KR101856033B1 - 유도만능 줄기세포의 배양 용기 및 배양 방법 - Google Patents

유도만능 줄기세포의 배양 용기 및 배양 방법 Download PDF

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Abstract

유도만능 줄기세포의 배양방법 및 유도만능 줄기세포의 스페로이드를 형성하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일 양태에 따르면 유도만능줄기세포의 줄기세포능(stemness)의 특성이 향상될 수 있다.

Description

유도만능 줄기세포의 배양 용기 및 배양 방법 {Container and Method for culturing Undifferentiated Induced Pluripotent Stem Cells}
본 발명은 유도만능 줄기세포의 배양 용기, 유도만능 줄기세포의 미분화 배양 방법, 및 유도만능 줄기세포의 스페로이드(spheroid)를 형성하는 방법에 관한 것이다.
수의학 및 의학 등에서 다양한 용도로 사용되는 줄기세포는 지대한 관심을 받고 있다. 특히 세포 기반의 병들거나 손상된 조직의 치료와 같은 재생의학에서의 줄기세포의 적용은 더욱 주목을 끌고 있다. 재생의학의 발전과 성공을 위한 핵심은 안전하면서도 비용 효율이 높은 적절한 줄기세포의 공급원을 찾는 것이다.
이와 관련하여, 유도만능줄기세포 (induced Pluripotent Stem Cell: iPSC)가 줄기세포 치료제의 공급원으로서 각광받고 있다. 유도만능줄기세포는 이미 분화된 세포들을 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성(pluripotency)을 갖도록 유도된 세포를 말한다. 유도만능줄기세포는 역분화 유도인자들에 의해 분화된 세포를 재프로그램화(reprogramming)하여 얻어질 수 있으므로, 체세포 핵치환(somatic cell transfer) 없이 환자 면역 적합성 만능 세포주의 생성이 가능하다. 따라서 유도만능줄기세포는 환자의 세포에서 유래될 수 있어 임상에 적용 시 면역 거부반응을 피할 수 있다. 또한, iPSC는 난자나 배아를 사용하지 않기 때문에 생명윤리적 논란이나 종교적 비난이 없는 장점이 있다. 그러나 기존의 재프로그램화(reprogramming)에 의한 유도만능줄기세포의 제조방법은 제조 효율이 매우 낮다는 단점을 가지고 있으며, 역분화 유도 및 증식 과정에서 동물 유래의 지지세포(feeder cells)의 사용을 필요로 하므로, 유도만능줄기세포를 실제 임상에 적용하는데 있어서 안전성 측면에 한계가 있다. 따라서 유도만능줄기세포를 지지세포 없이도 미분화 상태에서 분화능을 유지하면서도 높은 생존능을 가지도록 배양하는 방법이 요구되는 실정이다.
이에 본 발명자들은 유도만능줄기세포의 증식 효율이 높은 배양 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 나노 구조체를 유도만능줄기세포의 배양에 이용할 경우, 세포의 생존능 뿐만 아니라 줄기세포능을 향상시킬 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
일 목적은 유도만능 줄기세포 배양용기를 제공하는 것이다.
다른 목적은 유도만능 줄기세포가 미분화 상태로 증식 효율이 높으며 우수한 줄기세포능을 갖게 되도록 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 목적은 유도만능 줄기세포의 스페로이드를 형성하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양태는 나노 구조체 어레이를 포함하는 유도만능 줄기세포 배양용기을 제공한다.
본 발명의 유도만능 줄기세포 배양용기는 나노 구조체 어레이를 포함한다.
본 발명에서 사용된, 용어 "나노 구조체"란 나노 (10-9) 스케일을 갖는 객체를 의미한다. 일반적으로 0.1 내지 100 나노 미터의 범위를 갖는 모든 구조를 포함하는 물체로서, '나노 구조물'이라는 용어로 대신할 수 있다. 상기 나노 구조체는 예를 들면, 나노 막대, 나노 튜브, 나노 벽, 나노컬럼 또는 나노컬럼일 수 있으며, 구체적으로는 나노컬럼일 수 있다. 용어 "나노컬럼"이란 나노미터 단위의 직경을 갖는 둥근 기둥 모양의 구조체를 의미하는 것으로, 상기 나노컬럼은 1 nm 미만의 직경을 가지는 것에서부터 수백 nm 직경을 가지는 것일 수 있다. 상기 나노컬럼의 상단은 평평한 형태를 가질 수 있다. 상기 평평한 형태로 인해 본 발명의 어레이 상의 나노컬럼은 세포막을 뚫지 않지 않고, 세포가 나노컬럼 상에서 존재할 수 있다. 이러한 점에서 상기 나노컬럼은 세포막을 뚫고 들어가는 성질을 이용하는 종래의 나노컬럼과 차이가 있다.
용어 "나노 구조체 어레이"란 다수 개의 나노 구조체가 일정한 규칙에 따르거나 또는 무작위로 배열되어 있는 것을 의미한다. 상기 나노 구조체 어레이는 예를 들면, 기판 상에 다수 개의 나노 구조체가 무작위 간격으로 이격하여 위치된 것일 수 있으며, 구체적으로 기판 상에 다수 개의 나노컬럼이 무작위 간격으로 이격하여 위치된 것일 수 있다. 상기 다수 개란 2개 이상을 의미한다. 따라서 상기 나노 구조체 어레이는 더욱 구체적으로 2개 이상의 나노컬럼이 기판 상에 무작위로 이격하여 배치되어 있는 것을 의미할 수 있다. 상기 나노컬럼은 기판 상에 수직으로 위치된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 나노컬럼이 유도만능 줄기세포의 배양에 영향을 주지 않는 임의의 각도로 기판 상에 위치할 수 있다.
본 발명의 나노 구조체 어레이에 배열된 나노컬럼의 길이는 1.5 ㎛ 이하일 수 있으며, 예를 들면 0.5 내지 1.5 ㎛, 0.5 내지 1.4 ㎛, 0.5 내지 1.3 ㎛, 0.5 내지 1.2 ㎛, 또는 0.5 내지 1.0 ㎛ 일 수 있다. 상기 나노컬럼의 길이는 더욱 구체적으로 0.5 내지 1.0 ㎛ 일 수 있다. 일 실시예에서 1.5 ㎛ 이하의 길이를 갖는 나노컬럼을 포함하는 배양용기가 더 긴 길이를 갖는 배양용기보다 많은 수의 유도만능 줄기세포의 스페로이드가 형성되는 것을 확인하였다.
상기 나노 구조체 어레이에서 상기 나노컬럼의 밀도는 예를 들면 150/100 μm2 이상, 200/100 μm2 이상, 250/100 μm2 이상, 300/100 μm2 이상, 350/100 μm2 이상, 400/100 μm2 이상, 450/100 μm2 이상, 500/100 μm2 이상 일 수 있다 (밀도 = 나노 컬럼 수/나노 어레이 면적). 또한 상기 나노컬럼의 밀도는 구체적으로 150/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 200/100 μm2 내지 1000/100 μm2 250/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 300/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 350/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 400/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 450/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 또는 500/100 μm2 내지 1000/100 μm2 일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 배양용기에 포함된 나노컬럼의 밀도가 높을 수록(예를 들면 150/100 μm2 이상) 유도만능 줄기세포의 스페로이드의 형태가 보다 구형이면서, 콜로니 직경이 커지는 것을 확인하였다. 또한 나노컬럼의 밀도가 커질수록 낮은 나노컬럼의 밀도를 갖는 배양 용기 또는 플랫 배양용기(나노컬럼 미포함 배양용기) 보다 200 ㎛ 보다 높은 직경을 갖는 스페로이드가 더 많이 생성되는 것을 확인하였다.
또한 상기 나노 구조체는 보다 구체적으로 0.5 내지 1.5 ㎛의 나노컬럼의 길이를 가지며, 150/100 μm2 내지 1000/100 μm2 (나노 컬럼 수/나노 어레이 면적)의 밀도를 갖는 것일 수 있다.
상기 나노컬럼은 세포와 접촉하는 영역, 즉 나노컬럼의 탑(top) 부분이 평평한 형태를 가질 수 있다. 이에 따라 상기 나노 컬럼 어세이는 세포를 관통하지 않으며, 유도만능 줄기세포 간의 상호작용을 강화시킬 수 있다.
상기 나노컬럼의 직경은 50 내지 500nm, 60 내지 400m, 70 내지 300nm, 100 내지 300nm, 100 내지 250nm, 또는 100 내지 200nm일 수 있다.
상기 나노 구조체 어레이는 배양용기의 모든 면에 위치할 수 있으며, 구체적으로는 배양용기의 바닥 면에 위치할 수 있다.
상기 나노 구조체의 재질은 세포독성을 나타내지 않는 재질로서 예를 들면, 실리콘(Si), ZnO, GaAs, InP, InAs, Ni, Pt, Au, SiO2, TiO2, 탄소 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 이루어진 것일 수 있으며, 구체적으로는 실리콘일 수 있다.
용어 "유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)"는 분화된 세포 (예를 들어, 체세포)로부터 역분화되어 얻어진 다능성(pluripotency)을 갖는 세포를 가리키는 것으로, '역분화 줄기세포'라고도 지칭된다. 본 발명에서 유도만능 줄기세포는 예를 들면 인간을 포함한 포유류로부터 유래한 체세포를 이용하여 제작된 것일 수 있으며, 구체적으로 인간의 체세포에 역분화 기술을 이용하여 제작된 것일 수 있다. 역분화를 위한 만능 인자는 예를 들면 Oct4, Sox, Klf, Myc, Lin28, Nanog, 또는 이의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배양 용기에 포함된 나노구조체 어레이는 화학적 작용기를 갖도록 표면이 개질된 것일 수 있다. 예를 들면 상기 나노 구조체 어레이는 양으로 하전된 아민기가 표면에 형성되도록 화합물로 코팅될 수 있다. 구체적으로, 상기 나노 구조체 어레이는 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS)로 코팅될 수 있다.
또한 상기 배양 용기는 유도만능 줄기세포의 증식력 또는 생존력을 향상시키기 위한, 플라스마 처리, 오존 처리 또는 기타 화학물질의 코팅 등의 추가적인 처리가 된 것일 수 있다.
본 발명의 유도만능 줄기세포 배양 용기는 유도만능 줄기세포를 피더층 없이 미분화 상태로 배양하기 위한 것일 수 있다. 상기 유도만능 줄기세포의 미분화 상태 배양은 유도만능 줄기세포가 분화되지 않고, 다능성(pluripotency) 또는 줄기세포능(stemness)을 유지한 상태로 배양되는 것을 의미한다. 또한 상기 배양용기는 유도만능 줄기세포의 다능성 또는 줄기세포능을 향상시키기 위한 것일 수 있다
일 실시예에서 본 발명의 배양 용기에서 배양된 유도만능 줄기세포는 줄기세포능이 향상되었으며, 구형 콜로니 내의 세포사(cell death)가 감소할 수 있다. 용어, "줄기세포능(stemness)"은 자기복제능력을 가지면서 두 가지 이상의 세포로 분화할 수 있는 체세포와 구분되는 줄기세포의 특성을 나타내는 용어로, 세포분열을 통한 우수한 자기복제능력 및 다양한 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 모두 갖는 줄기세포의 특징을 나타낸다. 따라서 본 발명의 배양용기에 배양된 유도만능 줄기세포는 향상된 줄기세포능을 가질 수 있어 세포치료제의 용도로 더욱 적합할 수 있다.
또한 상기 유도만능 줄기세포 배양 용기는 유도만능 줄기세포의 스페로이드를 형성하기 위한 것일 수 있다.
용어 "유도만능 줄기세포의 스페로이드(spheroid)"는 유도만능줄기세포의 집합체로서, 분화되지 않은 유도만능 줄기세포들이 치밀하게 모여 형성된 구형의 세포 집단을 의미한다. 용어 '스페로이드'는 '구형(spherical) 콜로니'와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
또한 상기 유도만능 배양 용기는 유도만능 줄기세포 간의 상호작용을 높이기 위한 것일 수 있다. 본 발명의 배양용기는 유도만능 줄기세포 간의 상호작용 (cell-to-cell interaction)을 증진시켜, 크고 치밀한 유도만능 줄기세포 스페로이드의 형성을 가능하게 한다.
또한 본 발명의 유도만능 줄기세포 배양 용기에서 상기 나노 구조체 어레이는 재활용될 수 있다. 일 실시예에서 나노 구조체 어레이에서 iPSC를 배양하여 스페로이드를 형성한 후, 이를 세척한 다음, 상기 나노 구조체 어레이에서 새로운 iPSC를 배양하였을 때, 크고 조밀한 iPSC 구형 콜로니가 잘 형성되는 것을 확인하였다.
또한 본 발명의 유도만능 줄기세포 배양용기는 대면적 세포 배양용기 일 수 있다. 일 실시예에서 100mm 직경의 배양 디쉬에 맞춰 스케일 업된 나노컬럼 어레이 상에서 유도만능 줄기세포의 미분화 배양 및 스페로이드 형성이 잘 이루어지는 것을 확인하였다. 따라서 세포 치료제 용도로서 많은 양을 필요로 하는 줄기세포, 특히 iPSC 배양에 적합하다.
다른 양태는 나노 구조체 어레이 상에서 유도만능 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 유도만능 줄기세포를 미분화 상태로 배양하는 방법을 제공한다.
상기 배양 방법에 있어서, 상기 나노 구조체는 상기 배양용기에서 설명한 바와 같다.
구체적으로 상기 나노 구조체는 나노컬럼일 수 있다. 상기 나노컬럼의 길이는 1.5 ㎛ 이하일 수 있으며, 예를 들면 0.5 내지 1.5 ㎛, 0.5 내지 1.4 ㎛, 0.5 내지 1.3 ㎛, 0.5 내지 1.2 ㎛, 또는 0.5 내지 1.0 ㎛ 일 수 있다. 상기 나노컬럼의 길이는 더욱 구체적으로 0.5 내지 1.0 ㎛ 일 수 있다. 또한 상기 어레이에서 상기 나노컬럼의 밀도는 예를 들면 150/100 μm2 이상, 200/100 μm2 이상, 250/100 μm2 이상, 300/100 μm2 이상, 350/100 μm2 이상, 400/100 μm2 이상, 450/100 μm2 이상, 500/100 μm2 이상 일 수 있다 (밀도 = 나노 컬럼 수/나노 어레이 면적). 또한 상기 나노컬럼의 밀도는 구체적으로 150/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 200/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 250/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 300/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 350/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 400/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 450/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 또는 500/100 μm2 내지 1000/100 μm2 일 수 있다.
상기 유도만능 줄기세포의 배양은 나노구조체 어레이를 포함하는 배양용기에서 배양하는 것일 수 있다. 상기 배양은 통상의 기술자에게 알려진 유도만능 줄기 세포 배양 방법에 의해 수행되거나, 통상의 기술자가 자명하게 도출할 수 있는 변형을 갖는 일반적인 유도만능 줄기세포의 배양 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면 본 발명의 나노구조체 어레이를 포함하는 배양용기에서 유도만능 줄기세포의 배지를 넣고, 유도만능 줄기세포를 씨딩하여 일정 기간 증식시키는 것일 수 있다. 상기 배지는 본 발명이 포함되는 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 유도만능 줄기세포의 배지일 수 있다. 또한 상기 배양은 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지되었거나, 용이하게 도출가능한 유도만능 줄기세포를 배양하는 기법, 예를 들면 배양 순서, 배지 성분 조정, 및 배지 첨가물 추가 등을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 유도만능 줄기세포를 미분화 상태로 배양하는 방법은 피더층 없이 유도만능 줄기세포를 미분화 상태로 유지하면서 배양하는 것일 수 있다. 용어 "피더층 (feeder layer)"은 줄기세포의 증식을 유도할 목적으로 함께 배양하는 세포층을 의미한다. 상기 피더층을 이용한 배양방법은 줄기세포를 미분화 배양하기 위해 통상적으로 사용되고 있으며, 일반적으로 마우스의 섬유아세포를 이용한다. 그러나 마우스의 섬유아세포를 이용한 배양 방법은 이종 감염 문제로 인해 인간 유도만능 줄기세포를 임상에 이용하는데 위험성이 있을 수 있다. 따라서 상기 방법은 종래의 미분화 상태의 줄기세포 배양방법에서 나타날 수 있는 이종 감염 문제의 단점을 해결할 수 있다.
본 발명의 배양 방법에 따라 배양된 증시된 유도만능 줄기세포는 줄기세포능이 향상될 수 있다. 또한 구형 콜로니(spherical colony) 내의 세포사(cell death)가 감소하고 생존능이 증가할 수 있다.
일 실시예에서 본 발명의 배양 방법에 따라 나노컬럼 구조체 어레이 상에서 지지세포 없이 배양된 유도만능 줄기세포의 형태와 다능성 마커의 발현을 확인한 결과, 통상적으로 이용하는 배양용기인 페트리 디쉬 및 구조체가 형성되지 않은 Si-웨이퍼와 비교하여, 본 발명은 조밀하게 구형의 콜로니를 형성할 수 있었으며, 보다 높은 수준으로 Nanog의 발현률을 유지하는 것을 확인하였다. 또한 유도만능 줄기세포의 세포 생존능이 개선되는 것을 확인하였다.
또한 본 발명의 배양방법에 따라 배양된 유도만능 줄기세포를 분화시켰을 때, 삼배엽층으로 잘 분화되는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 유도만능 줄기세포 배양방법은 미분화 상태 및 다능성을 유지함과 동시에 분화능도 잘 유지시키면서 유도만능 줄기세포를 배양하게 할 수 있다.
또 다른 양태는 나노 구조체 어레이 상에서 유도만능 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 유도만능 줄기세포의 스페로이드를 형성하는 방법을 제공한다.
본 발명의 유도만능 줄기세포의 스페로이드 형성 방법에 있어서, 상기 나노 구조체 어레이는 상기 배양 용기에서 설명한 바와 같다.
구체적으로 상기 나노 구조체는 나노컬럼일 수 있다. 상기 나노컬럼의 길이는 1.5 ㎛ 이하일 수 있으며, 예를 들면 0.5 내지 1.5 ㎛, 0.5 내지 1.4 ㎛, 0.5 내지 1.3 ㎛, 0.5 내지 1.2 ㎛, 또는 0.5 내지 1.0 ㎛ 일 수 있다. 상기 나노컬럼의 길이는 더욱 구체적으로 0.5 내지 1.0 ㎛ 일 수 있다. 또한 상기 어레이에서 상기 나노컬럼의 밀도는 예를 들면 150/100 μm2 이상, 200/100 μm2 이상, 250/100 μm2 이상, 300/100 μm2 이상, 350/100 μm2 이상, 400/100 μm2 이상, 450/100 μm2 이상, 500/100 μm2 이상 일 수 있다 (밀도 = 나노 컬럼 수/나노 어레이 면적). 또한 상기 나노컬럼의 밀도는 구체적으로 150/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 200/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 250/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 300/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 350/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 400/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 450/100 μm2 내지 1000/100 μm2, 또는 500/100 μm2 내지 1000/100 μm2 일 수 있다.
본 발명의 유도만능 줄기세포의 스페로이드의 형성 방법에 따라, 유도만능 줄기세포는 나노 구조체 어레이 상에서 배양됨으로써, 세포간의 상호작용이 강화하게 되고, 이는 스페로이드 형성에 영향을 미칠 수 있다.
일 실시예에서 본 발명의 방법에 따라 형성된 유도만능 줄기세포의 스페로이드는 다른 방법과 비교하여 각 스페로이드가 더 큰 직경 및 보다 구형의 형태를 갖는 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 방법에 따라 형성된 유도만능 줄기세포의 스페로이드는 다른 방법에 비해 200 μm 이상의 직경을 갖는 스페로이드의 수가 증가하는 것을 확인하였다.
상기 방법에 따라 형성된 유도만능 줄기세포의 스페로이드 내의 유도만능 줄기세포는 강화된 다능성을 가질 수 있다. 일 실시에에서 상기 방법에 따라 형성된 유도만능 줄기세포의 스페로이드의 다능성 발현 마커 (예를 들면, Oct-4, 또는 Sox-2, 등)의 수준이 페트리 디쉬 및 평편한 Si 기판에서 배양된 유도만능 줄기세포보다 높은 것을 확인하였다.
또한 일 실시예에서 형성된 스페로이드 유래의 유도만능 줄기세포를 분화시켰을 때, 삼배엽층의 마커가 모두 발현하는 것을 확인함에 따라 본 발명의 형성된 스페로이드 내의 유도만능 줄기세포의 분화능이 유지되는 것을 확인하였다.
일 양상에 따라 배양된 유도만능 줄기세포는 줄기세포능(stemness)의 특성이 향상되고, 유도만능 줄기세포의 스페로이드의 직경 및 수가 증가할 수 있다. 또한 유도만능 줄기세포의 스페로이드 내 세포사가 감소하며 세포의 생존능이 증가할 수 있다. 따라서 본 발명은 유도만능 줄기세포의 배양에 유용하게 활용할 수 있다. 또한 상기 배양 용기는 재활용이 가능하며 대면적으로 세포 배양이 가능하여, 세포 치료제 용도로서 많은 양을 필요로 하는 유도만능 줄기세포의 배양 용기로서 적합하다.
도 1은 Si 웨이퍼 및 3개의 상이한 길이 (short, medium 및 long)를 갖는 나노컬럼 어레이의 SEM 이미지이다, 기준자(Scale bar): 1 ㎛.
도 2는 3개의 상이한 길이 (short, medium 및 long)를 갖는 나노컬럼 어레이 상에서 배양된 유도만능 줄기세포의 구형 콜로니 형성 결과를 나타낸 것으로, (a)는 는 AF-코팅 플레이트 (plate), Si 웨이퍼 및 나노컬럼 어레이(vSNA)에서 3일 동안 배양한 iPSC 구형 콜로니를 CFDA로 염색한 이미지이며 (기준자: 200 ㎛), (b)는 다양한 표면에서 배양된 유도만능 줄기세포의 200 ㎛ 이상의 직경을 갖는 구형 콜로니의 정량 결과를 나타내는 그래프이다, * P < 0.05.
도 3의 (a)는 Si 웨이퍼 및 4개의 상이한 밀도를 갖는 나노컬럼 어레이 (vSNA1, vSNA2, vSNA3 및 vSNA4)의 SEM 이미지이다, 기준자: 1 μm. (b)는 배양 3일 차에 Si 웨이퍼 및 상기 나노컬럼 어레이에 의해 생산된 iPSC 구형 콜로니의 형태를 보여주는 것으로, 형광 이미지를 위해 CFDA로 세포를 염색한 결과이다, 기준자: 200 ㎛. (c)는 다양한 표면에서 배양된 유도만능 줄기세포의 구형 콜로니 (직경 200 ㎛ 이상)의 정량 결과를 보여준다, * P < 0.05.
도 4는 AF-코팅 플레이트, Si-웨이퍼 및 나노컬럼 어레이에서 배양된 각 유도만능 줄기세포의 3차원적 이미지를 보여준다.
도 5는 상이한 표면에서 생산된 iPSC 구형 콜로니의 특성 규명 결과를 나타낸다. (a)는 배양 5일 차 염색된 세포의 공초점 현미경 이미지로, 스페로이드 내 살아있는 세포는 CFDA (녹색)로 염색되었고, 죽은 세포는 PI (적색)로 염색되었다, 기준자: 100 ㎛. (b)는 5일 동안 페트리 디쉬 및 나노컬럼 어레이에서 생산된 구형 콜로니의 직경 분포를 나타낸다, 기준자, 200 ㎛. ‡ P < 0.005. (c)는 5일 동안 페트리 디쉬 및 나노컬럼 어레이에서 생산된 iPSC 스페로이드의 E-카데린 및 N-카데린 발현의 면역블롯 결과이다.
도 6은 다양한 표면에서 배양된 iPSC의 부착 특성을 나타낸다. (a)는 24시간 동안 다양한 표면에서 배양된 iPSC의 면역형광 이미지로, 국소 접착 빈쿨린 (녹색) 및 세포골격 액틴 필라멘트 (적색)를 공초점 현미경으로 동시에 시각화하였다. 핵은 Hoechst 33342 (청색)로 염색되었다, 기준자: 10 ㎛. (b)는 세포 부착의 정량화 결과로, iPSC를 24시간 동안 다양한 표면에서 배양하였으며, 나노컬럼 어레이 상의 부착 세포의 형광이미지를 1로 설정하였다. 기준자: 200 ㎛. ‡ P < 0.005.
도 7은 다양한 표면에서 5일 동안 배양된 iPSC 내 다능성 마커의 발현 수준을 나타낸다. (a)는 iPSC의 AP 활성화이다. *, P < 0.05; ‡ P < 0.005. (b)는 다능성 줄기세포 마커(Nanog, Oct-3/4, 및 Sox-2)의 반정량 RT-PCR 분석결과이다. (c)는 다능성 줄기세포 마커(Nanog, Oct-3/4, 및 Sox-2)의 면역블롯 분석결과이다.
도 8의 (a)는 iPSC에서 SSEA-1 발현 FACS 분석 결과를 보여준다. (b)는 천연 줄기세포 마커 (Rex-1 및 Stella)의 반정량 RT-PCR 분석 결과이다.
도 9는 나노컬럼 어레이에서 배양된 iPSC의 분화능을 보여준다. (a)는 페트리 디쉬 및 나노컬럼 어레이에서 5일 동안 배양후 분화하는 iPSC에서 삼배엽의 마커에 대한 반정량 RT-PCR 분석 결과를 나타낸다: 외배엽 (Nestin 및 TP63/TP73L), 내배엽 (AFP, GATA-4, PDX-1/IPF1, 및 HNF-3b/FoxA2), 및 중배엽 (Brachyury) (b)는 다양한 표면에서 iPSC를 14일 동안 배양 후 다능성 줄기세포 마커(Nanog 및 Oct-3/4)의 반정량 RT-PCR 분석 결과를 나타낸다.
도 10은 페트리 디쉬 및 나노컬럼 어레이에서 14일 동안 배양된 iPSC의 삼배엽층의 면역형광이미지를 나타낸다: 공초점 현미경에 의해 외배엽 (백색; Tuj1), 내배엽 (녹색: AFP) 및 중배엽 (적색: SMA)을 시각화하였으며, 핵은 Hoechst 33342 (청색)으로 염색하였다, 기준자: 50 mm.
도 11은 본 발명에 따른 나노컬럼 어레이가 iPSC 세포 배양용기로서 재활용 가능하고, iPSC의 대량 배양에 적용가능하다는 것을 나타내는 도면이다. A는 형광현미경 및 DIC 이미지로서 나노컬럼 어레이 상에서 iPSC를 배양후 워싱하여 형성된 콜로니를 제거한 다음, 동일 나노컬럼 어레이 상에서 새로운 세포로 배양하여 형성된 iPSC 스페로이드를 보여주며, B는 100mm 배양 디쉬에 놓여진 대규모로 제작된 나노컬럼 어레이의 이미지를 보여준다, 기준자 200 mm.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
방법
1. 유도만능줄기세포(iPSC) 생성
독시사이클린(DOX) 유도성 OSKM 인자(Oct3/4, Sox2, Klf4 alc c-Myc)를 함유한 이차 마우스 배아 섬유아세포를 제작하였다. 리프로그래밍(reprogramming)을 위해, 이차 MEF(3-4 계대)를 MEF 배지 (10% FBS, 0.1 mM NEAA, 및 2 mM 글루타맥스가 보충된 DMEM)를 넣은 젤트렉스(Geltrex)-코팅 배양 디쉬에 1.5-2×104 cells/cm2의 세포 밀도로 플레이팅하였다. 다음날 (0일차)에 독시사이클린 (Sigma-Aldrich; 2-8 ㎍/mL)을 최초로 처리하고, 13일 차까지 계속 처리하였다. 추가 MEF 배지에서 세포를 며칠 더 배양시키고, 3일 동안 초기 배지 (RepM-Ini; 10% 녹-아웃 혈청 대체물(knock-out serum replacer), 5% FBS, 0.1 mM NEAA, 2 mM 글루타맥스, 및 0.055 mM β-머캅토에탄올이 보충된 녹아웃 DMEM)에서 리프로그래밍하도록 변경시켰다. 증식을 위해 Nanog-GFP 양성 콜로니를 골라냈다. 이 세포들을 1,000 units/ml의 백혈병 억제 인자 (LIF) 및 2i (ERK1/2 및 글리코겐 신타제 키나제 3 억제제)를 함유한 RepM-Ini에서 유지시켰다.
2. 나노컬럼 어레이의 제조
2.1. 나노컬럼 어레이의 제조
실리콘 기판(Si-wafer) (100, p-type, boron doped, 1-30 Ω cm-1, Taewon Scientific, South Korea)을 아세톤 및 이소프로필 알코올에서 5분 동안 초음파에 의해 세척하고, 질소 분사에 의해 건조시켰다. 이 기판을 5분 동안 산소 플라즈마 처리(Femto Science, South Korea)에 의해 활성화시킨 다음, 고분자전해질 다중층의 LbL 증착을 위해, 활성화된 실리콘 기판을 폴리양이온 용액(2.0 M NaCl 수용액 15ml에 0.03g 폴리(알릴아민 히드로클로라이드 용해됨) (PAH, Mw 15 000, Aldrich)에 5분 동안 침지시켰다. 그 후 1분 동안 탈이온수에 침지시킨 다음, 폴리음이온 용액 (0.03 g 폴리(소듐 4-스티렌술포네이트) (PSS, Mw 70 000, Aldrich)가 15 ml 2.0 M NaCl 수용액에 용해됨)에 5분 동안 침지시켰다. 탈이온수로 린싱한 후, 기판이 5개의 순서 (PAH-PSS-PAH-PSS-PAH)의 지정된 고분자전해질 다중층으로 코팅될때까지 상기 LbL 과정을 반복하였다. 금 표면위에 패턴을 만들기 위해 PS 나노스피어의 희석된 콜로이드로 실리콘 기판을 코팅하였다. 다음, PS 나노스피어가 없는 부분은 반응 이온 에칭을 이용하여 제거하였다. 20 nm-두께의 금속성 필름을 실버 샷(1-5 mm, 99.9%, Alfa Aesar)의 진공 열 증착에 의해, PS-나노스피어-장식된 실리콘 기판 상에 증착시키고, 이후 PS 나노스피어 제거를 위해 1분 동안 에탄올에 소니케이션하였다. 이 단계에서 기판을 실리콘 에칭 용액에 담근 후 수직 나노컬럼이 형성되는 나노크기의 홀을 갖는 무작위 어레이를 포함하는 얇은 금 필름으로 균등하게 덮었다. 탈이온수로 철처히 세척후, 금으로 덮인 기판을 바로 히드로플루오르산 (4.6 M) 및 과산화수소 (0.44 M) 의 에칭 혼합 용액에 담궜다. 이후, 기판을 탈이온수로 3회 철저하게 린싱하고 질소 블로잉으로 건조시켰다. 마지막으로, 결과로 얻은 기판을 끓는 왕수에 10분 동안 담궈서 잔여 은 플레이크를 제거하고, 탈이온수로 3회 린싱하고, 질소 블로잉에 의해 건조시켰다.
2.2. 나노컬럼 어레이( vSNA )의 패턴 형성
음으로 패턴화된 vSNA 기판을 위해, 전-세정된 실리콘 기판을 고분자전해질 증착 및 뒤이은 실리콘 에칭 전에 포토레지스트 패턴으로 부동화시켰다. 간략하게, 포지티브 포토레지스트 (GXR601, Microchem, USA) 층을 헥사메틸 디실라잔 (HMDS)-처리된 실리콘 기판 상에 4000 rpm에서 35초 동안 스핀 코팅시키고, 95 ℃에서 60초 동안 가벼운 열처리하였다. 미리 정해진 포토마스크를 통한 UV 노출 후, 기판을 30초 동안 디벨로퍼 용액(MIF 300, Microchem, USA)에 담근 다음 탈이온수로 린싱하고, 질소 블로잉으로 건조시켰다. 양으로 패턴화된 vSNA 기판을 위해, 비-패턴화된 vSNA 기판을 유사한 방식으로 포토레지스트에 의해 부통화시켰다. 이후, 비-매장된 vSNA만을 포토레지스트-부통화 vSNA 기판을 0.1 M KOH 용액에 담금으로써 화학적으로 제거하였다.
2.3. 나노컬럼 어레이( vSNA )의 표면 변형
적절한 세포 부착을 위해, 양으로 하전된 아민기로 표면을 커버하도록 vSNA 및 Si 웨이퍼를 (3-아미노프로필)트리메톡시실란 (APTMS) (Sigma-Aldrich)으로 기능화시켰다. vSNA 및 Si 웨이퍼에 산소 플라즈마를 10분 동안 처리함으로써 표면의 히드록실기를 노출시켰다. 촉매로서 아세트산을 이용하여, 메탄올에서 APTMS에 의해 30분 동안 실온에서 실란화를 수행하였다. 처리된 기판을 메탄올 및 물로 세척한 후, 질소 가스로 건조시켰다. 임의의 오염을 피하기 위해, 세포 씨딩(seeding) 전에 기판을 둘베스코 인산 완충 식염수(DPBS)로 3회 린싱(rinsing)하였다.
3. CFDA 에 의한 세포 염색
약 8 ×103 개의 iPSC 세포를 AF(부착인자 (attachment factor))-코팅 플레이트, Si 웨이퍼, 및 vSNA (모두 0.5 ×0.5 cm2의 면적으로 동일함) 상에 씨딩한 후, 배양 3일 차에 1 ㎛ CFDA (Sigma-Aldrich)로 염색하였다 CFDA 용액을 세포-플레이팅된 기판을 포함한 배지에 첨가한 후, 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 세포-플레이팅된 기판을 PBS로 세척한 후, 이미지화하였다. 형광 현미경(Axioskop2 FS plus; Carl Zeiss, Oberkochen, 독일)을 이용하여 형광 이미지를 얻었다. 염색된 세포를 528 ±19 nm (여기 490 ±10 nm)에서 수집된 형광 이미지에 의해 시각화하였다.
4. MTS 어세이
세포 생존능을 CellTiter 96 Aqueous One solution 세포 증식 어세이 (MTS 어세이, Promega)를 이용하여 제조사가 제공한 프로토콜에 따라 측정하였다. 간략하게, 1일 차에 다양한 기판 상의 세포를 신선한 배지 중 20% MTS 용액을 갖는 48-웰 플레이트에 놓고, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 흡광도의 변화를 490 nm에서 분광 플레이트 리더기 (spectrophotometric plate reader)로 측정하였다.
5. CFDA /PI 염색
약 8 ×103 개의 iPSC를 페트리 디쉬 및 vSNA (모두 0.5 ×0.5 cm2)에 각각 씨딩한 다음, 5일 동안 인큐베이션하였다. 세포 응집물(aggregate)을 AF-코팅 디쉬에 플레이팅한 후, 그들이 디쉬에 부착되도록 밤새 인큐베이션하였다. 1 mM CFDA 및 1 mM 프로피디움 아이오디드 (PI) 용액을 배지에 첨가한 후, 10분 동안 인큐베이션하였다. 이미지화 전에 세포-플레이팅된 기판을 PBS로 2회 세척하였다. 공초점 레이저-현미경(confocal laser-scanning microscope) (FV1000; Olympus, Hamburg, Germany)을 이용하여 형광 이미지를 얻었다.
6. 면역블롯팅 ( Immunoblotting )
세포를 수거하고 버퍼 (40 mM Tris-HCL, pH 8.0, 120 mM NaCl, 0.1% Non-idet-P40, 100 mM 페닐메틸술포닐 플루오리드, 1 mM 소듐 오쏘바나데이트, 프로테아제 억제제 칵테일)로 용해시켰다. 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의해 분리시킨 다음, PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 각각의 멤브레인을 0.1% Tween-20을 함유한 Tris-완충 식염수 중 5% 탈지분유로 블로킹시키고, 일차 항체로 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 페록시다제-접합 이차 항체로 디벨롭핑시킨 후, 강화된 화학발광(chemiluminescence)(ATTO KOREA, Korea)을 이용하여 시각화하였다.
7. SSEA -1의 FACS 분석
iPSC 구형 콜로니를 Accutase (Life Science)에 의해 단일 세포로 작제하고, PBS로 린싱한 후, 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 0.2% 트리톤 X-100으로 10분동안 투과시켰다(permeabilize). 소 혈청 알부민 (BSA)에 30분 동안 노출시킨 후, 1시간 동안 실온에서 SSEA-1에 대한 마우스 다클론 항체 (1:100 희석; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)로 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 세척하고, 마우스 면역글로불린 M (1:200 희석; Molecular Probes)에 대한 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트-접합 염소 항체로 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후 평균 형광 밀도의 측정을 위해 세포 (시료 당 20,000개)를 guava easyCyteTM Flow Cytometer (Millipore)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다.
8. 분화도 분석
분화도 분석을 위해, iPSC 스페로이드를 나노컬럼 어레이 (vSNA) 및 페트리 디쉬에서 5일 동안 배양된 iPSC 스페로이드를 AF-코팅 디쉬로 옮겼다. 이 세포들을 10% FBS가 보충된 EB 배지에서 (15% 녹아웃 혈청 대체제, 0.1 mM NEAA, 및 2 mM 글루타맥스로 보충된 녹아웃 DMEM)에서 2주 동안 배양하였다. 배지를 이틀마다 교체하였다. 총 RNA를 정제하고 유전자 발현을 전술한 반정량 RT-PCR을 수행함으로써 분석하였다.
9. E- 카데린 , F- 액틴 , 및 빈쿨린의 면역형광 염색
시료를 PBS로 1회 세척한 후, PBS 중 4% 포름알데히드 용액으로 20분 동안 고정시킨 다음, PBS로 3회 세척하였다. 0.2% 트리톤 X-100으로 10분 동안 투과화(Permeabilization)를 수행하고, PBS로 3회 세척하였다. 시료를 실온에서 30분 동안 PBS 중 2% BSA로 블로킹하고, 항-빈쿨린 일차 항체 (Sigma-Aldrich; 1:100)로 60분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 Alexa-488-접합 이차 항체(Invitrogen; 1:200)로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. TRITC-접합 팔로이딘 (Sigma-Aldrich; 25 mg/ml)을 F-액틴 시각화를 위해 첨가하였다. 각 단계를 2% BSA를 함유한 PBS 중에서 수행하고, 단계 사이에 세포를 동일 용액으로 5분 동안 3회 세척하였다. 핵의 인테그리티를 Hoechst (Invitrogen) 염색에 의해 확인하였다. 공초점 주사 레이저 현미경 (FV1000; Olympus, Hamburg, 독일)을 이용하여 모든 이미지를 얻었다.
10. 세포 부착 어세이
약 8 ×103 iPSC를 AF-코팅 디쉬, Si 웨이퍼 및 vSNA에 (모두 0.5 ×0.5 cm2) 각각 씨딩한 후 24 시간 동안 인큐베이션하였다. CFDA 용액을 세포-플레이팅된 기판을 포함하는 배지에 첨가한 후, 10분 동안 인큐베이션하였다. 세포-플레이팅된 기판을 PBS로 2회 세척하였다. 형광 현미경(Axioskop2 FS plus; Carl Zeiss, Oberkochen, 독일)을 이용하여 형광 이미지를 얻었다. 염색된 세포를 528 ±19 nm (여기 490 ±10 nm)에서 수집된 형광 이미지에 의해 시각화하였다.
결과
1. 나노컬럼 어레이 상에서의 형성된 iPSC 의 스페로이드 특성 규명
vSNA에서 배양된 마우스 iPSC의 특성에 대한 나노컬럼 어레이의 영향을 조사하기 위해, 상이한 6개 종류의 vSNA를 제조하였다. 제조된 vSNA에 대한 각각의 물리적 특성을 하기 표 1에 나타냈다. 제조한 vSNA, AF-코팅 플레이트, 페트리 디쉬, 및 Si(silicon) 웨이퍼에 상기에서 제조된 마우스 iPSC를 씨딩한 후 배양하였다.
vSNA의 물리적 특성
직경
(bottom surface, nm)		 밀도
(per 100 μm2)		 길이
(μm)
Short 170 ±4 155 ±5 1.0 ±0.010
Medium 160 ±4 163 ±24 1.8 ±0.080
Long 161 ±7 110 ±4 4.0 ±0.36
vSNA1 170 ±3 29±2 0.60 ±0.010
vSNA2 165 ±4 155 ±5 1.0 ±0.010
vSNA3 117 ±13 396 ±35 0.70 ±0.030
vSNA4 136 ±8 710 ±2 0.80 ±0.040
먼저, SNA의 나노컬럼의 길이가 iPSC의 형태에 영향을 미치는지 여부를 조사하였다. 주사전자현미경(scanning electron microscope: SEM) 이미지로부터 vSNA의 평균 길이를 측정하였으며, 그 결과 'Short vSNA'의 나노컬럼의 길이는 약 1.0 ㎛, 'Medium vSNA'의 나노컬럼의 길이는 약 1.8 ㎛, 'Long vSNA'의 나노컬럼의 길이는 4.0 ㎛으로 각각 측정되었다. 상기 세 종류 vSNA의 평균 직경 및 밀도는 각각 약 160 nm 이하, 및 150/100 μm2 (나노컬럼 수/어레이 면적) 이하의 평균 직경을 가지며, 유사한 밀도를 가졌다. 각각의 vSNA에서 3일 동안 배양한 iPSC를 세포 표면 면적을 생존능 마커 카르복시플루오레세인 디아세테이트 (CFDA)로 세포를 염색함으로써 관찰하였다. 그 결과는 도 2a에서 확인할 수 있는 바와 같이, Si 웨이퍼에서 배양된 iPSC는 부착 인자(attachment factor: AF)-코팅 플레이트에서 관찰된 바와 유사한, 평평한 콜로니를 형성한 반면, vSNA에서 배양된 iPSC는 모두 구형 형태를 가졌으며, 많은 수의 콜로니를 형성하였다. 또한 Long vSNA 및 Medium vSNA 보다 Short vSNA에서 200 ㎛ 이상의 직경을 갖는 구형의 콜로니들이 더 많이 발견되었다 (도 2b). 이는 기판에서 수직으로 형성된 짧은 길이의 나노컬럼이 구형 콜로니 형성에 우호적 환경을 제공한다는 것을 시사한다.
또한 iPSC의 구형 콜로니의 형성에 대한 vSNA 밀도가 미치는 효과를 조사하였다. vSNA의 평균 밀도를 SEM 이미지로부터 측정하였다 (도 3). 이 vSNA들은 유사한 직경 및 길이를 가졌다 (≤1.0 μm). 낮은 밀도의 vSNA (< 100 vSNs/100 ㎛2; vSNA1) 보다 높은 밀도의 vSNA (> 100 vSNs/100 ㎛2; vSNA2, vSNA3, 및 vSNA4)에서 크고 (≥ 200 ㎛ 직경) 보다 수많은 iPSC 구형 콜로니들을 생성되었음을 확인하였다 (도 3). iPSC 구형 콜로니의 크기 및 수는 높은 밀도의 vSNA들 (vSNA2, vSNA3, 및 vSNA4) 에서는 큰 차이가 없었다. 이러한 결과들은 vSNA가 직접 콜로니의 형태에 영향을 미칠 수 있으며, vSNA의 짧은 길이 및 고밀도가 iPSC 구형 콜로니 형성에 우호적인 조건을 제공한다는 것을 시사한다.
고밀도 vSNA (vSNA1)에서 배양된 iPSC 구형 콜로니의 3D 이미지를 3D 공초점 이미지를 이용하여 분석하였다. vSNA에서 배양된 iPSC는 콜로니의 수 및 크기를 증가시켰고, 구형의 3D 구조를 생성하였다. 또한 매우 치밀하게 패킹될때까지 계속해서 자라났다. 반면, AF-코팅 플레이트 및 Si 웨이퍼에서의 세포는 기판의 표면 부착과 함께 평평한 콜로니를 형성하였다 (도 4). 이러한 결과로부터, vSNAs가 평평한 기판을 갖는 배양용기와 비교하여 유도만능 줄기세포의 스페로이드 형성을 증진시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한 150/100 μm2 이상의 높은 밀도 및 1.5 ㎛ 이하의 짧은 길이의 나노컬럼 어레이가 보다 크고 구형의 스페로이드 생성을 유도하는 환경을 제공할 수 있다는 것을 확인하였다.
2. 나노컬럼 어레이에서 배양된 iPSC 의 콜로니 형태 분석
MTS 어세이를 이용하여 인큐베이션 24시간 후 vSNA에서 배양된 iPSC의 생존능을 평가하였다. MTS는 미토콘드리아에서 비색 대사 산물, 포르마잔으로 환원되는 테트라졸륨 화합물이다. 따라서 세포에 의해 생산된 포르마잔의 양은 살아있는 세포 수에 비례한다. 도 5a에서 나타난 바와 같이, 각각의 배양 기판(AF-코팅 플레이트, 페트리 디쉬, Si 웨이퍼, 및 vSNA4)에서의 세포 생존능은 유사하였다. 이러한 데이터는 vSNA가 세포의 생존능을 변경하지 않고 독성이 없는 것을 나타낸다.
또한 CFDA/PI 염색에 의해 종래 방법(페트리 디쉬에서의 서스펜션 배양)에 의해 생산된 세포 응집물과 비교하여 5일 동안 vSNA에서 배양된 구 형태의 콜로니의 세포사(cell death)의 비율을 조사하였다. 살아있는 세포는 광범위한 CFDA 표지화를 보여준 반면, 죽은 세포는 CFDA 염색이 되지 않았으며, PI 염색에 의해 시각화하였다. 흥미롭게도, 페트리 디쉬에 의해 생산된 세포와 비교하여, CFDA 염색은 vSNA에서 배양된 구형 콜로니에서 강화되었으며, PI 염색은 감소하였다 (도 5b).
아울러, vSNA에서 5일 동안 배양된 구형 콜로니의 직경을 측정하였다. 도 5 b에서 나타낸 바와 같이, vSNA에서 배양된 iPSC는 페트리 디쉬에서 배양된 세포들보다 큰 직경을 가지고, 보다 콤팩트한 스페로이드(spheroid)를 생산하였다. 이러한 결과들은 vSNA가 스페로이드 배양 동안 세포사를 감소시킨다는 것을 입증한다. 또한 이들 데이터는 iPSC가 장기간 동안 vSNA 상에서 유지될 수 있다는 것이며, 또한 vSNA가 iPSC의 세포 대 세포의 상호작용을 증진시킨다는 것을 시사한다.
3. vSNA 에서 배양된 iPSC 다능성 마커 발현 분석
vSNA에서의 구형의 콜로니 형성이 iPSC의 다능성에 영향을 미치는지 여부를 조사하였다. 조사를 위해 136nm 이하의 직경, 0.8㎛ 이하의 길이, 및 710 vSNs/100 ㎛2 이하의 밀도를 갖는 vSNA를 이용하였다. 알칼라인 포스파타제 (AP)는 뉴클레오티드, 단백질, 및 알칼로이드로부터 인산기를 제거하는 가수분해효소이다. AP는 배아 줄기세포(ESC) 및 iPSC와 같은 기타 다능성 줄기세포 유형에서 높은 수준으로 발현되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 다양한 배양 기판(AF-코팅 플레이트, 페트리 디쉬, Si 웨이퍼, 및 vSNA)에서 5일 동안 배양 후, iPSC의 AP 활성을 분석하였다. 도 6a에서 확인할 수 있는 바와 같이, AP 활성은 다른 배양 표면보다 vSNA에서 배양된 iPSC에서 강화되었다.
또한, 다능성-관련 전사 인자인, Nanog, Oct-3/4, 및 Sox-2의 mRNA 발현을 반정량(semiquantitative) RT-PCR에 의해 분석하였다. AF-코팅 플레이트, 페트리 디쉬, 또는 Si 웨이퍼에서 배양된 iPSC와 비교하여, vSNA에서 배양된 iPSC는 Nanog의 유의한 상향 조절을 나타냈다 (도 7).
다른 기판 보다 vSNA에서 배양된 iPSC에서 보다 Nanog의 단백질 발현 수준이 높은지 여부를 확인하기 위해 면역블롯을 수행하였다 (도 7(b-c)). Gata4 발현 (원시 내배엽 마커)은 5일 동안 다양한 배양 기판에서 배양된 iPSC에서 검출되지 않았다 (데이터 미표시). 또한 유세포 분석을 이용하여 표면 항원 SSEA-1의 발현의 변화를 분석한 결과, SSEA-1 발현은 AF-코팅 플레이트 및 페트리디쉬와 비교하여 vSNA에서 배양된 iPSC에서 강화되었다. 특이하게, Si 웨이퍼 상에서 배양된 iPSC는 vSNA에서 관찰된 바와 유사한 정도의 SSEA-1 발현을 나타냈다 (도 8(a)).
다음으로 vSNA에서 배양된 세포가 다능성을 나타내는 유전자를 활성하는지 여부를 평가하였다. 도 8(b)에서 나타난 바와 같이, Stella 및 Rex1 발현은 vSNA에서 배양된 iPSC에서 감소하지 않았으며, 이는 iPSC의 미분화된 상태의 유지를 시사한다.
4. vSNA 에서 배양된 iPSC 의 분화능 분석
vSNA4에서 배양된 iPSC의 분화 잠재성을 인 비트로 분화 어세이를 통해 조사하였다. 전사물 발현 분석을 통해 삼배엽에 대한 초기 계통 마커(lineage marker) 발현의 유도를 확인하였다 (도 9(a); 표지된 내배엽, 외배엽, 및 중배엽). 그 결과 vSNA에서 배양된 iPSC는 페트리 디쉬와 유사한 정도로 분화 잠재성을 유지하고 있었으며, 다능성 마커 발현 정도 또한 유사하였다 (도 7). 또한 분화 마커인 Tuj1 (외배엽), AFP (내배엽) 및 SMA (중배엽)의 단백질 면역형광 이미지를 통해 삼배엽층을 확인하였다. 도 10은 페트리 디쉬 및 나노컬럼 어레이에서 14일 동안 배양된 iPSC의 삼배엽층의 면역형광이미지를 각 분화 마커를 통해 나타낸 것이다.
이러한 결과들은 vSNA에서 배양된 iPSC가 삼배엽을 대표하는 세포들로 분화할 수 있는 능력을 보유하고 있다는 것을 입증한다. 또한 이들 데이터는 vSNA 상에서의 배양 시스템이 iPSC의 다능성을 지지한다는 것을 나타낸다.
5. vSNA 에서 배양된 iPSC 의 세포 골격 재배열 및 세포-세포 상호작용
가용성 분화 인자의 첨가 없이 vSNA에서의 구형의 세포 응집물을 관찰하였다. 표면과 세포의 상호작용을 평가하기 위해, 세포 형태 유지 및 부착된 표면에서의 이동에 중요한 세포골격 액틴의 분포 및 국소접착(focal adhesion)을 조사하였다. 도 5a는 다양한 기판에서 필라멘터스(filamentous) 액틴 (F-액틴) 및 빈쿨린의 면역형광 이미지를 보여준다. F-액틴의 발현은 Si 웨이퍼 및 AF-코팅 플레이트에서 iPSC의 세포 돌기에서 국부화(localization)을 보여주었다(도 5a). 대조적으로, 세포 돌기는 vSNA의 세포에서 발견되지 않았다 (도 5a). 그러나, 다양한 배양 기판에서, 국소접착 성분 빈쿨린에 대한 면역염색은 높은 수준의 세포질 염색을 보여주었으나, 국부화의 차이를 나타내지 않았다 (도 5a). 이러한 결과들은 세포의 접착을 약화시키는 vSNA가 자발적인 구형의 세포 응집물을 유도한다는 것을 나타낸다. 또한, 세포-세포 접착 단백질 E-카데린의 발현은 페트리 디쉬의 iPSC 스페로이드보다 vSNA에서의 iPSC 스페로이드에서 보다 높았다 (도 5b). 반면, N-카데린 발현은 페트리 디쉬보다 vSNA의 iPSC 스페로이드에서 감소하였다 (도 5b). 이는 vSNA가 보다 콤팩트한 스페로이드의 형성을 유도하는 것에 의해 세포-세포 상호작용을 강화시킨다는 것을 나타낸다. 이러한 결과들로부터 증가된 E-카데린이 SNA에서의 iPSC의 다능성 유지와 연관될 가능성이 있을 것으로 보인다.
2.6. vSNA 의 재활용 가능성 및 대규모 세포 배양능 확인
도 11의 A는 나노컬럼 어레이 상에서 iPSC를 배양후 워싱하여 형성된 콜로니를 제거한 다음, 동일 나노컬럼 어레이 상에서 새로운 세포로 배양하여 형성된 iPSC 스페로이드에 대한 형광현미경 및 DIC 이미지이다. 배양에 사용하였던 vSNA 상에서 새로운 iPSC의 스페로이드가 형태적 특성을 유지한 채로 반복적으로 형성될 수 있음을 보여주었다.
도 11의 B는 직경이 100mm인 배양 디쉬에 놓여질 수 있도록 스케일-업된 나노컬럼 어레이에 대한 사진 및 상기 나노컬럼 어레이 상에서 배양된 iPSC 콜로니의 현광현미경 이미지이다. 모든 나노컬럼 어레이 상에서 iPSC가 구형의 형태로 잘 형성된 것을 확인할 수 있었다.
이에 따라 본 발명에 따른 나노컬럼 어레이는 대규모 iPSC의 배양에 활용될 수 있으며, 또한 재활용될 수 있음을 확인하였다.

Claims (15)

  1. 기판 상에 다수 개의 나노컬럼이 무작위 간격으로 이격하여 위치된 길이가 0.5 내지 1.5 ㎛인 나노컬럼의 길이 및 150/100 μm2 내지 1000/100 μm2 (나노컬럼 수/어레이 면적)의 나노컬럼의 밀도를 갖는 나노 구조체 어레이를 포함하고, 상기 나노 구조체 어레이는 재활용되는 것인 유도만능 줄기세포 배양 용기.
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  5. 청구항 1에 있어서, 상기 배양 용기는 유도만능 줄기세포를 피더층 없이 미분화 상태로 배양하기 위한 것인 유도만능 줄기세포 배양 용기.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 배양 용기는 유도만능 줄기세포의 스페로이드를 형성하기 위한 것인 유도만능 줄기세포 배양 용기.
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  8. 기판 상에 다수 개의 나노컬럼이 무작위 간격으로 이격하여 위치된 길이가 0.5 내지 1.5 ㎛인 나노컬럼의 길이 및 150/100 μm2 내지 1000/100 μm2 (나노컬럼 수/어레이 면적)의 나노컬럼의 밀도를 갖는 나노 구조체 어레이 상에서 유도만능 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 나노 구조체 어레이는 재활용되는 것인, 유도만능 줄기세포를 미분화 상태로 배양하는 방법.
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  12. 기판 상에 다수 개의 나노컬럼이 무작위 간격으로 이격하여 위치된 길이가 0.5 내지 1.5 ㎛인 나노컬럼의 길이 및 150/100 μm2 내지 1000/100 μm2 (나노컬럼 수/어레이 면적)의 나노컬럼의 밀도를 갖는 나노 구조체 어레이 상에서 유도만능 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 나노 구조체 어레이는 재활용되는 것인, 유도만능 줄기세포의 스페로이드(spheroid)를 형성하는 방법.
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