CN103966160B - 无机纳米材料层状双氢氧化物在小鼠胚胎干细胞培养中的应用 - Google Patents
无机纳米材料层状双氢氧化物在小鼠胚胎干细胞培养中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种无机纳米材料层状双氢氧化物在小鼠胚胎干细胞培养中的应用。利用纳米层状双氢氧化物能够在不添加LIF因子的情况下，促进各多能性基因的表达，抑制细胞分化，并且处理后的细胞仍然具有向三个胚层分化的潜能。纳米层状双氢氧化物具有良好的生物相容性，低细胞毒性，易于接触细胞表面等特点，成本低廉，材料合成便捷，作用效果佳，为胚胎干细胞研究带来广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及纳米一种无机纳米材料层状双氢氧化物在小鼠胚胎干细胞培养中的应用。
背景技术
胚胎干细胞（ESC）来源于哺乳动物囊胚的内细胞团，具有无限的自我更新能力，这种细胞是多能干细胞，能够分化成为三胚层中任何一种细胞类型。因为ESC的这些特性，使得ESC成为当今生命科学研究的热点。目前，ESC在治疗糖尿病、心肌疾病、神经退化性疾病、骨关节疾病等方面取得了突破性的进展。虽然ESC细胞的相关研究成果在临床医学领域展现出了广阔的应用前景，但无论是胚胎干细胞还是成体干细胞，其基础研究都与临床应用相距甚远，仍然存在很多难以解决的问题，例如：胚胎干细胞培养过程工序繁琐，存在动物组分且成本较高等，是目前所要解决的重大问题。
纳米技术和干细胞的相互结合很有可能会带来重大的突破。目前纳米技术在干细胞研究中的应用主要包括：（1）基于磁纳米技术的干细胞分离纯化,（2）纳米颗粒用于干细胞的标记和示踪，（3）纳米材料作为生物分子的载体调控干细胞增殖与分化，（4）纳米生物传感器监测干细胞生理功能，（5）纳米科技应用于干细胞治疗，（6）三维纳米结构用于干细胞的增殖与分化。尤其是纳米材料的结构和组成对干细胞自我更新、增殖和分化产生的影响，使纳米科技与干细胞的结合成为再生医学和材料科学之间出现的一项新领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种无机纳米材料层状双氢氧化物在小鼠胚胎干细胞培养中的应用。
本发明提出的无机纳米材料层状双氢氧化物在小鼠胚胎干细胞培养中的应用，具体步骤如下：
(1)利用水热法，制备纳米层状双氢氧化物（SLW-1）的制备；
(2)通过差速贴壁法将正常培养的小鼠胚胎干细胞去除饲养层MEF细胞，按照2×104个/孔接种在铺有1%明胶的六孔板上，采用完全培养基培养24小时后，去除LIF因子，并在培养液中加入不同浓度的步骤(1)得到的SLW-1悬浮液培养4天；所述完全培养基的原料组成为：高糖DMEM；15％胎牛血清；0.1mmol／L非必需氨基酸；2mmol／L谷氨酰胺；0．1mmol／Lβ-巯基乙醇；1000U／ml白血病抑制因子；
(3)通过碱性磷酸酶染色、检测多能性基因以及内胚层、中胚层和外胚层三个胚层的标志分子的表达量，显示SLW-1能够促进mESC的自我更新力，抑制其分化；经SLW-1处理后的mESC能够形成拟胚体，并向三个胚层进行分化，说明该细胞仍具有多潜能性。
本发明中，所述SLW-1的粒径为20-200nm。
本发明中，所述SLW-1的有效浓度为20µg/ml-100µg/ml。
本发明的有益效果在于：层状双氢氧化物（SLW-1）作为一种新型的可控制的纳米材料近年来在各个领域都受到了广泛的关注，它具有良好的生物相容性，低细胞毒性以及具有较高的 zeta电位，这使得其更易于接触细胞表面。本发明在LIF因子去除的情况下运用SLW-1在一定程度上维持细胞自我更新，成本低廉，材料合成便捷，作用效果佳。
附图说明
图1为SLW-1透射电镜图。
图2为不同浓度SLW-1处理5天后的mESC碱性磷酸酶染色。其中：A为加入LIF，B为去除LIF，C为SLW-1加入后终浓度达到37.5µg/ml，D为 SLW-1加入后终浓度达到75µg/ml，ESLW-1加入后终浓度达到375µg/ml，F为 SLW-1加入后终浓度达到75µg/ml。
图3为Realtime PCR检测小鼠胚胎干细胞多潜能性和自我更新转录因子的表达。
图4为免疫细胞化学染色检测多潜能基因的表达。其中：A为 DAPI荧光染色标记细胞核，B为 Nanog荧光染色标记因子，C为DAPI荧光染色标记细胞核，D为 Oct4 荧光染色标记因子， E 为DAPI荧光染色标记细胞核， F为 Sox2荧光染色标记因子。
图5为免疫细胞化学染色检测分化后的拟胚体三个胚层的标志。其中：A为 内胚层荧光染色标记细胞核，B为内胚层特异性荧光标记，C为中胚层荧光染色标记细胞核，D为中胚层特异性荧光标记，E为外胚层荧光染色标记细胞核，F为外胚层特异性荧光标记。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。
实施例1：纳米层状双氢氧化物（SLW-1）的制备
配制Mg(NO3)2·6H2O (1.536 g, 0.006mol) 和Al(NO3)3·9H2O ( 0.75 g, 0.002mol)的金属混合盐溶液共40ml，水作为溶剂，其中Mg/Al的摩尔比1:1，配制0.016mol NaOH溶液。N2气氛下，将金属盐混合溶液加入到剧烈搅拌NaOH溶液中，所得悬浮液转至水热合成釜，100℃ 18h后取出，从而获得粒径大小为100-120nm的SLW-1悬浮液，真空干燥箱干燥后称重。合成的SLW-1通过透射电镜观察（如图1），具有较好的晶体结构，均呈六边形。
实施例2：小鼠胚胎干细胞mESC的培养及纯化。
原代获取小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），培养至3-5代，经10µg/ml丝裂霉素C处理3小时后作为饲养层细胞，1周内使用。mESC采用完全培养基：高糖DMEM，15%胎牛血清， 0.1mmol/L非必需氨基酸，2 mmol/L谷氨酰胺，0.1 mmol/Lβ-巯基乙醇，1000U/ml0.1白血病抑制因子，正常培养2-3天后，加胰蛋白酶（0.25%）-EDTA（0.02%）消化细胞，培养液中和胰酶后将细胞置于包被0.1%的培养皿上，静置培养30分钟。吸取未贴壁的mESC计数后，按照2×104个/孔接种在铺1%明胶包被的六孔板上，培养24小时后，更换为无LIF因子的培养液培养，并加入不同剂量的由实施例1获得的SLW-1纳米微粒，共培养5天，每日更换含新鲜培养液。
实施例3：SLW-1对mESC自我更新的影响
（1）碱性磷酸酶（ALP）活性检测
未分化的胚胎干细胞的一个重要生物学特征是能够合成高浓度的碱性磷酸酶(AP)，通过碱性磷酸酶可以反映出胚胎干细胞的分化状态。对由实施2获得的mESC固定后进行碱性磷酸酶染色。如图2所示，从形态上，去除LIF因子的mESC已完全分化，而加入SLW-1的mESC能够抑制分化；SLW-1终浓度37.5µg/ml和75µg/ml处理后的mESC碱性磷酸酶染色强阳性，而去除LIF因子的mESC呈弱阳性。说明SLW-1能够促进mESC的自我更新能力。
（2）Realtime PCR检测小鼠胚胎干细胞多潜能性和自我更新转录因子的表达。Nanog、Oct4、Sox2、Rex、Dppa3这些转录因子对ES细胞基因转录具有重要的调控作用，对保持ES细胞多潜能性和自我更新至关重要。实时定量荧光PCR能够检测这些转录因子在mRNA水平上的表达情况，反映细胞所处的状态。如图3所示，SLW-1能够上调这五个基因的表达水平，促进了小鼠胚胎干细胞自我更新能力。
（3）免疫细胞化学在细胞水平上检测多潜能基因的表达。选用Rabbit anti-nanog, Rabbit anti-Oct4, Rabbit anti-sox2作为1抗，Fluorescein Conjugated GoatAnti-Rabbit Secondary Antibody 作为2抗，DAPI进行细胞核染色，荧光显微镜观察染色情况。如图4所示，与对照组相比，SLW-1能够促进nanog,oct4和sox2在细胞水平的表达。
实施例4：SLW-1处理后的mESC多潜能性的评估
对SLW-1处理后的mESC所形成的拟胚体进行三个胚层分子标志的免疫细胞化学染色。SLW-1处理后的mESC能够成功地形成拟胚体，并进一步贴壁分化。拟胚体贴壁分化后4天后，通过免疫细胞化学对三个胚层标志进行免疫细胞化学检测。选用的胚层标志为：AFP（甲胎蛋白）作为内胚层标志，α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白）作为中胚层标志，nestin(巢蛋白)作为外胚层标志。如图5所示，形成的拟胚体能够向三个胚层进行分化，说明 SLW-1处理过的mESC具有多潜能性。
Claims (2)
1.一种无机纳米材料层状双氢氧化物在小鼠胚胎干细胞培养中的应用，其特征在于具体步骤如下：
(1)利用水热法，制备纳米层状双氢氧化SLW-1；配制Mg(NO3)2·6H2O 1.536 g,0.006mol 和Al(NO3)3·9H2O 0.75 g, 0.002 mol的金属混合盐溶液共40ml，水作为溶剂，配制0.016mol NaOH溶液；N2气氛下，将金属混合盐溶液加入到剧烈搅拌NaOH溶液中，所得悬浮液转至水热合成釜，在100℃下18h后取出，获得粒径大小为100-120nm的SLW-1悬浮液；
(2)通过差速贴壁法将正常培养的小鼠胚胎干细胞去除饲养层MEF细胞，按照2×104个/孔接种在铺有1%明胶的六孔板上，采用完全培养基培养24小时后，去除LIF因子，并在培养液中加入不同浓度的步骤(1)得到的SLW-1悬浮液培养4天；所述完全培养基的原料组成为：高糖DMEM；15％胎牛血清；0.1mmol／L非必需氨基酸；2mmol／L谷氨酰胺；0．1mmol／Lβ-巯基乙醇；1000U／ml白血病抑制因子；
(3)通过碱性磷酸酶染色、检测多能性基因以及内胚层、中胚层和外胚层三个胚层的标志分子的表达量，显示SLW-1能够促进mESC的自我更新力，抑制其分化；经SLW-1处理后的mESC能够形成拟胚体，并向三个胚层进行分化，说明该细胞仍具有多潜能性。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述SLW-1的有效浓度为20µg/ml-100µg/ml。
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