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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein Vorrichtungen und Verfahren
zum Scannen und Abbilden von Gegenständen, und insbesondere auf
Bilder, die aus teilweise Unterbildern von Gegenständen, wie
z.B. Zellen aus biologischen Flüssigkeiten, die
in einer zweidimensionalen Ebene verteilt sind, erhalten werden.
Die von der Erfindung bereitgestellte Scanning- und Darstellungstechnik
ist besonders für
die Bilddarstellung von Zellen geeignet, die mit magnetischen Mitteln
ausgerichtet werden und mit einem digitalisierten optoelektronischen
Mittel untersucht werden.
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Hintergrund
der Erfindung
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Durch
die Erfindung der Mikroskopie durch Antoni van Leeuwenhoek im Jahre
1674 wurde die Visualisierung von mikroskopischen Entitäten wie Zellen
möglich.
Die Einführung
von Farbstoffen, die unterschiedliche Bestandteile von Zellen anfärbten, durch
Paul Ehrlich ca. zweihundert Jahre später, kann in Kombination mit
der Lichtmikroskopie als erster Schritt in der neuen Ära der Zellanalyse
angesehen werden. Verbesserungen bei der Zellmarkierungstechnik
und den relevanten Instrumenten, die die unterschiedlich markierten
Zellen identifizieren und differenzieren können, haben unsere Fähigkeit zur
Erforschung der Welt der Zellbiologie erheblich verbessert. In den
letzten 25 Jahren ersetzen automatische Blutzellzähler die
manuelle Untersuchung von zytochemisch angefärbten Blutausstrichen. Zu den
Kriterien für
die Zellklassifizierung durch morphometrische Mittel zählten Parameter
wie z.B. das Verhältnis
von Kern zu Zytoplasma, Größe und Form der
Zelle und des Kerns, Anzahl und Größe von zytoplasmischen Körnchen.
Da Zellen bei der Reifung ihr morphologisches Erscheinungsbild allmählich verändern, entsteht
bei der Zuordnung der Zellen mehr Unsicherheit durch erhebliche
Schwankungen zwischen einzelnen Beobachtern. Morphologische Veränderungen
im Zusammenhang mit bösartigen
Veränderungen
können
mit der Zellerscheinung im Reifungsprozess in Verbindung gebracht
werden und abnormale Häufigkeiten
von atypischen Zellen dienen häufig
als Kriterium für
die Zuordnung dieser Zellen als bösartig.
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Verbesserungen
in der Zellklassifizierung stammen aus der Identifikation auf Immunophänotyp-Basis.
Die frühen
Techniken, wie z.B. Bildung von Rosetten von Schaferythrozyten um
T-Lymphozyten wurden durch flusszytometrische Analyse von Zellen, die
mit fluoreszierenden Antikörpern
zur Erkennung der spezifischen Zelloberfläche oder intrazellulären Antigenen
markiert waren, ersetzt. Die multiparametrische Flusszytometrieanalyse
hat die Fähigkeit
zum Zählen
und Klassifizieren von nachgewiesenen Ereignissen auf Basis von
Größe und Anfärbeeigenschaften
signifikant verbessert, aber nachgewiesene Ereignisse können nicht
weiter diskriminiert werden, wie z.B. Zellen durch morphometrische
Mittel. Die vorliegenden Verfahren und Vorrichtungen, die nach diesem
Grundsatz arbeiten, werden zur Diagnose und Klassifizierung einer
Vielzahl von unterschiedlichen Erkrankungen wie z.B. Leukämie und
Lymphome oder zur Verfolgung des Verlaufs von Krankheiten, wie z.B.
AIDS, eingesetzt. Mit besser werdender Technologie wurden mehr Informationen
erhalten, die wiederum zu einer größeren Nachfrage nach Ausweitung
der Sensitivität
und Spezifität
der Nachweismethoden für
seltene Zielspezies führten.
Ein Beispiel für
eine Anwendung, die noch verbesserungswürdig ist, ist die Identifizierung
und Zählung von
zirkulierenden Karzinomzellen epithelialen Ursprungs im Blut von
Krebspatienten, die in Häufigkeiten
von weniger als eine Karzinomzelle pro ml Blut vorliegen können. Mit
einer Kombination aus Epithelzell-Anreicherung mit magnetischen
Mitteln und Analyse mit multiparametrischer Flusszytometrie wurden signifikante
Unterschiede in der Anzahl „zirkulierender
Tumorzellen" zwischen
gesunden Personen und Patienten mit Brustkrebs gefunden (Racila
et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95, 4589-4594, 1998). In mehreren
Studien wurden diese „zirkulierenden
Tumorzellen" (CTC)
als Ereignisse mit den folgenden Eigenschaften definiert: positiv
für den
Epithelzellmarker Cytokeratin, negativ für den Leukozytenmarker CD45,
positive Anfärbung
mit einem Nukleinsäure-Farbstoff
und Lichtstreueigenschaften, die mit Zellen kompatibel sind. Morphometrische
Bestätigungen der
nachgewiesenen Ereignisse wie Zellen und weitere molekulare Hinweise
fehlen aber bei Flusszytometrie-Methoden, aber es besteht ein deutlicher
Bedarf danach, um sicherzustellen, dass die nachgewiesenen seltenen
Ereignisse tatsächlich
Tumorzellen sind, die von einem Primärtumor stammen. Zur Reduzierung
von subjektiven Fehlern bei der Zellklassifizierung zwischen verschiedenen
Bedienern bei manuellen Methoden wurden automatische Bildanalysesysteme
eingeführt,
aber diesen Systemen des Standes der Technik ohne vorhergehende
Zellanreicherungsschritte fehlt es nach wie vor an inhärenter Sensitivität. Mehrere
automatische Zelldarstellungssysteme wurden beschrieben oder sind
im Handel für
die Zellanalyse erhältlich.
Das von Chromavision entwickelte System ACISTM oder
automatisches Zelldarstellungssystem (Douglass et al., US-Patent 6,151,405)
arbeitet mit kolorimetrischer Mustererkennung durch mikroskopische
Untersuchung vorbereiteter Zellen nach Größe, Form, Farbton und Anfärbeintensität gemäß Beobachtung
unter einem automatischen computergesteuerten Mikroskop und/oder durch
visuelle Untersuchung durch einen Mediziner. Das System untersucht
Zellen auf Mikroskop-Objektträgern
und wurde für
Gewebeschnitte konzipiert. Das System SlideScanTM oder
MDSTM von Applied Imaging Corp. (Saunders
et al., US-Patent 5,432,054) wird als automatisches intelligentes
Mikroskop und Bilddarstellungssystem beschrieben, das Zellen oder "Objekte" nach Farbe, Intensität, Größe, Muster
und Form nachweist, wonach eine visuelle Identifizierung und Klassifizierung
erfolgt. Im Gegensatz zum ACIS-System
hat dieses System die Fähigkeit
zum Nachweis von fluoreszierenden Markern, wodurch die Fähigkeiten
erweitert werden. US-A-5 428 451 offenbart ein Verfahren und ein
Gerät,
bei dem Teilchen in einer Probenflüssigkeit gezählt werden,
indem die Flüssigkeit
durch eine optische Zelle geleitet wird, die vorzugsweise die Form einer
Magnetteilchentrennvorrichtung hat. Ein Bild der Teilchen wird über ein
optisches Linsensystem auf eine CCD-Anordnung projiziert. Signale
der einzelnen CCDs werden von einem Computer verarbeitet, um Informationen über die
Anzahl Teilchen, die durch die optische Zelle laufen, zu liefern.
Die Vorrichtung in dieser Literaturstelle hat keine Kamera, die
relativ zur Probenkammer beweglich ist, und sie hat keinen Codierer,
der die x-y-Position der Zielkörper
ablesen kann.
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Diese
und andere derzeit verfügbaren
Methoden besitzen aber keine ausreichende Sensitivität für die genaue
Klassifizierung und Typisierung von seltenen Ereignissen, wie z.B.
zirkulierenden Tumorzellen in Blut. Deshalb will die vorliegende
Erfindung die oben erwähnten
Methoden verbessern und ein einfaches und wirksames Mittel und Methoden
für die automatische
Darstellung von Objekten bereitstellen, die beispielsweise in Verbindung
mit hochsensitiver Immunophänotypisierung
verwendet werden kann, um den Nachweis, die Zählung und die genaue Klassifizierung
von seltenen Zielspezies, wie z.B. zirkulierenden Tumorzellen in
Blut oder anderen Flüssigkeiten
zu gestatten.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt Vorrichtungen und Verfahren bereit,
die die Anwendung neuer Bilddarstellungstechniken mit Systemen wie
dem Cell Tracks Zellanalysensystem wie von Tibbe et al. (Nature
Biotech. 17, 1210-13, 1999) beschrieben gestatten. Die von Tibbe
und in der Offenbarung der vorliegenden Erfindung beschriebenen
Vorrichtungen und Methoden können
auch für
andere Zielobjekte verwendet werden. Die primäre Anwendung ist aber die schnelle
immunmagnetische Auswahl von seltenen Zellen aus Blut mit anschließender automatischer
Ausrichtung der isolierten Zellen und automatische Bildanalyse.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden nach der magnetischen Sammlung und Anreicherung
aus Blut die magnetisch markierten Zellen entlang ferromagnetischen
Linien von Nickel (Ni) ausgerichtet und von einem Laser, der mit
einer konventionellen Objektivlinse fokussiert wird, beispielsweise
von einem Compact Disc Player; abgetastet. Da die Zellen selektiv mit
einem oder mehr fluoreszierenden Markern angefärbt wurden, können die
gemessenen Fluoreszenzemissionen und -intensitäten zur Identifizierung oder Klassifizierung
des Zelltyps verwendet werden.
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Das
erfindungsgemäße System
benötigt kein
Flüssigkeitsströmungssystem.
Die durch die winkelförmigen
Magneten erzeugten Magnetfelder in der nähe der Nickellinien halten
die magnetisch markierten Zellen in fixen Positionen. Dadurch kann
zu den nachgewiesenen Ereignissen nach Messung der Fluoreszenzemissionen
und -intensitäten
zurückgegangen
werden, um eine umfassendere Analyse zur weiteren Identifizierung
der nachgewiesenen Ereignisse durchführen zu können. Die Bilder dieser Ereignisse
können
mikroskopisch betrachtet werden und unabhängige morphometrische Kriterien
können
zur Identifizierung der Ereignisse als tatsächliche Zellen angelegt werden.
Gemäß der vorliegenden
Erfindung stellt das neuartige Scanning- und Darstellungsverfahren
somit ein verbessertes diagnostisches System für den Nachweis, die Klassifizierung
und die Zählung
von Zellen bereit, das ein effizientes automatisches Mittel zum
Sammeln und Ausrichten immunmagnetisch markierter Zielzellen aus
Körperflüssigkeiten
umfasst und bei dem die so gesammelten Zellen auch mindestens eine
immunspezifische fluoreszierende Markierung tragen, die Zielzellen
von Nichtzielzellen, die mit anderen fluoreszierenden Markern gekennzeichnet
sind, unterscheidet. Die Darstellungen der gesammelten und ausgerichteten Zellen
werden aus individuellen digitalisierten Unterbildern und deren
x-y-Koordinaten rekonstruiert, wodurch volle kombinierte Darstellungen
der Objekte erhalten werden und eine verbesserte Klassifizierung der
nachgewiesenen Objekte und Zielereignisse möglich ist.
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Erfindungsgemäß wurden
die neuen Laserscanning- und Darstellungstechniken in ein System, wie
z.B. dem Cell Tracks System, integriert, um Fluoreszenzbilder guter
Qualität
zu erhalten. Die hierin beschriebenen und in den Ansprüchen enthaltenen Entdeckungen
haben gegenüber
den Systemen und Verfahren des Standes der Technik zu einer großen Verbesserung
bei dem Nachweis, der Zählung
und der Klassifizierung von seltenen Zellen geführt. Ein effizienter Nachweis
von Zellen, die mit geringer Häufigkeit
vorkommen, sogenannte seltene Ereignisse, erfordert minimale Behandlung
der Proben, damit keine Zellen verloren gehen. Ferner sollte das
Volumen, aus dem die seltenen Zellen getrennt und angereichert werden,
möglichst
groß sein,
um die Nachweissensitivität
zu erhöhen.
Mit der Entwicklung und Anwendung der offenbarten neuen Techniken
können
nun Fluoreszenzbilder spezifischer Ereignisse erhalten werden, die
zu äußerst genauer
Identifizierung führen,
so dass das erfindungsgemäße System ein
wirkungsvolles Werkzeug für
den Nachweis seltener Ereignisse in Körperflüssigkeiten ist.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1
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Schematische
Darstellung des Cell Tracks Systems unter Verwendung einer bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung. Die für
die Darstellung wichtigen Komponenten sind fett gedruckt gezeigt.
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2
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a)
Bild des Leuchtbrennflecks, wie er zum Scannen von Zellen verwendet
wird; die kürze
Achse ist 4 μm
lang und die lange Achse ist 15 μm
lang. Die gepunkteten Linien weisen auf die Position der Ni-Linien
hin. b) Schaubild der summierten Pixelintensitäten in x-Richtung wie in 2a zu
sehen.
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3
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Schematische
Darstellung der Bildrekonstruktionsmethode. Die nachgewiesenen Ereignisse oder
Zellen werden mit dem Laser abgetastet, indem das mit einem Codierer
ausgerüstete
Gestell bewegt wird. Die CCD-Kamera erfasst die individuellen Unterbilder
und speichert sie zusammen mit den entsprechenden Codiererpositionen,
die die x-y-Koordinaten
des Gestells darstellen, in einem Computerspeicher. Am Ende des
Scanvorgangs werden die Unterbilder anhand der Codiererwerte, die
auf die Anzahl Pixel, um die die anschließenden Unterbilder relativ
zueinander verschoben werden sollten, zurückgerechnet werden, zu einem
vollen rekonstruierten Bild des Objekts kombiniert. Summierung der
verschobenen Unterbilder ergibt das vollständige rekonstruierte Fluoreszenzbild
der Zelle.
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4
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- a) Fluoreszenzsignale, die beim Scannen einer homogenen
Farbstoffschicht erfasst werden.
- b) Zwei Schaubilder der Summen der Fluoreszenzintensitäten in x-
und y-Richtung für
den in 4a abgetasteten Farbstoff.
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5
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- a) Grafische Darstellung des vom Objektiv erfassten
Raumwinkels als Funktion der Position in der Kammer. Die numerische
Blende (NA) des CD-Objektivs in Luft ist 0,45 mit einer resultierenden
effektiven NA von 0,34 in der Kammer auf dem Gestell. Diese NA entspricht
einem Raumwinkel (⎕) von 0,37 sr. Der Abstand der Nickellinien
beträgt
10 μm. Der
Kreis stellt ein ausgerichtetes Objekt mit einem Durchmesser von
7 μm dar. Der
wirksame Sammelwinkel von zwei Punkten ist in der Figur gezeigt.
- b) Das Schaubild zeigt die relative Summe der berechneten Raumwinkel
aus 4a in z-Richtung.
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6
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- a) Streudiagramm von CD45 Antikörper-APC/Cy7 versus
CAM5.2 Antikörper-APC
Fluoreszenz von SKBR3 Spike-Zellen
in Ganzblut, erfasst und ausgerichtet durch EpCAM antikörper-markierte
magnetische Nanoteilchen. Einige repräsentative Unterbilder der gemessenen
Ereignisse in Region 1, der SKBR3-Zellregion, und des breiten, die Trümmer enthaltenden
Bandes, sind gezeigt. Region 2 ist die Region, in der Leukozyten
erscheinen würden,
wenn sie vorhanden wären,
und entlang der Ni-Linien
ausgerichtet wären.
b) Vollbild einer SKBR3-Zelle
mit ihren entsprechenden gemessenen Fluoreszenzsignalen.
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7
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Streudiagramm
von Oxazin 750 Fluoreszenz versus CD4-APC Fluoreszenz von weißen Blutkörperchen
in Ganzblut, erfasst und ausgerichtet durch CD45-markierte magnetische
Nanoteilchen. Einige repräsentative
Bilder der Monozyten- und Granulozytenregionen sind gezeigt.
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8
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Zeitaufgelöstes Bild
von mit Oxazin 750 angefärbten,
in CD45 Ferroflüssigkeit
erfassten Leukozyten in Ganzblut unter Verwendung des Cell Tracks Systems:
die Zeitspanne beträgt
0 bis 120 Sekunden in Intervallen von 20 Sekunden.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung wird nun bezugnehmend auf bevorzugte Ausführungsformen
in der folgenden Beschreibung weiter beschrieben:
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Positionsangaben:
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Bevor
ein Vollbild eines zuvor gemessenen Ereignisses angefertigt werden
kann, wobei ein Vollbild definiert ist als rekonstruiertes Bild,
das aus kombinierten zahlreichen digitalisierten Unterbildern besteht,
muss das Ereignis bezugnehmend auf 1 auf der
Probekammer in 1 erneut lokalisiert werden,
wofür räumliche
Informationen wie z.B. x-y-Probekoordinaten für jedes Unterbild benötigt werden. Um
Positionsangaben in der y-Richtung zu erhalten, ist das Gestell,
das sowohl die Magneten als auch die Probekammer bewegt, mit einem
Codierer mit einer Auflösung
von 0,2 μm
ausgerüstet.
Die Linienzahl für ein
Unterbild eines bestimmten Ereignisses wird gemessen, um Positionsangaben
in x-Richtung zu erhalten. Die Codierersignale werden zusammen mit der
Linienzahl im Speicher gespeichert und mit den gemessenen PMT-Signalen
für jedes
Unterbild gekoppelt. Auf diese Weise wurden alle gemessenen Unterbild-Ereignisse mit einer
x-y-Position der Probe in Verbindung gebracht und indexiert.
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Um
zu der Position zurückzukehren,
an der ein bestimmtes Ereignis oder Unterbild gemessen wurde, wird
der Laserbrennpunkt um mehrere Linien entsprechend der aktuellen
Linienzahl minus der Linienzahl, bei der das bestimmte Ereignis
gemessen wurde, verschoben. Gleichzeitig bewegt sich das Gestell
in y-Richtung zur bestimmten Position des Codierers. Ein alternatives
Verfahren zum Erhalt von Codierersignalen ist es, den unten beschriebenen Ni-Linien
Profile hinzuzufügen,
die Signale zur Aufzeichnung der Position liefern. Dadurch kann
ein wesentlich einfacheres und preiswerteres Gestell zur Bewegung
der Probe verwendet werden.
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Darstellungsverfahren:
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Das
in 1 gezeigte System besteht aus einer monochromen
Standard-CCD-Kamera mit einer Bildfrequenz von 25 Hz und mit manueller
Verstärkungsanpassung.
Durch Einführen
des entfernbaren Spiegels in den Lichtstrahl wird das fluoreszierende
Licht, das vom CD-Objektiv
erfasst wurde, von der sphärischen
achromatischen Linse (f = 150 mm) auf die CCD anstelle der Lochblende
fokussiert. Das CD-Objektiv besteht aus einer einzelnen asphärischen
Linse, die optimiert wurde, um eine diffraktionsbegrenzte Punktgröße für eine Wellenlänge von 780
nm wie bei CD-Spielern verwendet zu erhalten. Die NA der Linse ist
0,45 und der Linsendurchmesser beträgt 4 mm. Ein Bild des Brennflecks
wie er zum Abtasten der Zellen verwendet wird, ist in 2a zu sehen. Die elliptische Form des
Bilds wird mit den beiden zylindrischen Linsen erhalten, die in
einem etwas größeren Abstand
als die doppelte individuelle Brennweite angeordnet sind. Die kurze
Achse dieses elliptischen Brennpunkts wird auf 4 μm (FWHM)
gesetzt, d.h. kleiner als der Durchmesser einer Zelle, um zu vermeiden,
dass mehr als eine Zelle sich jeweils in einem Brennpunkt befinden
kann. Die längere
Achse ist größer als
der Ni-Linienabstand. Das auf die Ni-Linien gerichtete Licht wird
reflektiert und als Feedback-Kontrolle verwendet. Die Ni-Linien
sind auf einem 0,5 mm dicken Glassubstrat vorhanden. Fokussierung
des Laserlichts (635 nm) auf die Ni-Linien durch das Glassubstrat
mit dem CD-Objektiv, das für
diese Anwendung nicht optimiert wurde, führt zu einem nichthomogenen
Laserbrennpunkt.
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Das
Intensitätsprofil
des Laserbrennpunkts ist nicht nur nicht-homogen, da der Durchmesser
einer Zelle in der Regel zwischen 5 und 20 μm liegt, sondern es ist auch
kleiner als der Zelldurchmesser. Eine gleichmäßige Beleuchtung mit einem
Laserbrennpunkt, der kleiner ist als der Zelldurchmesser und ein
nicht-homogenes Intensitätsprofil
aufweist, kann aber erreicht werden, wenn der Laser über die Zelloberfläche geführt wird,
indem eine optische Komponente des Strahls bewegt wird, wie das
bei dem Laser-Scanning-Mikroskop der Fall ist (Corle, TR, Confocal
Scanning Microscopy and Related Imaging Systems, Academic Press,
NY, 1995). Im erfindungsgemäßen System
würde diese
Methode zum Feedback-Verlust führen,
was wiederum zum Verlust von Positionsangaben in x-Richtung führen würde. 2b zeigt das Intensitätsprofil, das nach Addieren der
einzelnen Pixelintensitäten
des Brennfleckbilds aus 2a in y-Richtung
erhalten wurde. Die gepunkteten Linien weisen auf einen Ni-Linienabstand von
10 μm hin.
Das summierte Intensitätsprofil
zeigt eine Intensitätsschwankung
von ±6% über den
Linienabstand. Die Bewegung einer Zelle in y-Richtung durch diesen
Brennpunkt führt
dazu, dass jedes Teil der Zelle fast gleich beleuchtet wurde, nachdem
es durch den Laserbrennpunkt gelaufen ist. Diese Methode wird verwendet,
um ein Fluoreszenzvollbild einer ausgerichteten Zelle hoher Qualität auf Basis
der Summierung einzelner Unterbilder zu erhalten.
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Magnetisches Gestell und
Kammer:
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Die
Magneten und die Kammer sind bereits auf einem Gestell angeordnet,
das die Zellen durch den Brennpunkt in y-Richtung bewegt. Um ein
Vollbild einer bestimmten Zelle zu erhalten, wird der Laserbrennpunkt
zu der Linie verschoben, an der das spezielle Unterbildereignis
gemessen wurde, und das Gestell wird in y-Richtung mit einer Geschwindigkeit
von 10 mm/s zu entsprechenden Codiererposition bewegt. Das Gestell
wird auf eine Geschwindigkeit von 5 μm/s verlangsamt, wenn der Abstand
zur Zellposition 25 Mikron beträgt.
Während
das Gestell bei dieser langsamen konstanten Geschwindigkeit in y-Richtung
bewegt wird, wird die Zelle vom Laserbrennpunkt abgetastet und das
Fluoreszenzsignal für jedes
Unterbild wird auf der CCD erfasst (3).
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Eine
Framegrabber-Karte erfasst die CCD-Unterbilder bei 25 Hz und diese
werden gespeichert. In jedem darauffolgenden Unterbild wird ein anderer
Teil der Zelle beleuchtet, weil der Laserbrennpunkt in Abtastrichtung
kleiner ist als der Zelldurchmesser. Zusammen mit der Erfassung
des Unterbilds wird die Codiererposition abgelesen und beide Werte
werden im Computerspeicher gespeichert. Insgesamt werden 40 Mikron
abgetastet, entsprechend 200 erfassten Unterbildern mit jeweils 150×250 Pixel,
die im Durchschnitt um 0,2 μm
relativ zueinander verschoben werden. Dies entspricht einer Verschiebung
von 2,63 Pixel auf der CCD-Oberfläche. Anhand der Codiererwerte
werden die erfassten Unterbilder über eine Anzahl Pixel verschoben, entsprechend
dem Unterschied in den zugeordneten Codiererwerten × 2,63,
die dann summiert oder kombiniert werden. Dies führt zu einem rekonstruierten Vollbild
der Zelle wie in 3 schematisch zu sehen ist.
Die Auflösung
des Unterbilds in y-Richtung wird durch die Codiererauflösung, d.h.
0,2 μm bestimmt. Die
Auflösung
in x-Richtung wird durch die Anzahl Pixel in dem in x-Richtung aufgezeichneten
Bild bestimmt und sie beträgt
0,07 μm
pro Pixel. Beide Auflösungen
sind kleiner als die Diffraktionsgrenze. Daher ist es für den Fachmann
verständlich,
dass die letztendliche Bildauflösung
nicht vom Codierer oder der Kamera bestimmt wird, sondern von der
Bildgebungsoptik.
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Homogenität der Beleuchtung:
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Die
Homogenität
der Beleuchtung im erfindungsgemäßen Verfahren
wurde mit einer dünnen Schicht
einer konzentrierten fluoreszierenden Farbstofflösung geprüft, die in der Ebene platziert
wurde, in der die magnetisch markierten Zellen zwischen den Ni-Linien
mit einem Abstand von 10 μm
ausgerichtet werden würden.
Die Farbstoffschicht wurde mit einer Geschwindigkeit von 5 μm/Sekunde
wie oben beschrieben abgetastet und dargestellt. Die sequentiell
erfassten Unterbilder sind in 4a gezeigt.
Für eine
gleichmäßige Schicht
des fluoreszierenden Farbstoffs würde man ein homogenes fluoreszierendes
Bild erwarten, wenn die Beleuchtung gleichmäßig wäre. Das erhaltene Bild ist
in 4b gezeigt. Die beobachteten Signale,
die in Intensitätseinheiten
entlang der mittleren Spur in y-Richtung des
Bilds gemessen wurden, schwankten um ±7%. Eine Erklärung für diese
Schwankung kann die Nicht-Homogenität der Farbstoffschicht
sein, die einen Einfluss auf das ausgesendete und erfasste Fluoreszenzlicht
hat. Eine zweite Erklärung
ist, dass das Gestell sich nicht mit konstanter Geschwindigkeit
bewegt hat. Die Position des Gestells ist nicht mit der Bildfrequenz
der Kamera und der Framegrabber-Karte synchronisiert, aber die Bilder
wurden unabhängig von
der Geschwindigkeit und Position des Gestells in y-Richtung bei 25 Hz
erfasst. Wenn sich das Gestell schneller als 5 μm/Sekunde in einer bestimmten
Region bewegt, würden
weniger Bilder dieser Region erfasst werden, so dass die Intensität insgesamt niedriger
wäre. Die
Schwankung der Geschwindigkeit des Gestells wurde aber gemessen
und erwies sich als viel geringer als die beobachtete Schwankung
in der gemessenen Bildintensität.
Die scheinbare Nichtgleichförmigkeit über die
mittlere Spur muss deshalb mit der Nichthomogenität der Farbstoffschicht
zusammenhängen.
Das Intensitätsprofil
in x-Richtung oder lotrecht zu den Ni-Linien und der Abtastrichtung
ist ebenfalls in 4b dargestellt. Die
Intensität
der Unterbilder in dieser Richtung hat ein Maximum, das zwischen
den Ni-Linien zentriert
ist und es wird geringer in der Nähe der Ränder der Ni-Linien. Die Ni-Linien
behindern das ausgesendete Fluoreszenzlicht, was zu einem kleineren
Sammelwinkel und wiederum zu einer kleineren effektiven NA des Objektivs
führt.
In 5a wird der wirksame Raumwinkel,
der vom Objektiv nachgewiesen wird, als Funktion der Position in
der Kammer berechnet. Die Simulation wurde mit einem Linienabstand
von 10 μm und
einer Tiefe oder Schichtdicke von 14 μm durchgeführt. Das Schaubild in 5b zeigt die Summe der berechneten Raumwinkelwerte
aus 5a in z-Richtung, so dass ein
Maß für die gesammelten und
gemessenen Intensitäten
als Funktion der x-Position erhalten wird. Das beobachtete berechnete
Intensitätsprofil
entspricht den gemessenen Intensitäten für die gleichmäßige Farbstoffschicht.
Die effektive NA von Objekten in der Nähe der Ni-Linien ist größtenteils
verringert, so dass sich eine nicht-gleichmäßige erfasste Intensität in x-Richtung ergibt,
obwohl eine gleichmäßige Beleuchtung
verwendet wurde. Objekte mit einem Durchmesser unter 7 μm, wie durch
den Kreis in 5a angedeutet, werden
aufgrund der Abschirmwirkung der Ni-Linien ohne Intensitätsverlust
abgebildet, da die effektive NA in dieser Region durch die Ni-Linien
reduziert wird.
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Zelldarstellung:
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Racila
et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. 95, 4589-94, 1998) beschrieben ein
Verfahren zum Trennen von Brustkarzinomzellen von Blut mit einer
Reihenfolge von Schritten, einschließlich immunmagnetischer Markierung
und anschließender
Immunophänotypisierungsanalyse
in einem Flusszytometer. Im erfindungsgemäßen System können die
Zellen immunophänotypisiert
werden und ihre Identität
kann durch Bereitstellung eines Fluoreszenzbildes bestätigt werden.
Das Verfahren wurde durch den Nachweis von gezüchteten Zellen der Brustkrebs-Spike-Zelllinie
SKBR3 in Ganzblut, geprüft. Die
Spike-Probe wurde wie in den Beispielen beschrieben hergestellt. 6a zeigt das Streudiagramm des APC/Cy7
Kanals versus dem APC Kanal in der Flusszytometrie. Die SKBR3-Zellen
befinden sich in Region 1. Trümmer
erscheinen als breites Band und eventuell vorhandene Leukozyten
befinden sich in Region 2. Nach Messung des Streudiagramms wurden
einige der Ereignisse mit der hierin offenbarten neuartigen Darstellungstechnik
dargestellt. Nach Auswahl eines Objekts oder einer Zelle im Streudiagramm
kehrt das Darstellungssystem automatisch zur gemessenen Position
der Zelle zurück und
die Darstellungsroutine beginnt. Der von den Ereignissen in Region
1 aufgenommene Bildsatz zeigt Zellen, in denen das Zytoplasma fluoreszierend
angefärbt
wurde. Der Kern dieser Zellen ist als dunklere Region sichtbar.
Die Bilder unterscheiden sich für Trümmer, die
nicht in Region 1 sind. 6b zeigt ein Bild
einer SKBR3-Zelle mit ihren entsprechenden gemessenen Fluoreszenzsignalen.
Das fluoreszierende Bild und die gemessenen PMT-Signale korrelieren gut.
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Rauschabstand:
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Die
Reduzierung der Bildabtastgeschwindigkeit führt zu einer größeren Anzahl
erfasster Unterbilder eines bestimmten Ereignisses und grundsätzlich zu
einem besseren Rauschabstand. Es wurde aber keine Verbesserung der
Bildqualität
für die
APC-markierten SKBR3-Zellen beobachtet, wenn die Bildabtastgeschwindigkeit
verringert wurde. Die Grenze der Bildabtastgeschwindigkeit wird
durch die Fotobleichrate der Farbstoffmoleküle bestimmt. Mit der CCD-Kamera
konnte keine Fluoreszenz nachgewiesen werden, wenn eine SKBR3-Zelle
zum zweiten Mal abgetastet wurde, was darauf hinweist, dass der größte Teil
der APC-Moleküle
bereits nach der ersten Abtastung durch Licht zerstört worden
war. Eine Verringerung der Abtastgeschwindigkeit würde daher keinen
Unterschied im nachgewiesenen Fluoreszenzsignal ausmachen und würde lediglich
zu einer Zunahme des fluoreszierenden Hintergrunds führen. Die
optimale Abtastgeschwindigkeit hängt
deshalb von den individuellen Farbstoffeigenschaften ab und ist
für jeden
fluoreszierenden Farbstoff, der verwendet wird, anders. Deshalb
kann es besser sein, schneller abzutasten, um den Rauschabstand
zu verbessern. Andererseits würde
eine schnellere Abtastgeschwindigkeit als 5 μm/Sekunde bei der Verwendung
einer Kamera mit einer Bildfrequenz von 25 Hz zu einem Verlust an
Auflösung
führen,
weil die erfassten Bilder in einem Abstand von mehr als 0,2 μm auseinander
liegen würden.
Eine CCD-Kamera mit einer höheren
Bildfrequenz würde
notwendig sein, um ohne Auflösungsverlust
schneller abtasten zu können.
Wenn die Standard-CCD-Überwachungskamera
durch eine empfindlichere Kamera ersetzt wird, wäre auch die Darstellung trübe angefärbter Zellen möglich.
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Konfokale Darstellung:
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Die
magnetische Sammelmethode im Cell Tracks System führt nicht
zu einer Spannung oder Verzerrung der Zellen wie dies üblicherweise
bei Cytospin-Systemen mit zentrifugaler Abscheidung auf Objektträgern der
Fall ist. Deshalb behalten die magnetisch ausgerichteten Zellen
ihre natürliche
dreidimensionale Form und ihr Volumen. Die hierin beschriebene Vorrichtung
und das Verfahren können auch
für eine
konfokale Darstellung von Zellen und somit zur Verbesserung der
Bildqualität
durch genauere Bestimmung der 3D-Verteilung des fluoreszierenden
Farbstoffs in den Zellen verwendet werden (Corle, TR, Confocal Scanning
Microscopy and Related Imaging Systems, Academic Press, NY, 1995).
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Darstellung ohne Ni-Linien:
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Im
Cell Tracks System werden Ni-Linien zur Ausrichtung der Zellen und
zur Relokalisierung der Zellen unter Verwendung der Linienzahl,
bei der die Zelle mit ihrem entsprechenden Codiererwert gemessen
wird, verwendet.
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Die
hierin beschriebene Darstellungserfindung ist aber nicht von der
Anwesenheit von Ni-Linien oder magnetischen Linien abhängig und
kann auf jeder Oberfläche
verwendet werden, auf der Zellen oder andere fluoreszierende Objekte
von Interesse vorliegen oder abgeschieden werden können. Nur die
Codiererdaten in der Abtastrichtung wären für die Rekonstruktion des Bilds
aus den gespeicherten und erfassten Unterbildern notwendig.
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Die
grundsätzlichen
Anforderungen für
die praktische Umsetzung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung sind wie folgt:
- 1) Das summierte
Intensitätsprofil
der Unterbilder in Abtastrichtung sollte so gleichmäßig wie
möglich
sein, da es direkt mit der Qualität des Vollbilds in Zusammenhang
steht. In der vorliegenden Erfindung beträgt die Schwankung weniger als
6%.
- 2) Die Gleichmäßigkeit
des summierten Intensitätsprofils
sollte sich in einer lotrecht zur Abtastrichtung liegenden Richtung
auf einen Bereich erstrecken, der breiter ist als der Durchmesser des
abgetasteten Objekts.
- 3) Das Gestell sollte sich mit einer Auflösung bewegen können, die
gleich oder kleiner ist als das kleinste Detail, das in einer Zelle
beobachtet werden soll.
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Für den Fachmann
ist offensichtlich, dass die verbesserten Scanning- und Darstellungssysteme der
Erfindung nicht auf die vorangehenden Beschreibungen von bevorzugten
Ausführungsformen
beschränkt
sind und dass die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung,
die diese Verbesserungen wie oben beschrieben enthalten, auch dafür sorgen,
dass die Erfindung in vielen Gebieten und Anwendungen für die Zelldiagnose
und für
teilchenförmige
Zielspezies allgemein verwendet werden kann. Die folgenden Beispiele
veranschaulichen bestimmte Ausführungsformen
und umfassen die zurzeit bekannte beste Methode der Erfindung.
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Beispiel 1
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Für diese
Versuche wurden 10 μl
fixierte SKBR3-Zellen (50.000 Zellen/ml) mit 290 μl EDTA-Blut
gemischt. Gleichzeitig wurden 100 μl magnetische Ferroflüssigkeit,
die mit anti-EpCAM beschichtet war (magnetische Teilchen mit einer
Größe von ca.
200 nm, beschichtet mit Proteinen, Streptavidin und biotinyliertem
EpCAM-Antikörper),
ein Antikörper,
der für
Epithelzellen spezifisch ist und bekanntlich auf SKBR3-Zellen vorhanden
ist (gezüchtet
bei Immunicon Corp., Huntingdon Valley, PA), 10 μl Allophycocyanin (APC), an
monoklonalen Antikörpern konjugiert,
die Anti-Cytokeratin-Spezies oder in Epithelzellen vorliegende zytoskeletale
Proteine erkennen (z.B. SKBR3-Zellen, die aus Epithel stammen) und
10 μl CD45-APC/Cy7 (Caltag,
Burlingame, CA) hinzugefügt,
um Leukozyten zu identifizieren und um Leukozyten zu identifizieren,
die nicht-spezifisch an Cytokeratin-Antikörper binden können. Nach
einer Inkubationszeit von 15 Minuten wurden 50 μl dieses Blut- Reaktionsgemisches
in die Kammer injiziert. Die Kammer wurde in die Cell Tracks Magnetanordnung gestellt
und nach einer Sammelzeit von zwei Minuten wurden das Feedbacksystem
eingeschaltet und die Messungen begonnen. In einer einzelnen Messung wurden
40 Linien mit ausgerichteten Zellen, jeweils mit einer Länge von
15 mm und mit einer Linienperiode von 30 μm, abgetastet. Bei einer Kammerhöhe von 0,5
mm beträgt
das abgetastete Volumen 9 μl. Die
Ergebnisse der Abtastung der gesammelten markierten SKBR3-Zellen
mit den entsprechenden gemessenen Immunfluoreszenzsignalen sind
in 6a und 6b gezeigt. 6a zeigt ein Streudiagramm des CD45-APC/Cy7-Farbstoffs
versus CAM5.2 Antikörper-ÄPC Fluoreszenz
von SKBR3-Zellen in Ganzblut, die mit EpCAM-markierten magnetischen
Nanoteilchen erfasst und ausgerichtet wurden. Einige repräsentative
Abbildungen der gemessenen Ereignisse in Region 1, der Region mit
den SKBR3-Zellen, und des Trümmer
enthaltenden breiten Bandes, sind gezeigt. Region 2 ist die Region,
in der Leukozyten erscheinen würden,
wenn sie vorhanden wären
und entlang der Ni-Linien
ausgerichtet wären. 6b zeigt ein Bild einer SKBR3-Zelle mit
ihren entsprechenden gemessenen Fluoreszenzsignalen.
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Beispiel 2
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In
diesem Versuch wurden 100 μl
EDTA antikoaguliertes Blut, 50 μl
Ferroflüssigkeit
mit 5 μg CD45-markierten
ferromagnetischen Nanoteilchen, 1,5 μl CD4-APC und 25 μl 10–5 M
Oxazin 750 Perchlorat (Exciton Inc., Dayton, OH) zugefügt. Die
optimale Konzentration der Reagentien wurde durch Reihentitration
jedes Reagens bestimmt. Nach einer Inkubationszeit von 15 Minuten
wurden 300 μl
PBS hinzugefügt
und 50 μl
des Blutgemisches wurden in die Kapillare überführt, die bereits zwischen den
Magneten angeordnet war. Die Kapillare hat einen Glasboden mit einer
Form, die zwischen die um 70° geneigten
Oberflächen
der Magneten passt. Zwei Streifen doppelseitigen Klebebands mit
einer Dicke von 0,5 mm (3M Co., St. Paul, MN) wurden mit einem Abstand
von 3 mm auf dem Glas angebracht, um die Seitenwände der Kapillare zu bilden.
Ca. 30 μm
breite und ca. 0,2 μm
dicke Ni-Linien wurden mit fotolithografischen Standardtechniken
auf einem 7740 Pyrex® Glaswafer (Corning International,
Deutschland) erzeugt. Die Wafer wurden in 4 mm × 25 mm große Stücke geschnitten und mit den
Ni-Linien zum Boden auf das doppelseitige Klebeband gelegt, um die Oberseite
der Kapillare zu bilden. Die Innenabmessungen der Kapillare sind
wie folgt: Höhe
= 0,5 mm, Länge
= 25 mm, Breite = 3 mm. In der hier vorgestellten Messung betrug
die Abtastgeschwindigkeit in y-Richtung 4 mm/Sekunde, die Kammer
wurde über 15
mm abgetastet und 40 Linien wurden abgetastet, was zu einer Messzeit
von zweieinhalb Minuten führte.
Da die Periode der Linien 30 μm
ist, wurden 18 mm2 Fläche abgetastet. Da die Höhe der Kammer
0,5 mm betrug, beträgt
das abgetastete Volumen 9 μl. Für das Differentialblutbild
führte
Hinzufügen
der Reagentien zu einem Verdünnungsfaktor
von 4,77. Um die Zeit zu verkürzen,
die die Zellen benötigen,
um sich zwischen den Linien auszurichten, und um sicherzustellen,
dass sogar schwach magnetisch gekennzeichnete Zellen zur Oberfläche gezogen
werden, wurde die Kapillare zusammen mit den Magneten mit der Oberseite
nach unten gelegt, nachdem das Blut in die Kapillare eingeführt wurde.
Nach zwei Minuten wurde die Kapillare mit den Magneten erneut umgedreht
und nach ca. einer Minute wurde das Feedbacksystem eingeschaltet
und die Messung begonnen. Zum Trennen der Emissionsspektren wurde ein
660df32 Bandfilter für
die APC-Fluoreszenz und ein 730df100 Bandfilter (beide Filter von
Omega Optical Co., Brattleboro, VT) für Oxazin 750 verwendet. Da
die Fluoreszenzintensität
von mit Oxazin 750 angefärbten
Zellen erheblich größer ist
als die von immunfluoreszierend CD4-APC-markierten Zellen, muss
die spektrale Überlappung
ausgeglichen werden. Ein typisches Beispiel für das Streudiagramm, das nach Kompensation
erhalten wird, ist in 7 gezeigt. Vier Populationen
sind deutlich erkennbar und wurden als CD4+ Lymphozyten, CD4+ Monozyten,
CD4- Lymphozyten und neutrophile Granulozyten identifiziert. Die
in der Figur gezeigten Gate-Einstellungen wurden zur Bestimmung
der Anzahl Ereignisse in jedem Gate verwendet. Die Gesamtzahl gemessener
Leukozyten betrug 12.350 und die Messzeit betrug 2,5 Minuten. Zur
Untersuchung der Verteilung der Fluoreszenz von den nachgewiesenen
Objekten wurde eine Software geschrieben, damit der Anwender im
Streudiagramm auf das interessierende Objekt zeigen konnte. Das
System bewegte sich dann zum Ort dieses Ereignisses und es wurde
ein Bild aufgenommen. Überraschenderweise
zeigten die Bilder deutlich, dass die durch Anfärbung mit Oxazin 750 erhaltene
Fluoreszenz nicht vom Kern, sondern von den Körnchen ausging (Shapiro HM, Stephens
S: Flow cytometry of DNA Content Using Oxazine 750 or Related Laser
Dyes With 633 nm Excitation. Cytometry 1986; 7: 107-110). Gezeigt
werden sechs Bilder der Ereignisse im Granulozyten-Gate und zwei
Bilder der Ereignisse im Monozyten-Gate.
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Beispiel 3
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Der
in Beispiel 2 beschriebene Versuch wurde wiederholt, aber es wurden
mit dem Cell Tracks System zeitlich aufgelöste Bilder der mit Oxazin 750 angefärbten und
von CD45 Ferroflüssigkeit
erfassten Leukozyten in Ganzblut angefertigt. 8 zeigt
vier Beispiele von Bildern, die in Abständen von 20 Sekunden aufgenommen
wurden. Die Verteilung der Fluoreszenz in den Zellen ändert sich
deutlich zwischen den Zeitintervallen und unterschiedliche Zellen verhalten
sich auch unterschiedlich, wie dies an den Zellen offensichtlich
ist, die in Bild 3 und 4 zu sehen sind. In beiden Bildern wurden
Aufnahmen von zwei Zellen in unmittelbarer Nachbarschaft aufgenommen und
die Unterschiede in der Aufnahme und der Zellverteilung von Oxazin
750 sind deutlich zu sehen. Aus diesen Beispielen geht hervor, dass
das Cell Tracks System auf einzigartige Weise in der Lage ist, eine
funktionale Analyse von Zellen durchzuführen, da man beispielsweise
die Reaktionen der Zellen in Blut auf Arzneimittel oder andere Bestandteile
in Echtzeit untersuchen kann.