JPH03502883A - 糞便潜血試験試薬と方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 糞便潜血試験試薬と方法 技術分野 本発明は、糞便潜血試験（ＰＯＢＴ）の分野にある。さらに本発明は、特に、誤 った結果の低出現率および／または高い感度と特異性を提供し、そして／または 実施がより容易である改良ＦＯＢＴに関する。

背景技術 ＦＯＢＴは１通常、胃腸（Ｇｌ）の損傷からの潜血の消失を検出するために臨床 上利用される。例えば、結腸および直腸のカルチノーマは、米国においてもっと も深刻な癌であり、死亡をひき起こす点では、肺癌以外のどの癌にも劣らない（ 毎年、約１００．０００の新しい病例があり、　５０．０００件が死亡している ）。結腸直腸の癌は、長い無症候期間をともないながらゆっくりと進行するため 、早期検出と、治療を成功させるための理想的な機会が提供される。結腸直腸の 損傷はしばしば出血し、一般的な非侵襲性の試験が可能であるので、したがって 、　ＦＯＢＴは、早期診断における合理的な試みである。同様に。

病院および医者は、病気、外傷９手術および他の原因の結果おこるＧｌ損傷を検 出するため、あるいはモニターするためにＦＯＢＴをしばしば利用する。

初期のＦＯＢＴは、酸性化グアヤク溶液を過酸化水素で試験するために、ペイン ト缶に入れた２４〜４８時間のすべての糞便の収集物を中央研究所に運ぶことを 包含した。グアヤクは複合植物抽出物で、ロイコ染料、αグアヤコン酸を含有す る。ロイコ染料は、触媒の存在下でヒドロペルオキシドにより酸化され、青色と なる： ヘモグロビンは効率のよい触媒（偏性ペルオキシダーゼ；ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏ ｘ　１ｄａｓｅ）であるため、糞便は、ロイコ染料／ヒドロペルオキシド試薬を 用いて、潜血の試験がされ得る。それにもかかわらず、この方法は、試験の不愉 快な性質のためにほとんど利用されず、この非常に有用な情報は医者にはほとん ど与えられなかった。

米国特許第３．９９６．００６号には、糞便中の潜血のためのグアヤクに基づく 試験を普及させたＦＯＢＴ法が記載されている。その方法は、前部パネルと後部 パネル（それぞれのパネルには。

穴とその穴をおおうための重要なフラップがある）の間にグアヤクがしみ込んだ 紙のシートを有するスライドを使用する。

糞便の検体を、前部パネルの穴から紙上に置き、パネルを閉じる。それから、後 部パネルを開けて、過酸化水素デベロッパーを後部パネルの穴から紙上に置く。

もし検体中に血液が存在するならば１紙は青色に変化する。この試験の市販の具 体例は、　ＨＩＥＭＯＣＣＵＬＴ■試験と呼ばれ、病院や医院で広く使用されて いる。ＨＥＭＯＣＣＵＬＴ　＠試験が広く普及しているにもかかわらず、最近の 研究からこの試験の感度と特異性における重大な限界が指摘されている。

本出願人は、感度の限界は部分的には次のことによると信じている；すなわち、 （１）多くの検体中のヘモグロビンは、はとんどあるいはまったくペルオキシダ ーゼ活性を示さない誘導体に分解されている　という事実、（２）試験中に使用 されるヒドロペルオキシド試薬によるペルオキシダーゼ活性のあるヘモタンパク の分解、および（３）分解生成物（すなわち、ヘムやヘミンのような鉄プロトポ ルフィリン）の試験に使用される試薬中での相対的な不溶解性である。もちろん 、感度の限界は、偽陰性の結果の原因となり得る。特異性の限界は、おそらく、 試験が行われる検体あるいは環境中の、植物ペルオキシダーゼ、食肉の摂取によ り糞便に残存する鉄プロトポルフィリン、および／または、鉄または銅に本試験 が応答するためである。特異性の制限は、偽陽性の結果を導く。

米国特許第４．３３３．７３４号には、グアヤクに基づ＜　ＦＯＢＴの変法が記 載されており、検体中の植物ペルオキシダーゼが存在するために引きおこる偽陽 性の結果の発生率を減少させることが意図されている。この変法は、ペルオキシ ダーゼ活性に必要不可欠であるカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを隔 離するための金属キレート剤と共に、ペルオキシダーゼ変性剤（例えば、尿素ま たはグラニシン塩酸塩）を包含する。変性剤およびキレート剤は、グアヤクと共 に処方される米国特許第４．０７１．３１７号は、　ＦＯＢＴに使用される有機 ヒドロペルオキシドおよびロイコ染料の混合物を安定化させるために極性溶媒（ 例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭ Ｆ））を使用することに関する。溶媒は。

ヒドロペルオキシドおよびロイコ染料と共に、最少の割合で処方される。この溶 媒は、固体マトリックスに施用され１次いで、マトリックスは試験に使用される 前に乾燥される。

いくつかの参考文献では、鉄プロトポルフィリンの単量体種は、二量体種または 凝集された種より大きなベルオキシダＤＭＳＯを含有するＤＭＳＯと水との混合 物中で、ヘミンはその単量体の型で現れることが記載されている。

媒体中にフェロヘムおよびプロトポルフィリンの凝集物を溶解させるための様々 な水溶性重合体（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリ ビニルピロリドン。

およびポリスチレンスルホネート）の使用が記載されている。

本発明の親出願に記載された発明の主な目的は、ロイコ染料に基づ＜　ＦＯＯＴ における不正確な結果（偽陽性の結果および偽陰性の結果）の発生率を減少させ ることであった。このことは、その出願に記載されているとおり、鉄プロトポル フィリンを溶解する溶媒システムを使用する溶液中の検体に、ヒドロペルオキシ ドまたはヒドロペルオキシドとロイコ染料の両方を施用することにより達成され た。

本発明は、当該分野で公知のＦＯＢＴ全体にわたる改良、および９本発明の親出 願に記載されたＦＯＢＴ全体にわたる改良を説明する。特に１本発明は９次のこ とを提供する：（１）色形成の促進および得られる色全体の増強；および（２） 試験の感度および特異性の増強、後者は１食肉の摂取の結果として存在する内存 性糞便へムの活性の抑制により行われる。本発明の方法および試薬組成物は、ペ ルオキシダーゼ活性を調節する１つまたはそれ以上の調節化合物を包含すること により前記目的を達成する。

発明の開示 したがって１本発明の１つの局面は、試料をクロモゲンおよびヒドロペルオキシ ドと接触させることにより試料中のペルオキシダーゼ活性のある物質の存在を検 出する改良法であって、その改良は、クロモゲンちよびヒドロペルオキシドと共 に、クロロキン、キナクリン、キニーネ、プリマキン、キニジン、およびそれら の混合物からなる群から選択される調節化合物を試料に適用することを包含する 。

本発明の別の局面は、ヒドロペルオキシドと、クロロキン。

キナクリン、キニーネ、プリマキン、キニジン、およびそれらの混合物からなる 群から選択される調節化合物とを含有するデベロッパー組成物である。デベロッ パー組成物は、　（クロモゲンと共に用いて）呈色反応によるペルオキシダーゼ 活性のある物質の検出に右いて有用である。

さらに本発明の別の局面は、試料中のペルオキシダーゼ活性のある物質の存在を 検出するために使用される完全試薬組成物であって、クロモゲン；ヒドロペルオ キシド；およびクロロキン、キナクリン、キニーネ、プリマキン、キニジン。

およびそれらの混合物からなる群から選択される調節化合物を含有する。

好ましい実施態様において、試料中のペルオキシダーゼ活性のある物質の存在を 検出するための方法は、クロモゲンとヒドロペルオキシドとが、糞便試料中のヘ モタンパクを検出するために使用される糞便潜血試験（ＰＯＢＴ）である。本発 明の方法によれば、このような試験に包含される前記調節化合物は、この試験の 基礎となっている呈色反応を促進または抑制する抗マラリア剤である。「促進剤 」は、クロロキンおよびキナクリンを包含し、一方「抑制剤」は、キニーネ、プ リマキンおよびキニジンを包含する。

驚くべきことに、これらの抗マラリア剤は、ヘム酸化触媒作用を変更するために 使用され得、したがって本発明の親出願に記載されたような呈色試験の感度およ び特異性を調節し得ることが本発明の発明者により発見された。特に、ヘモタン パクを検出する（すなわち、クロモゲンの着色状態への酸化を触媒する際の様々 なヘモタンパクのペルオキシダーゼ活性により検出するために、クロモゲンおよ びヒドロペルオキシドが組み合わせて使用されるＦＯＢＴの場合１本発明で開示 される促進剤化合物は１色形成の速度を促進し、得られる色合体を増強させる。

一方、抑制剤は、実際に１色形成の速度と程度を抑制する。このように、促進剤 および抑制剤は、これらの試験の速度、感度および特異性を調節するために、共 に、または１個々に使用され得る。

（以下余白） 発明を実施するための形態 本発明で用いられる「ヘモタンパク」という用語は、ヒドロペルオキシド（これ により、クロモゲンが酸化される）によるクロモゲンの酸化を触媒し、そのこと により検出可能な応答を生じさせる能力を有するヘモグロビンと、ヘム、ヘミン およびヘマチンのようなヘモグロビンの誘導体（特にモノマー形）とを包含する ことが意図される。この能力は１本発明において、「ペルオキシダーゼ活性（ｐ ｅｒｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）」と呼ぶ場合がある。

本発明で用いられる「クロモゲン」という用語は、特定の化学的な種または属に 限定されず、検出可能な応答（典型的には、肉眼で見ることができる色の変化） を生じさせる指示薬および指示薬の混合物を包含することが意図される。クロモ ゲンの特に好ましい例は、以下のようなロイコ染料である。

すなわち、グアヤク、ベンジジン、０−トルイジン、タレシーＪし、カテコール 、３，３”５，５゛−テトラメチルベンジジン、ｐ−トルイジン、β−ナフトー ル、ピロガロール、０−フ二二しンジアミン、ロイコマラカイトグリーン、３− アミノエチルカルバゾール、４−アミノアンチピリン、フェノール、２．２’− アジノージ−（３−エチルベンジル）アゾリンスルホン酸（ＡＢＴＳ）。

およびこれらの混合物である。

最も広い意味では９本発明は、試料中のペルオキシダーゼ活性のある物質の存在 を検出するための改良法に向けられ。

この方法は、試料をクロモゲンとヒドロペルオキシドと、クロロキン、キナクリ ン、キニーネ、プリマキン、キニジン。

およびこれらの混合物からなる群から選択される調節化合物とに接触させること を包含する。本発明はまた。（１）鉄プロトポルフィリンのための溶媒を含有す る溶液中に、ヒドロペルオキシドおよび前記調節化合物を含有する発色組成物、 および（２）該発色組成物およびクロモゲンを含有する完全試薬組成物とに向け られる。

好ましい実施態様において、試料中のペルオキシダーゼ活性のある物質の存在を 検出するための方法は、糞便潜血試験（ＦＯＢＴ）である。この実施態様におい て、すでに説明されたように、試料中に存在する種々の鉄プロトポルフィリン化 合物は、ヒドロペルオキシドの存在下、クロモゲンの酸化を触媒して着色状態に する作用を有し得る。

酸化により所望の比色反応を起こし得る多くのクロモゲン化合物が使用され得る が１本発明で使用される好ましいクロモゲンは、グアヤクおよびＡＢＴＳであり 、特に好ましいクロモゲンは、グアヤクおよびＡＢＴＳの混合物である。この後 者の混合物は１着色を増強し、このことにより試験の感度および特異性を改良す る。すなわち、この混合物は９個々の成分から期待され得る応答の合計よりは大 きい発色応答を起こす。色強度が増強されるのに加えて１色は、現在のＦＯＢＴ 　（例えば。

ＨＥＭＯＣＣＵＬＴ■試験）で観察される色よりも均一に広がり、より安定であ り（すなわち、長く続＜）、より再現性が高い。

混合物中のグアヤクとＡＢＴＳとの重量比は、約１：５〜５：１の範囲であり得 、好ましくは、約１：１であり得る。クロモゲン混合物を、以下で説明されるよ うに、ペルオキシドとともに、および／または鉄プロトポリフィリンのための溶 媒中で、完全試薬として処方される場合、処方物中に安定化量の亜硫酸ナトリウ ムまたは他の酸化防止剤を含有することが好ましい。好ましくは、亜硫酸ナトリ ウムは、溶液を飽和させる量より多くの量で存在する。溶液中のクロモゲン混合 物の濃度は９通常、約０．０５〜約１０％の範囲である。

本発明の親出願で記載されたように、クロモゲンまたはクロモゲン混合物は、固 体試験マトリックス上に置いた糞便試料を、ロイコ染料およびヒドロペルオキシ ドと接触させることを包含する種々のＦＯＢＴ方式に使用され得る。ひとつの方 式では、マトリックスに、混合物を予め含浸させる（すなわち。

マ）　ＩＪフックス、混合物を乾燥形態で担持している）。他の方式では、マ） 　ＩＪフックス混合物の１成分を含浸させ、残りの成分は、ヒドロペルオキシド と組み合わされて、または別々にマトリックス試料に溶液で適用される。長期間 の安定性を得るために、クロモゲン混合物とヒドロペルオキシドを別々に保持す るのが好ましい。例えば、同時調剤に適した別々の容器（例えば、共通の出口ノ ズルを具備する二重バレルシリンジ）に充填され得る。他の方式では、完全試薬 組成物の一部として溶液中のクロモゲンを採用する（長期間の安定性を必要とし ない場合）。完全試薬組成物は、クロモゲンと溶媒に加えて、ヒドロペルオキシ ドと、必要に応じて、ヘモタンバク可溶化剤、安定剤、植物ペルオキシダーゼ阻 害剤、鉄キレート化剤、促進剤、および緩衝剤のような他の添加剤を含有する。

これらの添加剤は、勿論、他の試験方式で、固体試験マトリックスに含浸させて もよい。このような完全試薬組成物を利用することは、マｌ−ＩＪフックス予め 含浸する必要がなく、新しい試験形態が可能になり、製造費が低く、未処理のマ ）　ＩＪフックス使用量が少なく、そして、試験性能が改善されるので有利であ る。

鉄プロトポルフィリンのための溶媒に基づいた溶媒系を含有する顕色剤／完全試 薬組成物を糞便試料に適用することは。

種々のＦＯＲＴ方式にも使用することができる。デベロッパーとして用いる場合 は、溶液は、ヒドロペルオキシドを含有し。

ロイコ染料が含浸されたマトリックス上の試料に適用される。

完全試薬の形態で用いられる場合は、溶液は、ロイコ染料。

好ましくは本発明の複数のクロモゲンと、ヒドロペルオキシドと、任意に前記の ような他の添加剤とを含有している。

本発明のＦＯＢＴ法に用いられる試験マトリックスは、セルロース系物質（木材 ２紙）、セラミック、ガラス繊維、天然もしくは合成の布地用繊維、フェルトお よびスポンジのような各種の多孔性材料で製造することができる。吸水性濾紙が 一般に使用され、好ましいものである。

鉄プロトポルフィリンのための溶媒として有用で本発明で使用するのが好ましい 液体は、一般に、鉄プロトポルフィリンを約５．０〜１０．０の範囲のｐＨで、 高容量まで溶解する中間体を含有している。本発明では、この容量は、２５■の 結晶ヘミンを、常温で、１艷の溶媒と混合し、未溶解のまま残るヘミンの量を測 定することによって決定される。上記の方法で評価され、ヘミンを溶解する高い 容量を示した液体には、非プロトン性アミド類、スルホキシド類、スルホン類、 ピリジン。

および特定アミン類と他の有機溶媒との混合物が包含される。

容認される鉄プロトポルフィリンの溶媒であることが判ったアミドは、下記式で 表わされる： ここで、　Ｒ’、　Ｒ’およびＲ３は、同一もしくは異なってもよく。

水素原子、低級アルキル基、フェニル基もしくはベンジル基を表わし、但しＲ’ とＲ２とが共に水素原子ではなくて、Ｒ３がＲ１もしくはＲ２と結合して５員も しくは６員の複素環を形成してもよい。「アルキル」という用語を修飾するのに 使われている「低級」という用語は、１〜６個の炭素原子を有する部分を意味す る。このような部分の例は、ヘチル、エチル、イソプロピル、ブチルおよびヘキ シルである。ジメチルボルムアミド、テトラメチル尿素および１−メチル−２− ピロリジノンがこの種の好ましい溶媒である。

容認される鉄プロトポルフィリンの溶媒であることが見出されたスルホキシド類 とスルホン類は、下記式で表される：Ｒ’−Ｘ−Ｒ’ しくは異なってもよく、低級アルキル基、フェニル基、ベン５員もしくは６員の 複素環を形成してもよい（例えば、テトラメチレンスルホキシド、ペンタメチレ ンスルホキシド）。

容認される鉄プロトポルフィリンの溶媒であることが見出された。中和されたア ミンと有機溶媒との混合物としては。

次のようなものが包含される：エタノールアミンと、グリセロール、テトラヒド ロフルフリルアルコール、２−メトキシエタノール、メチルエチルケトン、テト ラメチル尿素、スルホラン（テトラメチレンスルホン）もしくはブチロラクトン との混合物；２−（ジエチルアミノ）エチルアミンと、メチルエチルケトン、ア セトニトリル、スルホラン、ブチロラクトン。

テトラフルフリルアルコール、２−メトキシエタノールもしくはメタノールとの 混合物；およびジェタノールアミンと、メチルエチルケトン、アセトニトリル、 スルホラン、ブチロラクトンもしくはテトラヒドロフルフリルアルコールとの混 合物が包含される。鉄プロトポルフィリンの適切な溶媒である。

中和されたアミンと有機溶媒とのその他の混合物は１本発明で説明するようにし て経験的に決定してもよい。この混合物は、ＩＭの水性の中和アミンを基準にし て約１：１の体積比で混合するのが好ましい。

また鉄プロトポルフィリンの溶媒としては、試験マトリックスを濡らし、溶解し た鉄プロトポルフィリンを（クロマトグラフィーによって）試料から移送し得９ 色の変化がある場合には９色の変化を、より容易に示し、試料によって不鮮明に ならないものが好ましい。

本発明で用いる特に好ましい溶媒は、テトラメチル尿素と。

エタノールアミンもしくはジメチルアミンとの混合物であり。

この混合物は、約５０〜９０容量％のテトラメチル尿素と、これに対応して約１ ０〜５０％のエタノールアミンもしくはジメチルアミンとを含有している。最適 の製剤は、約７０容量％のテトラメチル尿素と、約３０容量％のエタノールアミ ンもしくはジメチルアミンを含有している。

過酸化水素、またはクメンヒドロペルオキシド、ｔ−ブチルヒドロビルオキシド 、ジイソプロピルベンゼンヒドロベルオキシドおよび２，５−ジメチルヘキサン ヒドロペルオキシドのような有機ヒドロペルオキシド類はデベロッパーもしくは 完全試薬に用いられ得る。有機ヒドロペルオキシド類は、（ａ）植物ペルオキシ ダーゼが糞便試料中に存在している場合のＦＯＢＴに偽陽性の結果を起こすこと 、および（ｂ）ヘモタンパクのペルオキシダーゼ活性を破壊することが余りない ので、有機ヒドロペルオキシド類を使用するのが好ましい。デベロッパー／完全 試薬中のヒドロペルオキシドの濃度は９通常、０．０５〜１０容量％、さらに通 常は０．５〜５容量％である。

本発明と組み合わせて用いられる調節化合物は、典型的］こ。

鉄プロトポルフィリンの溶媒を含有する溶液中に含有されている。これらの調節 化合物は、促進剤（すなわち呈色反応の速度を高める化合物）と、阻害剤（すな わちこの反応を遅らせる化合物）の両者を包含する抗マラリア剤である。

本発明で用いられる促進剤は、下記のクロロキン（Ｉ）とこれらの化合物は、上 記のようにルイス塩基の形態で用し１てもよく、または塩９例えばクロロキン塩 酸塩もしくはキナク１ｙン塩酸塩のようなハロゲン化物とし′て用いてもよ（１ ゜これらの化合物は、ペルオキシダーゼ活性物質（例えば糞便血液）を非常に迅 速に検出できる。促進剤は、鉄プロトポルフィリンの溶媒を含有する溶液は、約 ０．１〜約５．０％の範囲（こ。

最適なのは約１．５％の量で含有され得る。

上記の化合物が、ペルオキシダーゼ活性の促進剤として作用するということは全 く予想外のことである。とし）うのｃマ。

クロロキンとキナクリンは共に酵素活性を阻害するということは、当該技術分野 では、定着していたからである〔例えば。

ＦｒａｓｅｒとＫｅｒｍａｃｋ、　　Ｂｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃ、Ｃｈｅｍｏｔ ｈｅｒ、、１２巻、１６〜２３頁、　１９５７年（クロロキンによるヘキソキナ ーゼの阻害）；Ｇｅｒｈｌａｃｋ、　Ｋ１１ｎ、Ｗｓｃｈｅｒ８．３６巻、　３ ７６−７８頁、　１９５８年（クロロキンシフオスフェートによるグルタミン酸 デヒドロゲナーゼの阻害）　　；　Ｖａｎｄｅｒｊａｇｔら、　　Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐａｒａｓｉｔｏ、１０巻、４５〜５４頁、 　１９８４年（クロロキンとキナクリンによるアミノペプチダーゼの阻害）；お よび５ｈｕｔｅら、　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、　３ ４巻、　２４７１〜７５頁、　１９８５年（クロロキンによるホスファチジルイ ノシトールホスホジェステラーゼ）参照〕。

さらに本発明で調節化合物として開示された抗マラリア剤はすべて、キノリン核 をもっているが、キノリン自体は、触媒作用に対して有意な影響を全く持ってい ないことは注目すべきである。該技術分野で確立され、以下の実験の項で例証す るように、触媒促進作用は、キノリンベースの抗マラリア剤の一般的な性質では ない。本発明の発明者が試験した薬剤の中で、クロロキンとキナクリンだけが、 ヘミンとヘモグロビンの触媒活性を有効に促進する。

ペルオキシダーゼ活性物質を検出する試験法、特にＦＯＢＴにおけるこれらの促 進剤は、当該技術分野にとって大きな利益を提供する。多くのＦＯＢＴにおいて ９色形成反応が全く遅い場合がある。すなわち、いくつかの試料では、充分な発 色に２〜５分間を要する。さらに、ヘモグロビン自体ではなくて主として鉄プロ トポルフィリンを含有する塗抹試料では１発色が特に遅い。この種の試料は、患 者が出血している上部Ｇｌ損傷を有するか、または試験試料を３日間集めて患者 の医師に郵送もしくは運搬する場合でも、予想され得る。この制限のために、現 在のＰＯＢＴ製品によって偽陰性の試験結果を発生する比率が高くなる。しかし ９本願で開示する促進化合物を含有させると、上記の環境下で、信頼性の高い明 確な陽性の試験結果が得られる。すなわち、これらの促進剤を処方したＦＯＢＴ は、Ｇ、１．器官のどこで放出された血液でも、２分間より短い時間内で強い安 定した青色によって検出する。

「阻害剤」である調節化合物の種類について述べると、ペルオキシダーゼ活性物 質を検出する発色試験の重要な要素が。

試験法の感度を調節する性能であることを、まず指摘しなければならない。この ことは、試験法が、クロモゲンとしてグアヤクに依存している場合と、試験法が ヒトや動物の糞便の試料を用いようとしている場合に、特に当てはまる。純粋な 化合物である他の多くのクロモゲンとは異なり、グアヤクは。

多くの化合物を含有する粗製の植物エキスである。粗製のグアヤクエキス中の実 際のクロモゲンは、全エキスの非常に小さい割合に相当し、その割合は変動する 。その結果、試薬製剤中の粗グアヤクの濃度を単に変えるだけで試験の感度を。

高い信頼性で調節することは困難である。

さらに、糞便試料は、単一の種からのものでも、水分含量。

繊維の含量１食物残渣、内因性ヘムの含量などが大きく変動する。色々の種由来 の試料を試験しなければならない場合に。

この問題が加わる。一つの種に適切な試験感度が、他の種には完全に不適な場合 がある。糞便中に存在する潜血以外の潜血の試験にも、固有の異なる感度の要件 がある。

通常、　ＦＯＢＴの感度は、クロモゲンもしくは酸化体の濃度を経験的に変える ことによって調節される。あいにく、クロモゲンもしくは酸化体を減少させると 、陽性の試験で得られる色強度を低下させ、退色速度を増大させる。その結果、 所定のクロモゲン濃度で規定された試験感度では、容認できないうすい呈色反応 になり得る。理想的には、試験感度を、クロモゲン濃度の変更以外の機構で変え ることができるようにすべきである。しかし、現在までそのような機構は提案さ れていない。本発明は、　ＦＯＢＴおよびペルオキシダーゼ活性物質を検出する 他の試験法に各種の阻害化合物を含有させることによって、当該技術分野の上記 の要求と取り組んでいる。

本発明の発明者によって９本願で述べた呈色反応を阻害するということが見出さ れた化合物は、下記のキニジン（■）。

キニーネ（ｒＶ）およびプリマキン（Ｖ）である。

（Ｖ） 上記の化合物は２　さきに述べた促進剤と全く類似した構造ををしているので、 上記の化合物が、本願で述べたＦＯＢＴおよび類似試験法で阻害剤として作用す るということは全く意外なことである。Ｒｉｔｔｅｒｓｄｏｒｆの米国特許第３ ．９１７．４５２号は、実際に、キニーネがペルオキシダーゼ活性の刺激物質で あることを裏付けている；キニーネをペルオキシダーゼ活性の促進剤として使用 することを開示している西独特許第１．２４２．９０５号（本願で引用）および 米国特許第３．２９０．１１７号と同第３，９７５．１６１号および第４．１４ ８．６１１号も参照のこと。これらの開示からみて２キニーネ（および近縁化合 物のキニジンとプリマキン）が本願で述べるＦＯＢＴで強力な阻害剤であること は実に驚くべきことである。

これらの阻害剤を単独でもしくは上記の促進剤とともに用いれば９例えばグアヤ クもしくはグアヤク／ＡＢＴＳ混合物のようなりロモゲンの単一の所定濃度で、 試験感度を慎重に制御することができる。

特定のクロモゲン濃度を選んだ後、デベロッパー剤または試薬の組成物に含有さ れる促進剤および／または阻害剤の相対量を変えて、試験の感度と特異性を最適 化する。この２者が存在する場合、各々の量は約０．Ｏ１〜約１０．０％の範囲 内であり、この範囲は、約０．１〜６．０％の一般的なりロモゲンの濃度に対応 する。約０．１〜約１．０％の範囲の最適のクロモゲンの濃度において、特に好 ましい組成物は、約１．５％阻害剤を含有している（注二％値はすべて溶液の容 量当りの重量で表わされる。すなわちＩｇ／１００ｄ＝１％）。

上記のように良好なＦＯＢＴは、高い感度（偽陰性の試験結果の発生率が低いこ と）と高い特異性（偽陽性の試験結果の発生率が低いこと）の両者を持っていな ければならない。多くの刊行物が、現在のＦＯＢＴは偽陽性の試験結果の発生率 が５〜１０％以上であるということを、明確に示している。これらのことは臨床 上の負担を増大し、偽陽性の試験結果の発生率が最も高い結腸・直腸癌のスクリ ーニングに対する経費効率に重大な衝撃を与える。さらに、引き続いて行う診断 法（Ｘ線法、結腸鏡検査法、内視鏡検査法など）は、高価で不快であり１時間が かかり、そして罹病率と死亡率がかなり高い。

偽陽性のＦＯＢＴ試験結果が起こる主な原因は２食事に肉を摂取することによっ て糞便のフェリプロトポルフィリンの濃度が上昇することである。ＦＯＢＴ測定 を完了するのに必要な数日間に肉を摂取すれば、糞便のフェリプロトポルフィリ ンが追加されるために、偽陽性のＦＯＢＴ試験結果が起こる可能性が著しく増大 する。したがって患者は、　ＦＯＢＴ測定を完了するのに必要な数日間は肉の摂 取を止めるよう指示されるが、その指示の遵守は不充分な場合が多い。さらに、 　ＰＯＢＴを肉食獣に対する獣医学上の設定条件に利用したい場合には、肉の摂 取を避けることは実施不可能である。

本発明は、上記の問題の解決法を提供するものである。上記の阻害剤は、糞便潜 血試験法が食事の肉から受ける干渉作用をなくするのに利用され得る。ベルオキ ダーゼ活性を測定する呈色試験法を実施する前に、キニーネ、プリマキンもしく はキニジンを糞便に添加すると、ヘミン検出のしきい値のレベルが著しく上昇す る。すなわち、キニーネ、プリマキンもしくはキニジンの０．１〜１０％溶液の 約５０μｌを糞便試料に添加することによって、ヘミンの特定のしきい濃度（典 型的に０．０３ｍｇヘミン／ｇ糞便）を越える場合のみ、陽性の試験結果を生じ ることが可能になる。阻害剤が存在しない場合０．００７■／ｇ程度の低いレベ ルのヘミンが検出されることがある。

したがって本発明の追加の実施態様において１食肉の摂取による干渉を最小にし ながらＦＯＢＴを実施する方法が提供される。

溶液もしくは試験マトリックスに任意に含有され得るヘモタンパク可溶化剤には 、界面活性剤および水溶性ポリマーが包含される。ヘモタンパクを可溶化するの に適切な親水性−親油性バランスを有する界面活性剤が好ましい。このような界 面活性剤には、トリトン（ＴＲＩＴＯＮ■）界面活性剤（ポリオキシエチレンア ルキルフェノール類）；一連のアルキルトリメチルアンモニウムプロミド類由来 の界面活性剤（例えばセチルアルキルトリメチルアンモニウムプロミド（ＣＴＡ Ｂ）もしくはアルキルトリメチルアンモニウムプロミド界面活性剤のｐ−トルエ ンスルホン酸塩）；およびＣ１゜〜Ｃ１４脂肪酸のアルカリ金属塩もしくはアル カリ金属アルキル硫酸塩が含まれる。

適切な界面活性剤の例は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ３）。

ドデシルスルホン酸ナトリウム、デシル硫酸ナトリウム、テトラデシル硫酸ナト リウム、トリデシルスルホン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウム、カプロン 酸ナトリウム、ドデシルＮ−サルコシン酸ナトリウムおよびテトラデシルＮ−サ ルコシン酸ナトリウムである。ヘモタンパクを可溶化するのに用いられる水溶性 ポリマーには、ポリ（エチレンオキシド）。

ポリ　（ビニルアルコール）、ポリ　（ビニルピロリドン）、ポリ　（ビニルピ リジン）、およびポリ　（スチレンスルホナート）が包含される。これらの可溶 化剤は、ヘモタンパクを可溶化するだけでなく、ペルオキシダーゼ活性のないヘ モタンパクの二量体もしくは凝集体をペルオキシダーゼ活性モノマ一種に変換す ると考えられる。

鉄プロトポルフィリンを安定化し、そのペルオキシダーゼ活性を高める窒素含有 リガンドを、完全試薬もしくは試験マトリックスに組み込んでもよい。このよう なリガンドの例は。

ピリジン、ヒスチジン、カフェイン、イミダゾール、およびイミダゾール誘導体 である。

植物ペルオキシダーゼ阻害剤と鉄キレート化剤〔例えばエチレンジアミン四酢酸 、　Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’　、　Ｎ’−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、クエン酸、 酒石酸、ニトリロ三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、Ｎ、Ｎ’−ビスヒドロ キシエチルグリシン、エチレングリコールビス（２アミノエチルエーテル）四酢 酸。

Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン四酢酸〕を、試験マトリックスに組み込 んで、さらに誤った試験結果の可能性を減少させてもよい。緩衝液を添加して、 ロイコ染料を酸化するのに適切なｐＨを維持する。特定の緩衝液（ｐｔｌ範囲） は、使用されるロイコ染料によってきまる。ｐＨは通常約３〜約９である。例え ば、グアヤク酸化反応ではｐＨ６〜７．５に緩衝され（リン酸緩衝液）　、　３ ．３’５．５’−テトラメチルベンジジン酸化反応はｐＨ約４で緩衝され（酢酸 緩衝液）、およびＡＢＴＳは約９〜９．５のｐＨに緩衝される（グリシン緩衝液 ）。本発明のクロモゲン混合物については、　ｐｔ＋は５〜１０の範囲になけれ ばならない。

以下の実施例は９本発明を例示することを目的とし９本発明の範囲を限定するも のではない。

（以下余白） 叉［ ヘミンで触媒されるグアヤクの酸化反応における色形成の速度および度合に対す るクロロキンの効果を確かめるために、試験を行った。次の試薬を使用した。（ １）約７０容量％のテトラメチル尿素（ＴＭＵ）と約３０容量％の１Ｍエタノー ルアミン（ＥＡ）とからなる、ｐＨ７，０の溶媒混合物中の約１０％グアヤク溶 液：　（２）ＴＭＵ／ＥＡ溶媒混合物（６０：４０、容量比）中の４％クロロキ ン；　（３）５％クメンヒドロペルオキシド；および（４）ヘミン懸濁液、蒸留 水中で０、１６ｍｇ／ｍｌａ 試験手順：５％グアヤク、５％クメンヒドロペルオキシド、および表１に示され る様々な濃度のクロロキンとを含有する３゜０ＩＩ＋１のＴＭＵ／ＥＡ溶媒混合 物（６０：４０、容量比）に、２０μ２のヘミン懸濁液を加えることで、試料を 調製した。各場合の最終ヘミン濃度は、１．０７μｇ／＋１であった。その系の 光学走査を、３０秒間隔で４００から８００ｎｍの間で行った。６１０ｒｖ（Ｏ Ｄｅ＋ｌＩ）での光学密度ピークを、表１に記載する。

１−上 ６１０ｎｍでの光学密度 ６１０ｒｖで観察された色は、酸化体としてクメンヒドロペルオキシドを用いた グアヤクのヘミンで触媒される酸化反応から生じている。表１で見られる様に、 クロロキンがこの様な系に加えられる場合、色形成の速度および強度の両方が、 実質的に高められる。この促進効果は、クロロキンの濃度におおよそ比例してい る様に見える。０．０１％のクロロキンでは促進効果は小さく、約１から２％の クロロキンで最大に達する。要するに、クロロキンは実質的に試験感度を向上さ せる。

爽１１肚−」工 実施例１で行われた試験を、ヘモグロビン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ ＩＩＩＲＰ）、および塩化第二鉄を触媒として用いて再実行した。次の試薬を用 いた。（１）テトラメチル尿素および１Ｍエタノールアミンの溶媒混合物、６０ ：４０　（容量比）、ｐＨ１，０＜−ＴＭＵ／ＥＡ溶媒”）　；　（２）ＴＭＵ ／ＥＡ溶媒中の１０％グアヤク；　（３）Ｔｙｕ／ＥＡ溶媒中の４％クロロキン ；（４）クメンヒドロペルオキシド；（５）ヘミン懸濁液、蒸留水中で０．１６ ａ＋ｇ／ｍｌ　（最終反応濃度、３．２μｇ／＋１）　；　（６）ヘモグロビン 、蒸留水中で３１ｇ／ｍｌ　（最終反応濃度、６０μｇ／ｍｌ）　；　（７）セ イヨウワサビペルオキシダーゼ、蒸留水中で３００ＬＩ／ｍｌ　（最終反応濃度 、６Ｕ／ｍｌ）　；および（８）塩化第二鉄、ｌｏｏ＋ｍＭ　（最終反応濃度、 ３２４μｇ／凋ｌ）。

試験手順：５％グアヤク、５％クメンヒドロペルオキシド、および表２８から２ ｄに示される濃度のクロロキンとを含有する１、　ＯｗｌのＴＭＵ／ＥＡ溶液に 、２０μ！の触媒溶液（つまり、ヘミン、ヘモグロビン、ＨＲＰ、　　もしくは 塩化第二鉄）を加えることで、試料を調製した。光学密度の増加の初期速度（Ｖ ｉ　ｎ　ｉｔｓ　反応の最初の３０秒の間の６１０ｎｍでの光学密度の変化とし て定義される）を３００秒反応間隔の間の、６１０ｎｍでの最高光学密度（ＯＤ ＠、り、およびＨＲＰの場合には６０秒反応間隔の間の、６１０ｎｍでの最高光 学密度（ＯＤｓｅ）とを共に記録した。

Ｖ　Ｉｎ１ｔ　　　　　Ｏ，１１４０，０８７０，４７００，８７４０Ｄ　＋ｏ ａｘ　　　　　Ｏ，４４８０，４６２１，０６３１，４２６Ｖ　［ｎｉｔ　　　 　　Ｏ，２２３０，５６２１，０１８１，４６１０Ｄ　ｒａａｘ　　　　　０１ ６０７　　１．１１４　　１．６４２　　２．０７９Ｖ　Ｉｎ１ｔ　　　　　１ ．７７７　　１．６４６　　　．６５６　　１．０３３０Ｄ　６０　Ｓｅｅ　　 　　！、３７３　　　．８？３　　　．３６１　　　．５４１Ｖ　Ｉｎ１ｔ　　 　　　２．０６４　　１．７４４　　０．０９９　　０．００００Ｄ　ｗａｘ　 　　　　２．０６２　　１．７４９　　０．０９９　　０．０００上記の試験よ り、クロロキンは、ヘミンもしくはヘモグロビンが触媒として使用されているい ないに関わらず、色の形成速度および最大色強度を高めると結論を下し得る。糞 便潜血は、ヘミン、ヘモグロビン、もしくはその両方の混合物から成り得るので 、このことは重要である。従って、糞中のそれらの相対的な量に関わらず、両方 の存在を検出し得ることが、非常に望ましい。

更に驚くべきことに、クロロキンは、ＨＲＰおよび塩化第二鉄の両方による触媒 作用を抑制する。植物のペルオキシダーゼが、潜在的に偽陽性の試験結果の重要 な原因であることはよく知られている。従って、クロロキンによるＨＲＰの抑制 は、クロロキンが、一般的に植物のペルオキシダーゼの活性を抑制し、偽陽性の 重要な原因を除去することを示している。同様に、鉄塩は、偽陽性の試験結果を 引き起こすことが知られている。この様な塩は、しばしば、処方されたもしくは 店頭売りのミネラルの補足剤として患者が服用する。便器の水から回収された糞 標本もまた、配管システムに形成されたさびの結果として鉄塩を含有し得る。従 って、クロロキンが、塩化第二鉄による触媒作用を抑制するという事実はまた、 化合物がいかに著しく偽陽性の発生率を減少させ、従って試験の特異性を高め得 るかを示している。

実ＪＪ肚−」エ ヘミンおよびヘモグロビンで触媒されるグアヤクの酸化反応の様々な坑マラリア 剤の効果を、前述の実施例と同様の手順を用いて研究した。次の試薬を用いた。

（１）ヘミン、蒸留水中で０．０３ｍｇ／ｍｌ　（ＤＭＳＯ中にヘミンを溶かし 、水に濃縮ＤＭＳＯ溶液を加えることで調製；最終反応濃度、Ｏ，０Ｏ０６＋ｏ ｇ／ｍｌ）　；　（２）ＴＭＵ、　１Ｍエタノールアミン、ｐＨ７，０で７０％ に希釈；（３）ヘモグロビン、水中で０．６Ｂ／＋１　（最終反応濃度、Ｏ，Ｏ １２＋ｏｇ／ｍｌ）　：および（４）丁ＭＵ／ＥＡ　（７０：　３０容量比）中 ｉｉ：０．５％ミニ０．５％グアヤクＡＢＴＳおよび５２クメンヒドロペルオキ シドを含有するクロモゲン溶液。

試験手順＝２０μ２のヘミン懸濁液もしくはヘモグロビン溶液の部分標本を、エ ーテル、水、もしくは表示された薬剤（最終濃度、１．５％）を含有するクロモ ゲン溶液に加えることで調製し、６１０ｎｍでの光学密度を９０秒間モニターし た。

結果を表３および４に示す。

９０　　　０．９８？　　１．２４６　１．７８９　１．１６８　０．０４８　 ０．０６０３０　　　０．２８２　１．４７４　０．８７３　０．４１６　０． ０２１　０．０２９６０　　　０．５６４　１．４３１　　！、３３９　０．７ ４３　０．０３９　０．０５８９０　　　０．６８９　１．１５９　１．４５０ 　０．８８４　０．０５？　　０．０８０試験を行った全ての坑マラリア剤は、 キノリン環を有しているが、それにもかかわらず、キノリン自体は、触媒作用に 重大な影響は持たなかった。更に、触媒作用の促進効果は、キノリンに基づいた 坑マラリア剤の一般的な特性ではないと結論し得る。試験を行った薬剤のうち、 クロロキンおよびキナクリンのみが、ヘミンおよびヘモグロビンの触媒作用を効 果的に高めた。色の形成の速度および強度の両方が、高められた。

クロロキンおよびキナクリンに比べて、構造的に似た化合物の牛二−ネ、プリマ キンおよびキニジンは、ヘミンおよびヘモグロビン両方の触媒作用を強力に抑制 する。

夾血五−土 ヘミンおよびヘモグロビンで触媒されるグアヤクの酸化反応の牛二−ネおよびキ ニジンの効果を、次の様に研究した。

Ａ、牛二−ネの研究 工９次の試薬を調製し、この項で用いた。（１）ヘミン懸濁液（）ＩＭ）、蒸留 水中’ｔ’０．０３ｍｇ／ｌ　（最終反応濃度、Ｏ，０Ｏ０６＋ａｇ／ｍｌ）　 ；（２）ヘモグロビン溶液（ＨＢ）、蒸留水中で０．６１１１ｇ／ｌ　（最終反 応濃度、０．０１２ｍｇ／＋＊１）　；　（３）試薬■（クロモゲン溶液）、ｏ 、ｓ％グアヤク、１．５％クロロキン、Ｓ、ＯＺクメンヒドロペルオキシド、Ｔ ＭＵ／ＥＡ　（７０：　３０容量比）、ｐＨ７，０中の１．０％ＡＢＴＳ；　（ ４）試薬口：試薬Ｉと０．１ｚ牛二−ネ；（５）試薬１目：試薬Ｉと０．５％キ ニーネ；（６）試薬１ｖ：試薬Ｉと１．　ＯＳ牛二−ネ；および（７）試薬Ｖ： 試薬Ｉと２．０％もしくはヘモグロビン溶液を加えることで、試料を調製した。

６１０ｒｖ′？’の光学密度を９０秒間モニターし、３０秒間隔での光学密度を 表５に示す。

（以下余白） Ｓ ミ ２、次の試薬を調製し、この項で用いた。（１）ヘミン懸濁液、蒸留水中で０． ０３＋ａｇ／■ｌ　（ＤＭＳＯ中に−・ミンを溶かし、蒸留水に濃縮ＤＭＳＯ溶 液を加えることで調製、最終反応濃度０．０００６ｍｇ／ｍｌ）；および（２） り０％ゲン溶液、１．５ｚグアヤク、１％ＡＢＴＳ、　　１．８％１．２−ジア ミノシクロヘキサン−ｎ、　ｎ、　ｎ’、　ｎ’−テトラ酢酸（ＤＡＣＨＴＡＡ ）、５％クメンヒドロペルオキシド、ｉ、ｓｚクロロキン、および表６に示すキ ニーネ。

試験手順：　１ｍ＋１のクロモゲン溶液に、２０μ！のヘミン懸濁液を加えた。

６１０ｒｖでの光学密度を３００秒間モニターし、その結果を表６に示す。

本実施例のＡ、１項およびＡ、２項から結論出来る様に、キニーネは、促進剤で あるクロロキンの存在下でヘミンおよびヘモグロビン触媒作用を抑制し得る。最 終濃度０．１％でさえ、表５および６に示される様に、キニーネは、１．５％ク ロロキンの存在下でヘミンおよびヘモグロビン両方の触媒作用を著しく抑制し得 る。

Ｂ、キニジンの研究 １、本実施例Ａ、ｌと同様の手順を、クロロキンの存在下へミンで触媒されるグ アヤクの酸化反応でのキニジンの効果を研究するために使用した。

使用試薬：（１）ヘミン懸濁液、蒸留水中で０．３＋ｏｇ／ｌ　（ＤＭＳＯを用 いて上記の様に調製’）　；　（２）ＴＭＵ／ＥＡ（７０：３０容量比、エタノ ールアミンＬＭ）、ｐＨ７，０中に、試薬Ｉ（クロモゲン溶液）、２％キージン 、０．５％グアヤク、１％ＡＢＴＳ、　　１．５％りｃｔａキン、５．０％クメ ンヒドロペルオキシド；（３）試薬１１：１．０％キニジンを含有することを除 いて試薬Ｉと同じ；（４）試薬ＩＮ：　０．５ｘキニジンをｔｉすることを除い て試薬１と同じ；り５）試薬ＩＹ：０．１％キニジンを含有することを除いて試 薬Ｉと同じ；および（６）試薬Ｖ：キニジンを含有しないことを除いて試薬Ｉと 同じ（対照）試験手順：　１ｍｌノ試薬１．　ＩＩ、　ＩＩＴ、　　ｒＶ、また はｖに、２０μ２のヘミン懸濁液を加えて試料を調製した。試料の６１０ｎｍで の光学密度を１５０秒間モニターし、表７に作表した。

２、本実施例のＡ、２項で述べたのと同様の手順を、ヘミンで触媒されるグアヤ ク酸化反応の速度に対する牛ニシンの効果を確かめるために行った。試薬および 試験手順は、８．１項で使用されたのと同一であり、結果は表８に記載する。

表７および８で示す様に、牛二−ネのエピマーの牛ニシンは、ヘミンの触媒作用 を抑制するのにキニーネよりも更に効果がある。ヘミン触媒作用の著しい抑制が 、０．１％キニジンで見られ、抑制は事実上、２．０ｘキニジンで完結する。

Ｌ１五−１ 坑マラリア剤のキニーネおよびキニジンを用いて、広い範囲で試験感度を変える ために、次の研究を行った。

１、キニーネ。次の試薬を用いた：（１）ヘミン懸濁液、蒸留水中で０．０３ｍ ｇ／ｌ　（ＤＭＳＯを用いて上記の様に調製）　；　（２）キニーネを含有しな いクロモゲン溶液（表９の°−Ｑｕｆｎｅ−）、７０％ＴＭＵ／３０％ジエチル アミンＩＭ中に、１．５％グアヤク、２．０％ＤＡＣＨＴＡＡ、　　１％ＡＢＴ Ｓ、　５％ＣＩ（Ｐおよび表９に示すクロロキンを含有し、ｐＨはおよそ６．５ ；および（３）牛二−ネを含有するクロモゲン溶液（表９の”＋Ｑｕｒｎｅ“） 、前記の溶液と同じだが、０．５％のキニーネを加えた。

試験手順は、以下の通りであった。２０μｌのヘミン懸濁液をクロモゲン溶液に 加えた。６１０ｎｍでの光学密度を３００秒間モニターした。

Ｂ、牛ニシン。次の試薬を用いた＝（１）ヘミン懸濁液、蒸留水中で０．０３ｍ ｇハ、ＤＭＳＯを用いて上記の様に調製；（２）試薬ｌ：テトラメチル尿素およ び１Ｍジエチルアミン（７０：３０容量比；”ＴＭＵ／ＤＥＡ−）、ｐＨ７，０ 溶液中に、１．５ｚグアー”り、１，５％りｃｙｏキン、１．０％ＡＢＴＳ、　 １．８％ＤＡＣＨＴＡＡ、　５．０％クメンヒドロペルオキシド；（３）試薬Ｉ Ｉ　：　ＴＭＵ／ＤＥＡ中ニア５容量％ノ試薬１；（４）試薬ＩＩＩ：　ＴＭＵ ／ＤＥＡ中ニ５０容ｊ１％ノ試薬１；（５）試薬ＩＶ：　ＴＭＵ／ＤＥＡ中Ｊ、 ：４０ｆｉ’１％（７）試薬Ｉ；および（６）試薬Ｖ：　ＴＭＵ／ＤＥＡ中ニ３ ０重量％の試薬１０１ｍ１の表１０の試薬に、２０μｉのヘミン懸濁液を加え、 ６１０ｎ＋ｍでの光学密度を３００秒間モニターした。結果を以下に作表する。

本実施例で要約された研究から結論し得る様に、クロロキンを含有するＦＯＢＴ 試薬に抑制性坑マラリア剤を含むことで、広い範囲に試験感度を変化し得る。表 ９および１０において、色の形成の速度、６０秒での色の強度、および得られる 最大の色は、適当な程度の刺激性および抑制性坑マラリア剤を使用することで、 著しく変化し得る。

爽血五−立 試験感度に対するキニーネ、キニジン、およびプリマキンの効果を、少量のヘミ ンを混ぜた正常なイヌの糞の標本を用いて評価した。

Ａ、キニーネ。次の試薬を用いた：（１）以下に示すヘミン懸濁液；　（２）７ ０％ＴＭＵ／３０％ジエチルアミンＬＭ、、ｐＨ７，０中の、１．５％グアヤク 、１．５％りｏｃｒキン、１．０％ＡＢＴＳ、　１．８％ＤＡＣＢＴＡＡ、　５ ．０％ＣＵＰ　。

（３）試薬！＝７０％ＴＭＵ／ＤＥＡ　ＬＭ、　ｐＨ７，０中に２％のキニーネ ；（４）試薬ＩＩ：１％のキニーネを含有することを除いて試薬Ｉと同じ；（５ ）試薬１１１：０．５％のキニーネ（ｑｕｉｎｅ）を含有することを除いて試薬 ■と同じ；（６）試薬ＩＶ：０．２％のキニーネを含有することを除いて試薬ｌ と同じ；（７）試薬Ｖ：０．１χの牛二−ネを含有することを除いて試薬■と同 じ；（８）試薬Ｖｌ：０．０５％のキニーネを含有することを除いて試薬ｌと同 じ；（９）試薬Ｖｌｌ：　ｏ、ｏｏ％の牛二−ネを含有することを除いて試薬Ｉ と同じ；　（１０）試薬Ｍｉｌｌ　：対照−添加なし。

試験手順：　Ｈｅｍｏｃｃｕｌｔ　　および原型ＦＯＢＴの両方で陰性の試験結 果を示した、よく混合した犬の糞の標本から、多数の１〜２ｇの試料を秤量した 。糞中で望ましい濃度の３倍の濃度で、ヘミン懸濁水溶液を調製した。与えられ た試料の０．５倍に等しい大量の水性ヘミンを加えることで、表示した濃度（＋ ａｇ化合物／ｇ糞）を調製した。一定の濃度が得られるまで、各混合試料を混合 し、糞の塗抹標本をＷｈａｔｍａｎ　＃１フィルターペーパー上に作製し、室温 で乾燥させた。各糞の塗抹標本に、２０μ！の表示した試薬を加えた。ペーパー を、３０分間５０℃で乾燥した。

２０μｌの１．５％グアヤク試薬り２）を、各点に加えた。色の強度および移動 を１．２．５分後に決定した。結果を表１１に記載する。

（凡例：色の強度：Ｏ１認知できる青色なし；＋ＩＲわずかに認知できる青色； ＋１０１Ｉ、Ｉｌ：ｆに濃い青色；中間評価雪中間の強度の青色。色移動二〇・ 色移動なし、色は形成されているが、触媒点から移動できない；１０・標本から 溶液表面へ完全に色が移動；中間評価・溶液表面と触媒点との間で色が移動）（ 以下余白） 本実施例のこの項では、添加キニーネが存在する状態と存在しない状態で、原型 ＦＯＢＴ試薬を用いて混合翼標本を試験した。キニーネが存在しない場合では、 ０．００７ｍｇヘミン／ｇ糞の低さのヘミン濃度で、陽性試験結果が見られた。

発色するＦＯＢＴ試薬の添加前に、糞標本に０．０５％のキニーネを加えると、 ０゜００７＋＋ｇヘミン／ｇ糞で青色形成が妨げられた。

標本に０．１％キニーネ溶液を加えると、０．１５ｍｇ／ｇ糞の濃度でのヘミン の検出が妨げられた。ヘミンの濃度が増加するにつれて、２％キニーネの濃度で さえ、キニーネの添加はもはや色反応を除去はしなかった。従って、糞の塗抹標 本に適当な濃度のキニーネを加えることによって、特定の限界濃度のヘミンを超 えるもののみ陽性の試験を作り出すことが可能である。

Ｂ、プリマキン。キニーネの代わりに、プリマキンで代用したことを除いて本実 施例のＡ部分と同じ試薬および手順を使用した。結果を表１２に示す。

（以下余白） プリマキンの添加で、従って、同様の結果が観察された。

対照標準試薬は、０．００７＋＋ｇ／ｇ糞の濃度でヘミンの検出カイ可能であっ た。０．０５％のプリマキンが存在すれば、０．００７もしく１１０゜１５ｍｇ ／ｇ糞の濃度では、ヘミンは検出できなかった。

従って、標本にヘミンを添加することによって、ヘミンが１ｍｌあたり０．０３ ＋ａｇの限界に達した場合のみ、糞のヘミンを検出できる試薬を構成することが 可能である。

Ｃ，キニジン。キニジンを試験するために、上記の２つの実施例と同じ手順およ び試薬を用いた。同じ様な結果がここ（こ示されている。０．０５％の濃度で、 キニジンは、０．００７＋ａｇ／ｇ糞の濃度の糞中のヘミンの検出を妨げた。２ ％のキニジンでは、０．００７もしくは０．ＩＳ＋ｍｇヘミン／ｍｌで陽性反応 は見られなかった。糞のヘミンの濃度が０．０３ｍｇ／ｇ真に達するまで、２％ のキニジンカイ存在下では陽性反応は、達成されなかった。

（以下余白） 要するに、抑制性坑マラリア剤をＦＯＢＴ試薬に加えることは可能であり、それ によって試薬の感度が下がる。抑制性坑マラリア剤を直接、糞の標本に加えるこ とも可能であり、それによって試験試薬の感度を調節する。

爽血五−エ 食肉の摂取に寄って起こる偽陽性の試験結果を減少するために、カンヅメのドッ グフードの型態で肉を摂取している別々の５匹の犬の糞の標本を、ＦＯＢＴ試薬 を加える前のキニジンを含有している溶液にされした。犬は全て正常であり、腸 に発生する寄生虫はいなかった。

次の試薬を用いた：試薬１ニア０％ＴＭＵ／３０％ジエチルアミンＩＭ。

ｐＨ７，０中の、Ｏ，Ｓ％グアヤク、１．Ｏ％ＡＢＴＳ、１．８％ＤＡＣＨＴＡ Ａ、　１．５％りｏｏ−＋ン、５．０％Ｃ）ＩＰ；試薬ＩＩ：　７０１ＴＭＵ／ ３０％ＤＥＡ　ＩＭ、　ｐＨ７，０中の１．０％ＡＢＴＳ、　１．８％ＤＡＣＨ ＴＡＡ％０％牛ニシン；試薬ＩＮ　：　Ｓ％ノーｔ−ニシンを含有することを除 いて試薬■１と同じ；および試薬ＩＶニア０％ＴＭＵ／３０％ＤＥＡＩＭ％ｐＨ ７，０中の、１％グアヤク、ｌｏ％ｃＨＰ、　　１．０％ＡＢＴＳ。

１．８％ＤＡＣＨＴＡＡ、　３％りｏｏキン、注意：試薬！およびＩＶは、両方 ともクロロキンを含有する。

試験手順：犬＃１および犬＃２は、−日に付き、３カアブのｌａｗｓ　Ｃｈｕｎ ｋｓ乾燥ドッグフードと混ぜた１／２缶のカルカンブランドの肉の味付けをした ドッグフードからなる肉の食事を摂取した。犬：３は、２〜３カツプのＷａｙｎ ｅ乾燥ドッグフードと不規則ではあるが、しばしば食事の残り物とからなる食事 を摂取した。

犬＃４５６および＃４７４は、腸に発生する寄生虫のない、大小屋の動物で、肉 と乾燥ドッグフードの混ざった食事を維持した。

犬のサンプルの糞の塗抹標本をＷｈａｌ＋ａｎ　８１フイルターペーパー上に作 り、室温で乾かした。糞の塗抹標本に、２０μＥの試薬Ｉ＋およびＩｌｌを加え た。次いで、カラム１の糞の点（塗抹標本）に、０．５％グアヤク試薬１を加え 、カラム２および３の糞の点に、１％グアヤク試薬ｔＶを加えた。色の強度およ び移動をＬ　２および５分後に決定した。（凡例二色の強度二〇＝認知できる青 色なし；＋１＝わずかに認知できる青色；　＋ｉｏ＝非常に濃い青色；中間評価 ・中間の強度の青色。色移動二〇・色移動なし、色は形成されているが、触媒点 から移動できない；ｌＯ・標本から溶液表面への完全な色移動；中間評価・溶液 表面と触媒点との間の色移動） 標本は、処理していないフィルターベーパに塗うれ、ソノ後、原型ＦＯＢＴで直 接試験されるか、溶媒のみで処理されるか、もしくはＦＯＢＴ試薬にさらす前に 牛ニシンを含有する溶液で処理された。成分の濃度および容量は、最終ＦＯＢＴ インキュベーション中に存在するグアヤクおよびクメンヒドロペルオキシドの最 終濃度が、全ての場合で実質的に同じになる様に調整された。

最初の実験（表１４）では、クロロキンが存在するカラム１を除いて、クロロキ ンなしで標本を試験した。本実験で試験した全ての標本は、色を形成した。クロ ロキンが存在する場合、色の形成はより強く、非常に速く現れた。５％の牛ニシ ンは、クロロキンを含まないＦＯＢＴ試薬での色の形成をほぼ完全に妨げた。こ のことは、試験の読み取りが、１分もしくは５分で行われてもあてはまった。

クロロキンを含有するＦＯＢＴ試薬で、実験を繰り返した（表１５）。この場合 には、色の形成の速度および度合いは、完全なＦＯＢＴ試薬を標本に加えるか、 もしくは溶媒と濃縮試薬を標本地目体で混合するかで、非常に似通っていた。キ ニジンであらかじめ処理した標本は、処理しない対照物よりも色が非常に劣り、 糞の塗抹標本のうちの２つ（犬３および４５６からのもの）は、色を形成しなか った。残りの３標本は、使用された試験系でまだ視覚的に認識できる最も微弱な 色しか形成しなかった。従って、肉を摂取する犬からの糞の塗抹標本をキニジン であらかじめ処理することで、肉の摂取によって起こる偽陽性のＦＯＢＴ試験結 果を減少することが可能になった。

表−二１５ ＭＩＧ　　　ＩＮＴ　　　ＭＩＧ　　　ｉＮＴ　　　　ＭＩＧ　　　ＩＮＴ国際 調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．試料をクロモゲンおよびヒドロペルオキシドと接触させることにより該試料 中のペルオキシダーゼ活性のある物質の存在を検出する改良法であって、 該改良が、クロモゲンおよびヒドロベルオキシドと共に、クロロキン、キナクリ ン、キニーネ、プリマキン、キニジン、およびそれらの混合物からなる群から選 択される調節化合物を該試料に適用することを包含する、 改良法。
2. ２．請求項１に記載の方法であって、前記クロモゲンは、グアヤクおよびＡＢＴ Ｓの混合物を含有する。
3. ３．請求項２に記載の方法であって、前記混合物中のグアヤクとＡＢＴＳの比は 約１：５〜約５：１の範囲にある。
4. ４．請求項１、２、または３に記載の方法であって、前記ヒドロベルオキシドは 有機ヒドロベルオキシドである。
5. ５．請求項４に記載の方法であって、前記有機ヒドロペルオキシドはクメンヒド ロペルオキシドである。
6. ６．請求項１、２、３、４、または５に記載の方法であって、溶液は、鉄プロト ポルフィリンのための溶媒を少なくとも５０容量％含有する。
7. ７．請求項６の方法であって、前記鉄プロトポルフィリンのための溶媒は、次の （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）である：（ａ）次式の アミドであり、 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は同一また相異なり、そして水素、低級アルキ ル、フェニルまたはベンジルを表し、但し、Ｒ３およびＲ２の両方が水素でなく 、そして、Ｒ３がＲ１またはＲ２と結合して、５または６員の複素環を形成し得 る；（ｂ）次式のスルホキシドまたはスルホンであり、Ｒ１−Ｘ−Ｒ２ ここで、Ｘは ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼そ してＲ１およびＲ２は同一または相異なり、低級アルキル、フェニル、ベンジル であり、あるいは、Ｘが▲数式、化学式、表等があります▼ の場合、Ｒ１とＲ２は結合して，５または６員の複素環を形成し得る； （ｃ）ピリジン； （ｄ）エタノールアミンまたはジメチルアミンと、メチルエチルケトン、テトラ メチレンスルホン、ブチロラクトン、テトラヒドロフルフリルアルコール、２− メトキシェタノール、およびテトラメチル尿素からなる群から選択される共溶媒 との混合物； （ｅ）２−（ジエチルアミノ）エチルアミンと、メチルエチルケトン、アセトニ トリル、テトラメチレンスルホン、ブチロラクトン、テトラヒドロフルフリルア ルコール、２−メトキシェタノール、およびメタノールからなる群から選択され る共溶媒との混合物；および （ｆ）ジエタノールアミンと、メチルエチルケトン、アセトニトリル、テトラメ チレンスルホン、ブチロラクトン、およびテトラヒドロフルフリルアルコールか らなる群から選択される共溶媒との混合物。
8. ８．請求項１、２、３、４、５、６、または７に記載の方法であって、前記調節 化合物は、クロロキン、キナクリン、およびそれらの混合物からなる群から選択 される促進剤である。
9. ９．請求項１、２、３、４、５、６、または７に記載の方法であって、前記調節 化合物は、キニーネ、プリマキン、キニジン、およびそれらの混合物からなる群 から選択される抑制剤である。
10. １０．試料中のペルオキシダーゼ活性のある物質の存在を検出するために使用さ れる完全試薬組成物であって、クロモゲン；ヒドロベルオキシド；クロロキン、 キナクリン、キニーネ、プリマキン、キニジン、および，それらの混合物からな る群から選択される調節化合物を含有する、完全試薬組成物。
11. １１．試料中のペルオキシダーゼ活性のある物質の存在を検出するために使用さ れるデベロッパー組成物であって、ヒドロベルオキシドと、クロロキン、キナク リン、キニーネ、プリマキン、キニジン、およびそれらの混合物からなる群から 選択される調節化合物とを含有する、デベロッパー組成物。