DE2847282A1

DE2847282A1 - Methode zur bestimmung der anwesenheit eines analyten in einer koerperfluessigkeit und analysensystem hierfuer

Info

Publication number: DE2847282A1
Application number: DE19782847282
Authority: DE
Inventors: Richard Calvin Ebersole
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1977-11-03
Filing date: 1978-10-31
Publication date: 1979-05-10
Also published as: IT1101280B; FI783346A; CH638052A5; IT7829378A0; FR2408142A1; CA1122503A; IL55856A0; IE782168L; GB2008767B; NO783691L; SE7810351L; IL55856A; FR2408142B1; GB2008767A; JPS5491296A; AU4128378A; NL7810910A; LU80471A1; JPS5912139B2; DK489678A

Description

Die Erfindung betrifft eine Methode zur Bestimmung der Anwesenheit von ausgewählten immunochemisch reaktionsfähigen Substanzen, beispielsweise Antikörpern oder Antigenen, in Körperflüssigkeiten. Diese ausgewählten Substanzen werden nachstehend als Analyte bezeichnet.

Die Bestimmung dieser Analyte läßt viele wertvolle medizinische Aussagen zu. Beispielsweise werden der Schwangerschaftstest, der Syphillistest und der Blutfaktortest sämtlich nach üblichen immunochemischen Methoden durchgeführt. Bei den meisten dieser Methoden erfolgt eine visuelle Überprüfung auf Bildung von ausgefällten oder agglutinierten Antigen-Antikörper-Komplexen. Diese Methoden erfordern zuweilen mehrere Wiederholungen mit verschiedenen Verhältnissen der Reagentien, um Genauigkeit sicherzustellen, sowie eine individuelle visuelle Überprüfung jedes Testergebnisses. Ferner werden radioaktive und fluoreszierende Markierungsstoffe verwendet, um die subjektive visuelle Bestimmung zu vermeiden. Diese Methoden werfen jedoch zuweilen Probleme entweder hinsichtlich der Verwendung teurer oder instabiler Markierungsr.toffe oder hinsichtlich der Empfindlichkeit oder Sicherheit und Handhabung radioaktiver Materialien auf. Bei der Methode gemäß der Erfindung werden Immunreagentien verwendet, die mit Teilchen, beispielsweise magnetischen Materialien, die sicher in der Handhabung sind und leicht mit hochempfindlichen und leicht erhältlichen elektronischen Geräten nachweisbar sind, markiert sind. Diese Methode kann leicht an automatisierte und halbautomatisierte Arbeitsweise angepaßt werden.

Die Verwendung von magnetischen Teilchen bei der sero-

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logischen Testung ist bekannt, jedoch wurden die magnetischen Teilchen vor der Erfindung nur zur Entfernung oder zur Komplexbindung verschiedener Komponenten aus einer Fliissigkeitsprobe verwendet. Beispielsweise beschreiben die US-PSen 4 018 886 und 3 970 518 die Verwendung von magnetisch aktiven Teilchen zur Isolierung ausgewählter Proteine mit anschließender Abspaltung der Proteine von den Magnetteilchen und eine visuelle Überprüfung auf ausgefällte Proteine. Die US-PS 3 933 997 beschreibt die Verwendung von magnetischen Teilchen zur Konzentrierung von radioaktiven Markierungsstoffen auf einer Testsubstanz.

Keine der genannten Veröffentlichungen beschreibt die Anwendung der magnetischen Bestimmung zur Erzielung des gewünschten Ergebnisses.

Die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Analyten, beispielsweise eines spezifischen Antigens oder Antikörpers, in einer Körperflüssigkeit kann festgestellt werden, indem eine Probe der Körperflüssigkeit auf eine Oberfläche aufgebracht wird, die mit einem Rezeptorreagens, das mit dem Analyten spezifisch reaktionsfähig ist, bedeckt ist. Wenn der Analyt vorhanden ist, bildet er mit dem Rezeptorreagens einen Komplex. Die Oberfläche wird dann mit einem Immunreagens zusammengeführt, das eine Immunkomponente enthält, die entweder mit dem Rezeptorreagens oder mit einem Komplex des Rezeptorreagens und des Analyten spezifisch reaktionsfähig ist. Das Immunreagens enthält ferner Teilchen, die Eigenschaften aufweisen, die die elektrische Reaktanz zu beeinflussen vermögen. Sie sind winzige Fragmente, die die Dielektrizitätskonstante, die Leitfähigkeit oder magnetische Permeabilität der Oberfläche verändern. Diese Teilchen werden in diesem Fall als Reaktanzmarkierungsteilchen bezeichnet. Metall- oder Metalloxydteilchen werden bevorzugt und magnetisch

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aktive Teilchen besonders bevorzugt. Das Immunreagens wird im allgemeinen als flüssige Suspension auf die Oberfläche aufgebracht. Nicht umgesetztes Immunreagens wird dann von der Oberfläche entfernt und die Oberfläche auf Änderungen der Dielektrizitätskonstante, der Leitfähigkeit oder magnetischen Permeabilität untersucht. Bei einem direkten Test ist das Immunreagens mit dem Rezeptorreagens-Analyt-Komplex reaktionsfähig, und wenn festgestellt wird, daß die Reaktanzmarkierungsteilchen an die Oberfläche gebunden sind, so zeigt dies die Anwesenheit des Analyten in der Körperflüssigkeit an. In ähnlicher Weise ist bei einem indirekten Test das Immunreagens mit dem Rezeptorreagens, jedoch nicht mit dem Rezeptorreagens—Analyt-Komplex reaktionsfähig. Wenn keine Reaktanzmarkierungsteilchen auf der Oberfläche nachgewiesen werden, zeigt dies die Anwesenheit des Analyten in der Körperflüssigkeit an. Bei einem Konkurrenztest werden die Körperflüssigkeit und das Immunreagens gleichzeitig auf die Oberfläche aufgebracht. Die Menge von Reaktanzmarkierungsteilchen auf der Oberfläche ist ein Maß der Analytmenge in der Körperflüssigkeit. Dieses System kann manuell verwendet werden, läßt sich jedoch leicht an automatisierte Arbeitsweise anpassen.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Abbildungen beschrieben.

Fig.l ist eine Abbildung einer Testkarte, die für die Zwecke der Erfindung geeignet ist.

Fig.2 ist eine schematische Darstellung der im Rahmen der Erfindung stattfindenden Reaktionen.

Übliche Mittel können zur Feststellung der Anwesenheit der Reaktanzmarkierungsteilchen auf der Testfläche verwendet werden. Wenn beispielsweise die Reaktanzmarkierungsteilchen die dielektrischen Eigenschaften

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der Oberfläche beeinflussen, zeigt eine Kapazitanzmessung an, ob die Teilchen vorhanden sind. Wenn, um ein weiteres Beispiel zu nennen, die Teilchen magnetisch sind, können magnetische Tonköpfe, wie sie in üblichen Tonaufzeichnungsgeräten vorhanden sind, verwendet werden. Messungen der kapazitiven, konduktiven und magnetischen Permeabilität, die keine direkte Berührung mit der Testoberfläche erfordern, werden bevorzugt, jedoch sind Messungen mit direktem Kontakt zwischen der Oberfläche und dem Detektor nicht ausgeschlossen. Damit die Anwesenheit der Teilchen festgestellt wird, ist die Testoberfläche vorzugsweise indifferent gegenüber der zu messenden Eigenschaft. Es ist jedoch möglich, das Rezeptorreagens auf der Ober— fläche in Streifen anzuordnen oder eine periodische Magnetisierung auf der Oberfläche zu induzieren, wie sie durch ein Magnetbandaufzeichnungssystem erzeugt wird, und dann die Oberfläche mit einer bestimmten Geschwindigkeit an einem Detektor vorbeizubewegen, der die Frequenz überwacht. Die festgestellte Frequenz ist eine Funktion der Anordnung der Streifen des Rezeptorreagens oder der induzierten periodischen Magnetisierung und der Bewegungsgeschwindigkeit der Oberfläche. Die Testoberfläche selbst muß somit nicht völlig frei von elektrischer Reaktanz sein, um als indifferent für die Zwecke der Erfindung angesehen zu werden. Bei einem bevorzugten System zur Feststellung der Anwesenheit der magnetischen Markierungsteilchen ist die Testoberfläche einer Bezugsoberfläche, die mit magnetischen Teilchen bedeckt ist, benachbart. Nach den Immunreaktionen kann sowohl die Testoberfläche als auch die Bezugsoberfläche in periodischer Weise magnetisiert werden. Der Detektorkreis kann so ausgebildet werden, daß er nur den Teil des Signals von der Testoberfläche aufnimmt, der mit dem Signal von der Bezugsoberfläche

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in Phase ist. Diese Anordnung verringert die Effekte des Apparaterauschens und ergibt erhöhte Empfindlichkeit.

Die Testoberfläche muß ferner das Rezeptorreagens zu binden vermögen und darf das Testergebnis nicht verfälschen. Die Oberfläche kann flach sein oder Vertiefungen aufweisen, in denen jeder Test durchgeführt wird. Zahlreiche Werkstoffe sind für die Testoberflächen geeignet, jedoch werden Kunststoffkarten oder -bänder bevorzugt. Die Testoberfläche, an die das Rezeptorreagens gebunden wird, kann sich in geschlossenen Kunststoffpackungen oder -beuteln befinden. Diese Packungen können außerdem die Immunreagentien in einem getrennten Bereich enthalten, der für die Aufbringung auf die Testoberfläche nach Zusatz der Probe bestimmt ist.

Eine Änderung der elektrischen Reaktanz, beispielsweise der magnetischen Aktivität, kann bestimmt werden, auch wenn nur eine sehr geringe Menge der Reaktanzmarkierungsteilchen vorhanden ist. Daher erfordert jeder Test gewöhnlich nur einen Tropfen Körperflüssigkeit, und die Testoberfläche kann sehr klein sein. Demzufolge kann eine große Zahl von gesonderten Testflächen und, falls gewünscht, Bezugsflächen auf einer einzelnen Karte oder einem einzelnen Band angeordnet werden. Die gesonderten Flächen können entweder für eine Reihe von Tests für verschiedene ausgewählte Proteine oder eine Reihe von Tests für das gleiche Protein dienen, wenn die Konzentration des Immunreagens auf der Testoberfläche über einen bestimmten Bereich verändert wird, um eine Aussage nicht nur über die Anwesenheit des ausgewählten Proteins, sondern auch seine ungefähre Konzentration in der Körperflüssigkeit zu erhalten.

Das Rezeptorreagens kann durch Oberflächenadsorption,

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Geleinschließung, kovalente Bindung oder nach anderen ähnlichen Methoden an die Testoberfläche gebunden werden. Hiervon wird die kovalente Bindung bevorzugt. Jedes System der Rezeptorbindung, das die Reagens— moleküle auf der Testoberfläche so zu orientieren vermag, daß sie maximale Aktivität aufweisen, wird ebenfalls bevorzugt. Als Rezeptorreagenzien kommen nicht nur Antikörper, sondern auch Gewebe oder Zellrezeptorproteine, Serumtransportproteine und Lectine (Ringertive u. Savate "Cell Hybrids", Academic Press 1976, S. 55 und 247). in Frage.Hiervon haben die Antikörper wahrscheinlich die größte Anwendungsmöglichkeit. Andere Klassen von Verbindungen, beispielsweise Chelatbildner, können ebenfalls als brauchbare Rezeptorreagenzien dienen, wenn sie mit der in der Körperflüssigkeit zu bestimmenden Substanz mit genügender Spezifität reagieren, um fälsche Ergebnisse, die durch Konkurrenzreaktionen verursacht werden, zu vermeiden.

Als Materialien, die sich als Reaktanzmarkierungsteilchen eignen, die sich mit Immunverbindungen unter Bildung der Immunreagenzien verbinden, kommen Verbindungen in Frage, die die elektrische Reaktanz der Testoberfläche verändern, d.h. diese Materialien verändern, wenn sie als feines Pulver auf der Testoberfläche ver— teilt werden, die dielektrischen, konduktiven oder magnetischen Eigenschaften der Oberfläche. Der Vorteil der Erfindung liegt darin, daß Teilchen verwendet werden, die in sehr geringen Mengen durch sehr empfindliche, aber gut entwickelte und leicht erhältliche elektrische Geräte festzustellen und nachweisbar sind. Ferner werden durch Verwendung dieser Mateiialien die Probleme der unbeständigen Aktivität und die Handhabungsrisiken, die bei Verwendung von radioaktiven Indikatoren auftreten, ausgeschaltet. Bevorzugt als Reaktanzmarkierungsstoffe werden Metalle und Metalloxyde. Besonders bevorzugt werden Metalle und Metall-

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oxyde, die Ferromagnetismus aufweisen. Diese Materialien können mit den Antikörpern umgesetzt und auf die Testoberfläche im entmagnetisierten Zustand aufgebracht werden. Nach der Aufbringung kann die gesamte Oberfläche einem Magnetfeld ausgesetzt werden, um die Teilchen für Bestimmungs- und Nachweiszwecke zu magnetisieren. Diese magnetische Aktivität ist dann leicht mit verschiedenen bekannten Mitteln, beispielsweise einem üblichen Magnetbandsystem oder einem Halleffekt-Detektor, festzustellen und nachzuweisen. Als Beispiele geeigneter magnetischer Werkstoffe sind Metalle und Legierungen wie Eisenpulver, Nickel, Kobalt, CrO„, die ferromagnetische Flüssigkeit "Ferrofluid" (Hersteller Ferrofluids Corp.), CoO, NiO, Mn₂O-, Magnetoplumbite, magnetische Eisenoxyde und das Produkt "Alnico", eine Legierung von Aluminium, Nickel, Kobalt und Kupfer, zu nennen. Geeignet sind ferner organische Ladungskomplexe mit hoher elektrischer Leitfähigkeit, beispielsweise N-Methylphenazinumtetracyanchinodimethan /Ce(NO₃)₆Mg(H₂O)_g J₃.6H₂O-Kristalle, Bi₂Se₃-

Kristalle und Tetrahiofulvalenkomplexe mit Tetrocyanp-chinodimethan oder K„Pt(CN.)BrO-.H~0 und amorphe Materialien mit magnetischen Eigenschaften, beispielsweise die Chalkogenide, z.B. die Europiumchalkogenide und Chalkogenid-Glasteilchen.

Bevorzugt als magnetische Materialien werden die magnetischen Oxyde von Eisen, Kobalt, Nickel, Chrom und Mangan und mit Oxyd umhüllte Teilchen von Eisen oder Nickel.

Um eine genügend große Oberfläche für die Bindung der Immunverbindungen zu erhalten, werden Reaktanzmarkierungsstoffe mit großer Oberfläche von wenigstens

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100 m /g bevorzugt. Besonders bevorzugt werden Teilchen einer Größe im Bereich von 0,01 bis 50 um Durchmesser.

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Diese Materialien können nach bekannten Methoden an Immunverbindungen gebunden werden. Die Reaktanzmarkierungsstoffe können in ein organisches Polymerisat, an das Immunverbindungen gebunden werden können, eingebettet werden, oder die Oberfläche kann nach üblichen Methoden silanisiert werden. An die Silanbindung können dann organische Verbindungen gebunden werden. Die US-PS 3 954 666 beschreibt die Einbettung von Kernmaterialien in Polymerisate, und die US-PS 3 983 beschreibt die Verwendung von Silanbindungen, um organische Verbindungen an anorganische Teilchen zu binden. Methoden zur Immobilisierung von Enzymen an magnetischen Trägern, die ebenso auf Antikörper anwendbar sein wurden, werden unter "Methods in Enzymology" XLIV, Seite 324-326, beschrieben. Die Art der Bindung der reaktionsfähigen organischen Verbindungen an die Reaktanzmarkierungsstoffe bildet nicht die Grundlage der Erfindung. Auch andere Bindungsmethoden können angewendet werden, so lange sie die Komplexbildungsfähigkeit der Immunverbindungen nicht beeinträchtigen. Die Immunverbindungen werden gewählt, um entweder mit den Rezeptorreagentien oder mit dem Komplex des Rezeptorreagens mit der zu bestimmenden Substanz in der Körper— flüssigkeit spezifisch reaktionsfähig zu sein.

Da die Untersuchung oder Überprüfung bei der Methode gemäß der Erfindung elektronisch und nicht visuell erfolgt, läßt sich die Methode leicht an automatisierte Ausführungen anpassen. Der hier gebrauchte Ausdruck "automatisiert" soll nicht die Möglichkeit ausschliessen, daß einige der Arbeitsgänge manuell durchgeführt werden können. Fig.l zeigt eine bevorzugte Testkarte 1 mit mehreren Flächen oder Feldern 2, an die Rezeptorreagenzien gebunden sind. Getrennte Felder mit verschiedenen Rezeptorreagenzien können vorgesehen werden, oder das gleiche Rezeptorreagens kann an jedes Feld in

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verschiedenen Konzentrationen gebunden werden. Die Karte hat eine gedruckte Testbezeichnung 3 sowie einen mit der Maschine lesbaren Code 4, der die notwendigen Angaben für automatisiertes Arbeiten enthält. Wahlweise kann die Karte einen Raum 5 zum Eintragen eines Patienten-Identifizierungscode aufweisen.

Fig.2 veranschaulicht schematisch ein Testfeld 2 der in Fig.l dargestellten Testkarte. Rezeptorreagenzien sind an das Testfeld gebunden. Körperflüssigkeit des Patienten, die die Antikörper 11 enthält, deren Anwesenheit zu ermitteln ist, wird auf jedes Testfeld gegeben. Der Antikörper 11 bildet, wenn er vorhanden ist, mit dem Rezeptorreagens einen Komplex 12. Das Testfeld wird dann einem Immunreagens 13 ausgesetzt, das aus einer Immunverbindung 14, die an einen Reaktanzmarkierungsstoff 15 gebunden ist, besteht. Dieses Immunreagens bildet mit dem Rezeptorreagens-Patientenantikörper—Komplex, falls er vorhanden ist, auf dem Testfeld den Komplex 16.

Zu einem bevorzugten System für die Durchführung der Erfindung würde eine Station zum Eingeben, der notwendigen Testkarten für die gewünschten Tests gehören. Die Karten können einzeln oder in Gruppen nach Bedarf eingegeben werden. Die Karten werden automatisch zu einer Probenzusatzstation geführt, wo ein Tropfen der Körperflüssigkeit eines Patienten auf jedes Testfeld auf der Karte aufgebracht wird. Zu einer automatisierten Vorrichtung können eine Temperaturregelung und eine Station zur Äquilibrierung der Körperflüssigkeit auf den Testfeldern für vorbestimmte Zeiten gehören. Die Karte wird dann zu einer Station geführt, wo das Immunreagens auf jedes Testfeld aufgebracht wird. Auch diese Station kann Temperaturregelungs- und Äquilibfierungssysteme einschließen.

Anschließend wird überschüssiges Immunreagens entfernt

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und die Karte dann auf Anwesenheit von Reaktanzmarkierungsstoffen, die im Test geblieben sind, durch Messung von Veränderungen der elektrischen Reaktanz der Testfelder der Karte geprüft.

Es ist zu bemerken, daß die Testkarte bei der beschriebenen besonderen Ausführungsform durch jede Station geführt wird. Andere Ausführungsformen, bei denen jede Operation an einer Karte durchgeführt wird, die an einer einzigen Stelle in einer automatisierten oder halbautomatisierten Vorrichtung gehalten wird, sind ebenfalls möglich.

^ie Methode gemäß der Erfindung ist auf die Bestimmung der verschiedensten Materialien einschließlich der Antigene und Antikörper, deren Ursprung bei Viren, Bakterien, Zellen und Menschen liegt, sowie auf Hormode, Metaboliten von Medikamenten und spezielle Proteine anwendbar. Beispielsweise eignet sich die Methode zur Bestimmung von menschlichen Autoantikörpern, beispielsweise Antithyroglobulin, antigenen Proteinen wie Komplementfaktoren, Proteinhormone, Immunoglobuline und freie leichte und schv/ere Ketten (free light and heavy chains), z.B. Thyroxinbindungsglobulin, und verschiedenenen Arten von Mikroorganismus-Antigenen und -antikörpern, beisoielsweise Hepatitis-A- und -B-Virus. Die Anwendung dieser Methode hängt in erster Linie von der Verfügbarkeit eines geeigneten Materials ab, das als Rezeptorreagens dient und mit der zu bestimmenden Substanz spezifisch reaktionsfähig ist.

Beispiel 1

^O Zur Bestimmung eines menschlichen Antikörpers IgG kann eine Serumprobe mit einer Proteinpufferlösung, die 0,12% Rinderseruiualbumin und phosphatgepufferte Kochsalzlösung bei pH 7,7 + 0,2 enthält, vor-

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verdünnt werden. 0,1% Natriumazid, ein antimikrobielles Mittel, kann im Verdünnungsmittel als Konservierungsmittel zugesetzt werden.

Die verdünnte Patientenprobe kann quantitativ auf eine Testreaktionskarte überführt werden. Der in der festen Phase vorliegende Träger, der aus Anti-Human-IgG besteht, das kovalent an derivatisierte Polyamidfolien gebunden ist, wird wie folgt hergestellt:

10 g Folie aus Nylon-6 wird in 300 ml 3n-HCl suspendiert und 4 Stunden bei 30°C gerührt, aus der Lösung genommen und erschöpfend mit Wasser, Äthanol und Äther gewaschen. Der Carboxylgehalt einer 4 Stunden hydrolysierten Folie aus Nylon-6 beträgt etwa 30 bis 90 AjMol/g.

Die Kupplung des Antikörpers an den Träger aus depolymerisiertem Nylon-6 kann durch Aktivierung mit Carbodiimid durchgeführt werden. Die Gesamtreaktion besteht aus der Kondensation zwischen der Carboxylgruppe auf dem Träger und den Amingruppen des Antikörpers. Die Reaktion wird in zwei Stufen durchgeführt.

Zu einer Lösung von 50 mg l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfat in 10 ml Wasser wird 1 g der säurebehandelten Nylon-6-Folie gegeben. Das Reaktionsgemisch wird mit 6n-HCl auf pH 4 bis 5 eingestellt und 2 bis 4 Stunden der Reaktion bei 30⁰C überlassen. Die Folie wird dann herausgenommen und zur Entfernung des überschüssigen Carbodiimide mehrmals mit Wasser gewaschen.

Die aktivierte Folie wird dann in eine Lösung eingeführt, die im Handel erhältliches Anti-Human-IgG in Konzentrationen von 1 bis 50 mg Protein in 10 ml Wasser enthält. Nach Einstellung der Lösung auf einen pH-Wert zwischen 4 und 5 wird die Reaktion

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2 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C fortgesetzt. Die Reaktionslösung wird dann dekantiert und die Folie mit Wasser oder Puffer gewaschen.

Die Testoberflache wird dann mit der verdünnten Probe während einer genügenden Zeit äquilibriert, um die Antikörperbindung stattfinden zu lassen. Die erste Äquilibrierung kann im allgemeinen etwa 30 Minuten bei 32°C dauern. Die Reaktionszonen können dann mit der gleichen Proteinpufferlösung gewaschen und geschüttelt werden, um nicht absorbiertes Antigen von der Oberfläche zu spülen.

Die Testreagenszonen können dann in überschüssiges Ziegen-Anti-Human-igG, das mit magnetischen Teilchen markiert ist, getaucht werden. Für die Äquilibrierung auf der Karte werden die Immunteilchen in Phosphat-Kochsalzlösung-Puffer, der 0,12% Rinderserumalbumin enthält, bei pH 7,5 +_ 0,5 in geeigneter Weise verdünnt. Nach der Äquilibrierung können die Testreaktionsflächen mit dem BSA-Phosphatpuffer bei pH 7,7 +_ 0,2 gewaschen werden.

Die Reaktionsflächen werden in einem Magnetfeld magnetisiert, worauf die Testkarte durch einen Detektor gegeben wird, der die Anwesenheit von Magnetteilchen zu bestimmen vermag.

Beispiel 2

Dieses Beispiel veranschaulicht die Bestimmung von Antikörpern, die gegen spezifische Antigene gerichtet sind.

Eine Serumprobe wurde mit einer Proteinpufferlösung, die 0,1% Rinderserumalbumin und Tris-Chydroxymethyl)-aminomethan (Tris) enthielt und bei pH 6,5 _+ o,4 gepuffert war, vorverdünnt. 0,1% Natriumazid, ein mikro-

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bentötendes Mittel, wurde im Verdünnungsmittel als Konservierungsmittel zugesetzt.

Die verdünnte Probe wurde quantitativ auf eine Testreaktionsfläche überführt. Der in fester Phase vorliegende Träger, der aus Ilumanserumalbumin bestand, das kovalent/an derivatisiertes Polyamid oder Polymethacrylsaurepolymere gebunden war, wurde wie folgt hergestellt:

Die Gesamtkupplungsreaktion zwischen Albumin und Folien kann mit einer Vernetzung zwischen den Aminogruppen oder Carboxylgruppen der Folie und dem Protein verbunden sein. Die Vernetzung kann durch Verwendung eines polyfunktionellen Aziridinreagens, das mit Materialien, die aktive Wasserstoffatome enthalten, äußerst reaktionsfähig ist, erreicht werden.

Die Folien für die Bindung des Ilumanserumalbumins wurden zuerst in 1%iger Lösung von polyfunktionellen Aziridin XAIlA (Cordova Chemical, Sacramento, California) suspendiert, die Suspension wurde 30 Minuten bei 27°C gerührt, worauf die Folien aus der Lösung genommen und mit destilliertem Wasser gewaschen wurden. Die gewaschenen Folien wurden dann in einer Lösung, die Humanserumalbunin enthielt (1 mg/ml), 12 Stunden bei 4°C gerührt. Das Reagens aus immobilisiertem Albumin und Folie wird dann wiederholt mit Tris-Puffer (pH 6,5 _+ 0,4) bei 4°C gewaschen. Das Waschen wird fortgesetzt, bis kein Albumin mehr von der Folie freigegeben wird. Repräsentative Konzentrationen, in denen das Albumin an die Folien gebunden wird, sind nachstehend genannt.

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2 Folie ug/cm

Oberflächengruppen

Surlyn 3,3

Ionomerharz "Mylar"
Polyester (flammenbehandelt) 7,3

Keine Oberflächengruppen
Polycarbonat

Nylon (HCl-behandelt) 16,0

Aktivierte Oberflächengruppen
Äthylen-Maleinsäureanhydrid <_1,0

Die Testoberfläche für Anti—HSA wurde mit der verdünnten Probe so lange verdünnt, daß die Anti-HSA-Bindung stattfinden konnte. Die Reaktionsoberfläche wurde dann mit der gleichen Tris-Pufferlösung (pH 7,4 _+_ 0,4), die bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Versuch verwendet wurde, gewaschen, um nicht gebundene Probenreste von der Oberfläche zu entfernen.

Die Testreagenskarte wurde dann in überschüssiges Ziegen-Antihumanserumalbumin getaucht, das mit magnetischen Teilchen markiert war. Für die Äquilibrierung wurden die Immun-anti-HSA-Teilchen in einem Tris-Puffer (pH 6,5 _+ 0,5), der 0,12% Ziegenserumalbumin enthielt, in geeigneter Weise verdünnt. Nach der Äquilibrierung wurden die Testreaktionsflächen mit dem Ziegenserumalbumin-Tris-Puffer gewaschen, um nicht gebundene Teilchen zu entfernen.

Die auf der Reaktionsoberfläche verbleibenden magnetischen Teilchen können durch ein magnetisches Signal von bekannter Frequenz magnetisiert werden. Die Testkarte kann dann in einem Detektor, der die Anwesenheit von magnetischen Teilchen festzustellen vermag, verarbeitet werden. Die Feststellung der Reaktanzeigenschaften der Testfl"che kann durch Instrumententechniken,

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z.B. die Technik der Phasenverriegelung (phase lock application), phasenempfindliche Gleichrichtung und andere übliche elektronische Verstärkungssysteme, die dem Fachmann bekannt sind, erleichtert werden.

Der hier gebrauchte Ausdruck "bestehend im wesentlichen aus" soll nicht die zusätzlichen Arbeitsschritte oder Elemente ausschließen, die die Verwirklichung des Vorteils der Erfindung nicht verhiindern.

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Claims

Patentansprüche

1.J Methode zur Bestimmung der Anwesenheit eines Analyten in einer Körperflüssiqkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine Oberfläche, die mit Rezeptorreagenzien bedeckt ist, die mit dem Analyten spezifisch reaktionsfähig sind, mit der Flüssigkeit in Berührung bringt,

b) die bedeckte Oberfläche mit eimern Immunreagenz in Form einer Imrr.unverbindung in Berührung bringt, die mit den Rezeptorreagenzien oder mit einem Komplex des Analyten und des Rezeptorreagenz spezifisch reaktionsfähig ist und auf Reaktanz-Markierungsstoffe aufgebracht ist, die die Form von Teilchen haben, die die elektrische Reaktanz zu beeinflussen vermögen,

c) nicht umgesetztes Immunreagenz von der Oberfläche entfernt und

d) die elektrische Reaktanz der Oberfläche mißt.

2. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktanz-Markierungsstoffe magnetisch empfindlich sind.

3. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktanz-Markierungsstoffe eine starke kapazitive Reaktanz aufweisen.

4. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktanz-Markierungsstoffe leitfähig sind.

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5. Methode nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktanz-Markierungsstoffe im wesentlichen aus Metall- und/oder Metalloxydteilchen bestehen.

6. Methode nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,daß die Teilchen aus magnetischen Oxyden von Eisen, Kobalt, Chrom, Nickel oder Mangan bestehen oder von Oxyd umhüllte Teilchen aus Eisen oder Nickel sind.

7. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Rezeptorreagenz durch Adsorption, Geleinschliessung oder kovalente Bindung an die Oberfläche gebunden wird.

B. Methode nach" Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Rezeptorreagenz kovalent an die Oberfläche gebunden wird.

9. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Testoberfläche an maschinenlesbaren Testinfonmationen befestigt ist.

10. Automatisiertes Analysensystem mit einer Testoberfläche, an die ein Rezeptorreagenz gebunden ist, das mit einer Komponente einer Körperflüssigkeit spezifisch reaktionsfähig ist, einer Station zum Aufbringen einer Probe einer Körperflüssigkeit auf die Testoberfläche, Bauteilen zum Aufbringen eines Immunreagenz auf die Testoberfläche, wobei das Immunreagenz Immunverbindungen enthält, die mit dem Rezeptorreagenz oder mit einem Komplex des Rezeptorreagenz mit der Komponente der Körperflüssigkeit spezifisch reaktionsfähig und auf Reaktanz-Markierungsstoffe aufgebracht sind, die die Form von Teilchen haben, die die elektrische Reaktanz zu beeinflussen vermögen, Bauteilen zur Entfernung von überschüssigem Immunreagenz und Bauteilen, die die Anwesenheit von Reaktanz-Markierungsstoffen auf der Testoberfläche feststellen.

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