CN111763655B - 一种促进干细胞扩增的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞领域，提供一种促进干细胞扩增的方法，用于解决干细胞增殖效率低的问题。本发明提供的一种促进干细胞扩增的方法，包括：采用差速贴壁法去除正常培养的胚胎干细胞的饲养层MEF细胞；将干细胞按照1×104个/孔接种到多孔板上，在扩增培养基中培养；所述扩增培养基包括：高糖DMEM20~25质量份，非必需氨基酸10~12质量份，谷氨酰胺0.5~0.7质量份，β‑巯基乙醇0.001~0.05质量份，白血病抑制因子1000U/mL，纳米层状双氢氧化物0.1~0.3质量份。纳米层状层氢氧化物可以在一定程度上维持细胞自我更新，成本低廉，材料合成便捷，可以有效的促进干细胞扩增。

Description

一种促进干细胞扩增的方法
技术领域
本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种促进干细胞扩增的方法。
背景技术
胚胎干细胞来源于哺乳动物囊胚的内细胞团，具有无限自我更新的能力，这种细胞是多能干细胞，能够分化为三胚层中任何一种细胞类型。由于干细胞的这些特性，因此胚胎干细胞成为当今生命科学研究领域的热点。目前，胚胎干细胞在多种疾病的治疗方面取得了突破性的进展，但由于胚胎干细胞培养过程存在工序过于繁琐、存在动物成分且成本较高等问题，限制着胚胎干细胞研究的进一步发展。
纳米技术同干细胞技术结合很有可能会带来重大的突破，纳米材料的结构和组成对干细胞的自我更新、增殖和分化产生的影响，使得通过纳米技术解决胚胎干细胞增殖问题成为了可能。
发明内容
本发明解决的技术问题为解决干细胞增殖效率低的问题，提供一种促进干细胞扩增的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种促进干细胞扩增的方法，包括：
采用差速贴壁法去除正常培养的胚胎干细胞的饲养层MEF细胞；
将干细胞按照1×104个/孔接种到多孔板上，在扩增培养基中培养；
所述扩增培养基包括：高糖DMEM20~25质量份，非必需氨基酸10~12质量份，谷氨酰胺0.5~0.7质量份，β-巯基乙醇0.001~0.05质量份，白血病抑制因子1000U/mL，纳米层状双氢氧化物0.1~0.3质量份。
纳米层状双氢氧化物具有良好的生物相容性，低细胞毒性以及具有较高的zeta电位，更易同细胞接触。
纳米层状层氢氧化物可以在一定程度上维持细胞自我更新，成本低廉，材料合成便捷，可以有效的促进干细胞扩增。
优选地，所述扩增培养基包括：高糖DMEM 22~25质量份，非必需氨基酸11~12质量份，谷氨酰胺0.6~0.7质量份，β-巯基乙醇0.02~0.05质量份，白血病抑制因子1000U/mL，纳米层状双氢氧化物0.2~0.3质量份。
优选地，所述扩增培养基包括：高糖DMEM 22质量份，非必需氨基酸11质量份，谷氨酰胺0.6质量份，β-巯基乙醇0.02质量份，白血病抑制因子1000U/mL，纳米层状双氢氧化物0.2质量份。
优选地，所述纳米层状双氢氧化物的制备方法为：取硝酸镍10~15质量份，硝酸铝20~40质量份，氢氧化钠60~80质量份，碳酸钠10~20质量份，氧化石墨烯5~10质量份，硝酸锌1~5质量份，尿素20~30质量份；
将硝酸镍和硝酸铝溶解于1000~1200质量份的去离子水中得到混合盐溶液，将氢氧化钠和碳酸钠溶解于800~1000质量份的去离子水中得到混合碱液，将氧化石墨烯分散到1000~1200质量份的去离子水中，得到分散液；
将混合碱液同分散液混合，超声分散1~2h，再加入混合盐溶液，超声分散10~20min，得到混合液；将混合液在80~100摄氏度下晶化24~36h，冷却至室温，过滤，洗涤至洗液呈中性，在40~50摄氏度下烘干得到复合物
将硝酸锌溶解于1000质量份去离子水中，加入尿素，搅拌均匀，加入复合物，超声分散30~60min，得到悬浮液，将悬浮液升温至80~100摄氏度，反应12~24h，冷却至室温得到固体产物
将固体产物在氮气气氛以600~700摄氏度焙烧6~10h，然后冷却至室温，得到纳米层状双氢氧化物。将氧化石墨烯和锌纳米颗粒掺杂进纳米层状双氢氧化物中，可以进一步促进干细胞扩增。
优选地，所述硝酸镍12~15质量份，硝酸铝30~40质量份，氢氧化钠70~80质量份，碳酸钠15~20质量份，氧化石墨烯8~10质量份，硝酸锌4~5质量份，尿素25~30质量份。
优选地，所述硝酸镍12质量份，硝酸铝30质量份，氢氧化钠70质量份，碳酸钠15质量份，氧化石墨烯8质量份，硝酸锌4质量份，尿素25质量份。
优选地，所述氧化石墨烯为改性氧化石墨烯。改性的氧化石墨烯可以更进一步的促进干细胞扩增。
优选地，所述改性氧化石墨烯的制备方法为：取钛酸正丁酯20~30质量份，无水乙醇100~120质量份，硝酸铈0.5~1质量份，硝酸镍0.5~0.8质量份，氧化石墨烯40~60质量份，硼氢化钠20~30质量份；
将钛酸正丁酯加入无水乙醇中不断搅拌，再通过浓硝酸调节pH2~3，继续搅拌5~7h，得到第一溶液；
将硝酸铈溶于10倍量的去离子水中，得到第二溶液；
将第一溶液和第二溶液混合，搅拌均匀后加入硝酸镍，缓慢搅拌至获取透明的溶胶，陈化后得到凝胶，将凝胶烘干，研磨成粉末后在500~600摄氏度下焙烧2~5h，得到改性二氧化钛；
将氧化石墨烯分散到20倍量的去离子水中，超声30~60min，得到氧化石墨烯分散液，将改性二氧化钛加入到氧化石墨烯分散液中，再加入硼氢化钠，搅拌均匀，超声1~3h，自然冷却至室温，将产物过滤、干燥，得到改性氧化石墨烯。采用纳米钛对石墨烯进行改性，可以提高纳米层状双氢氧化物促进干细胞增殖的效果。
优选地，所述钛酸正丁酯25~30质量份，无水乙醇110~120质量份，硝酸铈0.8~1质量份，硝酸镍0.6~0.8质量份，氧化石墨烯45~60质量份，硼氢化钠22~30质量份。
优选地，所述钛酸正丁酯25质量份，无水乙醇110质量份，硝酸铈0.8质量份，硝酸镍0.6质量份，氧化石墨烯45质量份，硼氢化钠220质量份。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：纳米层状层氢氧化物可以在一定程度上维持细胞自我更新，成本低廉，材料合成便捷，可以有效的促进干细胞扩增；采用钛改性的氧化石墨烯可以更进一步的促进细胞的扩增。
具体实施方式
以下实施列是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
一种促进干细胞扩增的方法，包括：
采用差速贴壁法去除正常培养的胚胎干细胞的饲养层MEF细胞；
将干细胞按照1×104个/孔接种到多孔板上，在扩增培养基中培养；
所述扩增培养基包括：高糖DMEM 22质量份，非必需氨基酸11质量份，谷氨酰胺0.6质量份，β-巯基乙醇0.02质量份，白血病抑制因子1000U/mL，纳米层状双氢氧化物0.2质量份。所述纳米层状双氢氧化物的制备方法为：取硝酸镍12质量份，硝酸铝30质量份，氢氧化钠70质量份，碳酸钠15质量份，氧化石墨烯8质量份，硝酸锌4质量份，尿素25质量份；
将硝酸镍和硝酸铝溶解于1100质量份的去离子水中得到混合盐溶液，将氢氧化钠和碳酸钠溶解于900质量份的去离子水中得到混合碱液，将氧化石墨烯分散到1100质量份的去离子水中，得到分散液；
将混合碱液同分散液混合，超声分散1.5h，再加入混合盐溶液，超声分散10~20min，得到混合液；将混合液在90摄氏度下晶化26h，冷却至室温，过滤，洗涤至洗液呈中性，在45摄氏度下烘干得到复合物
将硝酸锌溶解于1000质量份去离子水中，加入尿素，搅拌均匀，加入复合物，超声分散35min，得到悬浮液，将悬浮液升温至90摄氏度，反应18h，冷却至室温得到固体产物
将固体产物在氮气气氛以650摄氏度焙烧80h，然后冷却至室温，得到纳米层状双氢氧化物。所述氧化石墨烯为改性氧化石墨烯。所述改性氧化石墨烯的制备方法为：取钛酸正丁酯25质量份，无水乙醇110质量份，硝酸铈0.8质量份，硝酸镍0.6质量份，氧化石墨烯45质量份，硼氢化钠220质量份；
将钛酸正丁酯加入无水乙醇中不断搅拌，再通过浓硝酸调节pH2~3，继续搅拌6h，得到第一溶液；
将硝酸铈溶于10倍量的去离子水中，得到第二溶液；
将第一溶液和第二溶液混合，搅拌均匀后加入硝酸镍，缓慢搅拌至获取透明的溶胶，陈化后得到凝胶，将凝胶烘干，研磨成粉末后在550摄氏度下焙烧3h，得到改性二氧化钛；
将氧化石墨烯分散到20倍量的去离子水中，超声40min，得到氧化石墨烯分散液，将改性二氧化钛加入到氧化石墨烯分散液中，再加入硼氢化钠，搅拌均匀，超声1~3h，自然冷却至室温，将产物过滤、干燥，得到改性氧化石墨烯。
纳米层状双氢氧化物具有良好的生物相容性，低细胞毒性以及具有较高的zeta电位，更易同细胞接触。纳米层状层氢氧化物可以在一定程度上维持细胞自我更新，成本低廉，材料合成便捷，可以有效的促进干细胞扩增。将碳纳米管掺杂进纳米层状双氢氧化物中，可以进一步促进干细胞扩增。改性的碳纳米管可以更进一步的促进干细胞扩增。对纯化的碳纳米管改性，可以提高纳米层状双氢氧化物促进干细胞增殖的效果。
实施例2
一种促进干细胞扩增的方法， 包括：
采用差速贴壁法去除正常培养的胚胎干细胞的饲养层MEF细胞；
将干细胞按照1×104个/孔接种到多孔板上，在扩增培养基中培养；
所述扩增培养基包括：高糖DMEM20质量份，非必需氨基酸10质量份，谷氨酰胺0.5质量份，β-巯基乙醇0.001质量份，白血病抑制因子1000U/mL，纳米层状双氢氧化物0.1质量份。所述纳米层状双氢氧化物的制备方法为：取硝酸镍10质量份，硝酸铝20质量份，氢氧化钠60质量份，碳酸钠10质量份，氧化石墨烯5质量份，硝酸锌1质量份，尿素20质量份；
将硝酸镍和硝酸铝溶解于1000质量份的去离子水中得到混合盐溶液，将氢氧化钠和碳酸钠溶解于800质量份的去离子水中得到混合碱液，将氧化石墨烯分散到1000质量份的去离子水中，得到分散液；
将混合碱液同分散液混合，超声分散1h，再加入混合盐溶液，超声分散10min，得到混合液；将混合液在80摄氏度下晶化24h，冷却至室温，过滤，洗涤至洗液呈中性，在40摄氏度下烘干得到复合物
将硝酸锌溶解于1000质量份去离子水中，加入尿素，搅拌均匀，加入复合物，超声分散30min，得到悬浮液，将悬浮液升温至80摄氏度，反应12h，冷却至室温得到固体产物
将固体产物在氮气气氛以600摄氏度焙烧6h，然后冷却至室温，得到纳米层状双氢氧化物。所述氧化石墨烯为改性氧化石墨烯。所述改性氧化石墨烯的制备方法为：取钛酸正丁酯20质量份，无水乙醇100质量份，硝酸铈0.5质量份，硝酸镍0.5质量份，氧化石墨烯40质量份，硼氢化钠20质量份；
将钛酸正丁酯加入无水乙醇中不断搅拌，再通过浓硝酸调节pH2~3，继续搅拌5h，得到第一溶液；
将硝酸铈溶于10倍量的去离子水中，得到第二溶液；
将第一溶液和第二溶液混合，搅拌均匀后加入硝酸镍，缓慢搅拌至获取透明的溶胶，陈化后得到凝胶，将凝胶烘干，研磨成粉末后在500摄氏度下焙烧2h，得到改性二氧化钛；
将氧化石墨烯分散到20倍量的去离子水中，超声30min，得到氧化石墨烯分散液，将改性二氧化钛加入到氧化石墨烯分散液中，再加入硼氢化钠，搅拌均匀，超声1h，自然冷却至室温，将产物过滤、干燥，得到改性氧化石墨烯。
实施例3
一种促进干细胞扩增的方法， 包括：
采用差速贴壁法去除正常培养的胚胎干细胞的饲养层MEF细胞；
将干细胞按照1×104个/孔接种到多孔板上，在扩增培养基中培养；
所述扩增培养基包括：高糖DMEM25质量份，非必需氨基酸12质量份，谷氨酰胺0.7质量份，β-巯基乙醇0.05质量份，白血病抑制因子1000U/mL，纳米层状双氢氧化物0.3质量份。所述纳米层状双氢氧化物的制备方法为：取硝酸镍15质量份，硝酸铝40质量份，氢氧化钠80质量份，碳酸钠20质量份，氧化石墨烯10质量份，硝酸锌5质量份，尿素30质量份；
将硝酸镍和硝酸铝溶解于1200质量份的去离子水中得到混合盐溶液，将氢氧化钠和碳酸钠溶解于1000质量份的去离子水中得到混合碱液，将氧化石墨烯分散到1200质量份的去离子水中，得到分散液；
将混合碱液同分散液混合，超声分散2h，再加入混合盐溶液，超声分散20min，得到混合液；将混合液在100摄氏度下晶化36h，冷却至室温，过滤，洗涤至洗液呈中性，在50摄氏度下烘干得到复合物
将硝酸锌溶解于1000质量份去离子水中，加入尿素，搅拌均匀，加入复合物，超声分散60min，得到悬浮液，将悬浮液升温至100摄氏度，反应24h，冷却至室温得到固体产物
将固体产物在氮气气氛以700摄氏度焙烧10h，然后冷却至室温，得到纳米层状双氢氧化物。所述氧化石墨烯为改性氧化石墨烯。所述改性氧化石墨烯的制备方法为：取钛酸正丁酯30质量份，无水乙醇120质量份，硝酸铈1质量份，硝酸镍0.8质量份，氧化石墨烯60质量份，硼氢化钠30质量份；
将钛酸正丁酯加入无水乙醇中不断搅拌，再通过浓硝酸调节pH2~3，继续搅拌7h，得到第一溶液；
将硝酸铈溶于10倍量的去离子水中，得到第二溶液；
将第一溶液和第二溶液混合，搅拌均匀后加入硝酸镍，缓慢搅拌至获取透明的溶胶，陈化后得到凝胶，将凝胶烘干，研磨成粉末后在600摄氏度下焙烧5h，得到改性二氧化钛；
将氧化石墨烯分散到20倍量的去离子水中，超声60min，得到氧化石墨烯分散液，将改性二氧化钛加入到氧化石墨烯分散液中，再加入硼氢化钠，搅拌均匀，超声3h，自然冷却至室温，将产物过滤、干燥，得到改性氧化石墨烯。
实施例4
实施例4同实施例1不同之处在于，所述纳米层状双氢氧化物的制备方法为：取硝酸镍12质量份，硝酸铝30质量份，氢氧化钠70质量份，碳酸钠15质量份，尿素25质量份；
将硝酸镍和硝酸铝溶解于1100质量份的去离子水中得到混合盐溶液，将氢氧化钠和碳酸钠溶解于900质量份的去离子水中得到混合碱液；
将混合碱液同混合盐溶液混合，超声分散10~20min，得到混合液；将混合液在90摄氏度下晶化26h，冷却至室温，过滤，洗涤至洗液呈中性，在45摄氏度下烘干得到复合物
将尿素溶解于1000质量份去离子水中，搅拌均匀，加入复合物，超声分散35min，得到悬浮液，将悬浮液升温至90摄氏度，反应18h，冷却至室温得到固体产物
将固体产物在氮气气氛以650摄氏度焙烧80h，然后冷却至室温，得到纳米层状双氢氧化物。
实施例5
实施例5同实施例1不同之处在于，所述氧化石墨烯未改性。
对比例1
对比例1同实施例1不同之处在于，所述扩增培养基包括：高糖DMEM 22质量份，非必需氨基酸11质量份，谷氨酰胺0.6质量份，β-巯基乙醇0.02质量份，白血病抑制因子1000U/mL。
实验例
将实施例1~6和对比例的方法用于培养胚胎干细胞，以MTT比色法确定不同方法培养出的细胞的增殖率，以对比例的吸光度为基准，判断实施例中增殖率的变化。
表1 各实施方式增殖率的变化率
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例1~5在对比例1的基础上，增值率增加了32~143%，表明在培养基中引入了纳米层状双氢氧化物可以显著地提高干细胞的增殖效率，为干细胞的大规模应用提供了条件。
实施例1~3中的干细胞增值率均产生了翻倍的效果，表明经过改性的碳纳米管改性纳米层状双氢氧化物可以有效促进干细胞增殖，实施例1的干细胞增值率明显优于实施例2和3，表明添加一定量的用于改性的纳米层状双氢氧化物可以进一步提高干细胞的增值率。
实施例4中的纳米层状双氢氧化物未经氧化石墨烯改性，其增殖率有一定的提高，但提升的效果弱于实施例1~3，表明氧化石墨烯改性的纳米层状双氢氧化物可以更进一步的提高干细胞的增值率。
实施例5中采用未改性的氧化石墨烯改性纳米层状双氢氧化物，，其效果弱于实施例1，其效果也弱于实施例1，表明只有用一定的方法改性的氧化石墨烯用于改性纳米层状双氢氧化物才能有效的促进干细胞的增殖。
对比例1中未加入纳米层状双氢氧化物，其促进干细胞增殖的效果较弱，表明只有一定添加量的纳米层状双氢氧化物才能促进干细胞的增殖。
上列详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，以上实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (1)

1.一种促进胚胎干细胞扩增的方法，其特征在于，包括：
采用差速贴壁法去除正常培养的胚胎干细胞的饲养层MEF细胞；
将胚胎干细胞按照1×104 个/孔接种到多孔板上，在扩增培养基中培养；
所述扩增培养基包括：高糖DMEM 22质量份，非必需氨基酸11质量份，谷氨酰胺0.6质量份，β-巯基乙醇0.02质量份，白血病抑制因子1000U/mL，纳米层状双氢氧化物0.2质量份；
所述纳米层状双氢氧化物的制备方法为：取硝酸镍12质量份，硝酸铝30质量份，氢氧化钠70质量份，碳酸钠15质量份，氧化石墨烯8质量份，硝酸锌4质量份，尿素25质量份；
将硝酸镍和硝酸铝溶解于1100质量份的去离子水中得到混合盐溶液，将氢氧化钠和碳酸钠溶解于900质量份的去离子水中得到混合碱液，将氧化石墨烯分散到1100质量份的去离子水中，得到分散液；
将混合碱液同分散液混合，超声分散1.5h，再加入混合盐溶液，超声分散10~20min，得到混合液；将混合液在90摄氏度下晶化26h，冷却至室温，过滤，洗涤至洗液呈中性，在45摄氏度下烘干得到复合物；
将硝酸锌溶解于1000质量份去离子水中，加入尿素，搅拌均匀，加入复合物，超声分散35min，得到悬浮液，将悬浮液升温至90摄氏度，反应18h，冷却至室温得到固体产物；
将固体产物在氮气气氛以650摄氏度焙烧80h，然后冷却至室温，得到纳米层状双氢氧化物；
所述氧化石墨烯为改性氧化石墨烯；所述改性氧化石墨烯的制备方法为：取钛酸正丁酯25质量份，无水乙醇110质量份，硝酸铈0.8质量份，硝酸镍0.6质量份，氧化石墨烯45质量份，硼氢化钠220质量份；
将钛酸正丁酯加入无水乙醇中不断搅拌，再通过浓硝酸调节pH2~3，继续搅拌6h，得到第一溶液；
将硝酸铈溶于10倍量的去离子水中，得到第二溶液；
将第一溶液和第二溶液混合，搅拌均匀后加入硝酸镍，缓慢搅拌至获取透明的溶胶，陈化后得到凝胶，将凝胶烘干，研磨成粉末后在550摄氏度下焙烧3h，得到改性二氧化钛；将氧化石墨烯分散到20倍量的去离子水中，超声40min，得到氧化石墨烯分散液，将改性二氧化钛加入到氧化石墨烯分散液中，再加入硼氢化钠，搅拌均匀，超声1~3h，自然冷却至室温，将产物过滤、干燥，得到改性氧化石墨烯。
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