ES2209073T3 - Metodo y recipiente para generar imagenes de particulas fluorescentes. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UN RECIPIENTE DE CONTENCION DE PARTICULAS FLUORESCENTES CON LAS QUE SE VA A FORMAR UNA IMAGEN. LAS PARTICULAS FLUORESCENTES SE COLOREAN CON UN COLORANTE FLUORESCENTE, SE RECOGEN EN LA PORCION INFERIOR (3'') DEL RECIPIENTE (3) Y SE ILUMINAN DESDE ABAJO CON UN RAYO DE UNA LUZ DE EXCITACION (1). PARTE DE LA SUPERFICIE EXTERIOR DE LA PORCION INFERIOR ES UNA SUPERFICIE DE ENTRADA DE UNA LUZ DE EXCITACION (3E). DE ESTE MODO, CON SOLO ILUMINAR LA PORCION INFERIOR (3'') O LA PARTE CERCANA A LA MISMA SE REDUCE LA LUZ DE FONDO MEJORANDO ASI EL CONTRASTE DE LAS IMAGENES DE LAS PARTICULAS.

Description

Método y recipiente para generar imágenes de partículas fluorescentes.

Esta invención se refiere a un método para generar imágenes de partículas fluorescentes, y más en particular, a un recipiente para retener partículas fluorescentes, tales como leucocitos o similares, coloreadas con un colorante fluorescente, para generar imágenes de las partículas fluorescentes.

En el campo médico, la preparación de plaquetas y la preparación de eritrocitos se produce extrayendo plaquetas y eritrocitos de la sangre entera. Estas preparaciones de plaquetas y de eritrocitos se utilizan para las transfusiones de sangre, y es indeseable que cualquier preparación contenga leucocitos. Por lo tanto, es importante poder saber cuantos leucocitos contienen las preparaciones. Usualmente, esto se realiza colocando una preparación de plaquetas de muestra en una cámara NAGEOTTE, coloreándola con un tinte fluorescente, proyectando una luz de excitación sobre la muestra y contando los leucocitos por medio de un microscopio. Específicamente, se toma una muestra de 50 microlitros de una bolsa de preparación de plaquetas de 200 o 400 mililitros, se cuentan los leucocitos de la muestra y se convierten en un recuento de leucocitos de la bolsa completa. Esta es una labor pesada, poco eficaz, que ocupa tiempo y que tiene que ser realizada por personal especializado.

Como alternativa, se ha propuesto un aparato para permitir contar los leucocitos, tiñendo los leucocitos con un colorante fluorescente, iluminando la muestra con una luz de excitación que tenga longitudes de onda predeterminadas, utilizando una cámara CCD o similar, para generar imágenes de la muestra, y a continuación, analizando las imágenes para obtener un recuento de leucocitos. Sin embargo, la solución que contiene los leucocitos coloreados también contiene colorante fluorescente, que también emite luz fluorescente. Por lo tanto, puesto que la luz de excitación no solamente excite los leucocitos coloreados sino que, también, es excitado el propio colorante fluorescente, hay una marcada disminución en el contraste de los leucocitos que se desean observar o de los que se desea obtener una imagen. En algunos casos, el contraste puede empeorar hasta el punto de que las imágenes de los leucocitos quedan tan confundidos con el fondo, que no se pueden captar, haciendo imposible contar los leucocitos.

El documento US 5242837 muestra un método y recipiente para la detección de analizados utilizando partículas magnéticas que atenúan la luz, en el cual los analizados marcados son excitados por medio de un haz dirigido sobre una superficie ópticamente transparente. La radiación de la señal producida por la excitación retorna a través de la superficie y se detecta a lo largo del mismo eje de excitación por medios espectroscópicos convencionales. Este documento muestra todas las características del preámbulo de la reivindicación 1.

El documento EP 661532A muestra una cubeta transparente para medir constituyentes, aplicando un haz de luz a través de una primera superficie plana de la cubeta, a través de los constituyentes contenidos en la cubeta y a través de una segunda superficie opuesta de la cubeta, de manera que la medición es uniaxial.

El documento EP 671622A muestra un instrumento de medición óptica y un método en el cual se forma, como un cuerpo unitario, un prisma para introducir una luz de excitación en uno de una guía de ondas de tipo placa y se forma un recipiente de reacción en un lado de la guía de ondas. Los anticuerpos marcados se encuentran limitados en el recipiente de reacción cerca de la guía de ondas y se dirige una luz de excitación al prisma a lo largo de la guía de ondas. La radiación de señal producida por la excitación, retorna a lo largo de la guía de ondas y sale del prisma para medición. Una disposición similar se conoce por el documento US 5677196.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un recipiente para contener partículas fluorescentes, que permita obtener buenas imágenes de las partículas fluorescentes, reduciendo el efecto de la luz de fondo.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para obtener imágenes de partículas fluorescentes que están coloreadas por un colorante fluorescente, estando contenidas las partículas en un fluido y conteniendo también el fluido el colorante fluorescente, comprendiendo el método:

disponer el fluido en un recipiente; y

recoger las partículas fluorescentes en una porción de fondo de un volumen encerrado por el recipiente, caracterizado porque, además, comprende:

guiar una radiación de excitación para que excite las partículas fluorescentes en el recipiente, en el que la citada radiación se guía, en el volumen encerrado por el recipiente, en una dirección desde el lado del recipiente directa y solamente a través de la citada porción de fondo, de manera que el colorante fluorescente dispuesto en cualquier parte del fluido distinta de la porción de fondo no es sustancialmente excitado, y

medir la radiación de las partículas fluorescentes desde debajo de la porción de fondo.

Para conseguir el objetivo anterior, la presente invención proporciona un recipiente para generar imágenes de partículas fluorescentes que están coloreadas con colorante fluorescente e iluminadas por luz de excitación, estando contenidas las partículas fluorescentes en una porción de fondo de un volumen encerrado por el recipiente y cuyas imágenes se generan desde debajo de la porción de fondo, en el que una parte lateral de la superficie exterior del recipiente que encierra la porción de fondo está formada para que sea una superficie de entrada de la luz de excitación.

De acuerdo con esta disposición, puesto que las partículas fluorescentes que son el objeto de interés se acumulan en la parte de fondo del recipiente de generación de imágenes y la porción de fondo del recipiente tiene una superficie lateral externa que es una superficie de entrada de la luz de excitación, solamente la porción de fondo del recipiente es iluminada por la luz de excitación, de manera que la luz de fondo se puede reducir, con lo cual se hace posible obtener imágenes de alto contraste de las partículas fluorescente en el recipiente.

La luz de fondo se puede reducir adicionalmente en forma considerable, utilizando un miembro de pantalla que cubra las partes del recipiente de generación de imágenes distintas de aquellas en la proximidad de la porción de fondo.

Es preferible formar la porción de fondo de manera que tenga una sección transversal cuadrada o rectangular horizontal, formado un lado de la misma una superficie de entrada de la luz de excitación. La porción de fondo también puede tener una sección transversal horizontal que tenga una forma redondeada, y una lente cilíndrica negativa dispuesta en el lado desde el cual la porción de fondo es iluminada por el haz de excitación.

Características adicionales de la invención, su naturaleza y varias ventajas, serán más aparentes con los dibujos que se acompañan y con la descripción detallada que sigue de la invención.

La figura 1 es un diagrama de bloques que muestra la configuración general en un aparato para generar imágenes de partículas fluorescentes, de acuerdo con la presente invención.

La figura 2 es una vista frontal del aparato utilizado para analizar y mostrar las imágenes de las partículas fluorescentes obtenidas.

La figura 3 es un diagrama que ilustra una disposición de una cubierta utilizada para apantallar la parte superior del recipiente de generación de imágenes.

La figura 4 es un diagrama que ilustra otra disposición para apantallar de la luz iluminante, la parte superior del recipiente de generación de imágenes.

La figura 5 es un diagrama de un sistema óptico utilizado para formar un haz de luz de excitación con forma de banda.

La figura 6 es un diagrama de otro sistema óptico utilizado para formar un haz de luz de excitación con forma de banda.

La figura 7 es un diagrama que muestra la configuración de elementos ópticos utilizados para formar un haz de luz de excitación con forma de banda.

La figura 8a es una vista en perspectiva exterior del recipiente de generación de imágenes.

La figura 8b es una vista en sección transversal del recipiente.

La figura 8c es una vista de fondo del recipiente.

La figura 9 es una vista horizontal, en sección transversal, de un recipiente de generación de imágenes, de acuerdo con otra configuración.

La figura 10 es una vista, en sección transversal, de un recipiente de generación de imágenes, de acuerdo con todavía otra configuración.

Las figuras 1 y 2 muestran la disposición de una primera realización de la presente invención. En los dibujos, el número de referencia 1 indica una fuente de luz láser, tal como, por ejemplo, un láser YAG que produce un haz de láser verde. El haz de láser de la fuente 1 de luz de láser, choca sobre, y es difundido por, una placa de difusión 2 compuesta por un vidrio pulido u otro miembro de este tipo que pueda difundir la luz. La luz difundida de esta manera, se proyecta en una porción de fondo 3 ' de un recipiente de generación de imágenes 3, cuya parte superior está tapada por una cubierta 4. Las partículas fluorescentes se acumulan en la porción de fondo del recipiente 3 de generación de imágenes, y estas partículas fluorescentes emiten fluorescencia cuando son iluminadas por el haz de láser. Las imágenes de las partículas fluorescentes iluminadas por el haz de láser, pasan a través de un vidrio de cubierta 5 y de una lente de objetivo 6, a un espejo 7 que refleja las imágenes a un filtro de barrera 8 que transmite luz en una banda de frecuencia prescrita, y a continuación son recogidas por una cámara CCD 9.

Las imágenes de las partículas fluorescentes recogidas por la cámara CCD 9 pasan, a través de una línea de señal 10, a un dispositivo de captura de vídeo 11 de un ordenador 12, en donde son tratadas por un circuito 13 de proceso de imágenes (figura 2) que permite que se reconozcan las partículas fluorescentes. Donde se encuentre una partícula fluorescente, hay un cambio en el brillo, de manera que las partículas fluorescentes pueden ser reconocidas, por ejemplo, utilizando la diferenciación de los valores de señal para detectar las coordenadas de posición de las partículas. De esta manera, las partículas fluorescentes reconocidas se muestran en un monitor 14. La figura 2 muestra la imagen 15 de la porción de fondo del recipiente, junto con una pluralidad de partículas fluorescentes 15a en la misma, mostradas en el monitor 14. Las partículas fluorescentes 15a se cuentan y el recuento también se muestra en la parte inferior 16 del monitor 14.

El recipiente 3 de generación de imágenes se moldea en una pieza de resina de poliestireno, vidrio o resina acrílica transparentes, preferiblemente resina de poliestireno. Insertados en el recipiente 3 de generación de imágenes se encuentran una muestra de preparación de plaquetas (por ejemplo, 100 microlitros), un producto químico (Tritón X) que disuelve el citoplasma de las plaquetas y de los leucocitos, y un colorante fluorescente (yoduro de propidio) para colorear los núcleos de los leucocitos. A continuación, el recipiente 3 de generación de imágenes se somete a separación centrífuga en una centrífuga (no mostrada), haciendo que los núcleos de los leucocitos se recojan en la porción de fondo del recipiente 3 de generación de imágenes. Todos los núcleos de los leucocitos se pueden recoger en la porción 3' de fondo del recipiente 3 de generación de imágenes aplicando una fuerza centrífuga prescrita.

A continuación, se utiliza la cubierta 4 para tapar el recipiente 3 de generación de imágenes, en el cual se recogen los núcleos de leucocitos coloreados con un colorante fluorescente en la porción de fondo 3' del mismo, y el recipiente 3 de generación de imágenes se monta en el aparato de generación de imágenes. Para formar las imágenes, se activa la fuente 1 de luz láser, produciendo un haz de láser que es difundido por la placa de difusión 2 y proyectado en la porción de fondo 3' del recipiente 3 de generación de imágenes. Puesto que los núcleos de los leucocitos en la porción de fondo 3' del recipiente 3 de generación de imágenes han sido coloreados por un colorante fluorescente, cuando son iluminados por el haz de una luz de excitación emiten luz fluorescente que tiene una frecuencia de aproximadamente 600 nm. Esta es recogida a través de la cubierta 5 de vidrio, la lente de objetivo 6, del espejo 7 y el filtro de barrera 8 debajo del recipiente 3 de generación de imágenes. El filtro de barrera 8 solamente transmite luz que tenga la frecuencia de la luz fluorescente, permitiendo que la luz de frecuencias dañinas sea bloqueada en este punto.

El haz de láser se proyecta solamente en la porción de fondo del recipiente, iluminando, de manera efectiva, los leucocitos recogidos allí. Por lo tanto, incluso si hay colorante fluorescente flotando en la solución en el recipiente 3 de generación de imágenes, se puede impedir que el colorante fluorescente forme una luz de fondo dañina, lo cual permite que se obtengan las imágenes con un contraste mejorado.

Con referencia a la figura 2, las imágenes de las partículas fluorescentes obtenidas de esta manera por la cámara CCD 9, son hechas pasar, por medio de una línea de señal 10, a un dispositivo 11 de captura de vídeo de un ordenador 12, en donde son tratadas por un circuito 13 de proceso de imágenes para contar el número de leucocitos 15a.

De acuerdo con la disposición descrita más arriba, el haz de láser se proyecta solamente sobre la porción de fondo del recipiente de generación de imágenes y no ilumina la parte superior del recipiente. Como se muestra en la figura 3, el efecto de iluminar solamente la porción de fondo se puede mejorar proporcionando una cubierta 20 que apantalle todas las partes distintas de la porción de fondo del haz de luz iluminante.

En lugar de la disposición de cubierta de la figura 3, se puede utilizar una disposición tal como la que se muestra en la figura 4. En esta disposición, se utiliza una máscara 21 que tiene una abertura central 21a con forma de ranura. El haz de láser de la fuente 1 de luz láser pasa a través de la abertura 21a, asegurando que solamente se ilumina la porción de fondo 3' del recipiente 3 de generación de imágenes.

Un haz de láser lineal o con forma de línea podría iluminar más de la porción de fondo del recipiente de generación de imágenes que un haz con forma de punto. La figura 3 muestra el tipo de disposición que se podría utilizar en un caso de este tipo, conformándose el haz de láser 30 para que sea un haz plano 33 haciéndolo pasar a través de lentes cilíndricas 31 y 32, y utilizándose el haz plano 33 para iluminar la porción de fondo 3' del recipiente 3 de generación de imágenes.

La figura 6 muestra otra disposición, en la cual se utiliza un espejo de barrido 40 para desviar el haz de láser 30, que pasa a través de una lente 41 para barrer la porción de fondo del recipiente de generación de imágenes.

La figura 7 muestra otra disposición que utiliza un haz de fibras ópticas. En esta disposición, las fibras en el extremo de entrada 50, desde el cual entra el haz de láser, se disponen en una configuración redondeada, mientras que, en el extremo de salida 51, las fibras se disponen en una línea recta, estando dispuesto el extremo de salida 51 en la proximidad de la porción de fondo del recipiente de generación de imágenes, para que se ilumine la porción de fondo del mismo.

En cada una de estas realizaciones, solamente se ilumina la porción de fondo del recipiente, o la proximidad de la misma, por un haz con forma de banda, haciendo posible de esta manera la obtención de imágenes de las partículas fluorescentes, con buen contraste. Además, si se utiliza una placa de difusión 2 para difundir el haz de láser, se permite que la porción de fondo del recipiente de generación de imágenes sea iluminada uniformemente.

La figura 8 muestra una realización preferida del recipiente 3 de generación de imágenes, preferiblemente formada como una sola pieza moldeada de resina de poliestireno. El recipiente tiene una porción superior en forma de anillo 3a, que tiene una muesca 3f con propósitos de posicionamiento. El recipiente 3 de generación de imágenes comprende una porción cilíndrica 3b, que se extiende verticalmente hacia abajo desde la porción superior 3a, hacia una porción 3b de diámetro pequeño, a través de una poción inclinada 3c. Se forma una porción de bloque 3e, sustancialmente cuadrada o rectangular, en el extremo inferior. Un lado de la porción 3e de bloque se dispone para que sea iluminado por un haz de láser, indicado por la flecha. Cuando han de formarse imágenes de partículas fluorescentes, el recipiente 3 de generación de imágenes se une al aparato, utilizándose la muesca 3f para situar el recipiente 3 de generación de imágenes. Cuando el recipiente 3 se ha ajustado en su posición, una cara plana de la porción 3e de bloque es perpendicular a la dirección de la iluminación del haz de láser, formando la superficie de entrada del haz incidente. De esta manera, el haz de láser ilumina solamente la porción de fondo 3c del recipiente 3 de generación de imágenes.

La porción de fondo también puede ser iluminada por una disposición tal como la que se muestra en la figura 9, en la cual la porción 3e de bloque tiene una sección transversal redonda, y se dispone una lente 60 cilíndrica negativa en el lado desde el cual se ilumina la porción de fondo por medio del haz de excitación.

En la disposición que se muestra en la figura 10, se utiliza una cubierta 70 para apantallar del haz de láser, las partes del recipiente 3 de generación de imágenes distintas de la porción de fondo. En este caso, se puede omitir la cubierta 20, mostrada en la figura 3, en el lado del aparato de generación de imágenes. La función de cubierta o pantalla se puede realizar aplicando un recubrimiento de pantalla de luz al recipiente, o pintando el recipiente con un color apantallante.

Se debe entender que, aunque la invención se ha descrito en lo que antecede con referencia a leucocitos como partículas fluorescentes, la invención no está limitada a ellos, sino que se puede aplicar a otras partículas fluorescentes.

Como se describe en lo que antecede, de acuerdo con la presente invención, las partículas fluorescentes de las que han de formarse imágenes se recogen en la porción de fondo del recipiente de generación de imágenes. Parte de la superficie exterior de la porción de fondo es una superficie de entrada de luz de excitación, de manera que solamente la porción de fondo del recipiente está iluminada por el haz de láser de excitación. Por lo tanto, la luz de fondo se reduce, haciendo posible obtener imágenes de alto contraste de las partículas fluorescentes contenidas en el
recipiente.

Claims (12)

1. Un método para formar imágenes de partículas fluorescentes que están coloreadas con un colorante fluorescente, estando contenidas las partículas en un fluido y conteniendo el fluido, también, el colorante fluorescente, comprendiendo el método:

disponer el fluido en un recipiente (3); y

recoger las partículas fluorescentes en una porción (3') de fondo de un volumen encerrado por el recipiente, caracterizado porque, además, comprende:

guiar una radiación de excitación para que excite las partículas fluorescentes a través del recipiente, en el que dicha radiación es guiada en el volumen encerrado por el recipiente, en una dirección desde el lado del recipiente directamente y solamente a través de la citada porción de fondo, de manera que el colorante fluorescente dispuesto en cualquier parte del recipiente distinta de la porción de fondo no quede sustancialmente excitado, y

medir la radiación de las partículas fluorescentes desde debajo de la porción de fondo.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la radiación de excitación se guía a través de la porción de fondo del volumen encerrado por el recipiente, en una dirección sustancialmente perpendicular a un eje longitudinal del recipiente.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que se proporciona un miembro de apantallamiento (20, 70) para apantallar de la radiación de excitación, todas las partes del recipiente distintas de la porción de fondo.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la radiación de excitación es un láser (1).

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la radiación de excitación es un haz que tiene una sección transversal rectangular.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la radiación de excitación se guía a través de una pluralidad de fibras ópticas (50) antes de ser guiada a través de la porción de fondo, estando dispuestos los extremos de las fibras ópticas (51), por los cuales sale la radiación de excitación, en una línea recta.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la radiación de excitación es difundida antes de ser guiada a través de la porción de fondo.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que una sección transversal tomada por un eje longitudinal del recipiente de una región del recipiente que contiene la porción de fondo, comprende una superficie de fondo y dos superficies laterales;

y en el que la radiación de excitación se guía a través de la porción de fondo de manera que entre en la porción de fondo a través de una primera de las superficies laterales y salga de la porción de fondo a través de una segunda de las superficies laterales.

9. Un recipiente (3) para utilizarse en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, formándose las imágenes de las partículas fluorescentes desde debajo de la porción de fondo (3'), en el que una parte lateral de la superficie exterior del recipiente que encierra la porción de fondo está formada para que sea la superficie de entrada de la luz de excitación.

10. Un recipiente de acuerdo con la reivindicación 9, en el que partes del recipiente distintas que las que se encuentran en la proximidad de la porción de fondo, están cubiertas por un miembro de apantallamiento (20, 70).

11. Un recipiente de acuerdo con la reivindicación 9, en el que una región del recipiente que encierra a la porción de fondo tiene una sección transversal horizontal cuadrada o rectangular, y un lado de la misma forma la superficie de entrada de la luz de excitación.

12. Un recipiente de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la porción de fondo tiene una sección transversal horizontal redonda.