DE3586806T2 - Verfahren zum sichtbarmachen von gesonderten submikroskopischen metallteilchen. - Google Patents

Description

• In den letzten Jahren sind in zunehmendem Maße kleine Metallteilchen, insbesondere kolloidale Goldteilchen, als Marker zum Lokalisieren, Kennzeichnen und Quantifizieren spezifischer organischer Substanzen und Strukturen verwendet worden. Gewöhnlich sind solche organischen Substanzen und Strukturen biologischen Ursprungs, und ihre Bestimmung mit Hilfe des Markierens mit einen Metall hat sich auf verschiedenen Gebieten der Biochemie, Pharmakologie, Zytologie und Histologie als nützlich erwiesen. Die entsprechenden Techniken haben eine weitverbreitete Anwendung gefunden, und zwar nicht nur in der rein wissenschaftlichen Forschung, sondern auch für den routinemäßigen Gebrauch im Rahmen praktischer Anwendungsgebiete, wie z. B. bei diagnostischen Verfahrensweisen.
• Duft Prinzip nach basiert die Verwendung kolloidaler Metallteilchen als Marker auf der Eigenschaft solcher Teilchen, Polymere, wie z. B. Nukleinsauren, Polysaccharide und dgl. mehr, zu binden, sowie auf der Eigenschaft dieser Polymeren, direkt oder indirekt mit spezifischen organischen Substanzen und Strukturen in Wechselwirkung zu treten. Im allgemeinen werden solche Wechselwirkungen auf der Bildung von Akzeptor-Liganden-Komplexen, wie z. B. Antigen-Antikörper-, Rezeptor-Liganden-Komplexen und dgl. Wechselwirkungen beruhen, und daher stellen immunologische Bestimmungen das bevorzugte Anwendungsgebiet von Techniken dar, die auf dem Markieren mit kolloidalen Metallen beruhen, wobei überwiegend Goldsole als Metallteilchen verwendet werden.
• In J.Histochem.Cytochem., 25, 1187 (1977), sind ein Verfahren zum Überziehen kolloidalen Goldes mit besonderen Proteinen und ein Verfahren zur Verwendung von mit spezifischen Proteinen überzogenen Goldteilchen als Marker für den Nachweis von spezifischen Zelloberflächenantigenen mit Hilfe der Elektronenmikroskopie beschrieben.
• In der US-PS Nr. 4 313 734 ist allgemein ein Verfahren für den Nachweis und/oder die Bestimmung einer oder mehrerer Komponenten der Reaktion zwischen eine spezifischen Bindungsprotein und der entsprechenden bindungsfähigen Substanz beschrieben, wobei eine oder mehrere, an geeignete Metallteilchen gekuppelte Komponenten verwendet werden. Der Nachweis und/oder die Bestimmung des so gebildeten Reaktionsproduktes oder -komplexes geschieht indirekt, wobei man die physikalischen Eigenschaften des in den relevanten Fraktionen enthaltenen Metalles ausnützt. Gemäß dieser Patentschrift kann die Bestimmung nach einer bekannten Methodik erfolgen, wie z. B. durch visuelles Beobachten oder durch Kolorimetrie des Metalles in dispergierter Form, durch Flammenemissionsspektrophotometrie und durch flammenlose Atomabsorptionsspektrophotometrie. Seinem Wesen nach betrifft das Verfahren Wechselwirkungen des immunologischen Typus, und in dieser Form wird das Verfahren generell als "Sol Particle Immuno-Assay (SPIA)" bezeichnet.
• Kürzlich sind verbesserte und vereinfachte Verfahren für die Sichtbarmachung von immobilisierten, mit einem Metall markierten Komplexen oder von mit einem Metall markierten Strukturen beschrieben worden, bei denen die Hellfeld-Lichtmikroskopie als primäres Nachweismittel angewendet wird. In der US-PS Nr. 4 420 558 ist z. B. ein Verfahren der Hellfeld- Lichtmikroskopie zum Aufzählen und Kennzeichnen von Untergruppen von Blutzellen und deren Vorläufern beschrieben, welches Verfahren das Markieren dieser Zellen und Vorläufer mit mit Gold markierten Antikörpern unter wohldefinierten Umständen umfaßt. Wie in dieser Patentschrift ausgeführt wird, basiert die Sichtbarmachung markierter Zelloberflächen auf den Aggregatseigenschaften der Goldteilchen, welche unter den angegebenen ständen einer ausgedehnten Fleckenbildung ("patching") unterworfen sind.
• In der US-PS Nr. 4 446 238 ist die Verwendung kolloidalen Goldes als Marker bei der Hellfeld-Lichtmikroskopie für die immunzytochemische Lokalisierung von definierten Antigenen in histologischen Schnitten beschrieben. Auch hier wiederum basiert der mikroskopische Nachweis auf der Beobachtung der intensiv rötlichen Farbe, die sich aus der Anhäufung großer Zahlen von Goldkörnchen über antigenhältigen Oberflächen ergibt.
• Typischerweise haben die verwendeten Metallteilchen bei den obgenannten Verfahrensweisen einen Durchmesser von etwa 10 bis etwa 100 nm. Dies liegt jedoch ein gutes Stück unterhalb der Auflösungsgrenze für die Hellfeld-Lichtmikroskopie, welche nach allgemeiner Auffassung um 200 nm liegt. Es ist daher ganz logisch, daß alle bisher bekannten, visuellen Verfahren der Lichtmikroskopie in ihrer Anwendung auf den Nachweis immobilisierter Aggregate von Metallteilchen beschränkt sind. Einzelne Teilchen konnten nur mit ultramikroskopischen Techniken beobachtet werden, insbesondere mit der Elektronenmikroskopie.
• Es ist nun - durchaus überraschenderweise - gefunden worden, daß einzelne Metallteilchen eines kleineren Durchmessers als 200 nm mit Hilfe von Hellfeld-Lichtmikroskopie oder durch Epipolarisations-Mikroskopie im sichtbaren Spektrum klar sichtbar gemacht werden können, vorausgesetzt, daß das so entstandene Bild einer elektronischen Kontrastverstärkung unterworfen wird. Trotz der völlig unerwarteten und in höchstem Maße überraschenden Möglichkeiten, die sich durch die vorliegende Erfindung anbieten, sei bemerkt, daß dieselbe nicht im Widerspruch zu irgendeinem etablierten Naturgesetz steht. Die Auflösungsgrenze wird gewöhnlich als der kleinste Abstand zwischen zwei kleinen Objekten definiert, welche noch als getrennt unterscheidend wahrgenommen werden können. Für die Lichtmikroskopie im sichtbaren Spektrum wird diese Grenze mit etwa 200 nm angenommen. Im allgemeinen ist dies zugleich der minimale Abschnitt eines Teilchens oder einer Struktur, der durch visuelle Lichtmikroskopie beobachtet werden kann. Die Tatsache, daß es nunmehr möglich gemacht worden ist, einzelne Metallteilchen eines kleineren Durchmessers als 200 nm, ja sogar eines kleineren Durchmessers als 20 nm, sichtbar zu machen und gegebenenfalls zu kennzeichnen, stellt daher einen signifikanten Fortschritt auf dem betreffenden Fachgebiet dar.
• Obgleich es stimmen mag, daß, wie berichtet worden ist, durch die Kombination der Lichtmikroskopie mit elektronischer Kontrastverstärkung mit Hilfe einer Videokamera die Sichtbarmachung gewisser Strukturen mit Abmessungen kleiner als 200 nm ermöglicht worden ist, so kann doch keine der beschriebenen Errungenschaften mit der vorliegenden Realisierung hinsichtlich der Nachweisgrenze und der optischen Klarheit verglichen werden. In "Cell Motility", 1, 275-289 (1981), wird berichtet, daß Mikrotubuli mit einem Durchmesser von etwa 25 nm mit Hilfe von Differential-Interferenz-Kontrastmikroskopie mit Kontrastverstärkung durch ein Videogerät (AVEC-DIC) sichtbar gemacht werden können. Es sei jedoch bemerkt, daß Mikrotubuli lineare Strukturen sind, deren Länge 200 nm bei weitem übertrifft. Außerdem ist es leichter, kleine Teilchen oder Strukturen in Bewegung zu beobachten, als wenn sie sich im Ruhezustand befinden. Im Gegensatz hierzu betrifft die gegenständliche Erfindung die Sichtbarmachung einzelner, im wesentlichen kugelförmiger Teilchen von submikroskopischen Abmessungen, welche sich im Ruhezustand oder in Bewegung befinden können.
• In "TINS", April 1984, 112, wird weiterhin ausgeführt, daß die AVEC-DIC-Techniken angewendet worden sind, um die Bewegung intraaxonaler Organellen nachzuweisen, welche sich unter der herkömmlichen Auflösungsgrenze befinden, und daß ein schwacher Stift von etwas, das scheinbar sehr kleine Vesikeln (mit Abmessungen von vielleicht 30 bis 50 nm) sind, beobachtet worden ist. Auch hier wiederum ist die Beschreibung in diesem Aufsatz auf die Beobachtung von Teilchen in Bewegung beschränkt, welche nur als ein schwacher Strom sichtbar werden. In völligem Gegensatz hierzu ermöglicht das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Sichtbarmachung von sowohl in Bewegung befindlichen als auch von ruhenden, submikroskopischen Metallteilchen mit einer solchen Klarheit und mit einem solchen Kontrast, daß die Teilchen von der nicht-metallischen Umgebung leicht unterschieden werden können, und daß der Nachweis und gegebenenfalls das Zählen dieser Teilchen sogar automatisiert werden kann.
• Wegen seiner Einfachheit und Verläßlichkeit vereinfacht das erfindungsgemäße Verfahren den Nachweis submikroskopischer Metallteilchen ganz wesentlich und eröffnet neue Perspektiven für die Verwendung solcher Teilchen als diagnostische Werkzeuge. Im Prinzip kann das Verfahren für die Lokalisierung, Bestimmung und/oder Kennzeichnung von Metallteilchen eines kleineren Durchmessers als 200 nm in irgendeiner nicht-metallischen Umgebung angewendet werden, welche Umgebung für die Betrachtung durch Lichtmikroskopie geeignet ist. Beispielsweise kann das Verfahren zum Sichtbarmachen von Metallteilchen beliebiger Natur, mit einem Durchmesser von etwa 1 bis 200 nm, vorzugsweise 5 bis 200 nm, in irgendeinem, im wesentlichen durchsichtigen Substrat, oder an der Oberfläche von transparenten oder nicht-transparenten Substraten, angewendet werden. Selbstverständlich wird die Bestimmung an der Oberfläche von nicht-durchsichtigen Substraten die Epilumineszenz-, und insbesondere die Epipolarisations-Mikroskopie erforderlich machen. Die Bestimmung kann nur qualitativ, oder aber auch quantitativ, sein. Im letztgenannten Fall kann die quantitative Messung einfach durch Zählen der Anzahl der Teilchen in einem Feld von vorbestimmter Größe durchgeführt werden. Als Beispiele von Metallen, von denen Teilchen der angegebenen Größe nach dem beanspruchten Verfahren sichtbar gemacht werden können, können Gold, Silber, Platin, Kupfer, sowie Eisen, Nickel, Zink, Chrom, Titan, Mangan, Kobalt, Molybdän, Rhodium, Palladium, Cadmium, Osmium, Iridium, Quecksilber, Aluminium usw. angeführt werden. Bevorzugte Anwendungsarten finden sich im Nachweis und in der Bestimmung von Edelmetallteilchen, insbesondere aus Gold, Silber und Platin.
• Der Zweck solcher Bestimmungen kann entweder die Lokalisierung und/oder Quantifizierung solcher Teilchen als solchen, oder die Lokalisierung und/oder Identifizierung und/oder Quantifizierung spezifischer Substanzen oder Strukturen sein, welche sich direkt oder indirekt an solche Teilchen binden. Gemäß ihrem ersten Aspekt bietet die Erfindung ein schönes und verlaßliches Verfahren zur Bestimmung von Metallteilchen in irgendeinem geeigneten flüssigen, halbfesten oder festen Medium, z. B. in Metallsolen, die in einem wäßrigen oder organischen Medium suspendiert sind. Darüberhinaus macht es die Leichtigkeit, mit welcher das Verfahren durchgeführt wird, attraktiv, Metallteilchen der angegebenen Größe als Tracer bzw. Indikatoren zum Untersuchen der Homogenität von Binär- oder Mehrfachkomponentensystemen nach dem Vermischen, oder zum Untersuchen der Strömungskennmerkmale von flüssigen, halbfesten oder festen, insbesondere amorphen, Medien, oder zum Bestimmen der Dicke von Überzügen aus flüssigen oder festen Filmen, und dgl. mehr, zu verwenden.
• In seinem zweiten Aspekt kann das Verfahren Anwendung bei der Bestimmung spezifischer organischer Substanzen oder Strukturen, meistens solchen biologischen Ursprungs, sowohl in vitro als auch in vivo, finden. Solche Anwendungsarten, bei welchen inan im allgemeinen Metallsolteilchen, insbesondere Goldteilchen, welche an wohldefinierte, organische Substanzen gekuppelt sind, verwenden wird, werden im Prinzip - aber ohne Beschränkung darauf - jene Fälle umfassen, bei welchen derzeit das Markieren mit Gold als nützlich bekannt ist. Als solches wird das beanspruchte Verfahren einen beträchtlichen Fortschritt und eine beträchtliche Bequemlichkeit in der Arbeitsweise auf solchen Gebieten, wie z. B. der Zytologie, Histologie, intra- und extrazellulären Diagnose biologischer Substanzen usw., mit sich bringen. Einer der Hauptvorteile des gegenständlichen Verfahrens besteht darin, daß dasselbe, wenigstens dem Prinzip nach, zerstörungsfrei ist und auf intakte, strukturell organisierte, insbesondere biologische Systeme angewendet werden kann.
• Beispielsweise kann unter Verwendung von an spezifische Proteine, z. B. Antikörper, gekuppelten Metallteilchen, und indem man dieselben mit geeigneten, bindungsfähigen Substanzen in Wechselwirkung treten läßt, die genaue Lokalisierung dieser letztgenannten Substanzen mit Leichtigkeit und auf eine im wesentlichen zerstörungsfreie Art und Weise durchgeführt werden. Die Tatsache, daß sehr kleine Teilchen verwendet werden können, macht es möglich, die oben beschriebenen Phänomene in einer Mikro-Umgebung, z. B. in einer - gewünschtenfalls lebenden - Zelle, zu beobachten. Daher kann das gegenständliche Verfahren zum lokalisieren und/oder Quantifizieren spezifischer, bindungsfähiger Substanzen und/oder Strukturen in einzelnen Zellen, und/oder zum Verfolgen von deren Verteilung und/oder Bewegungen innerhalb einer Zelle, und/oder zum Bestimmen der Geschwindigkeit gewisser Transportphänomene innerhalb der Zelle, angewendet werden. Beispiele spezifischer, intrazellulärer Transportphänomene, welche mit dem gegenständlichen Verfahren - sogar in lebenden Organismen - leicht beobachtet werden können, umfassen den mikrotubulären und axonalen Transport. Die Bestimmung des axonalen Transportes in durch Biopsie entnommenen, lebenden Nerven kann z. B. als diagnostisches Werkzeug zur Ermittlung von Zuständen wie Muskeldystrophie oder zum Verfolgen der Entwicklung solcher Krankheiten angewendet werden. Das Verfahren kann weiterhin für den Nachweis verschiedener Arten von viralen Infektionen verwendet werden.
• Wegen seines generellen Charakters kann das Verfahren in diagnostischen Tests angewendet werden, die auf dem Nachweis von Oberflächenantigenen oder intrazellulären Antigenen oder, ganz allgemein irgendwelcher spezifischer organischer Substanzen in biologischen Medien oder daraus abgeleiteten Fraktionen basieren. Gewöhnlich werden solche Substanzen eine Polypeptidnatur aufweisen, wie z. B. Hormone, Proteine, Enzyme usw., sein. Im Prinzip ist es möglich, eine diagnostische Technik auf der Basis des vorliegenden Verfahrens auf eine einzelne Zelle anzuwenden. Wegen seines zerstörungsfreien Charakters kann das Verfahren daher vorteilhafterweise zum Ausmachen einzelner Zellen angewendet werden, deren biochemische Eigenschaften von denjenigen anderer Zellen abweichen, wobei die ausgewählten Zellen vollkommen lebensfähig bleiben und weiter kultiviert können. Solche Anwendungen werden bei gentechnologischen Verfahrensweisen besonders nützlich sein, nämlich ,in die positiven von den negativen Expressorzellen rasch abzutrennen. Das Verfahren eignet sich auch für den Nachweis einer genetischen Abweichung oder von Stoffwechseldefekten in pränatalen Organismen.
• Im Vergleich zu bereits vorhandenen diagnostischen Verfahren auf der Basis von Solteilchen-Immunoassays hat das vorliegende Verfahren eine viel größere Empfindlichkeit. In der Tat basieren die vorhandenen Verfahren im allgemeinen auf einer Lichtabsorption oder -streuung durch die Masse der absorbierten oder suspendierten Metallteilchen. Selbstverständlich erfordert die Beobachtung von Farbe, z. B. auf einem Blotting- Medium, das Vorhandensein einer massiven Anzahl von Teilchen. Im Gegensatz hierzu macht es das vorliegende Verfahren möglich, einzelne Teilchen zu beobachten und zu zählen. Daher wird das vorliegende Verfahren die Entwicklung diagnostischer Blots dort, wo bestehende, z. B. visuelle oder kolorimetrische Techniken, zu wenig empfindlich sind, z. B. für den Nachweis von Hepatitis, weitgehend erleichtern.
• Auf dem Gebiet der Pharmakologie wird das Verfahren eine wertvolle Hilfe sein, um die zelluläre und subzelluläre Lokalisierung von Pharmaka und deren Rezeptoren zu verfolgen.
• Die Herstellung von Solteilchen, insbesondere Goldteilchen, deren Kuppeln an geeignete Bindungssubstanzen, z. B. Antikörper, und die verschiedenen Methoden zum direkten oder indirekten Verbinden derselben mit den gewünschten, bindungsfähigen Substanzen sind ausreichend bekannt. In diesem Zusammenhang sei z. B. auf die IBRO-Handbuch-Reihe "Immunohistochemistry", A.C. Cuello (Hsg.), Wiley, New York, 1983, S. 347-372; auf die US-PS Nr. 4 313 784 und auf "Immunocytochemistry", J.M. Polak und S. Van Noorden (Hsg.), Wright PSG, Bristol, 1983, S. 82-112, verwiesen.
• Das Verfahren gemaß der vorliegenden Erfindung zum Sichtbarmachen von Metallteilchen kann unter Verwendung von gegenwärtig zur Verfügung stehender Ausrüstung durchgeführt werden. Eine solche Ausrüstung wird einerseits ein entsprechendes Lichtmikroskop und anderseits ein elektronisches Gerät zur Kontrastverstärkung umfassen. Als geeignetes Lichtmikroskop kann irgendein Standardmikroskop guter Qualität verwendet werden, welches für Hellfeld- und/oder Epipolarisations-Mikroskopie ausgestattet ist. Die Verwendung von monochromatischem Licht ist nicht wesentlich, es wird dadurch aber die Qualität verbessert. In der Praxis hat es sich gezeigt, daß monochromatisches, grünes Licht ausgezeichnete Ergebnisse liefert. Wird die Hellfeld-Lichtmikroskopie angewendet, dann kann eine weitere Verbesserung durch Verwendung der Differential-Interferenz-Kontrast-(DIC)-Technik erzielt werden. Als elektronisches Gerat zur Kontrastverstärkung ist irgendeine der üblichen Typen von Videokameras geeignet, die mit einer manuellen oder automatischen Helligkeits- und Kontrastregelung ausgestattet ist. Selbstverständlich wird die Qualität der Bilder in direkter Beziehung zu der Präzision des Gerätes stehen.
• Bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, und um die betreffenden Metallteilchen im größtmöglichen Ausmaß von dem umgebenden Substrat zu unterscheiden, ist es zweckdienlich, eine größere Blendenöffnung, als dies für die optimale Sichtbarnachung des Substrates erforderlich wäre, zu verwenden. In der Praxis werden die besten Ergebnisse beim Arbeiten mit vollständiger oder nahezu vollständiger Blendenöffnung erhalten, das heißt unter Bedingungen, bei denen das direkte, mikroskopische Bild wegen seiner übeimäßigen Helligkeit fast keinen Kontrast aufweist und aus diesem Grunde für die visuelle Prüfung völlig unzureichend ist. Werden die Metallteilchen mit einer Videokamera richtig betrachtet und verarbeitet, wobei der Großteil des Nabenlichtes abgeschaltet und der Kontrast verstärkt wird, dann werden die Metallteilchen als wohldefinierte, getrennte Flecken klar und deutlich sichtbar. Unter der Hellfeld-Lichtmikroskopie werden die Flecken gegen einen hellen Hintergrund dunkel erscheinen, während unter der Epipolarisations-Mikroskopie die Teilchen als helle, funkelnde Flecken sichtbar werden. Läßt das Mikroskop den Übergang von der Hellfeld-Lichtmikroskopie zu der Epipolarisations-Mikroskopie ohne Unstellung des Feldes zu, dann ergibt die abwechselnde Sichtbarmachung der Teilchen nach jeweils einer der beiden Techniken eine ausgezeichnete Bestätigung von deren Identität.
• Wegen der Klarheit, mit welcher die Metallteilchen auf dem verarbeiteten Bild sichtbar sind, läßt sich deren Nachweis und Quantifizierung in einem geeigneten Substrat unter Verwendung irgendeiner der üblichen Arten von automatischen Zähleinrichtungen leicht automatisieren.
• Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht, welche Beispiele den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise beschränken sollen.
BEISPIEL Prüfung der von den Mikrotubuli abhängigen, intrazellulären Motilität mit Teilchen im -Bereich und unter Anwendung von Video-Ultramikroskopie (Nanovid-Ultramikroskopie)
• Verfahren: Video-Ultramikroskopie unter Verwendung von Teilchen mit einer Größe im nm-Bereich oder Nanovid-Ultramikroskopie.
• Es wurden PTK-(Potorous-Tridactylis-Nieren)-Zellen 24 bis 48 h nach deren Einimpfen auf Deckgläschen aus Glas verwendet. Kolloidale Goldteilchen mit einer Größe von 20 bis 40 nm und mit einem Überzug aus Serumalbumin (Nordic) wurden mit Polyethylenglykol stabilisiert. Die Größenverteilung wurde ultrastrukturell bestimmt. Die Mikroinjektion wurde auf einem Kontrast-Mikroskop mit invertierter Phase durchgeführt. Glaskapillaren, die auf eine Spitzenöffnung von ± 1 um gezogen worden waren, wurden durch Kapillarwirkung hinterfüllt. Sofort nach der Injektion wurde das Deckglas aus der Petri-Schale entfernt und unter Verwendung von Parafilm-Streifen als Abstandshalter und von "Valap" (Vaselin, Lanolin, Paraffin, jeweils ein Drittel von jedem dieser Stoffe) zum Versiegeln der Mikrokammer auf einem Objektträger montiert. Die Präparation wurde dann auf einem Reichert- (Wien, Österreich)-Polyvar-Mikroskop montiert. Die Temperatur der Präparation wurde durch einen Luftstrom in einem Brutschrank auf 37º ± 1ºC gehalten. Das Mikroskop war mit einem Universalkondensor und einer 100 · -Planapo-Linse ausgestattet. Während der gesamten Beobachtungsperiode wurde unter Anwendung einer Ölimmersion sowohl des Kondensors als auch der Objektiv-Linse eine Köhler-Beleuchtung erzielt. Durch unschalten der Kondensor-Einstellungen oder der Filtereinheiten können die gleichen Zellen innerhalb von weniger als 30 s nacheinander mit dem folgenden optischen Geräteaufbau beobachtet werden: im Durchlicht, durch Differential-Interferenz-Kontrast-(DIC)-Mikroskopie, durch Interferenz-Reflektions-Mikroskopie unter Verwendung eines dichroitischen Spiegels und gekreuztem Polarisator und Analysator, durch Epifluoreszenz-Mikroskopie, durch Dunkelfeld-Beobachtungs- oder Phasenkontrast-Mikroskopie unter Verwendung einer 100 · -Planapo-Phasenkontrast-Objektiv-Linse. Für Durchlicht- oder DIC-Mikroskopie wurde die volle numerische Apertur des Systems angewendet. Die Beleuchtung erfolgte mit der grünen Linie einer 100 W-Halogenlappe oder eines 200 W-Quecksilber-Lichtbogens.
• Das Bild (etwa die zentralen 20% des Gesamtfeldes) wurde direkt auf die Schirmplatte einer Panasonic-WV-1800-Videokmera projiziert, welche eine horizontale Auflösung von 800 W-Linien ergibt. Das Video-Signal wurde in einen Panasonic-WV-5340-Monitor und in einen Sony-VD-5850P- -U-Matic-Videokassettenrecorder eingegeben, der eine horizontale Auflösung von 340 Linien ergibt. Die Aufzeichnungen erfolgten im Echtzeitmodus oder im Zeitraffermodus unter Verwendung einer AC-580-Animationssteuereinheit von EOS für den Sony-Recorder. In der Regel wurde der Recorder programmiert, alle 10 s 2 Bilder aufzunehmen. Die Wiedergabe mit Normalgeschwindigkeit (25 Bilder/s) entsprach daher einer 125-fachen Beschleunigung. Die photographischen Aufzeichnungen wurden von dem Monitor unter Anwendung von Echtzeitwiedergabe oder von Standbildern, wenn die Aufzeichnung im Zeitraffermodus durchgeführt wurde, angefertigt. Die Verschlußzeit betrug 1/4 - 1/8 s.
• Völlig überraschenderweise erschienen auf dem Bildschirm dann, wenn der Kondensor auf normale Hellfeld-Übertragung geschaltet wurde, und wenn die Beleuchtung so verstärkt wurde, daß sie die Kamera vollständig sättigte, klar definierte, dunkle Flecken auf einem völlig weißen Hintergrund. Die Goldteilchen reflektierten das polarisierte Licht und erzeugten genügend dichroitische Wirkungen, weil das Licht durch den gekreuzten Analysator hindurchging. Sie erschienen als hellglänzende Flecken auf einem Hintergrund, der aus dem gewöhnlichen Interferenz- Reflexionsbild der Zelle bestand. Mit Ausnahme von sehr großen Aggregaten, die gewöhnlich in der Zellmitte lokalisiert sind, waren durch die Okulare keine Flecken sichtbar, und auf der photographischen Platte konnten keine Flecken aufgezeichnet werden. Unter Verwendung eines Normanski-Differential-Interferenz-Kontrast-(DIC)-Mikroskops wurden selbst die kleinsten Teilchen leicht nachgewiesen. Sie können jedoch nicht von endogenen Organellen unterschieden werden, sofern man nicht auf die Hellfeld-Beobachtung hin- und herschaltet. Um die einzelnen Goldteilchen nachzuweisen, wurden 20 bis 40 nm-Goldteilchen in Zellen injiziert, welche auf mit Formvar überzogenen Gittern gezüchtet worden waren, und die Zellen wurden auf Videoband aufgezeichnet und unmittelbar danach durch Übergießen mit Glutaraldehyd fixiert. Sie wurden dann noch zur elektronenmikroskopischen Beobachtung einer Gesamtfassung weiter bearbeitet. Ähnliche Versuche wurden mit blanken Gittern durchgeführt, auf welchen das Goldsol adsorbiert war. Beide Versuche zeigten klar, daß die meisten der kleinsten Flecken einzelne Goldteilchen waren. Kleine Aggregate aus 2 bis 3 Teilchen schienen die gleiche Größe zu haben. Größere Aggregate, von denen nur wenige vorhanden waren, waren wahrscheinlich in der Kapillarspitze der Mikropipette erzeugt worden, welche unter Verwendung der 40 nm-Größe oft verstopft wurde. Sie erschienen auf dem Bildschirm als Kügelchen eines Durchmessers von 0,5 bis 1 um. Die Gesamtfassungs-Elektronenmikroskopie, insbesondere unter Verwendung von Stereophotographien, half ebenfalls mit, aufzuzeigen, daß die meisten Goldteilchen frei im Zytoplasma waren, und daß sie häufig mit Mikrotubuli eng assoziiert waren. Das Vitalanfärben der Zellen mit Arridin-Orange, um das Lysosomen-Kompartiment zu demonstrieren, zeigte keine Goldteilchen innerhalb dieser Organellen, obwohl dies eindeutig dann der Fall war, wenn die gleichen Teilchen in dem Medium an die Zellen verfüttert worden waren. Ziemlich häufig waren die Goldteilchen scheinbar an ein Vesikel gebunden, welches selbst an einen Mikrotubulus gebunden war.
• Die Analyse des Videobandes zeigte, daß die Goldteilchen, obwohl die Mikroinjektion stets nahe an den Kern erfolgte, innerhalb von 10 bis 15 min durch die gesamten Zellen dispergiert waren. Die Beobachtung im Echtzeitmodus und im Zeitraffermodus zeigte, daß sich alle Teilchen längs linearer Pfade in Richtung auf das Zentrosom und von diesem weg in einer typischen, springenden Art und Weise bewegten. Insbesondere die Einzelteilchen (sowohl jene von 20 nm als auch jene von 40 nm) waren alternativ in einer typisch linearen Berg und in einer lokalen, unregelmäßigen Bewegung des "Umherspringens" begriffen. Die letztgenannte Art von Bewegung war jedoch viel langsamer als eine echte Brown'sche Molekularbewegung von Goldteilchen in dem Medium. Obgleich die kleinen Teilchen in dem Zytoplasma bis zu 2 bis 4 h nach der Injektion dispergiert verblieben, zeigten die größeren Teilchen die Tendenz, sich im Zentrosomenbereich anzuhäufen. Eine Analyse der Geschwindigkeit und Frequenz der hüpfenden Bewegung für verschiedene Größen von Goldaggregaten und ein Vergleich mit den endogenen Organellen zeigte eine praktische Identität in deren Verhalten, welches interessanterweise von der jeweiligen Größe abhängig war.
• Die Wirkungen des Mikrotubuli-Inhibitors Nocodazol (10&supmin;&sup6;-10&supmin;&sup5; M) waren sowohl für die endogenen Organellen als auch für die Goldteilchen ganz und gar vorhersagbar und identisch. Die hüpfende Bewegung verschwand allmählich, und es blieb nur die unregelmäßige, lokale Bewegung bestehen. Natriumazid (10&supmin;² M) brachte die hüpfende Bewegung innerhalb einiger weniger Minuten zum Stillstand, was einer raschen Erschöpfung an ATP entsprach.
• Die Wirkungen von Taxol waren neugierig machend. Kleine Teilchen setzten ihre hüpfende Bewegung fort, und zwar häufig längs peripherer Bändel von Mikrotubuli. Größere Aggregate kamen jedoch völlig zum Stillstand. Interessanterweise brachte das Acridin-Orange, ein Protein-Vernetzer, nicht nur die hüpfende Bewegung zum Stillstand, sondern es hemmte auch, im Gegensatz zu irgendeinem der anderen Medikamente, die lokalen unregelmäßigen Bewegungen.
• Die Mikrotubuli sind eindeutig an der hüpfenden Bewegung beteiligt. Da das Bewegungsverhalten von Untereinheiten nach Art eines Tretwerks ("treadmilling of subunits") als möglicher molekularer Mechanismus vorgeschlagen worden ist, wurden 40 nm-Teilchen, welche an einen monoklonalen Antikörper gegen Tubulin gekuppelt waren, injiziert. Es wurde zuerst bestätigt, daß mikroinjizierter, durch Fluoreszenz markierter Antikörper das gesamte Mikrotubuli-System in den Zellen beeckt, daß dieser Antikörper aber keine Wirkungen auf die hüpfende Bewegung, die Zellform und die Bewegung oder Mitose bei Konzentrationen unter 6 mg/ml (Injektionslösung) hat. In einigen Zellen nahmen die meisten Goldteilchen innerhalb von 10 bis 15 min eine vollständig feststehende, unbewegliche Stellung an und verblieben während mehr als 2 h unbeweglich. Einige wenige Teilchen lösten sich während des Beobachtungszeitraums ab und befestigten sich erneut an einer anderen Stelle. Häufig bildeten die Teilchen eindeutig lineare, regelmäßige Anordnungen, welche in Richtung auf das Zentrosom hin konvergierten. Ein Unschalten auf DIC-Mikroskopie zeigte eine normale Bewegung der endogenen Organellen, und zwar häufig längs Pfaden, die von den Goldteilchen genau beschrieben werden. In anderen Zellen war eine veränderliche Anzahl von Teilchen nicht feststehend, sondern führte eine hüpfende Bewegung aus. Es wird angenommen, daß diese Teilchen keine freie Tubulin-Bindungsstelle hatten, und zwar entweder durch Fehlen des Antikörpers oder durch Überdeckung der Antigen-Bindungsstelle, z. B. durch freie Tubulin-Untereinheiten. Die Menge der freien Untereinheiten kann sehr wohl von dem Stadium des Zellzyklus abhängen.
• In Zellen, in welche die Einspritzung während der Prophase gemacht wurde, hüpften einige Teilchen längs der Mikrotubuli des Aster (Teilungssternes zu Beginn der Mitose). Viele waren auch innerhalb der Kernspindel zu sehen, welche von nachweisbaren, endogenen Organellen frei war. Was aber besonders interessierte, war, daß sie nicht nur längs der Kernspindelfasern aufwärts- und abwärtssprangen, sondern daß sie auch seitlich durch die Kernspindel sprangen.
• Einige wenige Teilchen nahmen eine stationäre Stellung ein. Eines wurde an eine Kinetochorfaser gebunden, in der Nähe eines Zentromers, in der Metaphase gesehen. Es bewegte sich zusammen mit der Kinetochorfaser während der gesamten Anaphase. Als dieses Teilchen in der Telophase innerhalb des Kerns eingefangen wurde, löste es sich von dem Chromatin. Zu diesem Zeitpunkt begann das Goldteilchen, sich in einer sehr schnellen, typischen Brown'schen Molekularbewegung innerhalb einer Tasche zwischen den Chromatiden zu bewegen. Die Teilchen hüpften im Mittel mit der gleichen Geschwindigkeit. Dann verlangsamt sich die Geschwindigkeit des Teilchens plötzlich auf das gleiche Niveau wie jenes, welches in dem Zytoplasma von z. B. mit Nocodazol behandelten Zellen zu ersehen ist.

Claims (9)

1. Verfahren zum Sichtbarmachen einzelner Edelmetallteilchen mit einem Durchmesser kleiner als 200 nm, welches Verfahren das Beobachten dieser Teilchen durch Hellfeld-Lichtmikroskopie oder durch Epipolarisations- Mikroskopie unter Verwendung einer wesentlich größeren Blendenöffnung, als dies für eine direkte, visuelle Betrachtung des mikroskopischen Bildes optimal wäre, und das Verstärken des Kontrastes des so erhaltenen Bildes mit einem elektronischen Gerät zur Kontrastverstärkung umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zum Nachweisen und/oder Bestimmen spezifischer organischer Substanzen, welche sich an spezifische Bindungsproteine binden können, und welches Verfahren die folgenden Stufen umfaßt: i) Markieren des Reaktionsproduktes dieser bindungsfähigen Substanz mit diesem Bindungsprotein mit Edelmetallteilchen eines Durchmessers zwischen 1 und 200 nm; und ii) Sichtbarmachen einzelner Edelmetallteilchen des so markierten Reaktionsproduktes nach einem im Anspruch 1 beanspruchten Verfahren.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Markieren dieses Reaktionsproduktes durch Umsetzen der bindungsfähigen Substanz mit einem Bindungsprotein, welches direkt an die Edelmetallteilchen gekuppelt ist, durchführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Markieren des Reaktionsproduktes durch Unsetzen der bindungsfähigen Substanz mit dem Bindungsprotein und weiteres Umsetzen des so ausgebildeten Reaktionsproduktes mit einer zweiten bindungsfähigen Substanz oder Bindungssubstanz, welche an die Edelmetallteilchen gekuppelt ist, durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die Reaktion der bindungsfähigen Substanz mit dem Bindungsprotein eine Liganden-Rezeptor- Reaktion ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die bindungsfähige Substanz ein Antigen ist, und wobei das Bindungsprotein ein Antikörper gegen dieses Antigen ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Edelmetallteilchen Gold-, Silber- oder Platinteilchen sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Antigen ein Zelloberflächenantigen, ein Hormon, ein Enzym oder ein intrazelluläres Strukturelement ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das elektronische Gerät zur Kontrastverstärkung eine Videokamera ist.