como un factor de riesgo de degeneración macular), presión externa (por ejemplo, presión hidrostática; se sospecha que el aumento en la presión infraocular está involucrado en. glaucoma)), y la evaluación puede ser realizada con base en el n ú mero de foto-receptor que expresa rodopsina, y mediante inmunomanchado usando anticuerpo anti-caspasa 3. Para evaluación de toxicidad, la lámina celular de la presente invención puede ser aplicada a clasificación para una substancia tóxica de acuerdo con el método descrito en JP-A-2007-51 7210. Para ser específicos, la lámina celular de la presente invención es cultivada en la presencia o ausencia de una substancia candidato de toxicidad y usando el péptido marcador de integrína descrito en JP-A-2007-51 721 0, excitado con un láser a una longitud de onda de 488 nm, y la fluorescencia a 520 nm es detectada para la evaluación. Más aún, la lámina de células epiteliales de pigmento retinal de la presente invención también puede ser utilizada como un modelo vitro para la evaluación de varias funciones in vivo de célula epitelial de pigmento retinal, tal como la función que se refiere al mantenimiento de células visuales, tal como capacidad fagocítica de segmento exterior foto-receptor, acción neuroprotectora y similares, función de barrera de vasos sanguíneos retínales tal como acción de bombeo, unión estrecha y similares.

La lámina celular para trasplante de la presente invención puede usarse para el tratamiento de las enfermedades antes mencionadas en humanos y mamíferos diferentes de humanos (por ejemplo, mono, ratón, rata, perro, bovino, caballo, cerdo, borrego, cabra, gato, conejo, hámster, conejillo de Indias, etc. ).

El rango del área de enfermedad al cual la lámina celular para trasplante de la presente invención puede aplicarse es determinado apropiadamente dependiendo de la enfermedad objetivo, la especie animal, edad, sexo, peso corporal y síntoma de sujeto de administración, y similares.

La lámina celular para trasplante de la presente invención puede ser trasplantada una vez o en varias porciones. El número de aplicación de trasplante es determinado por profesionales del cuidado de la salud de acuerdo con la enfermedad y la línea de guía. Por ejemplo, cuando la enfermedad está relacionada con la enfermedad de degeneración macular relacionada con la edad, la lámina celular para trasplante de la presente invención puede ser trasplantada dos o más veces dependiendo de la severidad del mismo. Cuando el trasplante es realizado varias veces, el intervalo no es particularmente limitado, y un periodo de varios días a varias semanas puede ser colocado.

La lámina celular para trasplante de la presente invención es trasplantada por profesionales del cuidado de la salud de acuerdo con un método de trasplante apropiado de acuerdo con la l ínea de guía. Cuando la lámina celular par trasplante de la presente invención es trasplantada bajo la retina, un método de trasplante incluyendo entregar la lámina sobre un flujo de agua a partir de una aguja de inyección perforada, hasta el sitio de trasplante bajo la retina del globo ocular, puede emplearse o un aparato terapéutico exclusivo para trasplante también puede usarse.

Ejemplos La presente invención es explicada en más detalle a continuación al referirse a los Ejemplos, los cuales son meras ejemplificaciones y no limitan el alcance de la presente invención en manera alguna.

Ejemplo de producción 1 . Preparación de células epiteliales de pigmento retinal Como las células epiteliales de pigmento retinal a ser usadas para laminar en el siguiente Ejemplo 1 , se usaron células epiteliales de pigmento retinal maduras (253G1 , K1 1 PD2, 59M8, 59SV2, 59SV3, 59SV9, 46a, K21 EV15, 101 EV3, K1 1 EV9, 454E2) obtenidas al inducir la diferenciación de célula iPS, y células epiteliales de pigmento retinal (hES, CMK6) obtenidas al inducir diferenciación de célula ES, de acuerdo con el método descrito en Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131 .

Células epiteliales de pigmento retinal derivadas de iPS humanas 253G 1 es una célula epitelial de pigmento retinal obtenida al inducir diferenciación de célula iPS humana derivada de un humano saludable, y K1 1 PD2 y 59M8 son células epiteliales de pigmento retinal inducidas para diferenciarse de células iPS humanas derivadas de pacientes con retinitis pigmentosa diferentes unas de otras. La célula iPS fueron establecidas mediante un método que incluye introducir genes Oct3/4, Sox2, lf4 y c-Myc en fibroblastos derivados de la piel humanos usando retrovirus, de acuerdo con el método descrito en Cell 131 , 861 -872, 2007. 59SV2, 59SV3 y 59SV9 son células epiteliales de pigmento retinal obtenidas al inducir diferenciación de células iPS humanas derivadas del mismo paciente de ritinitis pigmentosa. Las células iPS fueron establecidas mediante un método que incluye introducir Oct3/4, Sopx2, Klf4 y c-Myc en fibroblastos derivados de piel humana al usar virus Sendai, de acuerdo con el método descrito en Proc. Jpn. Acad. , Ser. B 85 (2009) 348-362.

K21 EV15, 1 01 EV3, K1 1 EV9 y 454E2 son células epiteliales de pigmento retinal obtenidas al inducir diferenciación de células iPS humanas derivadas de pacientes con retinitis pigmentosa diferentes unas de otras. Las células iPS fueron establecidas mediante un método que incluye introducir Oct3/4, Sox,2, Klf4, L-Myc y LI N28 humanos en fibroblastos derivados de piel humana al usar vector episomal, de acuerdo con el método descrito en Nat Methods. 201 1 Mayo; 8(5): 409-12).

Células epiteliales de pigmento retinal derivadas de iPS de mono 46a es una célula epitelial de pigmento retinal obtenida al inducir diferenciación de célula iPS de mono (mono cinomolgo), de acuerdo con el método descrito en Jpn. J. Transplant. 44, 231 -235.

Células epiteliales de pigmento retinal derivado de ES hES es una célula epitelial de pigmento retinal obtenida al inducir diferenciación de la línea de células ES humanas khES-1 . CMK6 es una célula epitelial de pigmento retinal obtenida al inducir diferenciación de célula ES de mono, de acuerdo con el método descrito en Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131 .

Ejemplo 1 . Método de producción de lámina de células epiteliales de pigmento retinal Preparación de solución mezclada de gel de colágeno A: Colágeno tipo I soluble en ácido, derivado de tendón de cerdo Cellmatrix l-A (Nitta Gelatin, 3.0 mg/ml), B: medio de cultivo concentrado a una concentración de 5 veces [DMEM/F 12 (Invitrogen, 12500-062, 3 g) se disolvió en agua MilliQ, y el volumen total (50 mi) se trató con filtro], y C: amortiguador para reconstitución [NaOH 1 N (50 mM¡ 5 mi), NaHC03 (260 mM, 2.2 g) y HEPES (200 mM, 4.77 g) se disolvieron en agua MilliQ, y el volumen total (100 mi) tratado con filtración] fueron preparados. Bajo enfriamiento, B (2 vol) se mezcló (amarillo pálido) con A (7 vol) sin burbujeo. Entonces, C (1 vol) se adicionó y la mezcla se revolvió (rosa pálido) para dar una solución mezclada de gel de colágeno al 0.21%.

Preparación de lámina de células epiteliales de pigmento retinal La solución mezclada de gel de colágeno al 0.21% (200 µ?) se adicionó hacia la inserción de una inserción transweil de 12 mm (membrana de poliéster de poro de 0.4 µ?t?); Cornig, 3460), y la mezcla se incubó a 37°C durante 30 min. Entonces, F10-10% FBS [F-10 (Sigma, N6908, 445 mi), FBS (50 mi), penicilina-estreptomicina (Invitrogen, 15140-122, 5 mi)] se adicionó por 1500 µ? al exterior de la inserción y 500 µ? al interior de la inserción, y la transweil es incubada a 37°C durante 24 h. Posteriormente, el interior y exterior de la inserción se lavaron una vez con F10-10% FBS, células epiteliales de pigmento retinal respectivo obtenidas en el Ejemplo de producción 1 fueron sembradas a 5x105 (F10-109% FBS, 500 µ?) dentro de la inserción, y F10-10% FBS (1500 µ?) se adicionó al exterior de la inserción. Las células epiteliales de pigmento retinal fueron cultivadas en F10-10% FBS hasta confluencia. Después de alcanzar la confluencia, el medio se cambió a SFRM-B27 [DMEM (Sigma, D6046, 350 mi), F12 HAM (Sigma, N6658, 150 mi), B27 (Invitrogen, 17504-044, 10 mi), 200 mM L-glutamina (Sigma, G7513, 5 mi), penicilina-estreptomicina (Invitrogen, 15140-122, 5 mi), bFGF (wako, 060-04543, 10 ng/ml)] (1500 µ? al exterior de la inserción 500 µ? al interior de la inserción, el cambio de medio fue 3 veces/semana), y las células epiteliales de pigmento retinal fueron cultivadas hasta que mostraron color y forma adecuados.

Corte Después de progresar durante 6 semanas a partir del inicio del cultivo, la membrana de la inserción fue removida, colagenasa L (Nitta Gelatin, PBS(+): Sigma, 2600 U/ml, 100 µ?) se adicionó bajo la inserción, y la inserción se incubó a 37°C durante 60 min y se lavó 3 veces con PBS( + ). SFR -B27 se adicionó en forma de gotas de manera que la lámina de células epiteliales de pigmento retinal no debería secarse y cortarse en un tamaño deseado con PALM MicroBeam (ZEISS).

Ejemplo 2. Método de producción de lámina de células epiteliales de pigmento retinal (clase de colágeno) En la misma manera que en el Ejemplo 1 excepto que, en el paso de producir una lámina celular usando 253G1 (células epiteliales de pigmento retinal de iPS) En el Ejemplo 1, (A) colágeno tipo I derivado de piel de cerdo TE (producto de orden especial: conteniendo principalmente colágeno tipo I, una pequeña cantidad de colágeno tipo III, Nitta Gelatin, 5 mg/ml) se usó una solución mezclada de colágeno al 0.35%/cavidad, (B) colágeno tipo I derivado de tendón de cerdo T-1002 (producto de orden especial: colágeno tipo I, Nitta Gelatin, 5.1 mg/ml) se usó como solución mezclada de colágeno al 0.35%/cavidad, (C) colágeno etiquetado con FITC I (Chondrex, 1 mg/ml) se usó como solución mezclada con colágeno al 0.07%/cavidad, (D) colágeno I etiquetado con FITC (orden especial, Chondrex, 3 mg/ml) se usó como solución mezclada de colágeno al 0.21 %/cavidad, (E) atellocolagen (KOKEN, 3 mg/ml) se usó como solución mezclada de colágeno 0.215%/cavidad, y (F) se usó membrana de colágeno de permeabilidad para cultivo celular (KOKEN), en lugar de colágeno tipo I soluble en ácido derivado de tendón de cerdo Cellmatrix l-A (N itta Gelatin, 3 mg/ml) como solución mezclada con colágeno al 0.21 %/cavidad, las láminas celulares fueron producidas y cortadas para dar láminas de células epiteliales de pigmento retinal.

Los resultados de prueba del Ejemplo 1 y los casos usando cada uno de los colágenos antes mencionados fueron comparados y evaluados en términos de 4 artículos [1 . Fuerza de gel; 2. Adhesión celular; 3. Crecimiento celular; 4. Seguridad]. Como resultado, (A) {1 . Inferior; 2. Equivalente; 3. Inferior; 4. Bueno}, (B) {1 . Bueno (5.1 mg/ml); 2. Equivalente; 3. Inferior; 4. Bueno}, (C) {1 . Inferior (1 mg/ml); 2. Inferior; 3. Desconocido; 4. Desconocido}, (D) {1 . Equivalente (3 mg/ml); 2. Equivalente; 3. I nferior; 4. Desconocido}, (E) {1 . Equivalente (3 mg/ml); 2. Inferior; 3. Desconocido; 4. Bueno}, y (F) {no fue lisado por colagenasa, de esta manera es inutilizable}. En cuanto a la fuerza de gel, se requiere un cierto nivel de fuerza para permitir el crecimiento de células epiteliales de pigmento retinal. De tal aspecto, una clase y concentración de colágeno particularmente preferibles fueron el colágeno tipo I soluble en ácido derivado de tendón de cerdo Cellmatrix l-A del Ejemplo 1 y (B) colágeno tipo I derivado de tendón de cerdo T-1 002 usado a la concentración antes mencionada. Cuando el substrato no tiene un cierto nivel de fuerza, el epitelio de' pigmento retinal no crece y no puede ser usado para la presente invención.

Ejemplo 3. Método de producción de lámina de células epiteliales de pigmento retinal (cantidad de colágeno) En la misma manera que en el Ejemplo 1 excepto que, en el paso de producir una lámina celular usando 253G 1 (células epiteliales de pigmento retinal de iPS) del Ejemplo 1 , la cantidad de solución mezclada de gel de colágeno a ser usada se cambió a 100 µ? o 300 µ? de 200 µ?, las láminas celulares fueron producidas y cortadas, por lo cual las láminas de células epiteliales de pigmento retinal fueron recuperadas.

Como se compara con el Ejemplo 1 , cuando la cantidad de la solución mezclada de gel de colágeno usada fue 1 00 µ?, una capa de gel de colágeno delgada se formó en la parte central debido a una influencia de la tensión superficial provocada por la pequeña cantidad de la solución mezclada de gel de colágeno y, conforme procedió el cultivo, las células epiteliales de pigmento retinal sembradas contactaron directamente la membrana de fondo con facilidad , lo cual provocó ruptura de la lámina de células epiteliales de pigmento retinal durante una operación para cortar la lámina. Cuando la cantidad de la solución mezclada de gel de colágeno usada fue 300 µ?, debido a que la cantidad de solución mezclada de gel de colágeno fue alta, se formó una capa de gel de colágeno gruesa, lo cual redujo relativamente la cantidad del medio que podía ser retenido en la inserción, y por lo tanto, el mantenimiento de cultivo no fue fácil de realizar, el tratamiento de colagenasa tomó tiempo y se temió que los daños sobre la lámina celular se volvieran más grandes. Cuando la cantidad de la solución mezclada de gel de colágeno usada fue 100 µ?, las células entraron en contacto directamente con la membrana, y la lámina celular se rompió de tal parte sobre la remoción de la membrana.

Ejemplo 4. Método de producción de lámina de células epiteliales de pigmento retinal (cantidad de colagenasa y tiempo de tratamiento) En la misma manera que en el Ejemplo 1 , excepto que en el paso de producir una lámina celular usando 253G 1 (célula epitelial de pigmento retinal de iPS) del Ejemplo 1 , 1 % de Collagenase L (Nitta Gelatin) o colagenasa tipo I (Roche) se contactó con la lámina de células epiteliales de pigmento retinal durante 1 0 min en una cantidad de 10 µ?, 20 min en una cantidad de 10 µ?, 30 min en una cantidad de 10 µ?, 20 min en una cantidad de 20 µ?, 60 min en una cantidad de 20 µ?, y 50 min en una cantidad de 30 µ?, en lugar de 30 min en una cantidad de 30 µ?, las láminas celulares fueron producidas y cortadas, por lo cual las láminas de células epiteliales de pigmento retinal fueron recuperadas.

Como resultado, cuando un tratamiento de colagenasa fue realizado durante 60 min en una cantidad de 10 µ? o 60 min en una cantidad de 20 µ?, se observó la degradación de colágeno del mismo nivel como con 30 µ? durante 30 min.

Ejemplo 5. Método de producción de lámina de células epiteliales de pigmento retinal (número de células sembradas) En la misma manera que en el Ejemplo 1 excepto que, en el paso de producir una lámina celular usando 253G 1 (célula epitelial de pigmento retinal de iPS) de Ejemplo 1 , el número de las células a ser sembradas dentro de la inserción cambió a (A) 5x1 04 células/500 µ?, (B) 1 ?105/500 µ? o (C) 1 x1 06/500 µ? de 5x1 05 células/500 µ?, las láminas fueron producidas y cortadas, por lo cual se recuperaron las láminas de células epiteliales de pigmento retinal.

Como se compara con el Ejemplo 1 , (A) y (B) requirieron un tiempo más largo para alcanzar la confluencia celular debido al pequeño número de células, y (C) mostró crecimiento lento y también tendió a requerir un .tiempo más largo para alcanzar la confluencia celular.

Ejemplo 6. Membrana basal formada sobre lámina de células epiteliales de pigmento retinal Una criosección (sección congelada) fue producida a partir de la lámina celular producida a partir de 253G 1 (célula epitelial de pigmento retinal de iPS) en el Ejemplo 1 y se sometió a manchado inmunohistoquímico. La formación de una unión estrecha se confirmó mediante la expresión de ZO-1 , y la formación de una membrana basal se confirmó mediante la expresión de laminina y colágeno tipo IV. Para la detección de cada proteína, se usaron los anticuerpos respectivos de conejo anti-ZO-1 fabricados por Zymed (dilución 1 : 1 00), laminina de conejo fabricada por Abcam (dilución 1 :200) y anticuerpo de colágeno tipo IV anti-humano de ratón fabricado por Calbiochem ( 1 :40). Además, se confirmó que la lámina de células epiteliales de pigmento retinal tiene una forma epitelial de capa simple a partir del estado de manchado nuclear usando 4' ,6-diamidino-2-fenilindol fabricado por Molecular Probes (DAPI ; 1 pg/ml).

Evaluación 1 . Perfil de expresión de gene específico epitelial de pigmento retinal de la lámina celular En el paso de producir una lámina celular de 59SV3, 59SV9 (células epiteliales de pigmento retinal de iPS) en el Ejemplo 1 , la expresión de BEST1 , RPE65, MERTK, CRALBP en las células que constituyen las láminas después del lapso de 1 semana, 4 semanas, 2 meses, en donde el d ía cuando el medio fue cambiado a SFRM-B27 después de la confluencia celular fue día 0, se confirmó mediante RT-PCR. Como resultado, se observó la expresión del mismo nivel que aquél del control positivo (RNA total de células epiteliales de pigmento retinal humano (fabricado por ScienCell, Cat. No. 6545)). Aquí, BEST1 , RPE65, MERTK son genes expresados específicamente en células epiteliales de pigmento retinal. CRALBP es un gene expresado en células epiteliales de pigmento retinal y células Muller.

Evaluación 2. Medición de colágeno residual en lámina epitelial de pigmento retinal Las criosecciones (sección congelada) fueron producidas mediante corte, antes y después de tratamiento de colagenasa, a partir de láminas celulares respectivas producidas a partir de 253G1 (célula epitelial de pigmento retinal de iPS) en el Ejemplo 1, y se sometió a manchado inmunohistoquímico. El núcleo fue manchado con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1 pg/ml) fabricado por Molecular Probes, y colágeno tipo 1 fue manchado con anticuerpo de colágeno tipo I anti-humano de conejo (dilución 1:40) fabricado por Calbiochem. Como resultado, el colágeno no fue detectado a partir de las láminas después del tratamiento de colagenasa, y se confirmó que la colagenasa removió colágeno recubierto sobre la placa de cultivo. Po otra parte, el colágeno fue detectado de las láminas cortadas antes del tratamiento de colagenasa.

Evaluación 3. Capacidad de secreción de citocina de lámina de células epiteliales de pigmento retinal Los medios de cultivo sobre el lado Apical y el lado Basal en la transwell se recuperaron antes del paso de cortar láminas células epiteliales de pigmento retinal a partir de las láminas celulares producidas de 253G1 (célula epitelial de pigmento retinal de iPS) y 454E2 (célula eptielial de pigmento retinal de iPS) en el Ejemplo 1, y las cantidades de producción de VEGF y PEDF fueron detectadas mediante ELISA de acuerdo con el método descrito en Arvydas M, IOVS, 2006; 47: 3612-3624. Como resultado, se confirmó que, similar al epitelio de pigmento retinal derivado de embrión humano reportado en Arvydas M, IOVS. 2006; 47: 3612-3624, VEGF se secretó principalmente en el lado Basal, y PEDF se secretó principalmente en el lado Apical (Fig. 1). Se mostró que la lámina celular de la presente invención tiene capacidad secretoria de citocina sim ilar a aq uélla en organismos vivos, y es superior en funcionalidad .

Evaluación 4. Resistencia eléctrica transepitelial de lámina de células epiteliales de pigmento retinal Una fuerte correlación es vista entre la función de barrera de una capa celular e impedancia, a saber, resistencia eléctrica transepitelial/transendotelial (TER) . U na sonda se colocó en el medio interior y exterior de la inserción de acuerdo con el método descrito por M I LLI PORE (usando Millicell ERS-2) , antes del paso de cortar la lám ina de célu las epitel iales de pigmento retinal producida a parti r de 454E2 (célula epitelial de pig mento retinal de iPS) en el Ejemplo 1 , y TER se midió eléctricamente . Como resultado, TER fue 640O cm2, y mostró un valor de TE R alto como el epitelio de pigmento retinal derivado de embrión humano reportado en Nature Protocols vol 4, no 5 662-673 (2009), Fig . 1 0. Se mostró q ue la lámi na celular de la presente invención tiene una alta función de barrera similar a aq uélla en organismos vivos.

Evaluación 5. Trasplante de lámina de células epitel iales de pigmento retinal derivada de células ES de mono Una lámina de células epiteliales de pigmento retinal de mono producida a partir de células epiteliales de pig mento retinal derivado de células ES de mono, CM 6 en el Ejemplo 1 fue trasplantada en un ojo de un mono de acuerdo con el método descrito en I nvest Ophthalmol Vis Sci. 1 995 Feb; 36(2): 381 -90. Antes del trasplante, la fotocoagulación retinal fue realizada para desordenar la retina del ojo para ser sometida a trasplante. En el día 28 del trasplante en el ojo del mono teniendo mácula de fotocoagulación retinal formada en el mismo, se tomaron fotografías del fondo del ojo, y las imágenes de las secciones de fondo ocular se produjeron como secciones histológicas al usar OCT (tomografía de coherencia óptica), con base en las cuales la condición de la retina fue confirmada. Como resultado, no se encontró fuga de fluorescencia mediante angiografía de fluoresceína, el injerto sobrevivió y no se encontró un desorden tal como adelgazamiento de retina y similares.

Evaluación 6. Trasplante de lámina de células epiteliales de pigmento retinal derivadas de células iPS de mono Una lámina de células epiteliales de pigmento retinal de mono producida a partir de células epiteliales de pigmento retinal derivadas de células iPS de mono, 46a en el Ejemplo 1 se trasplantó bajo la retina de un ojo para trasplante autólogo y tres ojos para trasplante cruzado de acuerdo con el método descrito en Invest Ophthalmol Vis Sci . 1995 Feb; 36(2). 381 -90. Un año post-trasplante, se tomaron fotografías del fondo del ojo y se produjeron imágenes de las secciones de fondo ocular como secciones histológicas al usar OCT (tomografía de coherencia óptica), con base en las cuales la condición de la retina fue observada con el transcurso del tiempo. En trasplante cruzado, se encontraron reacciones de rechazo claras tales como cambios fibrosos sobre la periferia del injerto, fuga de fluorescencia por angiografía de fluoresceína y lesión de brillantez alta bajo la retina mediante OCT. Por otra parte, en trasplante autólogo, no se observó tal rechazo claro, no se encontró fuga de fluorescencia mediante angiografía de fluoresceína, el injerto sobrevivió y no se encontró un desorden tal como adelgazamiento de retina sensorial y similares.

Aplicabilidad industrial Usando el método de la presente invención, una lámina de células epiteliales de pigmento retinal a ser aplicada por trasplante a pacientes con degeneración macular relacionada con la edad puede ser producida comparativamente de manera conveniente. En particular, cuando las células a ser usadas para cultivo son células epiteliales de pigmento retinal derivadas de iPS, las propias células del paciente pueden ser utilizadas, lo cual puede evitar rechazo en trasplante. Más aún, debido a que la lámina celular obtenida mediante el método de la presente invención tiene una membrana basal hecha a partir de los mismos componentes que en organismos vivos, una lámina de células epiteliales de pigmento retinal más cerca del estado en organismos vivos puede ser producida, lo cual es útil para varios propósitos de clasificación.

Esta solicitud es basada en una solicitud de patente no. 201 1 -0401 30 presentada en Japón (fecha de presentación: Febrero 25, 201 1 ), los contenidos de la cual son incorporados en su totalidad en la presente.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1 . Un método para producir una lámina celular que comprende los siguientes pasos: (1 ) sembrar y cultivar células epiteliales de pigmento retinal sobre un gel de colágeno para formar una lámina celular compuesta por las células epiteliales de pigmento retinal, y (2) degradar el gel de colágeno con colagenasa para separar la lámina compuesta por las células epiteliales de pigmento retinal.

2. Un método de producción de la lámina celular de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde las células epiteliales de pigmento retinal son células obtenidas al inducir la diferenciación de células madre o células progenitores.

3. El método de producción de la lámina celular de acuerdo con la reivindicación 2, en donde las células madre son células ES o células iPS.

4. El método de producción de la lámina celular de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la concentración de colágeno en el gel de colágeno es 0.1 % - 0.5%.

5. El método de producción de la lámina celular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además el siguiente paso (3): (3) confirmar la presencia o ausencia de una membrana basal sobre la superficie de contacto entre la lámina celular separada y el gel de colágeno.

6. Una lámina celular producida mediante el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Una lámina celular para trasplante, que comprende una capa celular formada con células epiteliales de pigmento retinal obtenidas al inducir la diferenciación de células madre o células progenitoras ex vivo, y una membrana basal secretada a partir de las células.

8. Una lámina celular para clasificar, comprendiendo una capa celular formada con células epiteliales de pigmento retinal obtenidas al inducir diferenciación de células madre o células progenitoras ex vivo, y una membrana basal secretada a partir de dichas células.