DK171928B1 - Fastfasesystem til benyttelse i ligand-receptor analyser og anvendelse af fastfasesystemet som en første porøs del i et ligand-receptor analyseapparat samt i sådanne analysefremgangsmåder - Google Patents

Description

DK 171928 Bl i

Opfindelsen angår et fastfasesystem til anvendelse ved en enkelt eller multipel ligand-receptor analyse til bestemmelse af en eller flere udvalgte analyter i en væskeformig prøve.

5 Opfindelsen angår endvidere anvendelse af et så dant fastfasesystem som en første porøs del i et apparat til anvendelse ved en ligand-receptoranalyse til bestemmelse af i det mindste en udvalgt analyt i en væskeformig prøve, samt anvendelse af fastfasesystemet i en 10 ligand-receptoranalysefremgangsmåde til bestemmelse af i det mindste en udvalgt analyt i en væskeformig prøve.

Ansøgningen er beslægtet med indholdet af DK patenter nr. 170 352 og 170 353 baseret på USSN 609 395, indleveret 11. maj 1984 og US patent nr. 4 727 019 base-15 ret på USSN 733 292, indleveret 10. maj 1985. Vi refererer her til indholdet af alle disse patenter.

Ligand-receptoranalyser, især immunassays, er sensitive diagnostiske hjælpemidler ved bestemmelse in vitro på serum og andre kropsvæsker af analyter associe-20 ret med sygdom og andre fysiologiske tilfælde af klinisk interesse.

Tidligere har immunassays typisk været baseret på en polyklonal antistofpræparation, bundet til en fast fase. I sådanne analyser lader man en opløsning af 25 antigen, der er mærket, så den kan påvises, konkurrere med antigen i en prøve om reaktion med antistoffet på fast fase. Den udstrækning, hvori det mærkede antigen findes bundet til den faste fase eller påvises i den væskeformede fase, kan benyttes som mål for tilstedevæ-30 relse og mængde af antigen i den prøve, man analyserer.

Senere blev ikke-konkurrerende immunometriske analyser tilgængelige. Ved disse benytter man også en polyklonal antistofpræparation bundet til en fast fase.

Man bringer prøven, der skal undersøges for et bestemt 35 antigen, i kontakt med den faste fase, så antigenet kan bindes til antistofferne her. Efter en inkubationspe- DK 171928 B1 2 riode adskiller man typisk prøven fra den faste fase, som derefter vaskes og inkuberes med en opløsning af yderlige polyklonale antistoffer, som er blevet mærket, f.eks. med et radionuclid, et enzym eller en fluoresce-5 rende enhed, så de kan påvises.

Efter denne anden inkubation skiller man ikke-bundet mærket antistof fra den faste fase og bestemmer mængden af mærket antistof i enten den væskeformige fase eller bundet til den faste fase i en antistof:antigen: 10 antistofkombination som et mål for tilstedeværelse og/ eller koncentration af antigen i prøven.

Endnu senere har man modificeret immunassayfrem-gangsmåder, så der anvendes monoklonale antistoffer. For eksempel beskriver US patent 4 376 110 to-positions im-15 munometriske analyser, hvor man benytter monoklonale antistoffer i par, det ene bundet til en fast fase og det andet mærket, så det kan påvises. Anvendelsen af par af monoklonale antistoffer, som reagerer ved forskellige bindingspositioner på et antigen, har gjort det muligt 20 at udføre samtidige immunometriske analyser, hvori man ved inkubationerne af antigen og mærket antistof ikke behøver mellemtrinene ved den tidligere teknik.

I de ovenfor nævnte immunanalysefremgangsmåder indeholder fastfasesystemet typisk et antistof, bundet 25 til partikler eller et antistof som overtræk på et materiale, såsom en membran eller et filter, der er egnet til at indfange et relevant antigen. I øjeblikket kræver fremstillingen af sådanne fastfasesystemer karakteristiske aktiveringsfremgangsmåder for at lette 30 overtrækningen af fast bærermateriale med antistof. Derudover kræves i almindelighed en efterovertrækning af det faste bærermateriale med en substans, der effektivt kan forhindre ikke-specifik binding. Fremgangsmåderne ved aktivering og efterovertrækning tager tid og er 35 besværlige, og derfor er fremstillingen af fastfasesy-stemerne meget kostbar.

DK 171928 B1 3

Foruden de ovennævnte begrænsninger i forbindelse med fremstillingen af hidtil tilgængelige fastfasesyste-mer, kan det nævnes, at det ikke har været muligt at analysere en given prøve for mere end én analyt ad gan-5 gen på et enkelt fastfasesystem. Derudover mangler tilgængelige fastfasesystemer indre kontrolmekanismer (dvs. positive og negative kontrolmekanismer) som er essentielle, når man skal bedømme pålideligheden og gyldigheden af en analyse. Fremstillingen af fastf asesystemer til 10 multipel immunanalysefremgangsmåder og/eller systemer med indre kontrol, har forud for opfindelsen været meget besværlig.

Der findes derfor et behov for et fastfasesystem, som kan fremstilles mere effektivt, mindre besværligt og 15 billigere. Der eksisterer også et behov for et forbedret fastfasesystem, som kan benyttes til at analysere en prøve for i det mindste to analyter samtidigt. Endelig findes der et behov for et forbedret fastfasesystem, som tillader indre kontrolmekanismer, når analyserne skal 20 udføres.

Fastfasesystemet ifølge opfindelsen, der i det væsentlige opfylder nævnte behov, er ejendommeligt ved, at fastfasesystemet omfatter et porøst bærermateriale, der omslutter en eller flere grupper af mikrokugler, og 25 hvori disse mikrokugler i hver gruppe er bundet til en receptor, der kan indfange en bestemt ligand, og som er forskellig fra receptorer bundet til mikrokugler i eventuelle andre grupper af mikrokugler.

Som nævnt tilvejebringer opfindelsen et fastfase-30 system til anvendelse ved ligand-receptoranalyser, især immunassays, til bestemmelse af en udvalgt analyt i en væskeformig prøve. I denne forbindelse betyder betegnelsen "ligand-receptoranalyse" en analyse for en analyt, som bestemmes ved dannelsen af et kompleks mellem 35 en ligand og en anden substans, der specifikt kan vekselvirke med liganden, dvs. en receptor. Liganden DK 171928 B1 4 kan være analyten eller en substans, der ved bestemmelse kan angive, at analyten er til stede i prøven. Fagmanden vil kunne indse, at afhængigt af analyten kan et medlem af et bestemt bindende par enten være receptor 5 eller ligand, afhængig af, hvordan analysen udføres, i opfindelsens sammenhæng skal betegnelsen "ligand" omfatte antigener, haptener, antistoffer, desoxyribonuclein-syre (DNA), ribonucleinsyre (RNA), hormoner, metaboliter og andre naturligt forekommende substanser af diagnos-10 tisk interesse, hvor der eksisterer en specifik bindende partner, dvs. receptoren i ligand-receptoranalysen.

Fastfasesystemet ifølge opfindelsen omfatter et porøst bærermateriale, såsom en membran eller et filter, der omslutter mikrokugler. Det foretrækkes, at mikro-15 kuglerne omsluttes i et afsondret område i bærermaterialet. Mikrokuglerne, der udvælges så deres størrelse svarer til porestørrelsen i bærermaterialet, er bundet til en receptor, såsom et antistof, fortrinsvis et mono-klonalt antistof, et antigen, en nucleinsyresekvens el-20 ler en anden substans, der kan indfange den udvalgte ligand, når den bringes i kontakt med en prøve, der indeholder liganden. For eksempel kan mikrokuglerne være bundet til et allergen, der kan indfange et IgE antistof i en prøve, som er specifik for det bundne allergen.

25 De foretrukne fastfasesystemer er adskilte grup per af mikrokugler, til hvilke er bundet et antistof, antigen eller anden passende receptorsubstans, omsluttet i afsondrede områder i det porøse bærermateriale, hvilket vil tillade udførelsen af en multipel analyse 30 til bestemmelse af i det mindste to udvalgte analyter.

Derudover kan adskilte grupper af mikrokugler være omsluttede af det porøse bærermateriale og kan benyttes til interne kontrolsystemer ved bestemmelse af udvalgte analyter.

35 Ved en anvendelse ifølge opfindelsen af det om handlede fastsfasesystem, der er ejendommelig ved det i DK 171928 B1 5 krav 14 angivne, benytter man fastfasesystemet som en porøs første del i et apparat til ligand-receptoranalyse til bestemmelse af i det mindste én udvalgt analyt i en væskeformig prøve, idet apparatet yderligere omfatter en 5 indretning i operationsmæssig forbindelse med ovennævnte første porøse del, der skal fremme strømning gennem denne af den væskeformige prøve og væskeformige reagenser benyttet ved analysen.

ved en yderligere anvendelse ifølge opfindelsen 10 af det omhandlede fastfasesystem, der er ejendommelig ved det i krav 17 angivne, vil man som et første trin anbringe den væskeformige prøve på fastfasesystemet, hvorved, medens væsken flyder gennem fastfasesystemet, receptoren bundet til mikrokuglerne vil indfange den ud-15 valgte ligand. Efter tilsætning af prøven tilsætter man til fastfasesystemet en opløsning af receptor-konjugat, der kan binde den udvalgte ligand og er mærket, så den kan påvises. I denne forbindelse betyder betegnelsen "receptor-konjugat" et kompleks, der består af en recep-20 tor og en mærkningsenhed til hjælp ved påvisning. Ved et immunometrisk assay for et udvalgt antigen kan recep-tor-konjugatet være et mærket antistof, foretrukkent et monoklonalt antistof. Alternativt kan man benytte mærket antigen som receptor-konjugat, hvis den udvalgte li-25 gand er et antistof.

Man kan derefter fjerne ikke-bundet receptor-konjugat ved vask. Tilstedeværelse af bundet receptor-konjugat på fastfasesystemet bestemmes derefter og er et tegn på tilstedeværelse af analyten i prøven.

30 Dette sammendrag af opfindelsen er blevet foreta get, for at man bedre skal kunne forstå tegningerne og den detaillerede beskrivelse af opfindelsen nedenfor.

På tegningen viser fig. 1 et billede af et porøst bærermateriale, 35 anvendeligt ifølge opfindelsen og af den måde, hvorpå man tilsætter mikrokugler dertil.

DK 171928 B1 6 fig. 2 er et billede af et tværsnit af fastfase-systemet ifølge opfindelsen, fig. 3 viser ovenfra et fastfasesystem til bestemmelse af en enkel analyt i en prøve 5 ifølge opfindelsen, fig. 4 viser ovenfra et foretrukkent fastfasesy-stem ifølge opfindelsen til multipel bestemmelse af forskellige analyter i en prøve, 10 fig. 5 viser ovenfra et foretrukket fastfasesy- stem ifølge opfindelsen til bestemmelse af en enkelt analyt i en prøve, og hvor der findes indre positive og negative kontrolforanstaltninger , 15 fig. 6 er et tværsnit af et apparat, der indehol der et fastfasesystem ifølge opfindelsen til udførelse af analyser ifølge opfindelsen.

Som angivet ovenfor tilvejebringer opfindelsen et 20 fastfasesystem til anvendelse ved ligand-receptoranaly-ser, især immunassays til bestemmelse af en udvalgt analyt i en væskeformig prøve. Ifølge opfindelsen omfatter fastfasesystemet et porøst bærermateriale, der kan omslutte mikrokugler. Man kan benytte en række porøse bæ-25 rermaterialer, både naturlige og syntetiske, forudsat at mikrokugler, hvis størrelse svarer til porestørrelsen af bærermaterialet, kan omsluttes ifølge opfindelsen. Blandt foretrukne bærermaterialer er membraner eller filtre, dannet af glasfiber, nylon eller keramiske mate-30 rialer med veldefineret porestørrelse.

Fastfasesystemet indeholder yderligere mikrokugler, hvortil er bundet en udvalgt receptor, såsom et antistof, foretrukkent et monoklonalt antistof, et antigen eller en anden passende receptorsubstans, der kan ind-35 fange den relevante ligand. Mikrokugler af et polymermateriale som latex, polyethylen, polypropylen eller DK 171928 B1 7 polystyren foretrækkes ifølge opfindelsen. Imidlertid vil fagmanden kunne indse, at et antal mikrokugler, fremstillet af enten naturligt eller syntetisk materiale, kan anvendes. I tilfælde af polymerer udvælger man 5 polymeren på basis af dens evne til at bindes let med det udvalgte medlem af et ligand-receptorpar, det kan f. eks. være en polymer eller copolymer, der besidder en funktionel gruppe, som gør bindingen lettere ved dannelse af kovalente bindinger eller ved overtrækning.

10 Derudover udvælges mikrokuglerne, så deres effektive størrelse tillader, at de omsluttes af det porøse bærermateriale, og at væske kan strømme omkring dem og gennem bærermaterialet. Det foretrækkes at benytte mikrokugler, hvis diameter er ca. 0,1-50 μ. Vi har fundet, at mikro-15 kugler indenfor dette størrelsesområde vil maksimere det effektive reaktionsoverfladeareal med den udvalgte ligand, idet sammenklumpning og vedhæftning af mikrokuglerne i bærermaterialet herved bliver så lille som mulig. Især foretrukket er mikrokugler med diameter i om-20 rådet ca. 0,1-2,0 μ. Mikrokugler i dette størrelsesområde vil forbedre kontakten og reaktionen mellem receptoren bundet til mikrokuglerne og den udvalgte ligand samt forløbet af reaktionen.

I forbindelse med opfindelsen aktiverer man de 25 udvalgte mikrokugler med en passende receptor, f.eks. et antistof, et antigen eller en anden biologisk substans egnet som receptor, idet den kan indfange og binde den udvalgte ligand. Man kan opnå aktivering ved hjælp af kovalent binding eller i passende tilfælde ved at over-30 trække mikrokuglerne med receptoren. Når det drejer sig om et immunassay, hvor tilstedeværelsen af et antigen i en prøve skal påvises, foretrækkes det at receptoren er et monoklonalt antistof. Man kan imidlertid godt anvende polyklonale antistoffer fra antisera. Fremgangsmåder 35 ved overtrækning eller ved kovalent binding af proteiner til mikrokugler og ved præparation af monoklonale og po- DK 171928 B1 8 lyklonale antistoffer er velkendte og behøver ingen gentagelse her. De aktiverede mikrokugler bringes til om-slutning i bærermaterialet, fortrinsvis indenfor et veldefineret område eller områder i bærermaterialet, og i 5 et forudbestemt mønster.

Derudover har vi uventet fundet, at det er ønskeligt at benytte en overordentlig lav koncentration af aktiverede mikrokugler i opløsning, når de skal omsluttes, foretrukken ca. 0,01-1,0%, idet analysefølsomheden 10 herved vokser. Fremgangsmåden ved omslutning af mikro-kuglerne i bærermaterialet er ikke kritisk, og man kan benytte en række fremgangsmåder. For eksempel kan man sætte mikrokuglerne på overfladen af det porøse bærermateriale som en suspension i en passende væske, f.

15 eks. som en polymerlatex, fortrinsvis en monodispers latex, som derefter fjernes ved tørring. Man kan benytte tyngdekraften, et vakuum eller hårrørskræfter til at trække mikrokuglerne ind i afsondrede områder i det porøse bærermateriale, før væsken, der er opslæmmet deri, 20 fjernes. Da mikrokuglerne er aktiverede før de omsluttes, vil opfindelsen overvinde de begrænsninger, man har ved fremstilling af fastfasesystemer ifølge kendt teknik.

Ved en foretrukket udførelsesform af fastfasesy-25 stemet ifølge opfindelsen omsluttes mikrokuglerne med bunden receptor i bærermaterialet på en måde, som tillader deres mobilitet i bærermaterialet og forhindrer deres sammenklæbning eller sammenklumpning i bærermaterialet, og som yderligere tillader hurtig strømning af væ-30 ske gennem bærermaterialet og rundt om partiklerne.

Idet ansøgeren ikke ønsker at være bundet af teorien, mener man, at den frie bevægelighed af mikrokugler i bærermaterialet vil forstærke kontakten mellen receptor, der er bundet til mikrokuglerne, og den udvalgte ligand 35 og vil tillade en effektiv udvaskning under en analyse. Derudover må, som angivet ovenfor, antallet og størrel- DK 171928 B1 9 sen af de omsluttede mikrokugler optimeres indenfor de angivne grænser, hvis man skal opnå den ønskede følsomhed af en analyse. Man kan overtrække mikrokuglerne, før de bliver omsluttet, for at minimere eller forhindre de-5 res sammenklumpning og vedhæftning i bærermaterialet.

I fig. 1 vises i tværsnit et billede af et porøst bærermateriale 10, der kan anvendes ifølge opfindelsen, og den måde man påsætter aktiverede mikrokugler 12 derpå (væsken, hvori mikrokuglerne findes, vises ik-10 ke). I fig. 2 vises i tværsnit et billede af et fast-fasesystem 14 ifølge opfindelsen. I fig. 2 vises altså det porøse bærermateriale 10, hvori de aktiverede mikrokugler 12 er omsluttede i et veldefineret eller i et afsondret område 16 i bærermaterialet 10. Et bil-15 lede ovenfra af fastfasesystemet 14 til benyttelse i en analyse ved bestemmelse af en enkel analyt, som det er vist i fig. 2, vises i fig. 3. I overensstemmelse hermed vises i fig. 3 det afsondrede område 16, i hvilket mikrokugler 12 er omsluttet, og hvor de kan ind-20 fange en ligand i bærermaterialet 10, der hører til fastfasesystemet 14.

Et foretrukket fastfasesystem ifølge opfindelsen indeholder adskillige grupper mikrokugler, omsluttet i afsondrede områder, fortrinsvis i et forudbestemt møn-25 ster i bærermaterialet. Hver gruppe mikrokugler bliver, før de bliver omsluttet, bundet til forskellige receptorer, såsom et antistof eller et antigen, der kan indfange hver sin ligand af interesse. I overensstemmelse hermed vil i en udførelsesform af opfindelsen hver grup-30 pe af mikrokugler bestå af en population af mikrokugler bundet til det samme antistof, antigen eller anden receptor, der er udvalgt til brug i analysen. Alternativt kan en gruppe mikrokugler indeholde en blanding af mikrokugler, til hvilke forskellige receptorer er bundet.

35 por eksempel kan, når det grejer sig om et immunassay for et antigen, hver gruppe mikrokugler omfatte i det DK 171928 B1 10 mindste to undergrupper af mikrokugler, hvori hver undergruppe er bundet til et antistof, foretrukken et mo-noklonalt antistof, der kan bindes til forskellige determinanter eller bindingssteder på antigenet. Det fo-5 retrækkes, at de monoklone antistoffer, der er bundet til undergrupperne af mikrokugler, der udgør en adskilt gruppe mikrokugler, udvælges, så de har en spefifik reaktivitet med ikke-vekselvirkende bindingssteder på den udvalgte ligand, idet herved specificiteten og følsom-10 heden af analysen forstærkes.

I overensstemmelse hermed er et fastfasesystem, som beskrevet ovenfor, nyttigt ved en multipel ligand-receptoranalyse til samtidig bestemmelse af i det mindste to udvalgte analyter i en given prøve. Når det dre-15 jer sig om et immunassay, kan man påvise tilstedeværelse af forskellige analyter i en prøve ved en speciel farvereaktion for hver analyt, idet man benytter forskellige enzymmærkede antistoffer, som fører til forskellige farvereaktioner, når de sættes til et passende substrat.

20 Man kan også omslutte forskellige grupper af mikrokugler i det porøse bærermateriale på en måde, så de kan identificeres ved hjælp af deres placering i bærermaterialet.

Det foretrukne fastfasesystem, beskrevet ovenfor, 25 er især nyttigt, når det er ønskværdigt samtidig at bestemme tilstedeværelsen af mere end en analyt i en prøve, f.eks. når man skal bestemme årsagerne til en allergisk reaktion. Man kan uden videre opnå dette, idet man omslutter adskilte grupper mikrokugler, der hver er bun-30 det til én af en gruppe specifikke allergener (dvs. proteiner eller carbohydrater, som man mistænker for at fremkalde en immunrespons) i adskilte zoner i bærermaterialet. Et sådant fastfasesystem tilvejebringer i virkeligheden en samling allergener, der kan indfange IgE 35 antistoffer, som kan findes i en serumprøve fra en patient. I overensstemmelse hermed vil reaktivitetsmønst- DK 171928 B1 11 ret på fastfasesystemet, som det bestemmes ved tilstedeværelse af allergenspecifikke IgE antistoffer i en given prøve, yde et fingerpeg for hvilke allergener, der fører til en given allergisk reaktion. I sådanne analyser be-5 stemmer man typisk allergen-IgE parrene ved at benytte mærket anti-IgE antistof som beskrevet i US patent nr.

3 720 760.

Idet vi nu vender os til fig. 4, vises der ovenfra et foretrukket fastfasesystem 18 til benyttelse i 10 en multipel analyseproces i overensstemmelse med billedet af et fastfasesystem 14 i fig. 2. Der vises altså i fig. 4 et bærermateriale 10, i hvilket der findes adskilte områder 20, 22, 24 og 26, der indeholder grupper af mikrokugler, som hver aktiveres med forskellige re-15 ceptorer, så de kan indfange forskellige ligander på fastfasesystemet 18.

Ifølge opfindelsen vil et foretrukket fastfasesystem yderligere indeholde adskilte grupper mikrokugler, der virker som et internt kontrolsystem (dvs. po-20 sitivt og/eller negativt kontrolsystem). For eksempel kan mikrokuglerne i det positive kontrolsystem være bundet til den bestemte ligand eller en anden passende receptorsubstans, der kan efterligne bindingen af den bestemte ligand. Derimod vil mikrokuglerne, der udgør det 25 negative kontrolsystem, enten være uden tilbundet komponent eller foretrukken bundet til en substans, f.eks. et antistof eller antigen eller DNA, afhængigt af det enkelte tilfælde, som ikke er i stand til at indfange den pågældende ligand, men kan efterligne de ikke-specifikke 30 bindende vekselvirkninger af receptoren bundet til mikrokugler med andre komponenter i prøven end den pågældende ligand. Et sådant fastfasesystem, som kan benyttes i en enkelt eller i en multipel analyse, vil give en mulighed for at bestemme gyldigheden og pålideligheden 35 af analysen. Således vil i et immunassay indførelsen af en negativ kontrolmekanisme give et middel til at be- DK 171928 B1 12 stemme, om et falsk positivt resultat, som man normalt mener skyldes uspecifik binding af en komponent i prøven ved receptoren, er opnået. En positiv kontrol vil på den anden side reducere muligheden for, at man ikke op-5 dager et falsk negativt resultat.

Derudover kan der i fastfasesystemet ifølge opfindelsen inkorporeres interne referencer til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af en udvalgt ligand ved en analysefremgangsmåde.

10 I fig. 5 vises ovenfra et foretrukket fastfase- system 28 som beskrevet ovenfor til bestemmelse af en enkelt analyt, og som omfatter indre kontrolsystemer. Således viser fig. 5 i overensstemmelse med billedet i fig. 2 et fastfasesystem 28 med en adskilt zone 16 i 15 bærermaterialet 10, der indeholder mikrokugler, til hvilke den udvalgte receptor er bundet. Den adskilte zone 30 i bærermaterialet 10 indeholder mikrokugler, til hvilke den udvalgte ligand er bundet som en positiv kontrolmekanisme, og en adskilt zone 32 i bærermateri-20 alet 10 indeholder mikrokugler, som foretrukken er overdækket med en substans, som efterligner den ikke-specifikke binding af receptoren som en negativ kontrolmekanisme. Når man således anvender system 28 i en analyse på en prøve fra en patient, som indeholder en 25 bestemt analyt, vil både zone 16 og 30 angive et positivt resultat. På den anden side vil en ændring i zone 32 sammen med en ændring i zone 16 kunne fortolkes som et falsk positivt resultat.

Apparatet i forbindelse med anvendelsen ifølge 30 opfindelsen indeholder som en første porøs del et fastfasesystem som beskrevet ovenfor. Apparatet indeholder yderligere indretninger i operationsmæssig forbindelse med den første porøse del, der skal lette gennemstrømningen gennem første del af en væskeformig prøve og væ-35 skeformige reagenser. Passende anvendelige indretninger er sådanne, hvormed man kan påsætte et vakuum eller en DK 171928 B1 13 kapillar virkning under den porøse del, så væske kan blive trukket gennem den. Det kan også dreje sig om indretninger, hvormed man påsætter et overtryk over den porøse del, hvorved væskeprøven eller reagenserne pres-5 ses gennem denne del. Ved anvendelsen ifølge opfindelsen bringes en anden absorberende del i kontakt med fastfa-sesystemet på en måde, så den tillader strømning af en væskeformig prøve gennem fastfasesystemet og ind i det absorberende materiale. Den anden absorberende del, der 10 besidder en overflade, over hvilken man kan anbringe fastfasesystemet, har kapillarrør gennem sig, der i det væsentlige forløber vinkelret på omtalte overflade.

Disse kapillarrør står i forbindelse med porerne i første del. En række materialer kan benyttes til fremstil-15 ling af den absorberende del, såsom celluloseacetat, fibre eller polyester.

I en anden udførelsesform kan man anbringe fastfasesystemet på en porøs basis, som tillader strømning af en væskeformig prøve gennem fastfasesystemet og ind i 20 det absorberende materiale. Den understøttende basis kan bestå af en porøs skive, såsom en polyethylenskive, og hvile på den absorberende del på en måde, så den absorberende del er i direkte forbindelse med porerne i fastfasesystemet via denne understøttende basis. Kon-25 struktionen af et sådant apparat findes f.eks. i det væsentlige beskrevet i de på side 1 nævnte DK og US patentskrifter. Pig. 6 illustrerer et sådant apparat. I overensstemmelse hermed vises i fig. 6 et fastfasesystem 14, såsom fastfasesystemet vist ovenfra i fig. 3, og 30 afbildet i tværsnit i fig. 2. Fastfasesystemet 14 i apparatet 34 hviler på en porøs understøttende basis 36, som tillader strømning af en væskeformig prøve gennem fastfasesystemet 14 og ind i en absorberende del 38 som beskrevet ovenfor.

35 Som tidligere angivet er fastfasesystemet ifølge opfindelsen og apparatet, hvor dette anvendes, af bety- DK 171928 Bl 14 delig nytte ved udførelsen af en ligand-receptoranaly-ser, især multiple receptoranalyser til bestemmelse af i det mindste to analyter og/eller ligand-receptoranaly-ser, der indeholder interne kontrolsystemer. Selv om 5 opfindelsen især er nyttig ved udførelsen af immunas-says, vil fagmanden kunne indse, at fastfasesystemet ifølge opfindelsen med passende ændringer vil kunne blive benyttet til andre ligand-receptoranalyser, hvoriblandt analyser, der omfatter nucleinsyresondeteknologi.

1 o I overensstemmelse med ligand-receptorfremgangs- måden under anvendelse ifølge opfindelsen af det omhandlede fastfasesystem sætter man en væskeformig prøve af interesse, på fastfasesystemet i et apparat, som beskrevet ovenfor. Hvis det drejer sig om et immunassay, om-15 fatter den faste fase foretrukken som receptor et mono-klonalt antistof bundet til mikrokuglerne, selv om man kan benytte en polyklonal antistofpræparation, når den pågældende ligand er et antigen. Hvis liganden imidlertid er et antistof, kan fastfasen indeholde et antigen, 20 for hvilket det antistof, der skal bestemmes, er specifikt. Når den væskeformige prøve har passeret gennem fastf asesystemet og ind i den absorberende del, tilsætter man en opløsning af receptor-konjugat, der er i stand til at binde med den pågældende ligang og er mær-25 ket, så det kan bestemmes. Når det drejer sig om immun-assays, kan receptor-konjugatet være et antistof, foretrukken et monoklonalt antistof, eller et antigen, der kan binde til den pågældende ligand. Tilsætningen af receptor-konjugat tillader, som det er passende, dannel-30 sen af et kompleks med liganden, der er indfanget af fastfasesystemet. Når det drejer sig om et immunassay, og hvis mikrokuglerne i fastfasesystemet er bundet med monoklonalt antistof, og det mærkede antistof også er et monoklonalt antistof, udvælger man de to antistoffer, så 35 de binder til ikke-vekselvirkende bindingssteder på antigenet, i det væsentlige som beskrevet i US patenter DK 171928 B1 15 nr. 4 376 110 og 4 486 5 30, til hvis indhold vi herved refererer. I for tiden foretrukne udførelsesformer mærker man receptor-konjugatet med et enzym. Imidlertid kan andre konventionelle markører, såsom radionucleider, 5 fluorescerende midler, fosforescerende midler og polymerer, der indeholder farvestoffer eller kemoluminescente enheder, også anvendes. Når opløsningen af receptor-konjugat har passeret gennem fastfasesystemet, kan man tilsætte en vaskeopløsning til fjernelse af ikke-bundet 10 receptor-konjugat. Derefter påviser man receptor-konjugatet, der har dannet kompleks med den relevante ligand.

Hvis man har valgt et enzym som markør, bestemmer man bundet receptor-konjugat ved at tilsætte et passende enzymsubstrat til fastfasesystemet. Ved reaktion med sub-15 stratet vil enzymet, hvis det er rigtigt udvalgt, forårsage en farveændring på fastfasesystemet, stemmes visuelt eller ved hjælp af apparater.

Fagmanden vil kunne indse, at man kan udføre analyser for en stor mængde analyter ifølge opfindelsen.

20 Listen af mulige analyter er for lang til at blive gengivet her. Imidlertid kan antigener, såsom prostata-sur phosphatase, prostata-specifikt antigen, alpha-fetopro-tein, carcinoembryont antigen, luteiniseringshormon, kreatinkinase isoenzymer og andre antigener i serum, 25 plasma, urin eller andre biologiske væsker, bestemmes i et immunassay. Derudover er opfindelsen nyttig ved analysen for vira, bakterier, parasiter eller svampe eller antigener eller antistoffer associeret hermed, omfattende f.eks. Rubella-virus, Rota-virus, adenovirus, respi-30 retorisk syncitial virus, HTLV, hepatitis virus, hepati-tis/A, hepatitis/B, hepatitis nonA nonB, influenza virus, cytomegalovirus og herpes virus såvel som gruppe A og gruppe B streptococcus, Neisseria gonorrhea, Trichomonas vaginalis, Candida albicans, Chlamydia trachomatis 35 og Hemophilus influenza.

Ydermere vil fagmanden, der læser opfindelsen, kunne se, at den kan anvendes på analyser, der involve- DK 171928 B1 16 rer nucleinsyresonde-teknologi. Man kan specielt binde en nucleinsyre-sekvens, der er komplementær til en del af nucleinsyresekvensen af en ligand, der er af interesse, til mikrokugler, der derefter omsluttes i et porøst 5 bærermateriale. Et sådant fastfasesystem kan indgå i et apparat som beskrevet tidligere og benyttes i assayfrem-gangsmåder. Ved sådanne analyser påsætter man en væskeprøve, som man mener indeholder den pågældende ligand på fastfasesystemet, og liganden indfanges, på fastfasesy-10 stemet. Derefter tilsætter man en mærket nucleinsyre-sonde med en nucleinsyresekvens, der er komplementær til en anden del af nucleinsyresekvensen i den pågældende ligand, hvorved der kan dannes et kompleks af den mærkede nucleinsyresonde og liganden, der er indfanget på den 15 faste fase. Påvisning af mærket nucleinsyresonde bundet til fastfasesysmtemet tilvejebringer et tegn på tilstedeværelsen af analyten i prøven.

De følgende eksempler demonstrerer fremstilling af et omhandlet fastfasesystem, der indeholder mikrokug-20 ler, omsluttet af et glasfiberfilter og anvendelse ifølge opfindelsen af et sådant fasefasesystem til udførelse af et immunassay .

25 Eksempel

Bestemmelse af antigen

Analysen i det følgende eksempel er et immunassay til bestemmelse af human choriogonadotropin (HCG), et antigen, der findes i forhøjet niveau i urinen fra gra-30 vide kvinder.

Man udvalgte en monodispers latex af polystyren-mikrokugler, med diameter 0,8 μ (Interfacial Dynamics Corporation, Portland Oregon) og aktiverede den ved passiv absorption på en præparation af monoklonalt anti-35 stof, afledt fra hybridcellelinie HCU 061 (Hybritech Incorporated, San Diego, USA), som er specifik for DK 171928 Bl 17 HCG-antigenet. Man udvalgte størrelsen af mikrokugler-ne, så den svarede til Whatman GF/F glasfiberfilter (Whatman Company, Clifton, New Jersey), idet man foretog et eksperiment med fluorescentmærkede mikrokugler for at 5 bestemme, om de blev tilbageholdt af filteret. Man opnåede de monoklonale antistoffer fra ascitesvæske, rensede dem ved Na2S04 udfældelse og DEAE ionbytterkroma-tografi ved hjælp af standardfremgangsmåder.

Derefter overtrak man mikrokuglerne, bundet til 10 antistof, med en 1% opløsning af serumalbumin fra kvæg (BSA) i 50 ml phosphat (pH 8,0) for at reducere ikke-specifik binding af HCG og mærket antistof, idet man benyttede konventionelle fremgangsmåder.

10 μΐ af de aktive mikrokugler blev udsuspenderet 15 i 50 ml phosphat (pH 8,0) ved en koncentration på 0,25% w/v og ved hjælp af en pipette anbragt på et Whatman GF/F glasfilterfiber, der var indsat i et immunokoncen-trationsapparat som vist i fig. 6. Man lod mikrokuglerne sprede sig i filteret, så de dannede en afgrænset, 20 ringformet zone midt i filteret. Herefter lod man filteret tørre i luft i 15 minutter.

Man anbragte ca. 250 yl urin, der indeholdt 125 mlU/ml HCG på filteret. Derefter tilsatte man ca. 100 μΐ af en præparation af et andet monoklonalt antistof 25 mod HCG, afledt fra hybridcellelinie HCO 514, og mærket med enzymet alkalinphosphatase. Efter fem minutters inkubation, hvorunder det enzymmærkede antistof-konjugat blev trukket gennem filteret, vaskede man det med 2 ml 10 mM Tris-pufret saltvand (pH 8,0). Derefter tilsatte 30 man omtrent 100 yl af en opløsning, der indeholdt indox-ylphosphat, et substrat der passer til enzymmærkningen.

Efter fem minutters inkubation undersøgte man filteret visuelt for at se, om der var farvereaktion.

Der udvikledes en mørkeblå farve i den afgrænsede 35 zone i filteret, hvor de HCU-061 aktiverede mikrokugler var omsluttet, som et tegn på tilstedeværelse af HCG an- DK 171928 B1 18 tigen.

Eksempel II

5 Bestemmelse af antistof

Antistofer over for Rubella-virus blev påvist på en måde som ovenfor beskrevet ved påvisning ved HCG antigen i Eksempel i. Mikrokugler med diameter 0,8 μ, som var blevet aktiveret med renset Rubella-antigen, blev 10 omsluttet i en afgrænset zone på Whatman GP/F glasfiberfilteret, indsat i et immunokoncentrationsapparat som vist i fig. 6. Som en negativ kontrol omsluttede man en gruppe af mikrokugler, dækket med ikke-antigen, i en nabozone på filteret.

15 100 yl af serum, som man på forhånd vidste inde holdt antistoffer til Rubella-virus, blev anbragt på et andet filter, præpareret som beskrevet ovenfor. Samtidig anbragte man 100 μΐ af senam, som man vidste ikke indeholdt antistoffer, på hvert filter sammen med 2 ml 20 10 mM Tris-pufret saltvand (pH 8,0) 100 μΐ enzymkonjugerede antistoffer mod human IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland) og lod dem reagere med human IgG, der havde dannet kompleks med Rubella-antigen, bundet til mikrokuglerne. Efter vask 25 med 2 ml 10 mM Tris-pufret saltvand (pH 8,0), hvorved ikke-bundet konjugat skulle fjernes, tilsatte man substrat, der passede til enzymmarkøren, for at bestemme tilstedeværelse af eventuelle komplekser af antigen-antistof.

30 Ved analysen med positiv serum opnåede man en blåfarvning i den zone på filteret, hvor mikrokugler, bundet til Rubella-antigen, blev omsluttet. (I den negative kontrolzone fremkom ingen farve). Det negative serum producerede ikke farvereaktion.

35 Det må bemærkes, at sensitiviteten af analyserne i Eksemplerne kan tilpasses, når man varierer rumfanget DK 171928 B1 19 og koncentrationen af mikrokuglerne eller inkubationstiden, koncentrationen af konjugat og andre parametre, som man normalt benytter i analysefremgangsmåder.

Claims (29)

1. Fastfasesystem til anvendelse ved en enkelt eller multipel ligand-receptor analyse til bestemmelse af en eller flere udvalgte analyter i en væskeformig prøve, kendetegnet ved, at fastfasesystemet 5 omfatter et porøst bærermateriale, der omslutter en eller flere grupper af mikrokugler, og hvori disse mikro-kugler i hver gruppe er bundet til en receptor, der kan indfange en bestemt ligand, og som er forskellig fra receptorer bundet til mikrokugler i eventuelle andre 10 grupper af mikrokugler.

2. Fastfasesystem ifølge krav l, kendetegnet ved, at bærermaterialet er en membran eller et filter, der kan omslutte mikrokugler, hvis størrelse er forligelig med porestørrelsen i bærermaterialet.

3. Fastfasesystem ifølge krav 2, kende tegnet ved, at mikrokuglerne udvælges, så deres størrelse maksimerer deres effektive overfladeareal inden i bærermaterialet.

4. Fastfasesystem ifølge krav 2, kende- 20 tegnet ved, at mikrokuglerne udvælges med en diameter på ca. 0,1-50 μ, fortrinsvis ca. 0,1-2,0 μ.

5. Fastfasesystem ifølge krav 1, kende tegnet ved, at mikrokuglerne omsluttes af bærermaterialet på en måde, der tillader deres mobilitet i bæ- 25 rermaterialet og forhindrer deres sammenklumpning eller vedhæftning.

6. Fastfasesystem ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mikrokuglerne eller hver gruppe af mikrokugler findes omsluttet i et afsondret område eller 30. afsondrede områder i bærermaterialet.

7. Fastfasesystem ifølge krav 1-6, kendetegnet ved, at i det mindste én gruppe mikrokugler er bundet til en receptor, der kan indfange en bestemt ligand; at i det mindste én yderligere gruppe mikrokug- 35 DK 171928 B1 ler er bundet til denne bestemte ligand eller en anden passende receptorsubstans som positiv kontrol ved bestemmelse af nævnte analyt; og/eller at i det mindste én yderligere gruppe mikrokugler er bundet til en substans, 5 der ikke er i stand til at indfange denne ligand, eller ikke er bundet til nogen komponent, som en negativ kontrol ved bestemmelse af nævnte analyt.

8. Fastfasesystem ifølge krav 2, kendetegnet ved, at membranen eller filteret er af et 10 materiale udvalgt blandt glasfibre, nylon eller keramiske materialer.

9. Fastfasesystem ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mikrokuglerne består af et polymermateriale, der kan bindes til receptoren, og hvilket po- 15 lymermateriale udvælges fortrinsvis blandt latex, poly-ethylen, polypropylen, polystyren og copolymere deraf, mest foretrukket latex.

10. Fastfasesystem ifølge krav l, kendetegnet ved, at ligand-receptor analysen er et im- 20 munassay.

11. Fastfasesystem ifølge krav 10, kendetegnet ved, at receptoren, bundet til mikrokuglerne eller i det mindste én gruppe af mikrokugler, er et antistof eller antigen, der kan indfange nævnte bestemte 25 ligand, fortrinsvis et monoklonalt antistof.

12. Fastfasesystem ifølge krav li, kendetegnet ved, at mikrokuglerne eller den i det mindste ene gruppe af mikrokugler udgøres af i det mindste to undergrupper af mikrokugler, til hvilke der er bundet 30 monoklonale antistoffer udvalgt, så de binder til ikke-vekselvirkende, forskellige bindingssteder på den bestemte ligand.

13. Fastfasesystem ifølge krav 1, kendetegnet ved, at analysen er et nukleinsyresonde- 35 assay, og hvor receptoren indeholder en nukleinsyrese-kvens, der er komplementær til en del af nukleinsyrese-kvensen hos den bestemte ligand. DK 171928 B1

14. Anvendelse af et fastfasesystem ifølge et eller flere af kravene 1-13 som en første porøs del i et apparat til anvendelse ved en ligand-receptor analyse til bestemmelse af i det mindste én udvalgt analyt i en 5 væskeformig prøve, idet apparatet yderligere omfatter en indretning i operationsmæssig forbindelse med ovennævnte første porøse del, der skal fremme strømning gennem denne af den væskeformige prøve og væskeformige reagenser benyttet ved analysen.

15. Anvendelse ifølge krav 14, kendeteg net ved, at nævnte indretning omfatter en anden absorberende del i forbindelse med ovennævnte første del på en måde, der tillader strømning af den væskeformige prøve og væskeformige reagenser benyttet ved analysen gen-15 nem første del og ind i denne anden del, denne anden del besidder en overflade, over hvilken første del anbringes, samt kapillarrør igennem sig, der i det væsentlige forløber vinkelret på omtalte overflade, disse kapilla-tor står i forbindelse med porerne i første del, hvorved 20 væske, der har gennemtrængt første del, vil trækkes ned i kapillarrørerne i anden del.

16. Anvendelse ifølge krav 14, kendetegnet ved, at ligand-receptor analysen er et nuklein-syresondeassay.

17. Anvendelse af et fastfasesystem ifølge et eller flere af kravene 1-13 i en ligand-receptor analysefremgangsmåde til bestemmelse af i det mindste én udvalgt analyt i en væskeformig prøve, hvor analysefremgangsmåden omfatter, at man: 30 a) anbringer den væskeformige prøve, som måske indeholder en bestemt ligand, på den første porøse del af et apparat som defineret i krav 14, b) tilsætter en opløsning af receptor-konjugat, der kan binde sig til liganden, og hvor receptor-kon-35 jugatet er mærket, så det kan påvises, for at forårsage dannelse af et kompleks mellem recep- DK 171928 B1 tor-konjugatet og liganden; og c) påviser en eventuel tilstedeværelse af receptor- konjugat bundet til den porøse del.

18. Anvendelse ifølge krav 17, kende-5 tegnet ved, at ligand-receptor analysen er et immunas s ay .

19. Anvendelse ifølge krav 17, kendetegnet ved, at receptoren er et allergen, liganden er et IgE antistof specifikt for dette allergen, og receptor- 10 konjugatet er et mærket anti-IgE antistof.

20. Anvendelse ifølge krav 17, kendetegnet ved, at analyten er en virus eller et antigen eller antistof associeret med denne virus.

21. Anvendelse ifølge krav 20, kendeteg- 15 net ved, at liganden udvælges blandt Rubella virus, Rota virus, adenovirus, respiratorisk syncitial virus, HTLV, hepatitis virus, hepatitis/A, hepatitis/B, hepatitis nonA nonB, influenza virus, cytomegalovirus eller herpes virus.

22. Anvendelse ifølge krav 17, kendetegnet ved, at analyten er en bakterie, svamp eller parasit eller et antigen eller antistof, associeret med denne bakterie, svamp eller parasit.

23. Anvendelse ifølge krav 22, kendeteg- 25 net ved, at analyten udvælges blandt gruppe A og B streptococcus, Neisseria gonorrhea, Trichomonas vaginalis, Candida albicans, Chlamydia trachomatis eller Hemophilus influenze.

24. Anvendelse ifølge krav 17, kendeteg-30 n e t ved, at analyten er en fysiologisk markørsubstans udvalgt blandt human choriogonadotropin, prostata sur phosphatase, prostataspecifikt antigen, α-fetoprotein, carcinoembryont antigen, luteiniseringshormon eller kreatinkinase isoenzym.

25. Anvendelse ifølge krav 17, kendeteg net ved, at prøven er serum, plasma, urin eller en anden biologisk substans. DK 171928 B1

26. Anvendelse ifølge krav 17, kendetegnet ved, at receptor-konjugatet er mærket med et enzym, og at påvisningstrinnet omfatter tilsætning af et passende substrat til den første porøse del med det 5 formål at frembringe en farveændring ved reaktion med enzymet, farveændringen påvises visuelt eller ved instrumenter.

27. Anvendelse ifølge krav 17, kendetegnet ved, at receptoren er et monoklonalt antistof 10 og receptor-konjugatet er et mærket monoklont antistof, receptoren og receptor-konjugatet udvælges, så de binder til ikke-vekselvirkende forskellige bindingssteder på den bestemte ligand.

28. Anvendelse ifølge krav 17, kendeteg- 15 net ved, at ligand-receptoranalysen er et nukleinsyre- sondeassay.

29. Anvendelse ifølge krav 28, kendetegnet ved, at receptoren er en nukleinsyrese-kvens, der er komplementær til en del af nukleinsyrese- 20 kvensen hos den bestemte ligand, og at receptor-konjugatet er en mærket nukleinsyresonde, der er komplementær til en anden del af nukleinsyresekvensen hos den bestemte ligand.