EP1198712A2 - Verfahren zum darstellen von biologisch aktivierten induktivitätsändernden partikeln sowie vorrichtung dafür - Google Patents

Verfahren zum darstellen von biologisch aktivierten induktivitätsändernden partikeln sowie vorrichtung dafür

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EP1198712A2
EP1198712A2 EP00920436A EP00920436A EP1198712A2 EP 1198712 A2 EP1198712 A2 EP 1198712A2 EP 00920436 A EP00920436 A EP 00920436A EP 00920436 A EP00920436 A EP 00920436A EP 1198712 A2 EP1198712 A2 EP 1198712A2
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inductivity
changing
measuring
metal coil
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Kilian Hennes
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    • G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
    • G01N2015/019—Biological contaminants; Fouling

Definitions

  • the invention relates to a method for the display of biologically activated inductivity-changing — especially ferromagnetic or superparamagnetic
  • the invention also relates to a device for the detection and counting of suspended biological microparticles in liquid samples, in particular for carrying out the method mentioned.
  • Bacteria, blood cells or cell components in aqueous solutions have so far been counted using a flow cytometer or Coulter counter.
  • the corresponding particles are colored and identified using optical signals or paid by capacitive measurements.
  • monovalent primary antibodies are mixed with inductivity-changing, especially ferromagnetic or superparamagnetic, particles in multiple excess, which are coated with secondary antibodies; then, by means of partial sedimentation in a centrifuge, aggregated particles are separated, which consist of a monovalent primary antibody and antibody coated ferromagnetic partial particles exist.
  • inductivity-changing especially ferromagnetic or superparamagnetic, particles in multiple excess, which are coated with secondary antibodies; then, by means of partial sedimentation in a centrifuge, aggregated particles are separated, which consist of a monovalent primary antibody and antibody coated ferromagnetic partial particles exist.
  • viruses or gene probes can also be used, against whose hull proteins or spacer molecules the secondary antibodies are directed.
  • the biological particles for detection or counting can be linked immunologically, phagologically or molecular biologically with aggregated particles which can be measured when subsequently flowing through a metal coil - in particular the gap in a C-shaped metal coil with a ferromagnetic core and trigger affordable changes in inductance.
  • the metal coil as part of an electronic resonant circuit is intended to generate payable changes in the natural oscillation frequency.
  • a different measuring principle is used for the detection of the individual particle: the measurement of the change in inductance of a metal micro coil.
  • biological particles have a permeability constant ⁇ of approximately 1, they have to be marked with inductivity-changing substances beforehand for detection and payment by means of a coil.
  • This labeling takes place through the immunological, phagological or molecular biological coupling of ferromagnetic or superparamagnetic particles which are monovalently linked either to antibodies, to virus docking molecules or to gene probes on spacer molecules.
  • a device of the type mentioned at the outset with a feed line for a sample to be measured, which is surrounded as a measuring line by a metal coil as a measuring coil, which in turn is connected to a device for exciting the vibration and measuring resonance events.
  • this metal coil is placed around an approximately C-shaped core, the ends of which delimit a gap; the measuring line is laid through this gap.
  • the delivery line is connected to a device with capillaries - in particular with Teflon capillaries; the latter are assigned to an electromagnet and can be arranged in a space surrounded by a pole piece.
  • a branch line for excess samples is advantageously provided between the electromagnets and a valve of the delivery line.
  • a resistance and a capacitor can be arranged upstream of that device for exciting the vibration and measuring resonance events towards the metal coil.
  • the measuring coil, a piezo pump arranged upstream of it and a downstream resistor or capacitor are intended to be parts of a microsystem unit.
  • the coupling of the ferromagnetic markers thus takes place in the device, which at the same time enables the particles to be paid to be enriched: the markers are held in that Teflon capillary by means of an electromagnet as a sorption layer until the entire sample has been pumped into the capillary and at the same time the excess sample has run out of the capillary. The magnet is then switched off so that the markers diffuse freely and the surface of the biological particles can sate. Then the capillary content is pumped through the metal coil with the above-mentioned piezoelectric pump, in particular through the gap of the C-shaped metal coil with ferromagnetic core.
  • the metal coil was etched onto a printed circuit board as a spiral and is connected as a resonant circuit with a capacitor and resistor.
  • the oscillating circuit is excited with a frequency that corresponds to the natural oscillation frequency that is generated when an average marked biological microparticle is in the coil or in the gap. This creates a resonance oscillation in the resonant circuit whenever a corresponding microparticle passes through the coil.
  • An example of the application of this method is the detection of coli bacteria in water samples.
  • monovalent primary E. -coli-specific antibodies conjugated to secondary antibodies coupled to megnetic beads The suspension of these conjugates is pumped into the Teflon capillary and fixed there by means of an electromagnet.
  • coli bacteria are retained on the conjugates via the primary antibodies.
  • the suspension of magnetically marked coli bacteria can be pumped through the measuring coil or the gap in the metal coil.
  • the number of resonance events in the connected resonant circuit corresponds to the number of coli bacteria in the original water sample.
  • the detection device uses this measurement method.
  • particles such as bacteria, cells or cell components in aqueous solutions are detected and counted.
  • This technique enables miniaturization of the automatic particle counting process.
  • the particles are marked by reaction with monovalent antibody-coated or virus-coated ferromagnetic particles before the measurement.
  • the inductive measurement is based on passing the ferromagnetic particles aggregated with the biological particles through the microcoil of an electronic resonant circuit designed in the manner described. The resonance events that occur as they pass are counted.
  • the device according to the invention can be used in medicine, microbiology and hygiene, for example for counting blood cells; ecologically relevant microorganisms can be counted or pathogens detected.
  • FIGS. 1, 3 a detail of FIGS. 1, 3 in a schematic oblique view.
  • the reagent with ferromagnetic, biologically activated particles is pumped via lines 12 and 16 into a Teflon capillary 20 and fixed there by means of an electromagnet 22, the magnet coil of which is designated 24 and to which the Z-shaped wound Teflon capillary 20 in a concentric pole shoe 26 is assigned.
  • the free ends 38, 38 a of the measuring coil 36, 36 a are - after a resistor 42 and a capacitor 44 - connected to a device 46 for exciting the vibration and for measuring resonance events; there is a conversion into counts.
  • the number of resonance events in the connected resonant circuit corresponds to the number of coli bacteria in the original water sample Z.
  • a line branch 18 - containing a valve 48 - for excess sample portions Q is provided between the Teflon capillary 20 and the piezo pump 32 .

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Abstract

Bei einem Verfahren für die Darstellung von biologisch aktivierten induktivitätsändernden - insbesondere ferromagnetischen bzw. superparamagnetischen - Partikeln werden monovalente primäre Antikörper, Viren oder Gensonden mit induktivitätsändernden Partikeln im Überschuss gemischt, welche mit sekundären Antikörpern beschichtet sind, und anschliessend mittels partieller Sedimentation aggregierte Partikel abgetrennt; diese bestehen aus einem monovalenten primären Antikörper und antikörper-beschichteten induktivitätsändernden Teilpartikeln. Bei einer Vorrichtung zum Nachweis und Zählen für suspendierte biologische Mikropartikel in flüssigen Proben ist eine Förderleitung (16) für eine zu messende Probe als Messleitung (34) von einer Metallspule als Messspule (36a) umgeben und diese an eine Einrichtung (46) zum Anregen der Schwingung und Messen von Resonanzereignissen angeschlossen; die Metallspule (36a) ist um einen etwa C-förmig gebogenen Kern (50) gelegt und dieser weist einen Spalt (52) auf, durch den die Messleitung (34) geführt ist.

Description

BESCHREIBUNG
Verfahren zum Darstellen von biologisch aktivierten induktivitatsandernden Partikeln sowie Vorrichtung dafür
Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Darstellung von biologisch aktivierten induktivitatsandernden -- msbe- sondere ferromagnetischen bzw. superparamagnetischen
Partikeln. Zudem betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum Nachweis und Zahlen von suspendierten biologischen Mikropartikeln in flussigen Proben, insbesondere zum Durchfuhren des genannten Verfahrens.
Das Zahlen von Bakterien, Blutzellen oder Zellbestandteilen in wassrigen Losungen erfolgt bisher mittels Durch- flusszytometer oder Coultercounter . Hier werden die entsprechenden Partikel gefärbt und anhand von optischen Signalen identifiziert oder durch kapazitive Messungen gezahlt .
In Kenntnis dieser Gegebenheiten hat sich der Erfinder das Ziel gesetzt, derartige Messungen zu vereinfachen.
Zur Losung dieser Aufgabe fuhrt die Lehre des unabhängigen Anspruches; die Unteranspruche geben günstige Weiterbildungen an. Zudem fallen in den Rahmen der Erfindung alle Kombinationen aus zumindest zwei der in der Beschreibung, der Zeichnung und/oder den Ansprüchen offenbarten Merkmalen.
Erfmdungsgemaß werden monovalente primäre Antikörper mit induktivitatsandernden, vor allem ferromagnetischen bzw. superparamagnetischen, Partikeln in mehrfachem Uberschuss gemischt, welche mit sekundären Antikörpern beschichtet sind; anschließend werden mittels partieller Sedimentation in einer Zentrifuge aggregierte Partikel abgetrennt, die aus einem monovalenten primären Antikörper und antikorper- beschichteten ferromagnetischen Teilpartikeln bestehen. Anstelle primärer Antikörper können auch Viren oder Gensonden verwendet werden, gegen deren Hullproteine bzw. Spacer- molekule die sekundären Antikörper gerichtet sind.
Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung können die biologischen Partikel zum Nachweis bzw. zum Zahlen immunologisch, phagologisch oder molekularbiologisch mit aggre- gierten Partikeln verbunden werden, die beim anschließenden Durchströmen einer Metallspule — insbesondere des Spaltes einer C-formigen Metallspule mit ferromagnetischem Kern -- messbare und zahlbare Induktivitatsanderungen auslosen.
Auch hat es sich als gunstig erwiesen, mduktivitatsan- dernde Partikel vor dem Durchströmen der Metallspule mittels Elektromagnet in einer Kunststoffkapillare festzuhalten und dort mit den in die Kapillare einströmenden biologischen Partikeln zu verbinden, wahrend die Probe, in welcher diese enthalten waren, aus der Kapillare herausge- fuhrt wird. Zudem sollen durch die Metallspule als Teil eines elektronischen Schwingkreises zahlbare Änderungen der Eigenschwingfrequenz erzeugt werden.
Um den apparativen Aufwand bei der optischen Messung zu um- gehen und eine höhere Spezifitat gegenüber der kapazitiven Messung zu erreichen, wird also für den Nachweis des einzelnen Partikels ein geändertes Messprinzip eingesetzt: Die Messung der Induktivitatsanderung einer Mikrospule aus Metall. Da biologische Partikel aber eine Permeabilitatskon- stante μ von annähernd 1 haben, müssen diese zum Nachweis und zur Zahlung mittels Spule zuvor mit induktivitatsandernden Substanzen markiert werden. Diese Markierung geschieht durch die immunologische, phagologische oder mole- kularbiologische Ankopplung von ferromagnetischen bzw. superparamagnetischen Partikeln, welche monovalent entweder mit Antikörpern, mit Virus-Andockmolekulen oder mit Gensonden an Spacermolekulen verbunden sind. Im Rahmen der Erfindung liegt eine Vorrichtung der eingangs genannten Art mit einer Forderleitung für eine zu messende Probe, die als Messleitung von einer Metallspule als Messspule umgeben ist, welche ihrerseits an eine Einrich- tung zum Anregen der Schwingung und Messen von Resonanzereignissen angeschlossen ist.
In einer besonderen Ausgestaltung ist diese Metallspule um einen etwa C-formig gebogenen Kern gelegt, dessen Enden einen Spalt begrenzen; durch diesen Spalt ist die Messleitung gelegt.
Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung ist die Forderleitung an eine Einrichtung mit Kapillaren -- insbesondere mit Teflonkapillaren -- angeschlossen; letztere sind einem Elektromagneten zugeordnet und können in einem von einem Polschuh umgebenen Raum angeordnet sein.
Vorteilhafterweise ist zwischen den Elektromagneten und einem Ventil der Förderleitung eine Zweigleitung für überschüssige Proben vorgesehen. Zudem können jener Einrichtung zum Anregen der Schwingung und Messen von Resonanzereignissen zur Metallspule hin wengistens ein Widerstand sowie ein Kondensator vorgeordnet sein.
Die Messspule, eine ihr vorgeordnete Piezopumpe und ein nachgeordneter Widerstand bzw. Kondensator sollen erfin- dungsgemaß Teile einer mikrosystemtechnischen Einheit sein.
Die Ankopplung der ferromagnetischen Marker geschieht also in der Vorrichtung, welche gleichzeitig eine Anreicherung der zu zahlenden Partikel ermöglicht: Die Marker werden in jener Teflonkapillare mittels eines Elektromagneten als Sorptions-Schicht festgehalten, bis die gesamte Probe in die Kapillare gepumpt wurde und gleichzeitig die überschüssige Probe aus der Kapillare herausgelaufen ist. Hierauf wird der Magnet ausgeschaltet, damit die Marker frei diffundieren und die Oberfläche der biologischen Partikel sattigen können. Dann wird der Kapillaren-Inhalt mit der erwähnten piezoelektrischen Pumpe durch die Metallspule gepumpt, insbesondere durch den Spalt der C-formig gestalteten Metallspule mit ferromagnetischem Kern. Die Metall- spule wurde als Spirale auf eine Leiterplatte geatzt und ist mit Kondensator und Widerstand als Schwingkreis geschaltet. Der Schwingkreis wird mit einer Frequenz angeregt, die derjenigen Eigenschwingfrequenz entspricht, welche generiert wird, wenn sich ein durchschnittlich mar- kierter biologischer Mikropartikel in der Spule bzw. im Spalt befindet. Dadurch entsteht im Schwingkreis immer dann eine Resonanzschwingung, wenn ein entsprechender Mikropartikel durch die Spule tritt.
Ein Beispiel für die Anwendung dieses Verfahrens ist der Nachweis von Kolibakterien in Wasserproben. Hierzu werden monovalente primäre E . -coli-spezifische Antikörper mit an megnetische Beads gekoppelten sekundären Antikörpern konjugiert. Die Suspension dieser Konηugate wird in die Teflon- Kapillare gepumpt und mittels Elektromagnet dort fixiert. Beim Durchströmen der Kapillare mit der zu untersuchenden Wasserprobe werden Kolibakterien über die primären Antikörper an den Konjugaten festgehalten. Nach dem Abschalten des Magneten kann die Suspension von magnetisch markierten Kolibakterien durch die Messspule bzw. den Spalt der Metallspule gepumpt werden. Die Anzahl der Resonanz-Ereignisse im angeschlossenen Schwingkreis entspricht der Anzahl der Kolibakterien in der ursprünglichen Wasserprobe. Durch den Einsatz dieses Gerätes und der entsprechenden Konηugate ist es möglich, ohne den aufwendigen Einsatz der Durchflusszytometrie Bakterien automatisch zu zahlen. Des weiteren ist es möglich, mit dieser Messmethode eine Minia- turisierung des Nachweisgerates zu erreichen. Mit der beschriebenen Technik werden Partikel wie Bakterien, Zellen oder Zellbestandteile in wassrigen Losungen nachgewiesen und gezählt. Diese Technik ermöglicht eine Miniaturisierung des automatischen Partikelzählverfahrens. Dazu werden die Partikel vor der Messung durch die Reaktion mit monovalenten antikόrper- bzw. virenbeschichteten ferromagnetischen Partikeln markiert. Die induktive Messung beruht auf dem Passieren der mit den biologischen Partikeln aggregierten ferromagnetischen Partikel durch die in be- schriebener Weise gestaltete Mikrospule eines elektronischen Schwingkreises. Die beim Passieren auftretenden Resonanzereignisse werden gezählt.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann in der Medizin, Mi- krobiologie und Hygiene eingesetzt werden, beispielsweise zum Auszählen von Blutzellen; es können ökologisch relevante Mikroorganismen ausgezählt oder krankheitserregende Keime nachgewiesen werden.
Weitere Vorteile, Merkmale und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung eines bevorzugten Ausfuhrungsbeispieles sowie anhand der Zeichnung; diese zeigt in
Fig. 1, 3: jeweils ein Schema zu einem er- findungsgemaßen Verfahren;
Fig. 2: ein Detail der Fig. 1, 3 in schemati- sierter Schragsicht.
Vor einem Verfahren zum Nachweis von Kolibakterien in einer durch eine Leitung 10 zugefuhrten Wasserprobe Z werden monovalente primäre E . -coli-spezifische Antikörper mit an ma- gnetische Beads gekoppelten sekundären Antikörpern konjugiert. Die Leitung für die monovalenten magnetischen Partikel F ist mit 12 bezeichnet. Beide Leitungen 10, 12 enthalten Schlauchpumpen 14 und vereinigen sich nach diesen zu einer gemeinsamen Forderleitung 16.
Das Reagenz mit ferromagnetischen, biologisch aktivierten Partikeln wird über die Leitungen 12 und 16 in eine Teflonkapillare 20 gepumpt und dort mittels eines Elektromagneten 22 fixiert, dessen Magnetspule mit 24 bezeichnet und dem die Z-formig aufgewickelte Teflonkapillare 20 in einem konzentrischen Polschuh 26 zugeordnet ist. Dieser begrenzt mit einem von ihm in Radialabstand umgebenen Polstift 28 einen Ringraum 30 für die Teflonkapillare.
Beim Durchströmen der Kapillare 20 mit der zu untersuchenden Wasserprobe Z werden Kolibakterien als zu zahlende biologische Partikel über die primären Antikörper an den ferromagnetischen Konjugaten festgehalten. Nach dem Abschalten des Elektromagneten 22 kann die Suspension von magnetisch markierten Kolibakterien dank einer Piezopumpe 32 in einer Messleitung 34 durch eine geatzte Metallspule als Messspule 36 einer mikrosystemtechmschen Einheit 40 transportiert werden. Aus dieser werden die gezählten Partikel in Pfeilrichtung X ausgetragen.
Im Ausführungsbeispiel der Fig. 3 wird jene Suspension in der Messleitung 35 durch den Spalt 52 eines ferromagnetischen, C-förmig gebogenen Kerns 50 einer Messspule 36a transportiert .
Die freien Enden 38, 38a der Messspule 36, 36a sind -- nach einem Widerstand 42 und einem Kondensator 44 -- an eine Einrichtung 46 zum Anregen der Schwingung und zum Messen von Resonanzereignissen angeschlossen; dort erfolgt eine Umwandlung in Zählimpulse.
Die Anzahl der Resonanzereignisse im angeschlossenen Schwingkreis entspricht der Anzahl der Kolibakterien in der ursprünglichen Wasserprobe Z.
Zwischen der Teflonkapillare 20 und der Piezopumpe 32 ist ein -- ein Ventil 48 enthaltender — Leitungsabzweig 18 für überschüssige Probeanteile Q vorgesehen, dem in der Förderleitung 16 ein Ventil 48 nachgeschaltet ist.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren für die Darstellung von biologisch aktivier- ten induktivitatsandernden, insbesondere ferromagnetischen bzw. superparamagnetischen, Partikeln,
dadurch gekennzeichnet,
dass monovalente primäre Antikörper mit induktivitatsandernden Partikeln im Uberschuss gemischt werden, welche mit sekundären Antikörpern beschichtet sind, und anschließend mittels partieller Sedimentation aggregierte Partikel abgetrennt werden, die aus einem monovalenten primären Antikörper und antikorper-be- schichteten induktivitatsandernden Teilpartikeln bestehen .
2. Verfahren für die Darstellung von biologisch aktivier- ten induktivitatsandernden, insbesondere ferromagnetischen bzw. superparamagnetischen, Partikeln, dadurch gekennzeichnet, dass Viren mit induktivitatsandernden Partikeln im Uberschuss gemischt werden, welche mit gegen die Hullproteine der Viren gerichteten Anti- korpern beschichtet sind, und anschließend mittels partieller Sedimentation aggregierte Partikel abgetrennt werden, die aus einem Virus und antikorper-be- schichteten induktivitatsandernden Teilpartikeln bestehen .
3. Verfahren für die Darstellung von biologisch aktivierten induktivitatsandernden, insbesondere ferromagnetischen bzw. superparamagnetischen, Partikeln, dadurch gekennzeichnet, dass spacermolekul-gekoppelte Oligo- nukleotid-Gensonden mit induktivitatsandernden Partikeln im Uberschuss gemischt werden, welche mit gegen die Spacermolekule gerichteten Antikörpern beschichtet sind, und anschließend mittels partieller Sedimenta- tion aggregierte Partikel abgetrennt werden, die aus einer Gensonde und antikorper-beschichteten induktivitatsandernden Teilpartikeln bestehen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass biologische Partikel zum Nachweis bzw. zur Zahlung immunologisch, phagologisch oder molekularbiologisch mit den aggregierten Partikeln verbunden werden, die als Marker beim anschließenden Durchströmen einer Metallspule meßbare und zahlbare Induktivitatsanderungen auslosen.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Marker beim Durchströmen des Spaltes an einem etwa C-formig gebogenen Kern einer Metallspule messbare und zahlbare Induktivitatsanderungen auslosen.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass mduktivitatsandernde Partikel vor dem Durchströmen der Metallspule mittels Elektromagnet in einer Kunststoffkapillare festgehalten und dort mit den in die Kapillare einströmenden biologischen Partikeln verbunden werden, wahrend die sie enthaltende Probe aus der Kapillare herausgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Metallspule als Teil eines elektronischen Schwingkreises beim Durchströmen der induktivitatsandernden Partikel zahlbare Anderun- gen der Eigenschwingfrequenz erzeugt werden.
8. Vorrichtung zum Nachweis und Zahlen für suspendierte biologische Partikel in flussigen Proben, insbesondere Vorrichtung zum Durchfuhren der Verfahren nach wenigstens einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Forderleitung (16) für eine zu messende Probe als Messleitung (34) von einer Metallspule als Messspule (36, 36a) umgeben und diese an eine Einrichtung (46) zum Anregen der Schwingung und Messen von Resonanzereignissen angeschlossen ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallspule (36a) um einen etwa C-formig gebogenen Kern (50) gelegt und dieser einen Spalt (52) aufweist, durch den die Messleitung (34) gefuhrt ist.
10. Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Forderleitung (16) an eine Einrichtung mit Kapillaren (20) , insbesondere Teflonkapilla- ren, angeschlossen ist sowie letztere einem Elektromagneten (22) zugeordnet sind.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare/n (20) in einem von einem Polschuh (24) umgebenen Raum (30) angeordnet sind.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den Elektromagneten (22) und einem Ventil (48) der Forderleitung (16) eine Zweigleitung (18) für überschüssige Proben (Q) angeordnet ist.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Einrichtung (46) zum Anregen der Schwingung und Messen von Resonanzereignissen zur
Metallspule (36, 36a) hin wenigstens ein Widerstand
(42) sowie ein Kondensator (44) vorgeordnet sind.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Messspule (36, 36a) mit vorgeordneter Piezopumpe (32) und nachgeordnetem Widerstand (42) bzw. Kondensator (44) Teile einer mikro- systemtechnischen Einheit (40) sind.
EP00920436A 1999-02-17 2000-02-15 Verfahren zum darstellen von biologisch aktivierten induktivitätsändernden partikeln sowie vorrichtung dafür Withdrawn EP1198712A2 (de)

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