EP2404155A1 - Vorrichtung und verfahren zur anreicherung und erfassung von magnetisch markierten zellen in laminar strömenden medien - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur anreicherung und erfassung von magnetisch markierten zellen in laminar strömenden medien

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EP2404155A1
EP2404155A1 EP10707007A EP10707007A EP2404155A1 EP 2404155 A1 EP2404155 A1 EP 2404155A1 EP 10707007 A EP10707007 A EP 10707007A EP 10707007 A EP10707007 A EP 10707007A EP 2404155 A1 EP2404155 A1 EP 2404155A1
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EP
European Patent Office
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cells
magnetic field
magnetoresistor
detection
channel
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Withdrawn
Application number
EP10707007A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Oliver Hayden
Manfred Rührig
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Siemens AG
Original Assignee
Siemens AG
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Publication date
Application filed by Siemens AG filed Critical Siemens AG
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B03C1/288—Magnetic plugs and dipsticks disposed at the outer circumference of a recipient
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B03C2201/00—Details of magnetic or electrostatic separation
    • B03C2201/26—Details of magnetic or electrostatic separation for use in medical or biological applications

Definitions

  • the invention relates to a device and a method for enrichment and detection of cells in flowing media, in particular of labeled cells in complex media such as blood. 10
  • analytes can also be sorted to a limited extent according to size and magnetic moment, see N. Pamme and A. Manz, Anal. Chem., 2004, 76, 7250.
  • magnetoresistive sensor manufacturers are only offering assays for DNA and protein analysis for in vitro diagnostic use. For example, refer to the Internet addresses of magnabiosciences.com, diagnsticbioseners.com, seahawkbio.com and san.rr.com/magnesensors.
  • a magnetoresistive sensor e.g., GMR sensor
  • GMR sensor magnetoresistive sensor
  • the object of the present invention is therefore to overcome the disadvantages of the prior art and to provide an apparatus and a method for single-cell detection in the flowing medium.
  • the subject matter of the invention is an apparatus for enrichment and detection of cells, wherein at least one magnetoresistor is arranged in an outer, surrounding magnetic field below a channel in which a laminar flow of a medium flows with magnetically marked cells.
  • the invention relates to a method for enrichment and detection of magnetically labeled cells in a laminar flowing medium, wherein cells on a
  • Magnetoresistance be enriched by an external magnetic field.
  • the invention discloses the technique of obtaining an accumulation of labeled cells directly on the magnetoresistors by means of an external magnetic field so that a nearly 100% detection of the labeled cells can be achieved.
  • the flow cytometry shown here makes it almost possible to enumerate individual labeled cells with a near 100% recovery rate when the GMR component overflows dynamically in the flowing medium.
  • treacherous diseases such as cancer, it is sometimes necessary that in about 10ml of whole blood 1 to 100 cells are quantifiable.
  • Single labeled cells in a complex matrix such as blood or partially purified (typically 1: 1000 to 1: 1 000 000) while in the flowing medium are directed to the substrate surface (as close as possible to the GMR sensor)
  • the magnetic field is applied so that an amplification of the gradient of the magnetic field directly below the GMR sensors takes place so that the entry point of the magnetic field lines in the sample space is as close as possible to the GMR sensors.
  • the magnet is arranged directly below the GMR sensors.
  • the embodiment in which the magnet for the outer, the magnetoresistors surrounding magnetic field is beveled on one or both sides, so that results in a flux concentration and an increase of the magnetic field gradient.
  • Cell detection with magnetoresistors is most easily carried out with sophisticated sensors such as the AMR, GMR and / or TMR sensors, the two latter being advantageously designed as so-called spin valves.
  • the laminar flow causes the cells to be transported without turbulence in the liquid stream.
  • cells that come in contact with the surface are caused to rotate due to shear forces and the airfoil.
  • the effect is exploited to on the one hand as possible lead all labeled cells to the magnetoresistors, and on the other hand introduce the statistically distributed immunomagnetic marker on the cell surface by "rolling" close to the GMR sensors.
  • the accumulation of cells in a magnetic field gradient which is currently used only for cell separation, is suitable for specifically enriching the labeled cells from the laminar flow to the substrate surface with the magnetoresistors depending on flow rate and number of magnetic labels per cell.
  • the magnetic force and thus the shear force or holding force can be varied to the enriched cells without the transport of unlabelled cells along the microfluidic channel to prevent.
  • this measurement target is achieved by the following components of a measurement system interacting:
  • GMR sensor has a dimension equivalent to the diameter of a single cell (typically 5-40 microns), to achieve high signal-to-noise ratio and to detect signal from only one cell
  • An external magnetic gradient field is preferably used to guide stochastically distributed and labeled cells in a microfluidic channel to the substrate surface (typically the cell to GMR sensor distance will be 0-1 ⁇ m); then the signal-to-noise ratio can be increased
  • the flowing medium is advantageously laminar, since turbulence can lead to a reduction in the recovery rate of labeled cells.
  • Typical channels have a cross section of 100-1000 ⁇ m width and 100-1000 ⁇ m height. This means that a GMR sensor with cell dimensions is much smaller than the channel size.
  • the individual labeled cells are controlled in the immediate vicinity of the substrate in the flowing medium out.
  • a stochastic distribution of labeled cells on the substrate surface leads to counting losses (for example at 10 ⁇ m GMR in a 100 ⁇ m channel ⁇ 90% loss). Cells are therefore guided along, for example, ferromagnetic strips directly onto a sensor.
  • This measuring arrangement also has the advantage that in the ideal case only a single GMR sensor is necessary to count all marked cells.
  • FIG. 1 shows the two cross sections through an embodiment of a microfluidic channel according to the invention, on the left a cross section along the flow direction and on the right a cross section perpendicular to the flow direction.
  • Figure 1 shows schematically the process of cell enrichment on the substrate surface 8 with the GMR sensors.
  • FIG 1 shows a longitudinal cross section of a microfluidic channel 4 in which a laminar flow, as indicated by the arrow 5, is shown in the left part of the FIGURE. flows.
  • a laminar flow as indicated by the arrow 5
  • unlabeled cells 2 which move evenly distributed in the laminar flow.
  • a magnet 7 is arranged; the image immediately shows the accumulation of the marked cells on the bottom / substrate 8 of the channel within the magnetic field gradient 7.
  • the GMR sensors like all magnetoresistors, can also be connected to the Side walls of the channel wall and / or be arranged at the top of the channel.
  • the enrichment of cells with superparamagnetic markers 1 from a complex medium in a magnetic field 9 is shown.
  • the laminar flow 5 prevents swirling of the cells 1 and 2.
  • the cells 1,2 can roll along the substrate surface 8 and thus come into closest contact with the GMR sensors 3.
  • the strength of the magnetic field but the transport does not interfere with the labeled cells in the microfluidic channel, which can be adjusted, for example, by suitable pulsed operation and by the symmetry of the gradient field.
  • the microfluidic channel 4 can be seen in cross-section through the flow direction.
  • the field lines 9 of the magnetic field which have their origin in the GMR sensors 3 and therefore cause a gradient amplification of the magnetic field.
  • the magnet 7 has at least one bevel 6 towards the GMR sensors, but preferably 2 bevels 6 as shown.
  • Figure 2 shows the same image as Figure 1 in longitudinal cross-section and illustrates the cell rolling within the laminar flow 5.
  • the three phases of the CeIl- Rollings can be seen, first (A) the enrichment of the labeled cells 1 on the substrate surface of the bottom. 8 of the microfluidic channel 4 in the magnetic field 9, then (B) cell rolling over the sensor surface, where (C) cell detection takes place.
  • the gradient magnetic field (-100 mT with dB / dx of a few 10-100 T / m, depending on the loading of the cells with superparamagnetic particles) pulsed.
  • the detection of the labeled cells takes place in a weak measuring magnetic field of ⁇ ImT.
  • FIG. 3 shows in time sequence the strength of the magnetic field for cell enrichment, cell detection and GMR measurement.
  • the time is plotted on the X-axis, so that it can be seen that always two magnetic field strengths are applied in temporal change.
  • a method of continuous cell enrichment and cell detection may be performed by a sequence of pulsed magnetic fields.
  • FIG. 3 shows the cyclical sequence of (1) enrichment, (2) + (3) measurement for a continuous measurement, which is illustrated graphically.
  • the measurement and accumulation of the cells can thus be tracked or controlled independently of each other in the kHz range.
  • Figure 3 how at the very top with a "strong magnetic field and long pulse times" cell enrichment takes place within the microfluidic channel, below which is a graph showing that a weaker magnetic field with less pulse time is used for cell detection Graphic as with low magnetic field and short pulse time the GMR measurement is completed.
  • FIG. 4 again shows a microfluidic channel, again in cross section perpendicular to the flow direction as in FIG. 1 on the right side.
  • the measuring magnetic field can be applied vertically or in the same plane as the GMR sensors (FIG. 4).
  • the magnet (magnetic yoke) of the gradient magnetic field can be used to set a gradient in the measuring magnetic field in order to achieve a local detuning of the bridge members of the GMR measuring bridge. This detuning represents the measurement signal for the concentration of the magnetic particles in the sensor region.
  • the measuring magnetic field can additionally be time-modulated in order, for example, to obtain a time delay. using lock-in technology and suppressing the low-frequency noise (1 / f noise) to improve the signal-to-noise ratio.
  • pulsed magnetic fields are enriched and detected as shown in FIG.
  • FIG. 4 the schematic arrangement of the magnets or coils 7, 10 and 11 for enrichment and detection around the microfluidic channel 4 is shown.
  • the magnet 7 for the strong magnetic field is applied for enrichment below the GMR sensors and the coils 10 and 11 for the weak magnetic field are applied perpendicular to the GMR sensor for detection. Both fields can be controlled separately with 2 magnets, wherein preferably the weak magnetic field is applied in the sensor plane.
  • the accumulation of the cells or the applied shear force on the cells can be controlled by the magnetic field strength and the flow rate.
  • Marked cells are near the surface and can be sensitively detected with magnetoresistive components.
  • the presented method allows a large area application for multiplexing (e.g., array of GMR sensors).
  • Cell rolling can be adapted to the application by means of surface-functionalized microfluidic channels, for example functionalized with receptors (selectins), biological components (proteins, polysaccharides), or SAMs (self-assembled mono- layer) or by silanization.
  • receptors selectiveins
  • biological components proteins, polysaccharides
  • SAMs self-assembled mono- layer
  • Circulating tumor cells CTC
  • tumor stem cells inflammatory cells
  • stem cells inflammatory cells
  • bacteria or yeasts may precede the actual detection in the flowing medium.
  • the magnetic detection can be done with optical methods
  • Areas of application in the human area include:
  • Oncology regenerative medicine, infectiology, clinical diagnostics, clinical chemistry, imaging.

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Abstract

Vorrichtung und ein Verfahren zur Anreicherung und Erfassung von Zellen in strömenden Medien, insbesondere von magnetisch markierten Zellen in komplexen Medien wie beispielsweise Blut. Dazu wird zumindest ein Magnet mit zumindest einem Magnetowiderstand gekoppelt eingesetzt.

Description

Beschreibung
Vorrichtung und Verfahren zur Anreicherung und Erfassung von Zellen in strömenden Medien 5
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Anreicherung und Erfassung von Zellen in strömenden Medien, insbesondere von markierten Zellen in komplexen Medien wie beispielsweise Blut. 10
Bisher gibt es keine nicht-optische Lösung um verlässliche Einzelzelldetektion mit magnetischen Durchflusszytometer in laminarer Strömung durchzuführen.
15 Die gegenwärtig bekannten technischen Lösungen zur Einzelzelldetektion sind vorwiegend optische Methoden, um Zellen mit fluoreszierenden Markern oder durch Streulicht aus einer Suspension in Durchflusskanälen zu detektieren. Magnetische Methoden beschränken sich vorwiegend auf Anreicherungen von
20 magnetisch markierten Zellen sowie Biosensoren mit magnetore- sistiven Transducer.
Folgende magnetische Methoden sind bekannt:
251) Anlegen eines externen Magnetfeldes rechtwinklig zur Durchflussrichtung. In einem Gradientenfeld können zudem im eingeschränkten Masse Analyte nach Größe und magnetischem Moment sortiert werden, siehe dazu N. Pamme and A. Manz, Anal. Chem., 2004, 76, 7250.
30
2) Einbau eines ferromagnetischen Leiters im Boden der Trennkammer. Durch den lokalen Feldgradienten werden magnetisier- bare Zellen am Boden entlang des ferromagnetischen Leiters angereichert bei Durchflussraten von <1 mm/s von unmarkierten
35 Zellen getrennt D. W. Inglis, R. Riehn, R. H. Austin and J. C. Sturm, Appl. Phys . Lett., 2004, 85, 5093. 3) Ein Stromleiter wird am Boden der Trennkammer eingebracht. Durch den Stromfluss wird ein Magnetfeld induziert, dass wiederum - wie unter Punkt 2 ausgeführt - verwendet werden kann, um Zellen anzureichern (Durchflussrate: 6 nl/min in Mikrofluidikkanälen) Pekas, N., Granger, M., Tondra,
M., Popple, A. and Porter, M. D, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 293, pp . 584-588, (2005) . c) M. Tondra, M. Granger, R. Fuerst, M. Porter, C. Nordman, J. Taylor, and S. Akou, IEEE Transactions on Magnetics 37, (2001), pp . 2621- 2623.
Die Detektion markierter Zellen mit eingebetteten GMR Sensoren kann bisher nur statisch analog zu einem Assay und nicht dynamisch, also beispielsweise in laminarer Strömung, durch- geführt werden. siehe dazu: J. Schotter, P. B. Kamp, A. Becker, A. Puhler, G. Reiss and H. Brückl, Biosens. Bioe- lectron., 2004, 19, 1149.
Kommerzielle Hersteller von Sensoren mit magnetoresistiven Elementen bieten nur Assays für DNA und Proteinanalytik für die In-vitro-Diagnostik an. Dazu sei beispielsweise auf die Internet-Adressen von magnabiosciences.com, diagnsticbiosen- sors.com, seahawkbio.com und san.rr.com/magnesensors verwiesen .
In bekannten magnetischen Durchflusszytometer werden Zellen, die mit magnetischen, beispielsweise superparamagnetischen Labels, markiert sind, in einer Durchflusskammer oberflächennah über einen magnetoresistiven Sensor (z.B. GMR Sensor) transportiert wie z.B. N. Pekas, M. D. Porter, M. Tondra, A. Popple and A. Jander, Appl . Phys . Lett., 2004, 85, 4783 beschrieben .
Problematisch dabei ist, dass die erforderliche Nähe der mar- kierten Zelle zum Sensor nicht erreicht wird, da das magnetische Streufeld durch die magnetischen Marker mit der dritten Potenz zum Abstand vom Sensor abfällt. Es können daher mit den bislang bekannten Verfahren in der Regel bei weitem nicht alle markierten Zellen erfasst werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die Nachtei- Ie des Standes der Technik zu überwinden und eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Einzelzelldetektion im strömenden Medium anzugeben.
Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der Erfindung, wie er in den Ansprüchen, der Beschreibung und den Figuren offenbart ist, gelöst.
Demnach ist Gegenstand der Erfindung eine Vorrichtung zur Anreicherung und Detektion von Zellen, wobei unterhalb eines Kanals, in dem eine laminare Strömung eines Mediums mit magnetisch markierten Zellen fließt, zumindest ein Magnetowiderstand in einem äußeren, ihn umgebenden Magnetfeld angeordnet ist. Außerdem ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Anreicherung und Detektion von magnetisch markierten Zellen in einem laminar strömenden Medium, wobei Zellen an einem
Magnetowiderstand durch ein äußeres Magnetfeld angereichert werden .
Die Erfindung offenbart also erstmalig die Technik, wie durch ein äußeres Magnetfeld eine Anreicherung von markierten Zellen direkt an den Magnetowiderständen erreicht wird, so dass eine nahezu 100% Erfassung der markierten Zellen erreichbar ist .
Dabei handelt es sich eben um Zellen, wie sie in Lebewesen, beispielsweise Tiere/Menschen vorkommen.
Durch die hier gezeigte Durchflsszytometrie ist es nahezu möglich, einzelne markierte Zellen mit nahe 100% Wiederfin- dungsrate beim Überfließen des GMR-Bauteils dynamisch im fließenden Medium abgezählt werden können. Insbesondere bei tückischen Krankheiten wie Krebs ist es zum Teil nötig, dass in ca. 10ml Vollblut 1 bis 100 Zellen quantifizierbar sind.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform werden
a. Einzelne markierte Zellen in einer komplexen Matrix wie Blut oder teilaufgereinigt (typischerweise 1:1000 bis 1:1 000 000), während Sie sich im strömenden Medium befinden, an die Substratoberfläche geführt (so nah wie möglich am GMR sensor)
b. An der Oberfläche werden sie hinsichtlich des GMR Sensors im laminaren Fluss ausgerichtet (Zellen dürfen nicht stochastisch verteilt über das Substrat mit dem Sensor/den Sensoren fließen)
c. Detektion von Zellen erfolgt einzeln (werden „abgezählt"; daher magnetische Durchflusszytometrie) ; dazu ist ein ausreichend hohes Signal-Rausch-Verhältnis vorteilhaft.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird das Magnetfeld so angelegt, dass eine Verstärkung des Gradienten des Magnetfelds direkt unterhalb der GMR-Sensoren so stattfindet, dass der Eintrittspunkt der Magnet-Feldlinien in den Probenraum möglichst nahe bei den GMR-Sensoren liegt.
Dazu wird nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Vorrichtung der Magnet direkt unterhalb der GMR-Sensoren ange- ordnet.
Insbesondere vorteilhaft ist die Ausführungsform, bei der der Magnet für das äußere, die Magnetowiderstände umgebende Magnetfeld an einer oder beiden Seiten angeschrägt wird, so dass daraus eine Flusskonzentration und ein Erhöhung des Magnetfeldgradienten resultiert. Die Zelldetektion mit Magnetowiderständen erfolgt am einfachsten mit den technisch ausgereiften Sensoren wie den AMR, GMR, und/oder TMR - Sensoren, wobei die beiden letzteren vorteilhaft als sogenannte Spin Valves ausgeführt sind.
Die laminare Strömung bewirkt, dass die Zellen ohne Verwirbe- lung im Flüssigkeitsstrom transportiert werden. Jedoch werden Zellen, die in Kontakt mit der Oberfläche kommen, aufgrund auftretender Scherkräfte und dem Strömungsprofil in Rotation gebracht. Gemäß der Erfindung wird der Effekt ausgenutzt, um einerseits möglichst alle markierten Zellen an die Magnetowiderstände hinzu führen, und andererseits die statistisch verteilen immunomagnetischen Marker auf der Zelloberfläche durch „Abrollen" nahe an die GMR Sensoren heranzuführen.
Die Anreicherung von Zellen in einem Magnetfeldgradienten, die gegenwärtig nur für die Zellseparation eingesetzt wird, eignet sich, um gezielt in Abhängigkeit von Durchflussrate und Anzahl der magnetischen Labels pro Zelle die markierten Zellen aus der laminaren Strömung an die Substratoberfläche mit den Magnetowiderständen anzureichern. Darüber hinaus kann durch die die Durchflussgeschwindigkeit und die Stärke des Gradienten die Magnetkraft und damit die Scherkraft bzw. Haltekraft auf die angereicherten Zellen variiert werden ohne den Transport von unmarkierten Zellen entlang des mikroflui- dischen Kanals zu unterbinden.
Bevorzugt wird dieses Messziel dadurch erreicht, dass folgende Komponenten eines Messsystems zusammenspielen:
d. GMR Sensor hat eine Dimension, die dem Durchmesser einer Einzelzelle entspricht (typischerweise 5-40 μm) , um hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen und Signal nur von einer Zelle zu detektieren
e. Um einzelne Zellen in einem großen Probenvolumen messen zu können, werden diese in einem strömenden Medium geführt f. Ein externes magnetisches Gradientenfeld wird bevorzugt eingesetzt, um stochastisch verteilte und markierte Zellen in einem Mikrofluidikkanal an die Substratoberfläche zu führen (typischerweise wird der Abstand der Zelle zum GMR Sensor 0-1 μm betragen) ; dann kann das Signal-Rausch Verhältnis erhöht werden
g. Das strömende Medium ist vorteilhafterweise laminar, da eine Verwirbelung zur Reduktion der Wiederfindungsra- te von markierten Zellen führen kann. Typische Kanäle haben einen Querschnitt von 100- 1000 μm Breite und 100-1000 μm Höhe. Das bedeutet, dass ein GMR Sensor mit Zelldimensionen wesentlich kleiner ist als die Kanalgröße.
Die einzelnen markierten Zellen werden kontrolliert in unmittelbarer Substratnähe im strömenden Medium geführt. Eine sto- chastische Verteilung von markierten Zellen auf der Substratoberfläche führt zu Zählverlusten (beispielsweise bei lOμm GMR in einem 100 μm Kanal ~90%Verlust) . Zellen werden daher entlang von beispielsweise ferromagnetischen Streifen direkt auf einen Sensor hingeführt. Diese Messanordnung hat zudem den Vorteil, dass im Idealfall nur ein einzelner GMR Sensor notwendig ist, um alle markierten Zellen abzuzählen.
Im Folgenden wird die Erfindung noch anhand einiger Figuren näher erläutert:
Figur 1 zeigt die zwei Querschnitte durch eine Ausführungsform eines Mikrofluidkanals gemäß der Erfindung, links einen Querschnitt entlang der Strömungsrichtung und rechts einen Querschnitt senkrecht zur Strömungsrichtung.
Figur 1 zeigt schematisch den Prozess der Zellanreicherung auf der Substratoberfläche 8 mit den GMR-Sensoren .
Zu erkennen ist ein im linken Teil der Figur ein längsseitiger Querschnitt eines Mikrofluidikkanals 4 in dem eine laminare Strömung, wie sie über den Pfeil 5 angezeigt wird, strömt. Dabei befinden sich in der Nähe zum Pfeil 5 markierte Zellen 1 und unmarkierte Zellen 2, die sich gleichmäßig verteilt in der laminaren Strömung bewegen. Etwas rechts davon und unterhalb des Mikrofluidikkanals 4 ist ein Magnet 7 ange- ordnet, man erkennt im Bild sofort die Anreicherung der markierten Zellen am Boden/Substrat 8 des Kanals innerhalb des Magnetfeldgradienten 7. Die GMR-Sensoren wie alle Magnetowiderstände können dabei auch an den Seitenwänden der Kanalwand und/oder oben am Kanal angeordnet sein. Wiederum etwas weiter rechts, also in Strömungsrichtung, befinden sich am Boden/Substrat 8 des Kanals mehrere GMR Sensoren 3. Durch das „Cell-Rolling" am Kanalboden und die Anreicherung der markierten Zellen durch das äußere Magnetfeld ist es möglich, dass möglichst viele der markierten Zellen auch tatsächlich von den GMR-Sensoren erfasst werden.
Hier wird die Anreicherung von Zellen mit superparamagneti- schen Markern 1 aus einem komplexen Medium in einem Magnetfeld 9 gezeigt. Die laminare Strömung 5 verhindert eine Ver- wirbelung der Zellen 1 und 2. Durch Einstellung der Magnetfeldstärke können die Zellen 1,2 entlang der Substratoberfläche 8 rollen und kommen so in engsten Kontakt mit den GMR Sensoren 3. Die Stärke des Magnetfeldes soll aber den Transport der markierten Zellen im Mikrofluidikkanal nicht behin- dern, was beispielsweise durch einen geeigneten Pulsbetrieb sowie durch die Symmetrie des Gradientenfeldes eingestellt werden kann.
Rechts und im Abstand zu dem linken Teil der Figur 1 ist der Mikrofluidikkanal 4 im Querschnitt durch die Strömungsrichtung zu sehen. Zu erkennen sind die Feldlinien 9 des Magnetfeldes, die ihren Ursprung bei den GMR-Sensoren 3 haben und daher eine Gradientenverstärkung des Magnetfeldes bewirken. Dies ist maßgeblich darauf zurückzuführen, dass der Magnet 7 zu den GMR-Sensoren hin eine zumindest eine Schräge 6 hat, bevorzugt aber 2 Schrägen 6 wie gezeigt. Figur 2 zeigt das gleiche Bild wie Figur 1 im Längsquerschnitt und verdeutlicht das Cell-Rolling innerhalb der laminaren Strömung 5. Zu erkennen sind die drei Phasen des CeIl- Rollings, erstens (A) die Anreicherung der markierten Zellen 1 auf der Substratoberfläche des Bodens 8 des Mikrofluidikka- nals 4 im Magnetfeld 9, dann (B) das Cell-Rolling über die Sensoroberfläche wobei (C) die Zelldetektion stattfindet.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird, um eine Zelldetektion mit dem GMR Sensor (z.B. als Wheatsto- ne-Brückenschaltung) vorzunehmen, beispielsweise für eine kontinuierliche Anreicherung der Zellen das Gradienten- Magnetfeld (-100 mT mit dB/dx von einigen 10-100 T/m; abhängig von der Beladung der Zellen mit superparamagnetischen Partikeln) gepulst. Die Detektion der markierten Zellen erfolgt in einem schwachen Mess-Magnetfeld von ~ ImT.
In Figur 3 ist in zeitlicher Abfolge die Stärke des Magnetfeldes für die Zellanreicherung, Zelldetektion und die GMR- Messung gezeigt. Auf der X-Achse ist die Zeit aufgetragen, so dass zu erkennen ist, dass immer zwei Magnetfeldstärken im zeitlichen Wechsel angelegt werden. So kann ein Verfahren zur kontinuierlichen Zellanreicherung und Zelldetektion durch eine Abfolge von gepulsten Magnetfeldern durchgeführt werden.
Zu erkennen ist in Figur 3 die zyklische Abfolge von (1) Anreicherung, (2) +(3) Messung für eine kontinuierliche Messung, die bildlich graphisch dargestellt ist. Die Messung und Anreicherung der Zellen kann damit unabhängig voneinander im kHz Bereich verfolgt bzw. gesteuert werden. Zu erkennen ist in Figur 3 wie ganz oben mit einem „starken Magnetfeld und langen Pulszeiten" Zellanreicherung innerhalb des Mikroflui- dikkanals stattfindet. Darunter ist eine Graphik, die zeigt, dass ein schwächeres Magnetfeld mit geringerer Pulszeit zur Zelldetektion eingesetzt wird. Schließlich zeigt die unterste Graphik wie mit schwachem Magnetfeld und kurzer Pulszeit die GMR-Messung vollzogen wird. In Figur 4 ist wieder ein Mikrofluidikkanal zu sehen, wieder im Querschnitt senkrecht zur Strömungsrichtung wie in Figur 1 auf der rechten Seite.
Für die GMR Messung kann das Mess-Magnetfeld senkrecht oder in gleicher Ebene zu den GMR Sensoren angelegt werden (Figur 4) . Dabei kann der Magnet (Magnetjoch) des Gradientenmagnetfeldes zur Einstellung eines Gradienten im Mess-Magnetfeld benutzt werden, um eine lokale Verstimmung der Brückenglieder der GMR Messbrücke zu erreichen. Diese Verstimmung stellt das Messsignal für die Konzentration der magnetischen Partikel im Sensorbereich dar. In einer möglichen Ausgestaltungsform kann das Mess-Magnetfeld zusätzlich noch zeitlich moduliert werden, um z.B. mittels Lock-in Technik messen zu kön- nen und die niederfrequenten Rauschanteile (1/f- Rauschen) zu unterdrücken, um das Signal-Rauschverhältnis zu verbessern.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform wird mit gepulsten Magnetfeldern angereichert und detektiert wie in Figur 3 ge- zeigt. In Figur 4 wird dabei die schematische Anordnung der Magnete oder Spulen 7, 10 und 11 zur Anreicherung und Detek- tion um den Mikrofluidikkanal 4 gezeigt. Dabei wird beispielsweise der Magnet 7 für das starke Magnetfeld zur Anreicherung unterhalb der GMR-Sensoren angelegt und die Spulen 10 und 11 für das schwache Magnetfeld zur Detektion senkrecht zum GMR Sensor angelegt. Beide Felder können getrennt mit 2 Magneten gesteuert werden, wobei bevorzugt das schwache Magnetfeld in der Sensorebene angelegt wird.
Die wesentlichen Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens sind wie folgt:
1) Kontinuierliches Messverfahren um magnetisch markierte Zellen anzureichern und im Durchfluss zu erfassen.
2) Die Anreicherung der Zellen bzw. die ausgeübte Scherkraft auf die Zellen kann durch die Magnetfeldstärke und die Durchflussgeschwindigkeit gesteuert werden. 3) Markierte Zellen sind oberflächennah und können mit magnetoresistiven Bauteile sensitiv detektiert werden.
4) Das vorgestellte Verfahren erlaubt eine großflächige Anwendung für Multiplexing (z.B. Array von GMR Sensoren) .
5) Das „Cell-Rolling" kann mit Hilfe von oberflächenfunkti- onalisierten Mikrofluidikkanälen an die Anwendung ange- passt werden. Die Funktionalisierung kann beispielsweise mit Rezeptoren (Selektinen) , biologische Komponenten (Proteinen, Polysaccharide), durch SAMs (self-assembled mono- layer) oder durch Silanisierung durchgeführt werden.
6) Eine Anreicherung von markierten Zellen, wie seltene
Krebszellen (CTC; circulating tumor cells) , Tumorstammzellen, Inflammationszellen, Stammzellen, Bakterien oder Hefen, kann der eigentlichen Detektion im strömenden Medium vorausgehen .
7) Die magnetische Detektion kann mit optischen Methoden
(FACS, Fluoreszenz, Absorption), und elektrischen Methoden (Impedanz, Dielektrophorese) kombiniert werden.
8) Anwendungsfelder im Humanbereich sind unter anderem:
Onkologie, regenerative Medizin, Infektiologie, klinische Diagnostik, klinische Chemie, Imaging.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur Anreicherung und Detektion/Erfassung von Zellen, wobei in einem Kanal (4), in dem eine lamina- re Strömung (5) eines Mediums mit magnetisch markierten
Zellen (1) fließt, zumindest ein Magnetowiderstand (3) in zumindest einem äußeren, ihn umgebenden Magnetfeld (9) angeordnet ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der das Medium ein komplexes Medium wie Blut ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Ursprung der Feldlinien des Magnetfeldes (9) bei dem zumindest ei- nen Magnetowiderstand (3) liegt.
4. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Kanal (4) ein Mikrofluidikkanal ist.
5. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei zur Erzeugung des umgebenden Magnetfeldes zumindest ein Magnet (7) unterhalb des zumindest einen Magnetowiderstandes (3) angeordnet ist.
6. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Magnetowiderstand (3) ein GMR-Sensor ist.
7. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei ein weiteres Magnetfeld vorgesehen ist.
8. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei ein weiteres Magnetfeld durch eine in unmittelbarer Nähe zum Magnetowiderstand angeordnete Spule (10,11) erzeugt wird.
9. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei eine Spule (10,11) senkrecht zu dem Magnetowiderstand angeordnet ist.
10. Verfahren zur Anreicherung und Detektion von magnetisch markierten Zellen in einem laminar strömenden Medium, wobei Zellen an einem Magnetowiderstand durch zumindest ein äußeres Magnetfeld angereichert werden.
11. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der zumindest eine Magnetowiderstand im Kanal in gepulstem Betrieb von zumindest zwei Magnetfeldern umgeben ist.
12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die zumindest zwei Magnetfelder, die gepulst angelegt werden, sich in Größenordnungen an Stärke unterscheiden.
13. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die zumindest zwei Magnetfelder sich in ihrer Stärke um zumindest einen Faktor 100 unterscheiden.
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