JPS61292059A - リガンド―レセプターアッセイ用固相膜デバイス - Google Patents

リガンド―レセプターアッセイ用固相膜デバイス

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JPS61292059A JP61078064A JP7806486A JPS61292059A JP S61292059 A JPS61292059 A JP S61292059A JP 61078064 A JP61078064 A JP 61078064A JP 7806486 A JP7806486 A JP 7806486A JP S61292059 A JPS61292059 A JP S61292059A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ル班立分１ 本発明は、リガンドーレセブターアッ［イ法に係る。に
り詳細には本発明は、リガンド−レセプターアッセイ特
にモノクローナル抗体を使用するイムノアッセイに使用
される固相系に係る。
１走１ｉ１１ 本出願は、ジェー・ヴアルカース（Ｇ。
Ｖ　ａｌｋｉｒｓ）等の１９８４年５月１１日出願の米
国特許出願第６０９．３９５号及び１９８５年５月１０
日出願の米国特許出願第７３３．２９２号と同様の主題
を扱う。また、ジエー・ヴエルカース等の１９８６年３
月２１日出願の米国特許出願と同様の主題を扱う。これ
ら参照出願の記載は全て本明ＩＯ書に含まれるものとす
る。
ＢＪＬ！！２ｉ遣 リガンド−レセプターアッセイ特にイムノアッセイは、
病気及びその他の臨床的に重要な生理学的状態に関連す
る分析成分（ａｎａ＋ｙｔｅ　）を血清及びその伯の体
液からインビトロ検出するための敏感な診断手段となり
得る。
過去の代表的なイムノアッセイは、固相に結合したポリ
クローナル抗体調製物を利用していた。
かかるアッセイに於いては、検出できるようにラベルし
た抗原の溶液をサンプル中の抗原と固相抗体に対して競
合させる。ラベルされた抗原の固相抗体に対する結合の
程度又は液相中での検出の程度に基いて、被分析サンプ
ル中の抗原の存在及びその量を測定する。
その後、非競合性イムノメトリックアッセイも使用され
るようになった。かかるアッセイでも、固相に結合され
たポリクローナル抗体調製物が使用される。抗原を含有
する疑いがあるサンプルを固相ど接触させ固相の抗体と
結合させる。典型的には、インキュベーションステップ
後にサンプルを固相から分離し、この固相を洗浄し、検
出用物質例えば放射性核種、酵素又はクイ光物質でラベ
ルした付加的ポリクローナル抗体の溶液と共にインキュ
ベートする。
この２回目のインキュベーシヨン後に、未結合のラベル
抗体を固相から分離し、液相中のラベル抗体の量を測定
するか、又は、抗体：抗原：抗体ザンドイッヂとして固
相に結合したラベル抗体の量を測定し、この測定値に基
づいて被検サンプル中の抗原の存在及び／又は濃度を特
徴する特許第４，３７６．１１０号は、２種類のモノク
ローナル抗体を使用し一方を固相に結合させ他方を検出
用にラベルした２リ−イトイムツメ１〜リツクアツセイ
を開示している。抗原の異なるエピトープ部位を認識す
る２種類の抗体の使用によって、抗原とラベル抗体どの
インキュベーション中に従来方法の中間ステップを必要
とじｔ≧い同時的イムノメトリックアッセイを行なうこ
とが可能になった。
上記のイムノアッセイ法では、固相系が典型的には、ビ
ーズに結合された抗体を含むか、又は、対象抗原を捕捉
すべき適当な膜又はフィルターの如ぎ材料にコートされ
た抗体を含む。現在の処、与かる固相系の調製に特有の
問題は、固体担体に抗体を１−１−　Ｌ、易くするため
の活１（１化処理が必要なことである。更に通常は、非
特異的結合を阻止するに有効な物質による固体担体のコ
ーティングの如きバックコーティング処理が必要である
。活性化処理及びバックコーティング処理は時間のかか
る難しい処理であり、このため固相系の調製−１ス１へ
が極めて高くなる。
現有使用されている固相系の調製に関しては、」二記の
制約以外にも以上の如き欠点がある。第一に、１つの固
相系で所与の奢ナンブルの２秤取」二の分析物質を検定
することができない。第二に、現在の固相系はアラ［イ
の有効性と信頼性との決定に不可欠な内部標？Ｆ（１１
１１ち、陽ν１及び陰性の標準）をもたない。本発明以
前には、マルヂプルイＩ＼ノアッゼイ法及び／又は内部
（１１片・系に適した固相系の調製が極めて困＞ｉであ
った。
従って、より効率良くコ１１製できしかも調製のテ１［
度と費用とがＩ＆も少なくて済むＪ、う４【固相系の開
発が要望されている。史に、ザンブルの少なくとも２種
類の対象分析成分を同時に検定できるＪ：う右回相系が
要望されている。また、アッセイの性能の内部標準を含
み得る改良された固相系が要望されでいる。
＝　２０− 兄朋４１１ 本発明は、流体リンプル中の選択分析成分を検出するた
めのリガンド−レセプターアッセイ特にイムノアッセイ
で使用される固相系を提供する。
本文中の「リガンド−レセプターアッセイ」なる用語は
りガントと該リガンドとの特異的相互作用を生じ４Ｑる
別の物質即ちレセプターとの複合体の形成により検出さ
れ１９る分析成分の検定を意味する。リガンドが分析成
分自体でもよく、又は、検出されることによってリンプ
ル中の分析成分の存在を示す物質であってもＪ：い。対
象分析成分次第で、特異的結合を生じる相手がリガンド
又ｔまレセプターのいずれかになるようにアッセイを設
計し得ることは当業省に容易に理解されＪ：う。本文中
で「リガンド」なる用語は、抗原、ハブテン、抗体、デ
オキシリポ核Ｍ　（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ホ
ルモン、代謝物質及びその他の特異的結合の相手即ちリ
ガンド−１ルブクーアッレイのししブタ−をもつ診断的
に重要４ｒ天然産生物質を意味する。
本発明の固相系は、膜又はフィルターの如き多孔質マト
リクスを含んでおり諷マトリクス内部に微小ビーズ（ｍ
ｆｃｒＯ３ｐＨＱｒＱ）がトラップされている。
好ましくは微小ビーズが７１〜リクスの不１１１ｉ続又
は限定ゾーンにトラップされている。更に、多孔質マト
リクスの細孔サイズと適合しくｑる■法に選択された微
小ビー九、レレプターカ＼パ結合されている。レセプタ
ーは、抗体好１：Ｌ　＜　Ｇ；ｔ　ｔ＝ニックローナル
体、抗原、核酸配列、又は、リガンド含有リンプルと接
触でると選択リガンドを捕捉し得る（の他の物質である
。例えば微小ビーズにアレルゲンηＸ゛結合されてｄ３
す、結合アレルノ１゛ンに特１？的な゛リンプル中のＴ
（ＩＥ抵抗体捕捉され得る。
好ましい固相系に於いては、抗［ホ、抗原又はぞの他の
適当へレセプター物質を結合させた別々のグループの微
小ビーズが多孔質７１〜リクスの別々のゾーンにトラッ
プされており、少なくとも２種類の選択分析成分を検出
できるマルチプルアラレイのｆ１能が得られる。更に、
選択分析成分検出用の内部標準系を組込むために別々の
グループの微小ビーズが多孔質マトリクスにトラップさ
れていてもよい。
本発明の目的はまた、前記の如き多孔質固相系を第一部
材どして含む装置を提供することである。
好ましい装置は更に固相系と協働り”る吸収部月を第二
部材として含んでおり、流体ザンブルが固相系を通過し
て第二部材に流入できるように構成されている。（本文
中で１固相系」と１多孔質第一部材」なる用語は互換的
に使用されている。）本発明の目的はまた、流体υンプ
ルを固相系に導入し流体が固相系を通過するときに微小
ビーズに結合されたレセプターが選択標的リガンドを捕
捉するステップを第１ステツプどして含むリガンド−レ
セプターアッセイを提供することである。
相系に添加する。本文中の１”レセプター接合体」なる
用語は、レセプターと検出可能ラベルとを含む複合体を
意味Ｊる。標的抗原のイムノメトリックアッセイの場合
、レセプター接合体はラベル抗体好ましくは七ツク［１
−ナル抗体でもよい。又は、標的リガンドが抗体の場合
、レセプター接合体としてラベル抗原が使用されてもよ
い。
次に、洗浄ステップで未結合１ノセプター接合体の存在
を決定する。
上記の要約及び添付図面及び以下の詳細な記載より本発
明がより十分に理解され当業界に於ける本発明の重要性
が認識されるであろう。
１」凰ｍ宜兼 前述の如く本発明は、流体Ｉナンブル中の選択分析成分
を検出するためにリガンド−レセプターアッセイ特にイ
ムノアッセイで使用される固相系を提供する。本発明の
固相系は微小ビーズを内部にトラップし得る多孔質マト
リクスを含む。マトリクスの細孔サイズと適合し得る寸
法の微小ビーズを本発明に従ってトラップできる条件を
満たす天然及び合成のいかなる多孔質マトリクスを使用
してもよい。特に好適なマトリクスとしては、ガラス繊
維、ナイロン又は所定の多孔度をもつセラミック材料か
ら成る膜又はフィルターがある。
固相系は更に微小ビーズを含んでおり、選択レセプター
、例えば抗体好ましくはモノクローナル抗体、抗原又は
その他の対象リガンドを捕捉し得る適当なレセプター物
質が微小ビーズに結合されている。本発明ににれは、ラ
テックス、ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリスチ
レンの如き重合材料から成る微小ビーズの使用が好まし
い。しかし乍ら、天然又は合成の材料から成る種々の微
小ビーズの使用が可能であることは当業者に容易に理解
されよう。ポリマーの場合には、リガンド−レセプタ一
対の選択された一方、即ちリガンド又はレセプターとの
結合容易性に基づいてポリマーが選択される。例えば、
共有結合の形成又はコーティング処理によって容易な結
合を生じる官能基をもつポリマー又はコポリマーが選択
される。
更に、微小ビーズが多孔質マトリクス内部にトラップさ
れ且つマトリクス内の微小ビーズ周囲で流体が流動し得
るに有効な寸法をもつ微小ビーズが選択される。直径約
０．１〜約５０μｓの範囲の寸法をもつ微小ビーズの使
用が好Ｊニジい。この範囲内の寸法をもつ微小ビーズは
７１〜リクス内での集合及び付着が最も生じ難いので、
標的リガンドと反応するための有効表面積が最大になる
ことが知見された。直径約０．１〜約２．０ＩＪＪｎの
範囲内の寸法をもつ微小ビーズの使用が特に好ましい。
この範囲内の寸法をもつ微小ビーズは、微小ビーズに結
合したレセプターと標的リガンドとの間の接触及び反応
速度を促進する傾向をもつ。
本発明によれば、使用すべく選択された微小ビーズが、
適当なレセプター、例えば抗体、抗原又はその他の標的
リガンドどの結合及び捕捉用のし廿ブタ−として適当な
生物物質で活性化される。
活性化は、共有結合ににっで行なわれるか、又は適当な
場合には微小ビーズにしＬブタ−のコーティングを設り
ることによって行なわれる。」ノンプル中の抗原の存在
を決定するイムノアッセイの場合、好ましいレセプター
はモノクローナル抗体で＝　２７− あるが、抗血清か臂られたポリク［１−プル抗体の使用
も好ましい。微小ビーズにタンパク質を］−界で公知て
゛あるからここで（、Ｌ説明しない。活ゼ１化された微
小ビーズは７１〜リクス内、好ましくは７１〜リクスの
１つ以上の所定ゾーン内に所定パターンでトラップされ
る。更に出願人等の予想外の知見にＪ、れば、アラレイ
の感磨を白土さぜるには、極めて低濃度好ましくは約０
０１〜１０％の範囲内の濃度の活利微小ビーズの溶液を
トラップ用に使用するのが望ましい。マトリクス内の微
小ビーズトラップ手段は臨界的でなく、種々の手段を使
用し得る。例えば、適当な液体ベヒクル中の懸澗液例え
ばポリン−ラテックス好−１ニジ＜は単分散ｆｍｏｎｏ
ｄｉｓｐｅｒｓｅ）ラテックスとして微小ビーズを多孔
質７１−リクスの表面に伺加し、乾燥ステップで液体ベ
ヒクルを除去してもよい。ベヒクル除去以前に多孔質７
１〜リクス内部の不連続ゾーンに微小ビーズを案内する
ために、重力、真空又は毛管作用を使用し得る。本発明
では微小ビーズがトラップ以前に活性化されるので、従
来技術による固相系の調製に伴う制約を克服し得る。
本発明によれば、レセプターに結合した微小ビーズは好
ましくは、マトリクス内部で移動できるが７１〜リクス
内部での凝集又は集合（ま阻止されＪ」つマトリクス内
部の粒子周囲で流体が高速で流動できるように７１〜リ
クス内部にトラップされている。出願人はいかなる理論
にも固執リ−るつもりはないが、マトリクス内部の微小
ビーズの自由運動が微小ビーズに結合したレセプターと
標的リガンドどの接触を増進し、アッセイ法に於りる有
効イ【洗浄を可能にすると考える。更に、前述の如くア
ッセイ法の所望の感廓を達成するためには、トラップさ
れる微小ビーズの数と寸法とを１ｒＩ出の範囲内で最適
の値に選択す必要がある３、更にマトリクス内部での微
小ビーズの集合及び何名を最小にづるか又はｍ　１１＝
　Ｍ−るには、微小ビーズがトラップ以前にコートされ
でいるとよい。
次に第１図は、本発明で使用される多孔質マ］・リクス
１０と活性化微小ビーズ１２の添加状態とを示す概略断
面図である〈微小ビーズのベヒクルは図示しない）。第
２図は本発明の固相系１４の概略断面図である。即ち、
第２図の多孔質７１〜リクス１０は、マトリクス１０内
部の限定されたゾーン又ｉ、ｉ不ッセイで使用される固
相系１４の平面図である。従って第３図は、固相系１４
の７１〜リクス１０内にリガンドを捕捉すべく微小ビー
ズ１２がトラップされた不連続ゾーン１６を示す。
本発明の好ましい固相系は、マトリクス内部の不連続ゾ
ーンに好ましくは所定パターンでトラップされた複数グ
ループの微小ビーズを含む。各グループの微小ビーズは
トラップ以前に異なる対応リガンドを捕捉し得る異なる
レセプター例えば抗体又は抗原と結合されている。従っ
て本発明の１つの具体例に於いては、各グループの微小
ビーズが、アッセイに使用すべく選１Ｒされた同じ抗体
、抗原又はその他のレセプターに結合された微小ビーズ
の集団を含む。又は、１グループの微小ビーズが種々の
レセプターに結合された微小ビーズの混合物を含む。例
えば、抗原用イムノアッセイの場合、各グループの微小
ビーズが少なくとも２つの微小ビーズ亜集団を含んでお
り、各亜集団は異なる抗原決定基又は抗原のエピトープ
と結合し得る抗体好ましくはモノクローナル抗体と結合
している。異なるグループの微小ビーズを含む微小ビ一
ズ亜集団と結合したモノクローナル抗体が標的リガンド
の非干渉エピトープと特異的反応性を有するように選択
されこれによりアッセイの感受性と特異１！ｌ：とを向
上させるのが好ましい。
従って上記の如ぎ固相系は所与のサンプル中の少なくと
も２種類の選択分析成分を同時検出するマルチプルリガ
ンド−レセプターアッセイに有効である。イムノアッセ
イの場合、サンプル中の異なる分析成分の存在を各分析
成分毎の異なる♀色反応によって同時に検出し得る。こ
のためには、適当な基質の添加によって異なる♀色反応
を生じる別々の酵素ラベル抗体を各分析成分毎に使用す
る。又は、別々のグループの微小ビーズを多孔質マトリ
クス内部にトラップしマトリクス内の夫々固有の位置を
検出することによって各グループを識別できるように構
成してもよい。
更に、前記の如き好ましい固相系は、アレル１！一反応
の原因物質を決定する場合の如（サンプル中の１種類以
上の対象分析成分の存在を同時に決定したい場合に特に
有効である。この場合、各々が１つのグループの特異的
アレルゲン（例えば免疫応答を誘起１−る疑いのあるタ
ンパク質又は炭水化搬の１つと結合した別々のグループ
の微小ビーズをマトリクスの不連続ゾーンにトラップす
ることによって容易に処理できる。かかる固相系は主と
して、患者の血清サンプル中に存在し得るＩｇＥ抗体を
捕捉し得る一群のアレルゲンを担持し得る。
ε 従って所定のサンプル中のアレルゲン特異的Ｉｇ多抗体
の存在によって決定された固相系の反応性パターンが、
所与のアレルギ一応答を誘起するアレルゲンの指標とな
る。かかるアッセイでは典型的にはアレルゲン−ＴｏＥ
対が米国特許第３．７２０．７６０号に記載の如きラベ
ル抗−１＋Ｅ抗体の使用によって検出される。
次に第４図は、マルチプルアッセイ法で使用するのに適
した第２図の固相系１４と同様の固相系１８の概略平面
図である。第４図のマトリクス１０は不連続ゾーン２０
．２２，２４．２６を含み、各ゾーンは、固相系１８に
異なる対応リガンドを捕捉すべく異なるレセプターで活
性化された複数グループの微小ビーズを含む。
更に、本発明によれば、好ましい固相系が異なるグルー
プの微小ビーズを内部標準系（即ち、陽性及び／又は陰
性の標準）として含む。例えば、陽性標準を含む微小ビ
ー分値標的リガンドと結合されるか又は標的リガンドの
結合に擬似した結合を生じ得る別の適当なレセプターノ
結合され得る。
対照的に、陰性標準を含む微小ビーズは結合成分を含ま
ないか、又は、場合に応じて抗体もしくは抗原もしくは
ＤＮＡの如き物質に結合されており、これら物質は、対
象リガンドを捕捉することができないが標的リガンド以
外のリンプル成分と微小ビーズ結合レセプターどの非特
異的結合相互作用に擬似しＩ、二結合を生じ１９る物質
から選択される。
シングルアッセイ又はマルヂプルアッセイで使用され得
るかかる固相系は、アッセイの有効性と信頼性とを決定
する手段を提供Ｊ−る。従って、イムノアッセイでは陰
性標準を組込むことによって、一般にはリンプル成分と
レセプターどの非特異的結合に起因する誤った陽性結果
を判定する手段が（ｑられる。他方、陽性標準は誤った
陰性結果検出の発生を少なくする。
更に本発明は、上記に説明し■つ１９８６年３月２１ア 日出願のジエー・ヴフルカース等の出願に記載されたア
ッセイに於いて標的リガンドの定性的及び定量的に決定
するだめの内部標準を組込む手段を提供する。該出願は
本発明の出願人に譲渡されており、本明細書に含まれる
ものとする。
次に第５図は、１種類の分析成分を検出すべく構成さ゛
れた内部標Ｑｊ−が組込まれている前記の好ましい固相
系２８の平面図である。従って第５図の固相系２８は第
２図の概略図と同様に、選択レセプターが結合された微
小ビーズを含む不連続ゾーン１６を７１−リクス１０内
に右づる。マトリクス１０内の不連続ゾーン３０は陽性
標準どしτ、標的リガンドが結合された微小ビーズを含
んで４３つ、７１〜リクス・＞′Ｌ １０内の不連続ゾーン３２はｌ１２％、、標Ｑｊとして
、レレプターの非特異的結合に擬似する結合を生じ１！
？る物質で好ましくはコートされた微小ビーズを含／υ
でいる。従って固相系２８がり・１象分析成分を含有す
る被検者サンプルのアッセイに使用されるとぎ、ゾーン
１Ｇと３０どの双方が陽性結果を示づ必要がある。
また、ゾーン１６の変化に対応するゾーン３２の変化が
生じると、陽性結果が誤りであると解釈されるであろう
。
　３６一 本発明装置は、多孔質の第一部材どして前記の如き固相
系を含む。装置は更に、流体リンプルと液体試薬とが第
一部材を容易に通過（“るＪ：うに多孔質第一部材と作
動的に結合した付加的手段を含む。　使用に適した手段
としては、液体が多孔質部材を通って吸引されるように
多孔質部材の下方で真空ソース又は毛管作用を付加する
手段がある。
又は、付加的手段が、ザンプル液体又は試薬が部材を強
制的に通るように多孔質部材の上方に正の圧力を作用さ
ぼる手段から成ってもよい。特に好ましい具体例に於い
ては、液体リンプルが固相系を通過して吸収性材料に流
入できるように吸収性第二部材が固相系と協働する。表
面に固相が配置され得る吸収性第二部材は、毛細管が固
相系の細孔ど直接連通するように、固相系が配置される
表面にほぼ交差する方向に貫通毛細管を有する。吸収性
部材の材料として酢酸セルロース１ｍ又はポリエステル
の如き種々の材料を使用し寄る。
別の具体例に於いては、流体リンプルが固相系を通過し
て吸収性材料に流入する。」；うに固相系を多孔質支持
ベースに配回してもよい。支持ベースはボリエヂレンデ
ィスクの如き多孔質ディスクから成り、吸収性部材が支
持ベースを介して固相系の細孔ど直接）す４通するよう
に吸収↑（１部材に載置される。かかる装置の構造は例
えば、ジェー・ヴアルカース等の１９８４年５月１１目
出願の米国Ｑ２ｊ許出願第６０９．３９５号及び１９８
５年５月１０日出願の米国特許出願箱７３３，２９２Ｐ
３に記載の如く構成され得る。これら特許出願は本明細
書に含まれるものとする。
かかる装置の１つの例を第６図に示す。従って第６図で
は、第３図に平面図、第２図に概略断面図で示した固相
系と同様の固相系１４が配備される。
装＠３４の固相系１４は、流体ナンプルが前述の如く固
相系１４を通過し吸収性部材３８に流入するにうに多孔
質支持ベース３６に載置されている。
前述の如く、本発明の固相系と装置とは、リガンド−レ
セプターアッセイ特に２種類以上の対象分析成分を検出
するマルチプルリガンド−レセプターアッセイ及Φ匁は
内部標準系を組込ｌυだリガンド−レセプターアッセイ
を行なうために極めて有効である。本発明は特にイムノ
アッセイに有効であるが、本発明によって提供される固
相系を適当に修正することによって核酸プローブ技術を
含むアッセイの如き別のリガンド−レセプターアッセイ
に使用し得ることは当業者に明らかであろう。
本発明のリガンド−レセプターアッセイ法によれば、（
１秤取−りの）夕・１象分析成分を含有している疑いの
ある流体サンプルを前述の如き装置の固相系に尋人する
。イムノアッセイの場合、好ましくは固相系が微小ビー
ズに結合したモノクローナル抗体をレセプターとして組
込んでいるが、対象リガンドが抗原のとぎはポリクロー
ナル抗体口ｊ１製物を使用してもよい。しかし乍ら対象
りガントが抗体のときは固相が、検出すべき抗体に特異
的の抗原を含有してもよい。流体ナンブルが固相系を通
過して吸収性部材に流入後、標的リガンドと結合可能で
検出できるようにラベルされたレセプター接合体の溶液
を添加する。イムノアッセイの場合、レセプター接合体
は対象リガンドと結合し得る抗体好ましくはモノクロー
ナル抗体又は抗原から成り得る。レセプター接合体を適
切に添加すると、固相系によって捕捉されたリガンドと
の複合体が形成され得る。イムノアッセイの場合、固相
系を含む微小ビーズがモノクローナル抗体と結合した固
相系を含み、ラベル抗体もモノクロナール抗体のどき、
主として米ｍ特１［第４，３７６．１１０号及び米国特
許第４．４８６．５３０＠に記載されている如く抗原の
非干渉結合部位に結合するＪ：うに２Ｎ類の抗体が選択
される。該特許の開示は本明ｉｌｌ書に含まれるものと
する。現在の好ましい具体例では、レセプター接合体が
酵素でラベルされている。しかし乍ら、従来の別のラベ
ル例えば放射性核種。
ケイ光物質、リン光物質、及び色素又は化学発光部分を
含む、ポリマーも使用に適する。レセプター接合体の溶
液が固相系を通過した後に、未結合レセプター接合体左
除去すべく洗浄溶液を添加し得る。次に、対象リガンド
との複合体を形成したレセプター接合体を検出する。ラ
ベル成分として酵素を選択した場合、固相系に適当なＴ
Ｉ？素基質を添加して結合レセプター接合体を検出する
。適切に選択されているならば酵素が基質と反応して、
肉眼又はバ↑器手段で検出できる固相系の呈色変化を生
じるであろう。
本発明によって多様な種類の分析成分のアッセイが可能
であることは当業者に容易に理解されよう。検出対象と
なり得る分析成分は多いので本又はその他の生物流体中
の抗原イムノアッセイで使用し得る。更に、本発明はウ
ィルス、細菌、寄生虫又はカビのアッセイ、又は、これ
らに関連する抗原又は抗体のアッセイに有効である。例
えば、風疹ウィルス、ロタ（Ｒｏｔａ）ウィルス、アデ
ノウィルス、　ＩＩＦ吸器合胞休ウ体ルス、ＨＴＬＶ。
肝炎ウィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、非Ａ非Ｂ肝炎、イ
ンフルエンザウィルス、サイトメガロウィルス。ヘルペ
スウィルス、及びＡＴＬＢｌの連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ　）　、淋菌（Ｎ　＊ｉｓｓｅｒｉａｇ
ｏｎｏｒｒｈｅａ）　、　ｌｉｔトリコモナス（Ｔ　ｒ
ｉｃｈｏｍｏｎａｓｖａｇｉｎａｌｉｓ）　、カンジダ
令アルビカンス（ｃａｎｄｉｄａ、　ａｌｂｉｃａｎｓ
）、　トラコーマ・クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ　
ｔｒａｃｈｏｍａｔｔｓ）　、インフルエンザ菌（ｌ−
１ｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆ’１ｕｅｎｚａ）のアッ
セイに有効である。
更に本発明が核酸プローブ法を含むアッセイに適用可能
であることを本発明の開示より当業者は容易に理解し得
るであろう。詳細には、対象リガンドの核酸配列の一部
分に相補的な核酸配列を微小ビーズに結合し次に、該微
小ビーズを多孔質マトリクスにトラップさせる。かかる
固相系を７ツレイプロセスに使用される前述の如き装置
に組込む。かかるアッセイプロセスを実行するには、り
・１象リガンドを含有している疑いのある流体サンプル
を固相系に導入し、対象りガントを固相に捕捉させる。
次に、標的リガンドの核酸配列の異なる部分と相補的な
核酸配列をもつラベル核酸ブ［１−ブを添加し、ラベル
核酸プローブと固相に捕捉されたリガンドどの複合体を
形成さける。固相系に結合されたラベル核酸プローブの
検出が所Ｌｊのリンプル中の分析成分の存在の指標とな
る。
以下の実施例は、本発明によるガラ１１（１フイルター
にトラップされた微小ビーズを含む固相系の調製とかか
る固相系を用いたイムノアッセイとを示す。実施例は本
発明のいくつかの例を示すだＧＪであり本発明の範囲は
これらの実施例には全く限定されない。
実施例■ 抗原の検出 以下の実施例で示寸アッレイは、妊娠女子の尿左へ に高レベルで存在する抗原１．−るヒト魅毛性ゴナド１
ヘロピン（＋−（ｃＧ　’）を検出するイムノアッセイ
である。
微小ビーズの活性化 直径０．８ＩＩ＃ｌのポリスチレン微小ビーズの単分散
ラテックス（インターフェイシャル・ダイナミックス−
］−ボレーシコン（Ｉ　ｎｔｅｒｆａｃｔａｌＤｙｎａ
ｍｉｃｓ　ＣｏｒｐｏｒａＮｏｎ）　、ボートランド、
オ“レゴン）を選択し、ＨＣＧ抗原に特異性のハイブリ
ッドｉｌｌ胞系Ｈ，ＣＵ　０６１から得たモノクローナ
ル抗体１１１！Ｊ物（ハイブリチック・インコーホレー
テッドター内部の保持を決定するためにケイ光ラベルし
た微小ビーズを用いて予め実験しワットマン（Ｗ　ｈａ
ｔｍａｎ）　Ｇ　Ｆ　／　Ｆガラス繊維フィルター（ワ
ットマン・カムパニ−（Ｗ　ｈａｔｗａｎ　　Ｃｏｍｐ
ａｎｙ）、クリフトン、ニューシャーシ゛イ）と適合す
るように微小ビーズの寸法を選択した。モノクローナル
抗体を腹水液から採取しＮａ２ＳＯ４沈澱と標準法を用
いるＤＥΔＦイオン交換クロマトグラフィーとによって
精製した。
抗体結合した微小ビーズを次に、ｌ−１０Ｇとラベル抗
体との非特異的結合を低減するために５０１１１Ｍのリ
ン酸塩（ｐｌ−４８，０）中の１％ウシ血潰フルブミン
（ＢＳＡ）溶液で従来の手順でバックコートし１こ　。
濃度で５０ｍＭのリン酸塩（＋）Ｈ８，０）に再懸濁さ
せ、第６図に示す免疫濃縮装置に組込まれたワットマン
ＧＦ／ＦガラスＩＩＩフィルタにピペツ１−で移した。
次に微小ビーズをフィルター内でフィルターの中心に位
置する不連続円形ゾーンとして沈降させた。フィルター
を１５分間風乾した。
抗原の検出 １２５ｍ１ＬＪ／ｄのト１ｃＧを含有する約２５０鱈の
尿をフィルターに塗布した。
ハイブリッドＩＩＩ胞系ＨＣＯ３１４から採取し酸素ア
ルカリ性ホスファターゼでラベルした第２の抗１−ＩＣ
Ｇモノクローナル杭体調製物約１００ρを加えた。
５分間インキュベートしＩｌ系ラベル抗体接合体をフィ
ルターから抽出した後に、フィルターを２−の１０ｍＭ
　Ｉ〜リス緩衝生理食塩水（１）８８．０）で洗浄した
。次に酵素ラベルの基質たるリン酸インドキシル含有溶
液を約１００ρ添加した。５分間インキュベートし、フ
ィルターの呈色反応を肉眼で観察した。
１−Ｉ　ＣＵ−０６１活性化微小ビーズがトラップされ
たフィルターの不連続ゾーンが濃青色を呈した。
これはＨＣＧ抗原の存在を示す。
ｋ底置１ 抗体検出 実施例■に記載のＨＣＧ抗原の検出と同様にして風疹ウ
ィルスに対する抗体を検出した。精製風疹抗原で活性化
した直径０．８ＩＩＩＲの微小ビーズを第６図に示す免
疫濃縮装置に組込まれたワットマンＧＦ／Ｆガラス繊麗
フィルターの不連続ゾーンにトラップした。陰性標準と
して抗原でコートされない微小ビーズのグループをフィ
ルターの隣接ゾーンにトラップした。
髭１五鳳ｌ 風疹ウィルスの存在に陽性を示すことが判っている１ｏ
ｏｓの血清を前述の如く調整された第２フイルターに塗
布した。同時に、各フィルターの抗体の存在に陰性を示
すことが判っている１００ρの血清を２ｍｊの１０ｍＭ
　ｌ−リス緩衝生理食塩水（ｐＨ８，０）と１００庫の
Ｗ’ＪＡ接合したヒトＩＯＧに対する抗体（カークエガ
ード・アンド・べり−・ラボラトリーズ・インコーホレ
ーデラド（Ｋ　ｉｒｋｅｇａａｒｄ＆　　Ｐ　ｅｒｒｙ
　　ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　（ｎｃ、　、ゲザ
ースバーグ、メリーランド）と共に添加し、微小ビーズ
に結合した風疹抗原との複合体を形成したヒトＩ（ＩＧ
と反応させた。未結合接合体を除去すべく２ｍＤの１０
ｍ１ｙｌ　ｌ−リス緩衝生理食塩水（１１Ｈ８，０）で
洗浄した後に、形成された抗原−抗体複合体の存在を検
出するために酵素ラベルの基質を添加した。
陽性の血清は、風疹抗原を結合させた微小ビーズがトラ
ップされたフィルターの不連続ゾーンに青色を呈した。
（陰性標準のゾーンでは呈色は生じなかった）。陰性の
血清は呈色反応を生じなかった。
微小ビーズの量及び濃度、インキュベーシミン時間、接
合体濃度及びその他のアッセイ手順で常用のパラメータ
を変更することによって実施例のアッセイの感度を調整
し得ることが理解されよう。
特許法の要件に従って特定具体例に基いて本発明の詳細
な説明した。しかし乍ら、本発明の要旨及び範囲内で多
くの変形及び変更が可能であること、及びこれらの変形
及び変更がすべて特許請求の範囲に包含されることが当
業者には容易に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明で使用し得る多孔質マトリクス及び微小
ビーズ添加状態を示す概略説明図、第２図は本発明の固
相系の概略断面図、第３図はサンプル中の１種類の分析
成分を検出する本発明の固相系の平面図、第４図はサン
プル中の種々の分析成分を多重検出する本発明の固相系
の好適具体例の平面図、第５図は陽性及び陰性の内部標
準を含んでおりサンプル中の１種類の分析成分を検出す
る本発明の固相系の好適具体例の平面図、第６図は本発
明の固相系を組込んだ本発明のアッセイ実施用装置の断
面図である。 １０・・・・・・マトリクス、１２・・・・・・微小ビ
ーズ、１４，１８．２８・・・・・・固相系、３４・・
・・・・リガンド−レセプターアッセイ用装置、３６・
・・・・・多孔質支持ベース、３８・・・・・・吸収手
続ンｄｉ　、１日ｌｈ式） 昭和６１年７月＆−１１ １、事件の表示　　　昭和６１年特許願第７８（’）６
４号２、発明の名称　　　リガンドーレレプターアツセ
イ用固相系３、補正をする者 事件どの関係　　特許出願人 名　称　　　　ハイブリチック・イン］−ボレイテツド
４、代　理　人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４
号　山田ビル（郵便番号１６０）電話（０３）　　３５
４−８６２３５、補正指令の日付　　　昭和６１年６月
４日６、補正により増加する発明の数 ８、補正の内容 （１）　　黒色で鮮明に描いた適正２ｉ図面を別紙の通
り補充する。　　　　　（内容に変更イ１し）０　出願
人の代表考を記載した適正な願書及び委任状については
、本願に関する昭和６１年６月２０日付手続補正書く自
発）にて提出致しました。

Claims (51)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）流体サンプル中の選択分析成分を検出するために
    、微小ビーズをトラップした多孔質マトリクスを含み前
    記微小ビーズが標的リガンドを捕捉し得るレセプターと
    結合していることを特徴とするリガンド−レセプターア
    ッセイ用固相系。
  2. （２）前記マトリクスは、前記マトリクスの細孔サイズ
    と適合し得る寸法の微小ビーズをトラップし得る膜又は
    フィルターであることを特徴とする特許請求の範囲１項
    に記載の固相系。
  3. （３）前記微小ビーズは、前記マトリクス内部の前記微
    小ビーズの有効表面積を最大にする寸法をもつように選
    択されていることを特徴とする特許請求の範囲第２項に
    記載の固相系。
  4. （４）前記微小ビーズが、直径約０．１〜約５０μｍの
    範囲内の寸法をもつように選択されることを特徴とする
    特許請求の範囲第２項に記載の固相系。
  5. （５）前記微小ビーズが、直径約０．１〜約２．０μｍ
    の範囲内の寸法をもつように選択されることを特徴とす
    る特許請求の範囲第２項に記載の固相系。
  6. （６）前記微小ビーズは、前記微小ビーズが前記マトリ
    クス内で移動でき且つ前記マトリクス内での前記微小ビ
    ーズの集合又は付着が阻止されるように前記マトリクス
    内にトラップされていることを特徴とする特許請求の範
    囲第１項に記載の固相系。
  7. （７）前記膜又はフィルターがガラス繊維、ナイロン又
    はセラミック材料から選択された材料から成ることを特
    徴とする特許請求の範囲第１項に記載の固相系。
  8. （８）前記微小ビーズが前記マトリクスの不連続ゾーン
    にトラップされていることを特徴とする特許請求の範囲
    第１項に記載の固相系。
  9. （９）前記微小ビーズが、前記レセプターを結合させ得
    るポリマー材料から成ることを特徴とする特許請求の範
    囲第１項に記載の固相系。
  10. （１０）前記ポリマー材料が、ラテックス、ポリエチレ
    ン、ポリプロピレン及びポリスチレン並びにそのコポリ
    マーから選択されることを特徴とする特許請求の範囲第
    ９項に記載の固相系。
  11. （１１）前記リガンド−レセプターアッセイがイムノア
    ッセイであることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
    記載の固相系。
  12. （１２）前記微小ビーズに結合したレセプターが、前記
    標的リガンドを捕捉し得る抗体又は抗原であることを特
    徴とする特許請求の範囲第１１項に記載の固相系。
  13. （１３）前記抗体がモノクローナル抗体であることを特
    徴とする特許請求の範囲第１２項に記載の固相系。
  14. （１４）流体サンプル中の２種以上の選択分析成分を同
    時に検出するために、不連続ゾーン内に別々のグループ
    の微小ビーズをトラップした多孔質マトリクスを含み、
    別々のグループの微小ビーズが別々の標的リガンドを捕
    捉し得るレセプターと夫々結合していることを特徴とす
    るマルチプルリガンド−レセプターアッセイ用固相系。
  15. （１５）前記マトリクスは、前記マトリクスの細孔サイ
    ズと適合し得る寸法の微小ビーズをトラップし得る膜又
    はフィルターであることを特徴とする特許請求の範囲第
    １４項に記載の固相系。
  16. （１６）前記膜又はフィルターがガラス繊維、ナイロン
    又はセラミック材料から選択された材料から成ることを
    特徴とする特許請求の範囲第１４項に記載の固相系。
  17. （１７）前記微小ビーズが、前記レセプターを結合させ
    得るポリマー材料から成ることを特徴とする特許請求の
    範囲第１４項に記載の固相系。
  18. （１８）前記ポリマー材料が、ラテックス、ポリエチレ
    ン、ポリプロピレン及びポリスチレン並びにそのコポリ
    マーから選択されることを特徴とする特許請求の範囲第
    １７項に記載の固相系。
  19. （１９）前記リガンド−レセプターアッセイがイムノア
    ッセイであることを特徴とする特許請求の範囲第１４項
    に記載の固相系。
  20. （２０）前記少なくとも１つのグループの微小ビーズに
    結合したレセプターが、前記標的リガンドを捕捉し得る
    抗体又は抗原であることを特徴とする特許請求の範囲第
    １９項に記載の固相系。
  21. （２１）前記抗体がモノクローナル抗体であることを特
    徴とする特許請求の範囲第２０項に記載の固相系。
  22. （２２）前記微小ビーズのグループが少なくとも２つの
    微小ビーズの亜集団を含んでおり、前記標的リガンドの
    非干渉エピトープに結合するように選択されたモノクロ
    ーナル抗体が前記亜集団に結合されていることを特徴と
    する特許請求の範囲第２１項に記載の固相系。
  23. （２３）流体サンプル中の少なくとも１種類の選択分析
    成分を検出するために、別々のグループの微小ビーズを
    不連続ゾーンにトラップした多孔質マトリクスを含み、 （ａ）少なくとも１つのグループの微小ビーズが標的リ
    ガンドを捕捉し得るレセプターと結合していること、及
    び、 （ｂ）少なくとも１つのグループの微小ビーズが前記分
    析成分検出用の陽性標準としで前記標的リガンド又はそ
    の他の適当なレセプター物質と結合していること を特徴とするリガンド−レセプターアッセイ用固相系。
  24. （２４）流体サンプル中の少なくとも１種類の選択分析
    成分を検出するために、別々のグループの微小ビーズを
    不連続ゾーンにトラップした多孔質マトリクスを含み、 （ａ）少なくとも１つのグループの微小ビーズが標的リ
    ガンドを捕捉し得るレセプターと結合していること、及
    び、 （ｂ）少なくとも１つのグループの微小ビーズが前記分
    析成分の検出用の陰性標準として前記標的リガンドを捕
    捉できない物質と結合しているか又は結合成分をもたな
    いことを特徴とするリガンド−レセプターアッセイ用固
    相系。
  25. （２５）前記マトリクスは、前記マトリクスの細孔サイ
    ズと適合し得る寸法の微小ビーズをトラップし得る膜又
    はフィルターであることを特徴とする特許請求の範囲第
    ２３項に記載の固相系。
  26. （２６）前記膜又はフィルターがガラス繊維、ナイロン
    又はセラミック材料から選択された材料から成ることを
    特徴とする特許請求の範囲第２３項又は第２４項に記載
    の固相系。
  27. （２７）前記微小ビーズが、前記レセプターを結合させ
    得るポリマー材料から成ることを特徴とする特許請求の
    範囲第２３項又は第２４項に記載の固相系。
  28. （２８）前記ポリマー材料が、ラテックス、ポリエチレ
    ン、ポリプロピレン及びポリスチレン並びにそのコポリ
    マーから選択されることを特徴とする特許請求の範囲第
    ２７項に記載の固相系。
  29. （２９）前記リガンド−レセプターアッセイがイムノア
    ッセイであることを特徴とする特許請求の範囲第２３項
    又は第２４項に記載の固相系。
  30. （３０）少なくとも１つのグループの微小ビーズと結合
    した前記レセプターが前記標的リガンドを捕捉し得る抗
    体又は抗原であることを特徴とする特許請求の範囲第２
    ９項に記載の固相系。
  31. （３１）前記抗体がモノクローナル抗体であることを特
    徴とする特許請求の範囲第３０項に記載の固相系。
  32. （３２）更に、陽性標準として標的リガンド又は別の適
    当なレセプター物質を結合させた別のグループの微小ビ
    ーズを含むことを特徴とする特許請求の範囲第３０項に
    記載の固相系。
  33. （３３）流体サンプル中の少なくとも１種類の選択分析
    成分を検出するために、 （ａ）特許請求の範囲第１項、第１４項、第２３項又は
    第２４項に記載の固相系を含む多孔質の第一部材と、 （ｂ）前記流体サンプルと前記アッセイで使用される液
    体試薬とを前記第１多孔質部材中で流れ易くするために
    前記多孔質部材と作動的に結合した手段と を含むことを特徴とするリガンド−レセプターアッセイ
    用装置。
  34. （３４）流体サンプル中の少なくとも１種類の選択分析
    成分を検出するために、 （ａ）特許請求の範囲第１項、第１４項、第２３項又は
    第２４項に記載の固相系を含む多孔質の第一部材と、（
    ｂ）吸収性の第二部材とを含んでおり、前記第二部材は
    、前記流体サンプルと前記アッセイで使用される流体試
    薬とが前記第一部材を通過して前記第二部材に流入する
    ように前記第一部材と協働しており、且つ、前記第二部
    材は前記第一部材が重層される表面を有しており前記第
    一部材が重層される表面にほぼ交差方向の貫通毛細管を
    有しており、前記毛細管は前記第一部材の細孔と連通し
    ており前記第一部材を透過した流体が前記第二部材の毛
    細管に導入されることを特徴とするリガンド−レセプタ
    ーアッセイ用装置。
  35. （３５）前記リガンド−レセプターアッセイがイムノア
    ッセイであることを特徴とする特許請求の範囲第３３項
    に記載の装置。
  36. （３６）流体サンプル中の少なくとも１種類の選択分析
    成分を検出するために、 （ａ）特許請求の範囲第３３項に記載の装置の多孔質第
    一部材に標的リガンドと結合し得るレセプターが結合し
    た微小ビーズを含有させ、標的リガンド含有の疑いがあ
    る前記流体サンプルを前記多孔質第一部材に導入し、 （ｂ）標的リガンドと結合し得るレセプター接合体を検
    出できるようにラベルし、このレセプター接合体の溶液
    を添加して前記レセプター接合体と前記標的リガンドと
    の複合体を形成させ、 （ｃ）前記多孔質部材に結合した前記レセプター接合体
    を検出する ステップを含むリガンド−レセプターアッセイ法。
  37. （３７）前記リガンド−レセプターアッセイがイムノア
    ッセイであることを特徴とする特許請求の範囲第３６項
    に記載の方法。
  38. （３８）前記レセプターがアレルゲンであり、前記リガ
    ンドが前記アレルゲンに特異性のＩｇＥ抗体であり前記
    レセプター接合体がラベルした抗−ＩｇＥ抗体であるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第３６項に記載の方法。
  39. （３９）前記分析成分がウィルス又は前記ウィルス関連
    の抗原もしくは抗体であることを特徴とする特許請求の
    範囲第３６項に記載の方法。
  40. （４０）前記リガンドが風疹ウィルス、ロタウィルス、
    アデノウィルス、呼吸器合胞体ウィルス、ＨＴＬＶ、肝
    炎ウィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、非Ａ非Ｂ肝炎、イン
    フルエンザウィルス、サイトメガロウィルス又はヘルペ
    スウィルスから成るグループから選択されることを特徴
    とする特許請求の範囲第３９項に記載の方法。
  41. （４１）前記分析成分が細菌、カビもしくは寄生虫又は
    前記細菌、カビ又は寄生虫に関連の抗原又は抗体である
    ことを特徴とする特許請求の範囲第３６項に記載の方法
    。
  42. （４２）前記分析成分が、Ａ属又はＢ属の連鎖球菌、淋
    菌、腟トリコモナス、カンジダ・アルビカンス、トラコ
    ーマ・クラミジア又はインフルエンザ菌から成るグルー
    プから選択されることを特徴とする特許請求の範囲第４
    １項に記載の方法。
  43. （４３）前記分析成分が、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、
    前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異性抗原、アルフ
    ァフェトプロテイン、癌胎児性抗原、黄体形成ホルモン
    又はクレアチンキナーゼイソ酵素から成るグループから
    選択された生理学的マーカー物質であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第３６項に記載の方法。
  44. （４４）前記サンプルが、血清、血漿、尿又はその他の
    生物物質であることを特徴とする特許請求の範囲第３６
    項に記載の方法。
  45. （４５）前記レセプター接合体が酵素でラベルされてお
    り、前記検出ステップが、前記酵素と反応すると肉眼又
    は計器によって測定できる呈色変化を生じる適当な基質
    を前記多孔質第一部材に添加することを含むことを特徴
    とする特許請求の範囲第３６項に記載の方法。
  46. （４６）前記レセプターがモノクローナル抗体であり前
    記レセプター接合体がラベルされたモノクローナル抗体
    であり、前記レセプターと前記レセプター接合体とが前
    記リガンドの非干渉エピトープに結合するように選択さ
    れていることを特徴とする特許請求の範囲第３６項に記
    載の方法。
  47. （４７）前記アッセイが核酸プローブアッセイであり、
    前記レセプターが前記標的リガンドの核酸配列の一部分
    に相補的な核酸配列を含むことを特徴とする特許請求の
    範囲第１項に記載の固相系。
  48. （４８）前記リガンド−レセプターアッセイが核酸プロ
    ーブアッセイであることを特徴とする特許請求の範囲第
    ３３項に記載の装置。
  49. （４９）前記リガンド−レセプターアッセイが核酸プロ
    ーブアッセイであることを特徴とする特許請求の範囲第
    ３６項に記載の方法。
  50. （５０）前記レセプターが前記標的リガンドの核酸配列
    の一部分に相補的な核酸配列であり、前記レセプター接
    合体が前記標的リガンドの核酸配列の別の部分に相補的
    なラベル核酸プローブであることを特徴とする特許請求
    の範囲第３６項に記載の方法。
  51. （５１）前記微小ビーズがラテックスからなることを特
    徴とする特許請求の範囲第１０項又は第１８項又は第２
    ８項に記載の固相系。
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