JPS60227168A - 機器を必要としない定量分析システム及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮森斑１ 本発明は分析試料の簡便な分析法に関する。更に詳しく
は１本発明は、触媒作用を受ける対照反応を対照反応と
同じ基質を利用する第２の競合的な触媒反応と競合的な
状態に置く様な、一連の競合反応を用いて、所望のアナ
ライトの量を評価することに関する。

皮度二１】 試料中の興味の対象になる物質の濃度を定量する必要性
が増しており、用途も多岐に豆っている。この様な要請
は、特に臨床的な実験室試験、材料混合物（例えば食物
や農業混合物等）の製造時の品質管理、並びに例えば産
業廃棄物や都市廃棄物等の廃物の分析評価に関連して生
じる。定量方法は多様であるが、一般には着色物質、特
定波長の紫外線や赤外線を吸収する物質、蛍光物質、あ
るいは特定のエネルギーを放射又は吸収する物質等の検
出可能な物質の生成を必要とする。この様なエネルギー
の放射濃度は、簡単な比色計又は比色計チャー１・から
最新の可変波長赤外分光計に至るまでの複雑な装置を用
いる機器測定で検出することができる。他に、測定すべ
き物質又はこれの誘導体の特性に依拠する方法もあり、
この場合には質は分析スペクトル、核磁気共鳴スペクト
ル、又は蛍光Ｘ線分析等のより複雑な手段を用いて分析
する。

こうした分析方法の費用や複雑さは、もちろん、所１電
の装置の洗練度に比例する（高度に複雑な装置では操作
の手数が大いに省かれるのは事実である）。特に予備的
なスクリーニング試験や個々の消費者に役立つ試験につ
いては、高価な装置を使用せずに簡単に実施できる公式
化された試験方法が望ましい。本発明は、この様な複雑
性や高額の経費を要しない、所望のアナライトの定量方
法を提供するもので、アナログ測定に基づく装置の補助
を必要とせず、誰でも利用できるデジタル読取りを可能
にするものである。

米国特許第３　、９６４　、８７１　（Ｈｏｃｈｓｔｒ
ａｓｓｅｒ）に開示されている様に、グルコースに関す
る試験で標識の酸化を防ぐために種々の量の還元剤を含
む一連の酸化反応を用いてデジタル読取りする試みがな
されている。しかし、この方法は過酸化物を生成するア
ナライトに限定され、しかもこの様なアナライトについ
てさえ結果を必要とする定量濃度に細かく同調させるこ
とはできない。

本発明の方法は、一対の触媒の各々による基質に対する
競る、並びに段階的に程度の異なる競合という二つの概
念を組合せて統合することを基本とする。従って、本発
明で言う競合は、ラジオイム、ノアッセイ（ＲＩ　Ａ）
又は酵素標識イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
における様な抗体に対する抗原の競合等とは観点が異な
る。

静置、アナラ・「トの分析可能な濃度範囲を拡げるため
に２種類の酵素を同時に用いる方法が適用されている（
西独特許第ＤＥ３２１１１６７ＡＬ、１９８３年９月２
９日発行）。この特許で使用されている融媒は、検出可
能な生成物を有する触媒に対する補因子が実質的にもう
一方の触媒の補因子で表現される濃度未満で消費される
様にしである。そこで一方の触媒で測定されるアナライ
トの濃度範囲がもう一方の触媒で測定されるアナティト
の濃度範囲と異なることになる。だが、この方法ではデ
ジタル読取りの手段を備えておらず、この二つの触媒機
能は実質的に独立しているので、競合の長所は生かされ
ていない。

本発明では対照反応に利用できる基質の量が、存在する
競合反応に関グーする触媒の相対的な量に依存するので
、本発明は基貫宋対する競合に依拠するものである。更
に、競合反応触媒の相対的な量を段階的に変化させるこ
とによって、残存する基質綴を検出濃度の内外に変化さ
せることができる。競合する触媒の相対的な優を実験者
が任意に（又は製造業者が選定するー・連の設定水準に
）定めることができるため、定量に装置を必要としない
。

魚」］回肚訴 本発明はイエス／ノーの応答パターンを評価して所望の
アナライｊ・の濃度を定量する方法を提供するものであ
る。この方法では結果がデジタル形式で得られるため、
高価な装置はもとより比色計さえ使用せずに、例えば一
連の試験紙又はマトリックスーヒのパターンを用いて直
接読取ることができる。本発明の方法は、最も簡単な例
を挙げれば、同じアナライトに関する競合反応と様々の
水準で競合する標識反応によって試料を試験することか
ら成る。従って、どのアナライト濃度で標識が失われ始
めるかを一連の陽性又は陰性の応答から５゛Ｐ価するこ
とかできる。アナライトが多いほど標識を発効しなくす
るのに必要な競合の量も多くなる。従って、適当な検措
線を作っておけば、この方法により測定すべき物質の濃
度を直接測定することができる。

より具体的に言えば、説明のために挙げたこの筒中な例
では、アナライト物質の分析試料を幾つかに分割し、そ
れぞれに視覚的な方法等によって検出可能な応答が生じ
る様な、アナライトの「対照」反応用の試薬及び触媒を
同一部、また測定すべきアナライト物質を消費する第２
の競合反応の速度を制御する触媒を異なる濃度で加えて
処理する。競合触媒の濃度が比較的低ければ、対照とす
る標識反応で陽性の応答を示すに十分な量のアナライト
が残るし、競合触媒の濃度が比較的高ければ、アナライ
ト濃度は標識反応を検出するに要する水準未満に低下す
る。従って、結果が陽性から陰性に転換する点がアナラ
イト濃度の指標になる。

（上述の例では、アナライトが二つの競合触媒の基質で
ある最も筒中な例について説明したが、）この基本概念
は非常に多様なアナライトに適用できる。この様なアナ
ライトとしては、酵素基質の他に、酵素、免疫原、及び
特異的な親和性結合が可能な物質が含まれる。これらに
ついては更に詳しく後述する。

すなわち、本発明は−・つには、試料又は試料の分割液
を、既定量の対照反応用反応成分及び種々の門の競合反
応用触媒（ここで、対照反応又は競合反応の一方は標識
反応である）と接触させることから成る方法によって、
試料中の所望のアナライト濃度を測定する方法に関する
。

競合反応は抗体、特異的な親和性パートナ−１又は第２
次アナライトを生成させる試薬等の、アナライトに特異
的な添加剤によって媒介される。

しかし、競合反応自体が必要とする特異性を付ケするこ
ともある。

アナライトが酵素基質の場合には、対照反応を標識反応
と９．するのが好ましく、アナライトが酵素の場合には
競合反応を標識反応とするのが好ましい。また、特異性
が免疫反応又は特異的な明相反応によって付グされる場
合には、競合する反応のいずれを標識反応としても良い
。

更に本発明は、必要に応して使用される試薬、分析すべ
き溶液を分割する手段及び試料又は試料の分割液を適当
な試薬と接触させる手段、並びに予め設定しておいた反
応パターンの変化に基づいて直接結果を読取るための補
助マトリックス等を始めとする、本発明の方法を実施す
るための適当な材料を含む試験キントにも関する。

λ監立叉１１１ （Ａ、定義） 本明細書においては、「アナライ日又は「所望のアナラ
イト」を濃度を測定すべき物質の意味で用いる。例えば
、医療用の試験では、この様なアナライトとして、グル
コース、コレステロール、アンモニア、尿素、トリグリ
セリド、又はアミノ酸等の酵素基質、細菌細胞壁成分、
又は抗体等の免疫性物質、ビオチン等の特異的な親和結
合が可能なその他の物質、或いはホスファターゼ、グル
コースオキシダーゼ、ウレアーゼ、又はその基質がもう
一方の競合酵素によって消費され得るすべての酵素が含
まれる。

「試料」とはその中のアナライト濃度を測定すべき物質
を言う。この様な物質にも、血液、尿、又はこれらの誘
導体等の医療用試料から体内の細胞内環境物質や下水処
理流出液に至るまでの、はとんど無限の種類がある。こ
こでは「試料」という用語を、製造した物であれ自然に
Ｅ出される物であれ、存在するアナライトの濃度につい
て分析すべき種々の物質の意味で用いる。

「第２次アナライ日とは、所望のアナライトが基質又は
触媒として関与する反応の生成物として生成する物質の
ことを言う。特異性は、この予備的な反応の酵素／基質
特異性によって制御される。従って、例えば、反応して
過酸化水素を生成するすべてのアナライトは、先ず過酸
化水素を生成する変換反応を完全に行ってから、第２次
アナライトとして過酸化水素を用いてペルオキシダーゼ
／カタラーゼの競合下に定酸することができる。過酸化
水素の生成に対する触媒の特異性によって所望のアナラ
イトの分析が制限される。それぞれグルコース又はグル
コースオキシダーゼの分析のために、グルコースオキシ
ダーゼ等の酵素又はグルコース等の基質を加えて過酸化
物生成反応を生じさせることができる。

［アナライト変換反応」とは、対照反応及び競合反応の
両方に基質として役立つ第２次アナライトを生成する予
備的な特異的反応を意味する。

以下に記す反応は複数の過程を経て生じる場合があり、
単数形の「反応ｊは以下の文脈からも明らかな様に単一
過程の変換及び複数過程の変換の両方を含むものである
。

「反応成分」とは触媒及び／又は問題の反応を実行する
ために必要な、試験試料中に元来含まれていない反応試
剤のことを意味する。

「対照反応」とは、そのために反応成分を試料中に既定
量添加する、競合反応と同一の基質を利用する酵素触媒
反応のことを言う。

「競合反応」とは、対照反応と同一・の基質を基質とし
て利用し、試料中に対照反応用触媒に対する量を変化さ
せて添加される「競合触媒Ｊによって触媒作用を受ける
反応を言う。

最も一般的には、対照反応成分を一定量加え、競合反応
成分の添加量を変化させる。しかし、必要なことは明ら
かに、これらの成分のｍＭＵな量を段階的に変化させる
ことである。従って、対照成分濃度も変化することがあ
るが、この濃度は、対照反応はそれに対して競合反応を
標準化するための基準として用いられるという意味で「
既定」されている。

（なお、対照反応及び競合反応を集合的に「競合反応」
と呼ぶことがある。） 「標識反応」とは、所望のアナライト又は第２次アナラ
イトの濃度に直接又は間接に依存し、検出可能な物質を
生成する反応を言う。最も簡単な例では、こうした生成
物が単に色を見ることによって検出できるような物質で
ある。

直接的な基質の分析では、対照反応が標識反応でもある
が、間接的な基質の分析では、競合反応が標識反応であ
る。また、酵素アナライトでは、通常単に便宜上の理由
から競合反応が標識反応であり、イムノアッセ・ｒ又は
特異的親和性分析では、対照反応又は競合反応のいずれ
が標識反応でも良いが、通常は対照反応は溶液中に供給
ｙれた酵素抱合体によって触媒作用を受け、競合反応は
固体支持体に固定された酵素抱合体によって触媒作用を
受ける。

「アナライトに特異的な試薬」とは、試料中の成分のう
ちでアナライトとしか反応しない試薬のことを言う。特
異性の水準は、もちろん、アナライトの性質に関連する
汚染物の性質に依存する。

アナライトに対して特異的な試薬が、競合反応自身によ
って提供されることもある（すなわち、アナライトかこ
うした競合反応の基質又は酵素である場合）。しかし、
こうした試薬がこれらの競合反応成分に補足的に供給さ
れる場合もある。すなわち、競合反応が第２次アナライ
トを利用する場合、アナライトに特異的な試薬はアナラ
イト変換反応の基質又は酵素であり、例えばイムノアッ
セイでは、アナライトに特異的な試薬が抗体又は誘導体
で、特異的な親和性に基づく分析では、この試薬が「特
異的な親和性パートナ−」になる。

（Ｂ、本発明の方法の概要） この方法は多様なアナライトに適用することができるが
、特に次の様なアナライトがある。

１）　対照反応及び競合反応の両方に対する基、質。

２）　対照反応及び競合反応の両方の基質に変換可能な
基質。

用 ３）　対照反応用触媒。

４）　アナライト変換反応用の触媒。

５）　特異性抗体との反応性を持つ抗原。

６）　特異的な親和性結合が可能な基質。

これらの例についての詳細な説明は後述する。

競合する触媒対を用いて自己充足的に定量するという一
般的な概念を説明するには１図１に示す特定の例に対す
る仮定的な結果を用いるのが最も良い。この図において
は、アナライトが酵素基質で、対照反応が標識反応であ
る。図１は、Ａ（＠低）〜Ｄ（最高）の４種類のアナラ
イト濃度について、標識反応で生成する着色生成物の吸
光度（ｙ軸）を競合触媒濃度（Ｘ軸）の関数としてプロ
ットしたものである。曲線Ａ、Ｂ、Ｃ，及びＤは、この
連続的にアナライトａ度が増加するＡ〜Ｄの試料につい
て競合触媒の濃度を変えて得た着色生成物の吸光度を示
す。アナライト濃度が最も低い試料についての着色生成
物の吸光度を曲線Ａに示す。この曲線Ａは、競合触媒機
が一定の時、常にアナライト濃度が２番目に低い試料の
曲線Ｂよりも下にくる。また、次いで曲線Ｂはこれより
もアナライト濃度が高いＣ及びＤ等の曲線よりも下にく
る。吸光度水準Ｘの水平線は肉眼での検出限界を示す。

すなわち、目で見ることができるのは吸光度がＸより高
い検出性生成物を生成する反応だけである。この図から
判るように、曲線Ａ〜Ｄが可視直線と交差する競合触媒
濃度は順次高くなる。従って、競合触媒濃度が１では、
曲線Ａで示されるアナライト濃度でさえも検出できるが
、競合触媒濃度が４では最高のアナライト濃度（Ｄ）で
の吸光度でさえ限界線Ｘに近づく。これらの結果を表１
に示す。

（以下余白） 衣−一ユ Ａ　ＹＮＮＮ Ｂ　ＹＹＮＮ ＣＹＹＹ　Ｎ Ｄ　ＹＹＹ　Ｙ Ｙ＝イエス（検出可能）、Ｎ−ノー（検出不能）表１か
ら、アナライト濃度Ａ、Ｂ、Ｃ，及びＤを、濃度が異な
る競合触媒に対する応答パターンによって識別できるこ
とが判る、すなわち、濃度Ａの試料が可視の応答をする
のは競合触媒濃度１だけであるのに対して、濃度Ｂの試
料は競合触媒濃度ｌ及び２で可視の応答を示し３．４で
は応答しない。また、アナライトａ度りの試料は競合触
媒の全濃度で可視の応答をする。

従って、この例の場合には、分析すべき試料を幾つかに
分け、各々を対照／標識反応に必要な試薬及び触媒と接
触させる。対照触媒に対する競合触媒の量を変化させる
ことによって対照／標識反応との競合の度合も変化する
。アナライト濃度が高いと、競合触媒反応による消耗が
促進されるにもかかわらず、対照／標識反応を進めるこ
とができ、検出可能な反応と検出不能な反応を競合反応
触媒又は反応試剤の関数として配列すると、特定のアナ
ライト濃度に特徴的なものになる。

別の例においては、競合触媒を酵素アナライトによって
使用されるのと同じ基質との競合において用いることが
でき、従ってこの場合はアナライトが対照反応の触媒と
なる。この場合は、一定の限定礒の共通基質を反応系中
に添加する。酵素アナライトが呈色標識反応に触媒作用
を持つことはありそうもないため、便宜上、競合酵素と
してこの様な触媒作用をするものを選ぶ。こうした条件
では、アナライト濃度が高いと着色度はＬなる。もちろ
ん、対照反応がたまたま標識として利用できる場合は、
その様にしても良い。

（一般には対照反応が標識反応である方が簡単だが、競
合反応も標識としての機能を有しても良い。すなわちこ
の場合には、対照（既定の反応成分を添加する）反応は
競合／標識反応に関する単なる控えとしてしか用いられ
ない）。

更に別の例においては、測定すべきアナライトが適当な
アナライト特異性反応によって「第２次アナライト」を
生成する。この第２次アナライトは競合する対照反応及
び競合反応の基質として、測定すべきアナライトの代わ
りになる。従って、この変法においては、分析試料中に
、上記の様器こ質を形成する第２次アナライトが供給さ
れると共に、試験に特異性が付与される。この変法のお
かげで、同様の第２次アナライトを生成するものであり
さえすれば、多数の所望のアナライ＋１ここの標準的な
競合パターンを適用することができる。

アナライト自身が酵素の場合は、第２次アナライトに変
換可能な一定量の基質を使用する。才なわち、第２次ア
ナライトは添加された基質の生成物であり、その濃度は
酵素アナライトの濃度に比例する。これ以後の分析手順
は、基質がアナライトの場合について説明したのと同様
である。

例えば、実施例で後述する様に、Ｈ２Ｏ，Ｌはペルオキ
シダーゼ及びカタラーゼに制御される反応の競合によっ
て検出できる。幾つかの第１次アナライトは、第２次ア
ナライトとして過酸化物を生成させるために利用できる
。例えば、グルコース（グルコースオキシダーゼ）、コ
レステロール（コレステロールオキシダーゼ）、及びク
レアチニン（クレアチニン・アミジノヒドラーゼ及びサ
ルコシンオキシダーゼ）等がある（ＦｏｒＳａｔｉ、　
Ｐ。

等、Ｇ１１ｎ、　Ｃｈｅｒｒｒ、、１９．１４９４　（
１９８３）参照）。

アナライトは必ずしも酵素又は特異的な酵素反応の基質
である必要はない。本発明の一般的な方法は、所定濃度
のアナライトに特異的な抗体又は他の親和５合性パート
ナ−と共に量の異なる競合触媒を表面に所定の幾何形状
で配列させた支持体を用いることによって、抗体を生成
し得るすべての物質、又は特異的な親和性結合が可能な
基質の定駿にも利用することができる。対照反応用の触
媒は、この支持体を対照触媒を含む溶液と接触させて既
定量供給し、同時に又はこれに続いて支持体を試料と接
触させる。抗原−抗体作用又は親和性相圧作用によって
、支持体上にくまなく供給される対照酵素の濃度が溶液
中のアナライト濃度の関数として規定される。この方法
は後述の様に様々な形に脚色することができるが、基本
的な概念は、抗原／抗体特異性又は親和性結合の特異性
を用いて、種々の量の競合酵素触媒と接触する対照酵素
触媒の験を制御することにある。実施態様の設計、並び
に対照反応と競合反応のいずれが標識反応かによって、
この試験は、標識反応の水準を試料中のアナライト濃度
に正比例するようにも反比例するようにもできる。

（Ｃ，分析形態） 酵素又はその基質の分析に関する一つの好ましい方法で
は、対照反応を行わせるために必要なすべての反応試薬
及び触媒（又は基質）を含む等量の溶液、並びに競合反
応を行わせるのに必要な試薬及び様々の量の触媒を含む
多数の溶液を別々の容器に入れて用意する。水を使って
再溶解することができる試薬や触媒を使用しても良い、
いずれの場合も反応は湿潤状態で実施されるため、試薬
の供給方法が異なるだけに過ぎない。こうして、一定皺
の対照反応成分と様々な量の競合反応成分を含むこの一
連の容器中に、等量の分析試量を加える。反応完了に必
要な時間が経過後、容器を観察して、検出性生成物が実
際に見えるかどうかを確認する。可視／不可視のパター
ンを競合触媒濃度の関数として、予め決定しておいた標
準アナライト濃度の試料からめたパターンと比較して、
試験試料のアナライト濃度を定める。

どの様な形で実施するにせよ、実施可能な又は好ましい
１時間、温度、ＰＨ等の条件は、もちろん、試薬の特定
の性質や使用する触媒に依存する。しかし一般的に、医
療用として役立つ反応では、問題の酵素に最適のｐＨ（
通常は中性）で室温〜約３７℃の温度とし、試験される
基質の濃度に適した反応時間とする。また、好ましくは
、材料の濃度は、約１０倍の範囲のアナライト濃度に亘
って約１０分以内で信頼性及び再現性に富む結果が得ら
れるように最適化する。

より好ましくは、ろ紙、シリカゲル板、又はその他の吸
収体等の適当な支持マトリックスに対照反応用の試薬及
び触媒（又は基質）を含む溶液を全体に均一に含浸させ
る。次いで、この支持体を、好ましくは試料の取扱いや
読取りが行い易い様にして、はぼ中央部に位置する一連
の試験領域に小区分する。続いて、各試験領域に、競合
反応を行わせるための成分を領域毎に順次濃度を変えて
加える。この様なパターンは、例えばパターンに従って
配列する適当な容器中にこれらの材料を様々の濃度で含
む適当なテンブレー・トに対して支持体をブロッティン
グすることによって得ることができる。この様にして作
製した試験シートには、アナライトに様々の水準の競合
を提供する試験位置が相当する配列で含浸される。こう
した操作はすべて製造業者の施設で行うことが可能で、
製造されたマトリックスが最終使用者に供給される。

この様な系は基本的に「乾燥」化学系である。

すなわち、反応は、この系の成分を再湿潤するための溶
媒を使用しなくても起こる。この様な系を作製するため
の技術は、現在良く確立されて、十分に洗練されたもの
になっている。１９ｆｌ！：紀に開発されたなじみ深い
研究用リドマス試験紙からインスタント写真に使用され
ている多層の複雑な系に至るまで、定性分析及び宏量分
析用のこうした系が何種類か市販されている。また、例
えば糖尿病患者が使う血中グルコース含量又は承橋含量
測定用の試薬試験片の様な色の比較に基づく乾燥化学系
も幾つか市販されている。例えば、　Ａｋａｉ　、　Ｔ
。

等、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｇｈｅｍｉｓｔｒ　、　２９　
、１８２５（１９８３）（唾液中の尿素窒素）　、　ｌ
１ａｐｐｅｎ、　Ｇ。

Ｎ４等、シ、　２８　、１１５９　（１９８２）　（血
４ｈ中のコレステロール）を参照のこと、この様な乾燥
化学薬品支持体系の製造方法については、Ｗａｌｔｅｒ
、Ｂ、、Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、、５　５　、’４　９　
８　Ａ（１９８３）に記載されている。

次に、分析試料を種々の試験領域と接触させ、各領域に
可視の生成物が認められるか否かを記録する。こうして
得られた陽性及び陰性の結果のパターンから、試験試料
中のアナライト濃度を評価することができる。濃度につ
いての正確な定量的数値の決定は、同様の試料中にアナ
ライトを含む適当に希釈した一連の標準試料から得た相
当する結果と比較して行うことができる。すなわち、既
知の試料での予備検量が必要である。

もちろん、前述の様に、固体マトリックス支持体でこの
方法を実施する場合の熟成期間、温度、及びｐＨ条件は
、系中の特定の成分に依存する。

図２に配列の１例を示す。この図では、試験マトリック
スを一連の円弧部分に分割し、その各々に既定量の対照
／標識反応成分を含むようにしである。時計回りに１２
時から進むにつれて、各区分中の競合酵素量が（必要な
場合は、競合反応用に追加する試薬の量と共に）順次増
加する。試料を中心２１に加えマトリックスを通して拡
散させる。試料中に妨害物質が含まれる場合は（例えば
、全血試料中の赤血球細胞）、上澄液が膜を通過して試
験領域２３に達するように円形の半透膜２２を介在させ
るのが好ましい。試料中のアナライトｓ度に応じて、各
区域は時計回りの順に呈色する。こうして、呈色が停止
する１時間」を測定すれば、アナライト量の範囲を確認
できる。２時迄しか呈色しない試料は、１１時迄呈色す
る試料よりもはるかにアナライト濃度が低い。

より好ましい実施態様は、図３に示す「温度計」型であ
る。この支持体では、右から左に行くに従って試験区間
３１の競合反応成分濃度が増すように配列しである。第
２次アナライトの分析用に作製されている場合は、各区
間に等量の特異的なアナライト反応触媒も含浸しておく
（又は後から添加する）し、イムノアッセイ又は特異的
親和性分析用の場合には、マトリックスに特異的な抗体
又は親和性パートナ−を担持しておく（後述のＤ項を参
照のこと）。試験材料の試料又は分割液を各点に加え（
又は支持体を試料中に浸し）、（３２）の横に表示され
る特定の位置まで進む発色によって濃度範囲が表される
。分析検査は、試料濃度が高いほど着色帯がより左方向
に拡大するように（図３に示す通り）設計される。

時計型及び温度計型はいずれも、一連の異なる試験の定
量結果を表示するために便利な方法である。このマトリ
ックスは、一つの区間中にグルコース分析用の試薬、他
の区間にアンモニア分析用試薬、更に別の区間には尿素
分析用試薬を含有させるといったこともできる。

（Ｄ、イムノアッセイ及び特異的親和性結合分析） 験体補゛乳動物への注入に応じて生じるアナライトと免
疫グロブリンの特異的な抗原／抗体反応を利用する変法
や、アナライトのパートナ−化合物への特異的な親和性
結合を利用する変法では、すべて固体支持体の利用及び
固体支持体に設けられた競合酵素のパターン化された分
布を必要とする。

分布パターンは、基質又は酵素に適用する検量系に関連
して述べたのと同様に、すなわち「温度計」型又は「時
計ｊ型にすることができる。適当な固体支持体には、イ
ムノアッセイに通常使用される支持体（代表的には寒天
）、ポリスチレン、イオン交換樹脂、ガラス、アガロー
ス、デクストラン及びその誘導体等がある。抗体又は親
和性パートナ−分子は、公知の方法を用いて支持体に吸
収させたり共有結合させたりする。同様に、競合反応用
の酵素をその表面に分布させ、温度計の管の様に或いは
時計の時間が進む様な具合に酵素の密度が増加する様な
パターンで吸収させたり共有結合させる。蛋白質等の材
料を吸収又は共有結合させる方法については良く理解さ
れており、競合酵素及びアナライトに特異的な試薬のい
ずれにも応用可能な詳細な報告が入手できる。例えば、
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｆ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ第１＠ＸＩ、ｒ
Ｖ　（１９７６）「固定化酵素Ｊ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ）　Ｍｏｇｂａｃｈ、　Ｋ。

編を参照のこと。

続いて、支持体を分析すべき溶液及び対照反応用の反応
成分を用いて常法に従って処理する。対照酵素の濃度は
溶液中のアナライト量によって規定される。これは、対
照酵素が試料中のアナライト濃度に応じてアナライト抗
原に結合されるためか、対照酵素が追加された抗体と結
合して抗原が存在する場合しか結合しなくなるためか、
或いはアナライトに対する抗体と対照反応酵素に対して
指向するが不活性化はしない抗体との間での支持体空間
の競合によるものである。同様に、特異的な親和性結合
を用いる場合は、対照酵素は、競合アナライトと結合す
ることもあるし、支持体に固定されたアナライトに結合
し得る結合性ツク−トナーと結合することもある。これ
らの詳細についてはＦで詳述する。

（Ｅ、キット及び支持体） 本発明の方法に利用できる材料は、キット又は試験マト
リックスとして便利な形で供給することができる。従っ
て、本発明の方法を実行するための体系的なシステムを
提供するこの様な便利なパッケージ形態も本発明の範囲
に含まれる０本発明に有用な酵素等の触媒及び反応試薬
は、溶液としても乾燥した形態でも供給できるし、分析
の性質に応じて、反応容器に入れて販売向きのキットと
したり、適当な試験領域を備えたダイアグラム−マトリ
ックスとすることもできる。アナライトが酵素又は基質
である場合の分析の特に好ましい実施態様は、対照用の
乾燥試薬を含む一連の反応バイアル容器、好ましい場合
は、各容器に入れた既定量の特異的なアナライト試薬、
並びに相対的に異なった酸の競合反応用の試薬及び触媒
から構成される。使用に際しては、このバイアル容器は
、単に適量の水を加えるか、直接試料溶液を加えて活性
化することができる。適当な容器としては、通常のバイ
アル容器又は通常微生物学で連続的に希釈して反応させ
るために用いるミクロタイター・プレート等を利用でき
る。

固体支持体の代替物についてはある程度詳しく前述して
あり、これはアナライトの特異的な免疫性応答又は親和
的な結合性応答に基づく分析にも適用することができる
。酵素又は基質の分析では、支持体に結合する試薬もあ
るし支持体に後から添加されるものもある。免疫学的又
は特異的親和性結合分析では、特異性抗体又は特異的親
和パートナ−及び競合触媒を前もって支持体に固定化し
、対照成分は別に添加しなければならない。

Ｆ、傷表瓜工功 従って試験キットの成分は一般に適切な試薬と対照反応
用触媒と競合反応用触媒を含むが、場合により、アナラ
イト変換反応や、抗原／抗体反応や親和性結合反応に使
用する試薬の触媒を含むこともある。適切な標識反応と
しての対照反応又は競合反応は、例えばペルオキシダー
ゼと染料生成還元剤による過酸化水素の酸化であっても
よく、又ペルオキシダーゼによる染料生成反応を伴うグ
ルコースオキシダーゼによるグルコースの酸化でもよく
、又ｐＨ指示薬の存在下でＨ＋を発生する特異的酵素に
よる触媒作用を利用したいかなるアナライトの反応であ
ってもよい。以下に記載する染料以外に、ペルオキシダ
ーゼの触媒反応に使用できる染料としては？、２−アジ
ノージ−（３−エチルベンズチアゾリン−スルホネート
（ＡＢＴＳ■）、テトラメチルベンジジン、４−クロロ
−１−ナフトールがある。

このような反応を利用する代表的な例を以下に示す。　
（ａ−ｅの系列は基質型アナライトを定量するためのも
のであり、ｆ−ｈの系列は酵素アナライトを定量するた
めのものであり、ｉの処決は抗原／抗体反応及び特異な
親和性結合反応のためのものである）。

ａ）　グルコースのＳ：′ 方法ｌ：１肛２４１１穐Ｊし応 トン＋Ｈ２Ｏ２： Ｈ，Ｏ，＋４−アミノアンチピレン＋ｐ−ヒペルオキシ
グーゼ ドロキシ安息香酸塩　キノン イミン染料＋Ｈ２０ 競イＬ反五訂・ 一スローリン酸塩＋ＡＤＰ 方法２：１艮Ｚ塁１１葛 一スー６−リン酸塩＋ＡＤＰ グルコース−６−リン酸塩＋ＮＡＤ＋ ホスホグルコネート ジアホラーゼ ＮＡＤＨ２＋テトラゾリウム塩 ＮＡＤ＋ホルマザン（発色） ｌ・ン＋Ｈ２０゜ ン＋Ｈ２Ｏ２ 対型」艷１反厄 Ｈ，Ｏ７＋４−アミノアンチピレン＋ ベルオキシグーゼ ｐ−ヒドロキシ安息香酸塩 キノンイミン染料＋Ｈ，０ Ａ介返あ りタラーゼ ２Ｈ２０，２Ｈ２０＋０゜ 方法４：艷叉頂ヱ土ユｌ」五あ ヘキソキナーゼ グルコース＋ＡＴＰ−−−グルコー スー６−リン酸塩＋ＡＤＰ グルコース−６−リン酸塩＋ＮＡＤ ＋ホスホグルコネート 紅贋し遣Ｌ１反葛 シアホラーゼ Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ、＋テトラツリウム塩 ＮＡＤ＋ホルマザン 肌了すえ応： 乳酸塩＋ＮＡＤ ｂ）コレスーロール　１“ コレステロール十　％１ｚＸ７０−ＪＬ／コレスオキシ
ダーゼ テン−３−オン＋Ｈ２０゜ ヒ焦Ｚ豊１返茜 ２Ｈ，０２＋４−アミノアンチピレン＋ｐ−ベルオキシ
ダーセ ヒドロキシ安息香酸塩−−−−−−一→４Ｈ２０＋キノ
ンイミン染料 肌ｊ」え応 カタラーゼ ２　Ｈ２０２２Ｈ２０ Ｃ）風量じΣ１量 −・アナライト　・＼ ウリカーゼ 尿酸＋０２−−一→Ｈ２Ｏ２＋ アラントイン 対猛Ｚ蓋１１茜 Ｈ２Ｏ２＋４−アミノアンチピレン＋ｐ−ヒペルオキシ
グーゼ ドロキシ安息香酸塩−一−−−−−→ ４Ｈ２０＋キノンイミン染料 競イＨえＺ； カタラーゼ ２　Ｈ７０２２Ｈ２０＋０２ ．１）グ＋７４＋）　ド＋Ｈ２ｏＣＥＤ　３．１．１３
）グリセロール＋遊離脂肪酸 リパーゼ グ　１ノ　ヤ　。　−、、＋　Ａ　Ｔ　Ｐ　（ＥＣ２・
７１・３０）ＡＤＰ＋Ｌ−α−グリセロール−リン酸塩 Ｌ−＝α〜グリセロールーリンＨ塩＋　０２Ｌ−ベーゲ
リ辷ρ−Ｊムーソ〉剃控監　オキシダーゼＨ２Ｏ２＋ジ
ヒドロキシアセトン−リン酸塩 江鼠Ｚ益１返茜 Ｈ２Ｏ２＋４−アミノアンチピレン＋ ２Ｈ２０＋キノンイミン染料 趙イＬ反五ｔ： カタラーゼ ２Ｈ７０２２Ｈ２０＋０２ （ＥＣ：　３．５．３．３） クレアチニン＋Ｈ２０ 尿素＋サルコシン （ＥＣ１，５，３，’１．） サルコシン＋Ｈ２０＋０゜ グリシン＋ホルムアルデヒド＋Ｈ７０２炸１１」１１反
次 Ｈ２Ｏ２＋４−アミノアンチピレン＋Ｐ−ヒベルオキシ
グーゼ ドロキシ安息香酸塩　キノン イミン染料＋４Ｈ２０ １九幻伝： カタラーゼ ２Ｈ２０２２Ｈ２０＋０２ ＤＨ ピルビン酸塩＋ＮＡＤＨ２−−→Ｌ〜乳酸十ＮＡ口（Ｎ
Ａ［１ｌＨ２のみに限定） 執」し４堡１え多重： ヂアホラーゼ ＮＡＤＨ２＋テトラゾリウム塩 ＮＡＤ＋ホルマザン ＬＴ Ｌ−グルタミン酸塩＋ピルビン酸塩−一→Ｌ−アラニン
＋α−ケトグルタル酸塩 （グルタミン酸のみに限定） １在Ｚ豊１互茜： Ｌ−グルタミン酸塩＋ＮＡＤ＋＋Ｈ２０α−ケトグルタ
ル酸塩十ＮＨ３＋ＮＡＤＨ２ヂアホラーゼ ＮＡＤＨ２＋テトラゾリウム塩 ＮＡＤ＋ホルマザン ｈ）アスパルテート　アミノトランスフェラーゼ　ＡＳ
Ｔの Ｌ−７スハルテート＋α−ケトグルタル酸塩（グルタミ
ン酸塩に限定） １在Ｚ貞１亙Ｌ： Ｌ−グルタミン酸塩＋ＮＡＤ”　＋）（２０２−オキソ
グルタル酸塩子ＮＨ３＋ ＡＤＨ２ ヂアホラーゼ Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ　２＋テトラゾリウム墳−〜ーーーーー
→ＮＡＤ＋ホルマザン 本発明のアナライトはそれ自身が酵素活性の基質や酵素
である必要はなく、単に親和結合性を有する物質又は抗
体を作成回部な物質であればよい。

本発明を実施するために、アナライトに特異的な抗体や
親和性パートナ−が既定量　結合した固体支持体で、し
かも競合反応（これは固定支持体上の種々の位置で生ず
る）用酵素の一定量が結合している固体支持体を先ず準
備する。こ９場合抗体又は親和性パートナ−と競合用酵
素は散在した状態で、固体支持体に結合している。最も
簡単で理想的な例においては、第３図に示した「温度計
」型の場合と同様に、競合酵素の結合濃度が漸増的な又
は連続的な直線的変化として支持体上に現われる。分析
用試料と試薬が固体支持体に添加されるが、この添加は
支持体を分析用サンプルに浸漬すること及び／又は対照
反応用試薬の溶液に浸漬することにより最も容易に行な
うことができる。また、対照反応と競合反応のためには
任意の基質を使用することができる。対照反応及び競合
反応には任意の基質を用いることができる。すなわち、
前述のように過酸化水素、グルコース、ＮＡＤ　、ＮＡ
ＤＨ２　、グルタミン酸塩，ピルビン酸塩等の基質には
競合反応が可能な酵素の対がある。これらの基質はアナ
ライトの性質とは無関係に反応混合物中に供給し，支持
体の表面に既定量結合させる。

結合している競合酵素と実際に競合する対照酵素量が固
相の抗体対は親和性結合パートナ−との結合に利用で鼻
るアナライトａによって決まるため、本発明においては
分析結果が試料中のアナライト量に対応する。

対照反応又は競合反応の何れが標識反応であるかに従っ
て、応答はアナライト量に比例することもあるし、反比
例することもある。

こうした概念を理解するには特定の例を挙げて説明する
のが良いと思われる。そこで例として過酸化水素／ペル
オキシダーゼ／カタラーゼ系を用いる。これは、第２次
アナライトへの転換に基づく種々の定量に用いたのと同
じ組合せである。この系においてペルオキシダーゼは、
例えば過酸化水素がアミノアンチピレン及びｐ−ヒドロ
キシ安息香酸塩と反応して水とキノンイミン染料を生成
する様な標識反応の触媒として働く。この際、カタラー
ゼは単に過酸化水素が水と酸素に分解する反応に影響す
るた゛けで、発色は起さない。

先ず、支持体トに様様な量のペルオキシダーゼ又はカタ
ラーゼを、所望のアナライトに応じた既定量の抗体や親
和性パートナ−と共に結合させ、続いてこの支持体を、
分析試料、対照反応に特異的な酵素、並びに対照反応及
び競合反応用の基質を含む展開液で処理する。

ｉ）　以下に本発明の方法を実施するための基本的な手
順、すなわち、対照反応成分及びこれとの相対量が様様
に異なる競合反応成分の濃度を利用してアナライトの濃
度を自立的に定量するための手順について説明する。

以下の例では、常に、表面に親和性パートナ−又はアナ
ライトに特異的な抗体を有する支持体に，直線的な勾配
をつけて競合反応用酵素が結合している。

一゛　−　“ 楓アナライトに特異的な試薬や競合酵素は、例えばＧｈ
ｉｂａｔａ，　Ｉ　、　（Ｅｄ．）　”Ｉｍｍｏｂｉｌ
ｉｚｅｄ　ＥｎｚｙｒｓｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ”　Ｈａｌｓｔｅｄ　Ｐｒｅｓｓ’　
（＋９７８）Ｎ．　Ｙ．やＪａｃｏｂｙ，　Ｗ．Ｂ．、
　ｅｔ　ａｌ，　Ｍｅｔｈ．　Ｅｎ　。

ＸＸＸＩＶ　、　（１９７４）　”Ａｆｆｉｎｉｔｙ　
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ。

Ｅｎｚｙ＋ｎｅ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；　ｐａｒ
ｔ　Ｂ″，　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，　Ｎ．　Ｙ
．に記載の技術を用いて必要ならば支持体に同時に固定
することができる。支持体はセグメントから構成される
ので、各セグメントに各種酵素濃度のものを接触させて
組立てることにより競合触媒法度に勾配をつけることが
できる。

−例として、固体支持体室アナライトを含むサ一部を占
拠する。先浄後この結合アナライトを含む固体支持体を
、アナライト分子に共有結合した対照反応酵素今賂舎藤
を含む溶液と接触させる。

酵素を担体分子に結合する方法は公知で、例えばＷｉｌ
ｓｏｎ、　Ｍ、Ｂ、、ｅ＋＋゛ａｌ、“Ｉｍｍｕｎｏｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ　ａｎｄＲｅｌａｔｅｃ／！Ｓ
ｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　”　、　ｐｐ
２１５−２２４゜Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｈ
ｏ１ｌａｎｄ、　Ｎ、Ｙ、（１９７Ｂ）がある。残存す
る抗体や親和性パートナ−の少なくとも一部は抗原又は
親和性パートナ−を対照反応酵素に結合するために刺２
用することができる。もちろん、試料中のアナライト濃
度が高い程、対照反応酵素の結合量は少なくなる。固体
支持体は次に、基質及び競合する二つの反応用の反応成
分（゛この場合は、過酸化水素、アミノアンチピレン、
ヒドロキシ安息香酸塩及び適切な緩衝剤）を含む展開液
（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ）で処理する
。競合酵素濃度が最高の領域では、競合反応の阻止によ
り多くの対照酵素を必要とする。試料中のアナライト濃
度が高いと試料中のアナライト濃度が低い場合よりも競
合酵素濃度が低いところで、競合反応は対現反応による
影響をうける（即ち対照反応により支配される）。従っ
て競合反応が標識反応でもある場合（ペルオキシダーゼ
）には、アナライトが高濃度になると、指示薬である発
色キノンイミン染料が発現する部分が大きくなる。この
ような場合は、支持体を試料で処理してから対照酵素で
処理するか、試料と対照酵素の両者で同時に処理するか
は問題にならない。

この様な原則を適用可能なアナライトとしては、ビオチ
ンやウィルスカブジッド蛋白のような免疫原がある。ア
ナライトに特異的な試薬は、ビオチンではアビヂンであ
り、カブジッド蛋白では、これに対応する抗体である。

ビオチンな含む試料１例えばビオチンが結合し、たポー
スラディ・／シュではビタミンＨにホースラディツシュ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含む試料を、固定化した
アビジン及び壊変勾配をつけて固定化したカタラーゼと
接触させる。次に、洗滌後Ｈ，０２及び発色試薬を含む
展開液を添加する。

この方法の別法においては、対照酵素は、競合アナライ
トに結合するよりもむしろ、支持体に結合した抗体の反
応部位とは異なる部位でアナライトと反応する抗体又は
親和性パートナ−と結合する。従って支持体に結合する
アナライト分子が多くなる程、対照酵素の濃度は高くな
る。この場合１指示薬の色を直接アナライｆａｔと比例
させるためには、対照反応が標識反応（ペルオキシダー
ゼ）であり、競合反応がカタラーゼによる触媒作用を受
けなくてはならない。

例えばビオチンは前述したようにアビヂンとカタラーゼ
を固定した支持体に試料を接触させることにより定量で
きるが、試料を接触させた後で洗滌し１次にアビヂンと
ＨＲＰの複合体で処理することが必要である。又ヒト絨
毛性ゴナトドロフィン（ｈｃＧ）は、第１の抗ｈｃＧを
含む支持体をａ度勾配をつけたカタラーゼと接触後洗部
し、第２の抗ｈｃＧに結合したＨＲＰで処理して定量す
ることができる。

更に別の例では、対照反応用酵素に特異的に支配される
支持体上への抗体又は親和性パートナ一部位をアナライ
トを使ってブロックすることもできる。アナライトそれ
自身が支持体のかなりの部分を妨害するのに充分な大き
さを持つ嵩高の分子であれば、妨害は直接行われるし、
アナライトが充分な大きさでないならば、充分な大きさ
を持つＢＳＡのような結合蛋白を対照アナライトに結合
して供給する。何れの場合も、直線的な濃度勾配を持つ
競合反応用酵素と共にニ一つの特異的な試薬の混合物、
すなわちアナライトに特異的な試薬と対照酵素に特異的
な試薬の混合物を含むように支持体を作製する。次にこ
の支持体を、嵩高なアナライトそのもの、または、例え
ばＢＳＡのような物を結合させて嵩高にしたアナライト
分子との競合の下にアナライトで処理する。固体支持体
は、次に洗滌し、対照反応酵素で処理後、更に基質で処
理する。呈色の度合は、結合する対照反応酵素の量によ
り決まり、嵩高なアナライトが高濃度の場合には薄く、
又ＢＳＡ−アナライト複合体と競合するアナライトが高
濃度の場合には儂い。発生する色がアナライト濁度に正
比例する力ず反比例するかは、標識反応として対照反応
を選ぶが、競合反応を選ぶかによって決まる。

これら種々の方法を一般化すると第５図の様になる。こ
の図は抗原／抗体反応について記したが、抗体をアナラ
イトに対して特異的な親和性結合パートナ−に代えれば
、特異的親和性結合パートナ−にも全く同じ原則を適用
することができる。何れの場合も支持体結合する酵素（
Ｅｌ）はＥｌの密度が次第に増大するセグメントとして
配置している。

第５ａ図及び第５ｂ図に、試料中のアナライトとアナラ
イト分子に結合する対照酵素間での、結合した抗体部位
に対する競合に基づく方法を示す。

第５ｃ図は、抗アナライト抗体に結合した対照酵素が、
アナライトに占拠された位置で支持体に結合する使方を
持つことに基づく方法である。

第５ｄ図及び第５ｅ図は、結合したアナライトが対照酵
素の結合に立体障害を生ぜしめる場合を図示したもので
ある。

Ｇ、支厘潰 以下の実施例は本発明を説明するものであって、本発明
を限定するものではない。対照反応、競合反応、特異的
アナライト反応の夫々に使用できる反応試剤／触媒の組
合せは多数あるため、本発明をこれら反応試剤と触媒の
特別なものを用いた実施例で説明する。

従って以下の実施例は、当業者が容易に入手できるいく
つかの反応試剤及び触媒成分を使用するグルコース又は
コレステロールの分析法である。

しかし分ｌ腎ンブルの性質によっては、試薬と酵素が全
く異なった例も可能であり、又実際にこのことは必要に
なる。本発明の方法は、免疫分析や特異的親和結合に基
づく分析を行なう場合にほぼ普遍的に使用することがで
きる。

以下の実施例の夫々に於ては、試験用グルコース濃度は
０．０１−０．３にモル７ｍ文（即ち約１．８〜５４ｐ
ｇ／ｍｕ）の範囲にある。又分析は反応容積１．０１ｍ
９．に於て行なった。

（ＩＸ下令白〕 Ｇ・１・ａ、　１′　、して　グルコースオキシダーゼ 競合触媒及び基質の適切な濃度範囲を決定するために、
ヘキソキナーゼの存在下にグルコースをグルコース−６
−リン酸塩に変換し１次にグルコース−６−リン酸塩が
相当するカルボン酸に変換すると同時に、酸化ＮＡＤ＋
がＮＡＤＨに化学歌論的に変換する反応を標識反応とし
て使用した。ＮＡＤＨは３４０ｎｍの吸収で検出される
、即ち３４０ｎｍの吸光度を可視性の指標として使用し
た。更にＮＡＤ÷がＮＡＤＨへ変換する現象は、この際
ロイコ染料とｄｉａｐｈｏｒａｓｅ　（ジアホラーゼ）
を添加してやると可視標識物として使用することができ
る。この場合の反応は次の通りである： この反応では生成するＮＡＤＨに比例した観察可能な色
変化が生じる（この色変化は３４０ｎｍの吸光度として
この実施例で測定される値に比例している）。

競合反応はグルコースオキシダーゼを競合触媒と１．て
使用するグルコースの直接酸化であり、この結果は室温
及び３７℃の両者に於て測定した。

夫々の反応容器の全試料容積は１．０１ｍ文であり、次
の成分を含む。

！、５　ｕｎｉｔｓ／ｍＫＬ　ヘキソキナーゼ０．７７
７ｔモル／ｍｌ　ＡＴＰ ｌ、９　ｕｎｉｔｓ／ｍｕ　グルコース−６−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ ０．９１延モル／ｆｆｌ父　ＮＡＤ 上記混合物はｐ）（７，６に緩衝した。この量は試薬と
しては過剰量であり、又標識反応に於てグルコースを完
全′に消費するのに充分な触媒の量である。グルコース
はサンプル容量として１：１００に稀釈された。従って
この濃度は表２−４に示した濃度の０．０１倍になる。

試験用グルコース試料の夫々に対して、グルコースオキ
シダーゼ０１６２．５．１２５．２５０及び５００　ｕ
ｎｉｔｓ／ｍｌを含む５個の容器を用いた。

標識反応用の前記物質は、ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＳｔ
ａｔｚｙｍｅ　Ｍ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｋｉｔ、　ｃａｔ
ａｌｏｇ　＃２７５３ｆｌを稀釈して用いた。グルコー
スオキシダーゼはＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ　Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒから入手したもので、１５５ｕｎｉｔｓ／ｍｇ
の比活性を有するものである。

表２ａ及び表２ｂは各種濃度の６個のグルコース試料に
ついて周辺温度及び３７℃で得られた結果である。

一２ａ：　で４　′　ＯＤ グ）Ｌｙ：Ｉ−７，８度　グルコースオキシダーゼ濃度
（ｕ／ｍ文） む工ｊ」」Ｑ　旺」　突　η印　狭 ０．３１　０．１０？　０．０８０　θ、０８５　．０
．０？４　０．０ｅ４０．８２　０．２１？　０．１３
４　０．１７０　０．１４５　０．＋２２１．２５　０
．４１Ｂ　０．３２０　０．２８１　０．２８０　０．
２３７２．５　０．８Ｂ１　０．５９４　０．６２１　
０．５３０　０．４２４５．０　！、５２３　１．２２
６　１．＋４９　１．００２　０．８１５ン２ｂ：３７
℃　ｉｏ’ＯＤ。

グ、い−１−ｘ　濃度　グルコースオキシダーゼ濃度（
ｕ／ＩＩ１文） すより」」’Ｑ　岨」　号鋒　υ沙　郭」０．３＋　０
．１０８　０．０８１　０．０８ｆｔ　０．０？３．０
．０８２０、＋３２　０．２２０　０．１７８　０．１
？５　０．＋３７　０．１１９１．２５　０．３８３　
０．３１４　０．２９４　０．２８？　０．２３ｆ１２
．５　０．７１０　０．Ｅｉ１７　０．［１４７０，５
１００，４３２５，０１，７３４１，１３９１，ＩＨ０
，９４ｆ３　０．７１０上記結果から、オキシダーゼが
標識反応と効率良く競合するのはグルコース濃度が極め
て高い場合だけなので、適切な可視と不可視の境界線を
見出すには１高温度のグルコースオキシダーゼを使用し
なければならないことが判る。しかし表から、グルコー
スオキシダーゼ濃度が標識反応の可視性に影響すること
、及び着色度が試料中のグルコース量に比例することが
明白である。

Ｇ、１．ｂ、八　として　ヘキソキナーゼ同様の測定を
標識反応と競合反応の役目を反対にして行なった。櫟識
反〜応は、ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＳｔｒａｔｅｚｙｍ
　Ｍ　ｃａｔａｌｏｇ　＃２７８３２を使用し、適当な
無色染料前駆体を可視染料に変換するのに充分な触媒と
反応試剤を兵える濃度で実施した（各容器中）。この染
料はグルコースとグルコースオキシダーゼとの反応で過
酸化水素が生成するためにできるものである。この場合
、夫々の容器は次の成分を含む。

６．９　ｕｎｉｔｓ／ｍＡ　グルコースオキシダーゼ０
．５用モル／ｍｌ　４−アミノアンチピリン２１．８ｇ
モル／川用　ｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム ０．５　ｕｎｉｔｓ／ｍ文　ペルオキシダーゼ及びｐＨ
７，０に維持するための緩衝剤埃えられたグルコース試
料容器の夫々にはへキソキナーゼとＡＴＰの両者を１μ
又当り次の如く含むもの４種を作成した。

（ＯＩＵとＯ＝モル；３２．４ＩＵと１ルモル；６４．
８１Ｕと２０．モル、１２９．６ＩＵと４０ｗモル。） 一連の試験に対し、前述Ｇ、１．ａ、と同じグルコース
濃度の試料を用いた。即ち表２の濃度は試験液では１：
１００に稀釈した。結果は５００ｎｍ（標識反応生成物
の吸光度最大）に於いて３７℃で１０分後に読みとった
。その結果を表３に示す。

表　３ りＪｌ／　：Ｉ−２濃度　へキソキナーゼ濃度（ＩＵ／
ｍ文） ０より」コ　Ｑ　双」　Ｕコ　Ｕ且」 ０．３１　０．０８３　０．０？１１１　０．０５３　
０．０２？ＯＪ２　０．１９５　０．１Ｂ１３　０．１
０４　０．０Ｂ１１．２５　０．３９２　０．３５２　
０．２４４　０．１２Ｂ２．５　０．７９７　０．７２
９　０．４３４　０．２５９５．０　１．３０３　１．
２５０　１．０Ｂ９　０．５７？表３から、可視水準（
ｖｉｓｉｂｉｌｉｔｙ　１ｅｖｅｌ）を０Ｄ＝０．１と
すると、この方法を用いて０．０１７〜０．０６９ｐモ
ル／　ｍ　ｌの範囲のグルコース濃度を測定できること
が判る。勿論如何なる高濃度の試料でも適当に稀釈すれ
ば使用することができる。

Ｇ、２．　アナライ　・　るグ Ｌ≧≦Ｅ粉妻 グルコース濃度が前記と同範囲のものに、特異的アナラ
イト反応を行ない、ペルオキシダーゼの触媒作用による
過酸化水素の分解及び前記Ｇ、１．ｂ。

項に記述した染料の同時生成に基づいて標識反応が行わ
れるようにグルコースを消費させて過酸化水素を生成さ
せた。競合反応は種々の量のカタラーゼを使用して過酸
化水素を分解する反応である。夫々の反応容器には前記
Ｇ、１．ｂ、に記載したＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｓｔ
ａｔｚｙｍｅ　Ｍ　ｃａｔａｌｏｇ　＃２？８３２によ
り供される充分量のグルコースオキシダーゼと適切なペ
ルオキシダーゼ成分を添加し１次の組成になるようにし
た。

１３．８　ｕｎｉｔｓ／＋ａＪ１　グルコース・オキシ
ダーゼ１．０　＃Ｌモル／ｖａ５Ｌ　４−７ミノアンチ
ピレン４３．８　！モル／■Ｉ　ｐ−ヒドロキシ安息香
酸ナトリウム １　ｕｎｉｔ／ｍ文　ペルオキシダーゼ容器は夫々０１
６４０．１２８０．２５６０．５１２０　ｕｎｉｔｓ／
ｍ文のカタラーゼを含むようにした。各容器のグルコー
ス濃度は前記Ｇ、１項に記載の通りとした０反応は３７
℃で行ない、１０分検測定した。結果は表４に示す通り
である（この場合もグルコース濃度は分析前に１００：
１に稀釈した。）。

表　４ａ グルコース濃度　カタラーゼ（ｕ／ｍ文）ｊＵｌ」　±
　Ｈ堕　剣仰　牡徊 ０．３＋　０．０４７　０．０３４　０．０２５　０．
００？０、［１２０，１０５０，０？３　０．０４５　
０．０１８１．２５　０．２１？　０．１５０　０．０
８８　０．０４３２．５　０．４３７　０．２９７　０
．１７？　０．０８Ｂ５．０　０．８８０　０．６０１
　０．３５２　０．１８５表　４ｂ グルコース濃度　カタラーゼ（ｕ／１力組旺ｌコ　…　
即　凹　旦遍 ０．３１　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ Ｏ，Ｂ２　Ｙ　Ｎ　Ｎ　Ｎ １．２５　Ｙ　Ｙ　Ｎ　Ｎ ２．５　Ｙ　Ｙ　Ｙ　Ｎ ５、ＯＹ　Ｙ　Ｙ　Ｙ 但しＹ＝イエス（検出可能）、Ｎ＝メノー（検出不能） 以上の結果から、上述の方法は、可視水準をＯＤ＝　０
．１　とすると、グルコース濃度範囲０．０３５〜５ｍ
ｇ／ｍ文（分析時稀釈）を測定するのに適当であること
が判る。表４ｂはこの事実を示すために結果を表にまと
めたものである。

Ｇ、３．コレステロール ルステロール用ノＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｒ＋　Ｒｅａｇ
ｅｎｔｓｃａｔａｌｏｇ　＃　２７５７１試験キツトを
用いてアナライトの特異反応のためのコレステロール　
エステラーゼ及びオキシダーゼを準備し、又同時に標識
反応のためにペルオキシダーゼと試薬も準備した。標識
反応としてはカタラーゼの量を変えた。夫々の反応容器
は次記の成分を含んでいる。

１９Ｅ１．５ｕｎｉｔｓ／ｍＪｌｊ　：ｌレスチロール
オキシダーゼ５５４．２ｍＵ／ｍ　ｌ　コレステロール
エステラーゼ１８．６μモル／ｍ又　塩素酸ナトリウム
４．１−モル／ｌａｌ　４−アミノアンチピリン２．２
　ｕｎｉｔｓ／ｍｊＬ　ペルオキシダーゼ３．２８ｐモ
ル／ＩＩＩＫＬ　フェノール及び適切な反応条件を維持
するために充分な緩衝剤と界面活性剤。

夫々の系列はカタラーゼを夫々０．６２５．１２５０．
２５００．　３７５０　ｕｎｉｔｓ／ｍＪ、含む。

又コレステロールは最終反応容積に於て０．ｌ、２．３
．５　ｎｇ／ｍ文になるよう加えた。吸光度は５００ｎ
ｍで３７ＫＧに於て２分後読み取って表５に示した。

表　５ ：Ｉ、ステロール濃度　カタラーゼ （ｕｎｉｔｓ／ｍＪｊ　） 堕旺料Ｊ　ウ　Ｒ堕　凹　旺堕 １　０．０８２　０．Ｏ１３０，０！７２　０．ＱＱ４
２　０．１１０　０．０！４　０．０１１　０．００９
３　０．１８１　０．０３３　−　０．０１２４　０．
２３４　０．０４４　０．０２９　０．０＋５第４図は
これらの結果をグラフに表示したものである。この図を
第１図に示したモデルと比較すると望んだパターンが得
られたことがわかる。

Ｇ、４．−　マ　１ル・　ス　−゛で　′　０．２９項
の実施例の分析法をマトリックス支持体としてＷｈａｔ
ｍａｎ　＃　２２紙を用いて繰返した。グルコースオキ
シダーゼはグルコースと特異的に反応してペルオキシダ
ーゼを生成する。また、標識反応としては、Ｈ２Ｏ２と
の反応による染料生成のペルオキシダーゼによる触媒作
用を利用する。

競合反応はカタラーゼ・を使用してＨ２Ｏ２を分解する
反応である。

Ｇ、２５項に記載したように、特異的アナライト反応の
成分及び標識反応の成分としては、Ｗｏｒｔｈ−ｉｎｇ
ｔｏｎ　Ｓｔａｚｙｍｅ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　（５００ｎ
ｍ）　ｋｉｔを用いた。

試薬はカタラーゼ溶液と組合せて乾燥試薬として作成し
た。１５ｍＭのスポットが次記成分を含むようにした。

０．０２８　Ｕ　グルコースオキシダーゼ０．０２ｐモ
ル　４−アミノアンチピリン０．８８ｇモル　ｐ−ヒド
ロキ安息香酸ナトリウム０．０２０　ペルオキシダーゼ 及びｐＨ７の緩衝液 そしてカタラーゼの量は９〜１８７　ｊｎｉｔｓの範囲
で変えた。使用したグルコース量は３．１．ｇ〜５０ｇ
ｇの範囲で変えた。試薬は１５に文のスポットとして用
い、乾燥後ＬＯｈｌのグルコースを加え、発生した色を
次の通りＯ〜１０の尺度で評価した： ｌはトレース発色、２は可視紫色、４は中程度の発色、
７は強度の発色、１０は極めて強度の発色を示す。ひ紙
は３分後に読取るようにした。２と１の間でイエスとノ
ーに区分けすると、上記範囲の１０個のカタラーゼ濃度
について試験した場合、次の結果が得られた。

使用したサンプル中の グルコース濃度（ｆｆｉｇ／、１　）　Ｙｅｓ／Ｎｏの
割合０　、　３　１　１／９ ０　、　６　２　４／６ １　、　２５　７／３． ２　、　５　８／２ ５　、　０　１０１０ 従って試験した範囲では、グルコース濃度が異なると結
果のパターンも明らかに異なる。

実験Ｂに於てはカタラーゼ濃度を１２．５〜１５０　ｕ
ｎｉｔｓの範囲で変え、実験Ｃに於てはｌＯ〜８３　ｕ
ｎｉｔｓの範囲で変えたが同様な結果を得た（但し、可
視限界は高くなった）。すなわち、実験Ｂでは４をイエ
ス、４未満をノーと表示し、実験Ｃでは３をイエス、３
未満をノーと表示した以外は前記方法と同様にして、実
験Ｂでは２時間後に、実験Ｃでは１時間後に測定し、次
の結果を得た。

使用したサンプル中 のグルコース濃度　Ｙｅｓ／Ｎｏ割合 （ｍｇ／ｍ文）　実験Ｂ　実験Ｃ Ｏ，３１１／６　２１５ ０．６２　１／６　３／４ １．２５．　２１５　５／２ ２．５　４／３　７１０ ５．０　５／２　７１０ このように、固体支持体において「乾燥試薬」を用いて
所要の数値パターンを得ることができる。

競合反応のカタラーゼの代りにヘキンキナーゼ／ＡＴＰ
混合物を使用した以外はＥ、４項に記載した方法でグル
コースの定量を行なったところ前と同じ結果を得た。ヘ
キソキナーゼ（ＨＫ）は１〜ｌ　７１０／＋ｓ文の範囲
で、又ＡＴＰは一定量（１７０ｐｇ）を標識反応用の成
分と共に添加した。１時間後に測定を行ったが、３を観
察可能（イエス）、３未満を観察不能（ノー）として次
の如き結果を得た。

撃景ξｆｌ″Ｍ＠　ｇ　”（ｍｇ　／　ｍ　１　）　Ｙ
　ｅ　ｓ　／　Ｎ　ｏの割合０　、３１　０１５ ０．６２　２７３ １　、２５　３／２ ２　、５　５７０ ５　、０　５１０ Ｇ、６．タレアチン　ホスホキナーゼ−ＭＢアイソザイ
ム　の。

心臓組織はタレアチン　ホスホキナーゼ−ＭＢアイソザ
イム即ちＭ及びＢのサブユニットからなるクレアチンホ
スキナーゼを含むことは公知である。又脳組織は２Ｂ−
サブユニットをもつ酵素を含み、大抵の筋肉組織は２Ｍ
サブユニットをもつ酵素を含む、抗体はＭ及びＢの円形
に対して別々に製造することができ、る。試料中のＭＢ
アイソザイム含有量を次の如く分析した。抗Ｍ抗体及び
カタラーゼを固定した固体支持体を先ず作成した。

支持体のセグメントはアミノエチルセルロース（ＡＥ−
セルロース）を蛋白質で処理して固定することによって
作成した。この作成方法は次の通りである。即ちＡＥ−
セルロースを０．５Ｎ苛性ソーダで洗滌し、次にｐＨ７
になる迄水洗する。

水洗した固体を、次に５０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ
７）を含む３％ｗｔ／マのグルタルアルデヒド溶液中、
室温で３時間温置した。グルタルアルデヒドを結合した
ＡＥ−セルロースを５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）
で洗滌し、過剰のグルタルアルデヒドを除去し、次に５
０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）、０．２ｍｇ／ａ文のＢＳＡ
、０　、４ｍｇ１ｍ１の抗Ｍ抗体及びカタラーゼを含む
溶液中に温置したが、カタラーゼ濃度は夫々のセグメン
トに対して１，０００−５０，０００　ｕｎｉｔｓ／＋
ＪＪの範囲で変えた。４℃で２４時間温置後、ｌＮ−Ｎ
ａＣ１を含むｐＨ７の５０ｍＭリン酸塩溶液で３回洗滌
した。セグメントをカタラーゼ濃度の増加する順に直線
上に集め、固体支持体上に組立てた。クレアチンホスキ
ナーゼ−ＭＢアイソザイムを分析するため、支持体を２
５℃で１５分間サンプルと接触させた。０．１Ｍリン酸
塩、０．２ＭＮａＣ文でｐＨ７，２で洗滌した後、この
支持体をホースラーディンシュペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）と抗Ｂ抗体との複合体ｔｏＯｐＬｇ／ｍｕを含むリ
ン酸塩緩衝液中に温置した。

この複合体はＷｉｌｓｏｎ、　Ｍ、Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ
、　”　Ｉｍｍｕ−ｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａ
ｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　５ｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈ−
ｎｉｑｕｅｓ”　ｐｐ２１５−２２４　（Ｋｎａｐｐ、
　Ｗ、、（Ｅｄ、）。

Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　ＮＹ（１９７
８）　）に記述されたようにして作製した。２５℃で１
５分間温置後、０．１Ｍリン酸塩と０．２ＭＮａＣ文を
用いてｐＨ７，２で洗滌する。この固体は次にＰＨ６，
５の０．１Ｍリン酸塩、１ｍＭ４−クロロ−ニーナフタ
ール及び０．０３ｗｔ％　Ｈ２Ｏ２を含む基質展開液と
２５℃で１５分間接触させる。

発色染料、即ち４−クロロ−１−ナフタールは国体支持
体上に固着して、直接的な測定を可能にする不溶性物質
を生成する。

固体支持体は、基質展開液中に温置後、乾燥してから直
接測定する。

Ｇ、７．　ｅ土±ｌフ又ｊ ビオチンは、以下の点を除き上述の実施例７と全く同じ
方法で定量することができる。つまり、特異的親和性支
持体を製造する場合、抗Ｍ抗体で−はなく　０　、５　
ｍｇ／ｓｌのアビヂンを培養に使用する。すなわち、Ｈ
ＲＰとアビヂンの複合体を合成し、実施例７の抗Ｂ抗体
の代りに５０　ｐ、　ｇ　／　ｍ　Ｑ濃度のサンプルで
処理した後、支持体上に固定する。以後は同様にして発
色度合を視覚的に測定することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、種々のアナライト濃度に関する、競合触媒濃
度に伴う吸光度の変化を示す。第２図は、「時計」型ア
ナライザーの試験マトリックスの形状を示す。第３図は
、「温度計」型アナライザーの試験マトリックスを示す
。第４図は、コレに基づく分析への利用を図で説明した
ものである。 出願人　ライ　會ヴ　り一 代理人　弁理士　加藤朝道 図面の浄゛占（内容に変更なし） Ｉ”工Ｃｒ−−１− ２ １ヨエ［：ｒ−−２− ＦＩＧ、　５Ａ Ｅ２°〃タラービ　−Ｅ２・Ｗ℃ａ−Ｅｄｌ＠トＦＩＧ
、　５Ｂ Ｅ、−ヤノムオ牛シ′タニビ　Ｅ２−カタラーピ゛ＦＩ
Ｇ、５Ｇ Ｅ、・カップ−仁゛ ）−Ｅ２−　＊４ｔ−−２２ｍ）！ −く・〃クラービ（：＃ｆＪ抗体 手続補正書（自発） 昭和６０年３ＪＪｇ口 特許庁長官　志賀　学　殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第００１５４９号 （昭和６０年１月１０日出願） ２、発明の名称 機器を必要としない定量分析システム及び試薬３、補正
をする者 事件との関係　特許出願人 住所 氏名　ライ嗜ヴ　リー ５、補正命令の日付　自発 ６、補正により増加する発明の数　ナシ手続補止書（自
発） （ 昭和６０年４月１０日 特許庁長官　志賀　学　殿 ■、事件の表示 昭和６０年特許願第００１５４９号 （昭和６０年１月１０日出ｍ＞ ２、発明の名称 機器を必要としない定量分析システム及び試薬３、補止
をする者 事件との関係　特許出願人 住所 氏名　ライ・つ゛　り− ６、補正により増加する発明の数　ナシ７、補正の対象
　明細書の発明の詳細な説明の欄８、補正の内容　別紙
の通り 明細書の「発明の詳細な説明」の欄の記載を次り通り補
止する。 （１）明細書第２８頁第１８行 ｒＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｆ　ＥｎｚｙｍｏｌＪをｒＭｅｔ
ｈ、　Ｅｎｚ、Ｊと山王する。 （２）　同第３２頁第８行 「ｉの処決」を［後述の（ｉ）の処決（４２１以下）」
と補正する。 （３）同第６６頁第１２行及び１７行 「実施例７」をｒＧ、６．項」と補正する。 手続補正書（方式） 昭和６０年５月２？日 特許庁長官　志賀　学　殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第００１５４９号 （昭和６０年１月１０日出願） ２、発明の名称 機器を必要としない定量分析システム及び試薬３、補正
をする者 事件との関係　特許出願人 住所 氏名　ライ・つ゛　リー ４、代理人 （昭和６０年４月３０日　発送） ６、補正により増加する発明の数　ナシ７、補正の対象
　明細書の発明の詳細な説明の欄及び図面の簡単な説明
の欄 ８、補正の内容　別紙の通り １、明細書の発明の詳細な説明の欄を次の通り補正する
。 １）明細第４２頁第１５〜第２０行 ｒｃｈｉｂａｔａ、１．　（Ｅｄ、）　”Ｉｍｍｏｂｉ
ｌｉｚｅｄ　ＥｎｚｙｍｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ”　）ｌａｌｓｔｅｄ　Ｐｒｅｓｓ　
（１９７Ｂ）Ｎ、Ｙ　、や　Ｊａｃｏｂｙ、　Ｗ、Ｂ、
、　ｅｔ　ａｔ、　Ｍｅ↓Ｌ−シ■ユＸＸＸＩＶ、　（
１１３７４）　”Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ、　ＥｎｚｙｍｅＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；　ｐ
ａｒｔ　Ｂ”　、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。 Ｎ、　Ｙ、　Ｊを次の通り補正する。 「チパタ、アイ、（編）“イモビライズド　エンザイム
ズ　リサーチ　ディウ゛エロップメント”′ノールステ
ッド　プレス（１８７８）ニュー　ヨーク（Ｃｈｉｂａ
ｔａ、１．　（Ｅｄ、）　”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　
ＥｎｚｙｍｅｓＲｅｓｅ’ａｒｃｈ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ”　Ｈａｌｓｔｅｄ　Ｐｒｅｓｓ　（１９７Ｂ）
Ｎ、Ｙ、）や　ジャコピー、ダブリュー、ビー、　他エ
ムイーテ　−エ・・チ、イーエヌジー、、ＸＸＨＶ。 （１９７４）　”アフィニティー　テクニックス、エン
ザイム　ビュリフィケイション、パート　ビー′′　。 アカデミツク　プレス、ニュー　ヨーク（ＪａｃｏｂＹ
　＋Ｗ、Ｂ、、ｅｔ　ａｌ、１Ｍよ」ムユＸＸＸＩＶ、
　（１９７４）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｐ
ａｒｔ　Ｂ”　、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、
　Ｙ、　）　Ｊ２）明細書第４３頁第１２〜１４行 ｒＷｉｌｓｏｎ、Ｍ、Ｂ、、ｅｔ　ａｌ、　”Ｉｍｍｕ
ｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ
　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　”　、　
ｐｐ２１５−２２４．　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｐｒｅｓｓ
、　）Ｉｏｌｌａｎｄ、　Ｎ、Ｙ、（１９７Ｂ）Ｊを次
の通り補正する。 「ウィルンン、エム、ビ、−４６”イミュノフルオレッ
センス　アンド　リレイテッド　ステイニングテクニッ
クス”’　、　２１５〜２２４　頁、エルセウ゛イア　
プレス、オランダ、ニューヨーク（＋９７８）（Ｗｉｌ
ｓｏｎ、Ｍ、Ｂ、、ａｔ　ａｔ、“Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｓｅａｎｄ　ＲｅｌａｔｅｃＬＳｔａｉ
ｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”　、　ｐｐ２１５−
２２４．　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｈｏ１ｌａ
ｎｄ、Ｎ、Ｙ。 （１９７８）　）　Ｊ ３）図面の簡単な説明の欄の補正 明細書第６７頁第８行加入の「第５Ａ〜第Ｅ図」を「第
５Ａ〜５Ｅ図」と補正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ〕　試料又は試ネ：！の一連の分割液を、ａ）アナラ
   イトに特異的な試薬、 ｂ）既定量の対照反応成分、及び Ｃ）段階的に量が異なる競合触媒、並びに競合反応に必
   要な過剰量の試薬 と接触させることから成る（ここで、対照反応と競合反
   応のいずれか一方は標識反応である）、試料中のアナラ
   イト濃度の測定方法。 ２）　アナン−ｒ　トに特異的な試薬が、対照反応成分
   又は競合反応成分である、特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 請求の範囲第１項記載の方法。 ４）　アナライトに特異的な試薬がアナライトの親和性
   結合パートナ−である、特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ５）　アナライトに特異的な試薬が抗体である。特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ６）　種々の量の競合触媒を含む、所望のアナライト用
   の検出マトリフクス。 ７）　更に、競合反応に必要とする試薬を過剰１含む、
   特許請求の範囲第６項記載のマトリフクス。 ８）　更に、アナライトに特異的な試薬を既定量含む、
   特許請求の範囲第６項記載の検出マトリ・ンクス。 ９）　アナライトに特異的な試薬が抗体である、特許請
   求の範囲第８項記載の検出マトリ・ンクス。 １０）　アナライトに特異的な試薬が親和性結合パート
   ナ−である、特許請求の範囲第８項記載の検出マトリフ
   クス。