CN110106141A - 一种自体干细胞规模化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞领域，提供一种自体干细胞规模化的方法，用于提高干细胞的增殖效率。本发明提供的一种自体干细胞规模化的方法，包括：S11.取自体干细胞支撑单细胞悬液；S12.将单细胞悬液计数后用培养基将其稀释成10‑5~10‑3cells/mL的干细胞悬液，接种到培养基进行规模化扩增；所述培养基中包括纳米二氧化钛，所述纳米二氧化钛在培养基中的含量为10~40μg/ml。在培养基中增加纳米二氧化钛可以提高干细胞增殖的效率，可以加快干细胞的规模化。

Description

一种自体干细胞规模化的方法
技术领域
本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种自体干细胞规模化的方法。
背景技术
干细胞是生物体内存在的一种具有自我更新能力和多系分化潜能的原始细胞群体，人体所有的组织器官细胞均由干细胞分化而来。干细胞大致可分为两种，一种是胚胎干细胞，另一种是成体干细胞。胚胎干细胞是最原始的干细胞，可无限复制并分化为任意组织细胞，但由于目前科学技术水平和伦理道德的限制使其在短期内难以走向实际应用。近年来对成体干细胞的研究结果显示了其在未来生命科学中的良好应用前景。
目前培养和纯化成体干细胞(间充质干细胞)的通用方法主要都采用磁珠分选间充质干细胞，在常规氧含量(20％O2)条件下培养，在使用的培养基通常添加动物来源的血清，例如牛或马血清等。一方面，通过常规方法培养出的间充质干细胞在干细胞生物学特性、干细胞分化潜能等方面均难以达到符合实际应用的要求；另一方面，这些常规方法本身存在诸多缺点，例如，当采用常规使用的含量为100-200ml/L动物血清的培养基时，其通常存在以下缺点：培养的间充质干细胞的平均倍增时间较长，且生长速度不均一，无法在规定时间内制备出满足需求的细胞数量。另外，通常采用的磁珠分选工艺也具有许多缺点。首先，使用成本较高，目前用于细胞分离的磁珠价格较为昂贵，以每份骨髓样本(20-30mL)大约需分离108个细胞计算，单例人pMSCs制备成本将至少增加4000元人民币；其次，磁珠分选工艺体外操作时间较长，使细胞污染的机会大大增加，并对干细胞活性有很大影响；第三，磁珠分选时无论以阳性或阴性选择方式分离，都会损失不同数量细胞。对于常规氧含量(20％O2)的培养条件，由于体内氧浓度显著低于此值，其中动脉血平均氧浓度约为12％，组织的平均氧浓度约为3％，pMSCs的主要积聚部位——骨髓的氧浓度为1％-7％，富集干细胞的胚体氧浓度更低。过高浓度的氧使细胞产生大量的自由基，具有损伤应激作用。
因此，不论是动物血清或者磁珠分选的方式用于干细胞规模化增殖，都会影响干细胞的增殖率。
发明内容
本发明解决的技术问题为提高干细胞的增殖效率，提供一种自体干细胞规模化的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种自体干细胞规模化的方法，包括：S11.取自体干细胞支撑单细胞悬液；S12.将单细胞悬液计数后用培养基将其稀释成10-5~10-3cells/mL的干细胞悬液，接种到培养基进行规模化扩增；所述培养基中包括纳米二氧化钛，所述纳米二氧化钛在培养基中的含量为10~40μg/ml。
纳米二氧化钛分布在培养基，可以促进干细胞的增殖，提高干细胞增殖的效率。
通过在培养基中增加纳米二氧化钛可以提高干细胞增殖的效率，可以加快干细胞的规模化。
优选地，所述培养基中包括纳米二氧化钛在培养基中的含量为20~40μg/ml。通过优化纳米二氧化钛在培养基中的含量可以进一步提高干细胞增殖的效率。
优选地，所述培养基中包括纳米二氧化钛在培养基中的含量为20μg/ml。培养基中含有20μg/ml的纳米二氧化钛可以充分的促进干细胞的增殖，加快自体干细胞的增殖效率。
优选地，所述纳米二氧化钛为改性纳米二氧化钛。改性的纳米二氧化钛可以更进一步的提高干细胞的增殖效率。
优选地，所述改性纳米二氧化钛的制备方法为：取钛酸四丁酯10~30质量份，无水乙醇40~120质量份，硝酸铈0.5~1质量份，硝酸钼0.2~0.5质量份，硝酸锰0.1~0.3质量份，氧化石墨烯2~5质量份，NaBH4 0.5~1质量份；将钛酸四丁酯溶于无水乙醇，搅拌均匀后调节pH为2~3，继续搅拌2h，得到均匀的溶液；将硝酸铈和硝酸钼溶于去离子水后同溶液混合，加入硝酸锰，搅拌均匀后陈化得到凝胶；将凝胶烘干后烧结，得到预改性纳米二氧化钛；将预改性纳米二氧化钛溶于氧化石墨烯的水溶液，搅拌，超声分散均匀后，水热反应完全，冷却后过滤清洗、干燥，得到改性纳米二氧化钛。通过铈、钼对纳米二氧化钛改性后再通过氧化石墨烯改性可以更进一步的促进干细胞的增殖，为干细胞的规模化应用提供了条件。
优选地，所述钛酸四丁酯20质量份，无水乙醇80质量份，硝酸铈0.8质量份，硝酸钼0.4质量份，硝酸锰0.2质量份，氧化石墨烯3质量份，NaBH4 0.8质量份。通过优化纳米二氧化钛改性的配方可以更进一步的提高干细胞的增殖效率。
优选地，所述烧结温度为550~650℃，烧结1~2h。
优选地，所述水热反应的温度为100~120℃，反应1~2h。
优选地，所述氧化石墨烯为改性氧化石墨烯，所述改性氧化石墨烯的制备方法为：取氧化石墨烯10~15质量份，硝酸镍10~12质量份，KBH4 5~7质量份，去离子水1000~1200质量份；将氧化石墨烯分散在去离子水中，加入硝酸镍，搅拌均匀后缓慢加入KBH4，进行水热反应4h，得到黑色溶液，离心后过滤，将滤渣洗涤至洗出液呈中性，真空干燥后，研磨得到改性氧化石墨烯。改性的氧化石墨烯可以有效的提高纳米二氧化钛促进干细胞增殖的效果。
优选地，所述水热反应的温度为60~80℃，所述真空干燥的温度为80~90℃。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：在培养基中增加纳米二氧化钛可以提高干细胞增殖的效率，可以加快干细胞的规模化；改性的氧化石墨烯可以有效的提高纳米二氧化钛促进干细胞增殖的效果；通过铈、钼对纳米二氧化钛改性后再通过氧化石墨烯改性可以更进一步的促进干细胞的增殖，为干细胞的规模化应用提供了条件。
具体实施方式
以下实施列是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
一种自体干细胞规模化的方法，包括：S11.取自体干细胞支撑单细胞悬液； S12.将单细胞悬液计数后用培养基将其稀释成10-5~10-3cells/mL的干细胞悬液，接种到培养基进行规模化扩增；所述培养基中包括纳米二氧化钛，所述纳米二氧化钛在培养基中的含量为20μg/ml。所述纳米二氧化钛为改性纳米二氧化钛。所述改性纳米二氧化钛的制备方法为：取钛酸四丁酯20质量份，无水乙醇80质量份，硝酸铈0.8质量份，硝酸钼0.4质量份，硝酸锰0.2质量份，氧化石墨烯3质量份，NaBH4 0.8质量份；将钛酸四丁酯溶于无水乙醇，搅拌均匀后调节pH为2~3，继续搅拌2h，得到均匀的溶液；将硝酸铈和硝酸钼溶于去离子水后同溶液混合得到，加入硝酸锰，搅拌均匀后陈化得到凝胶；将凝胶烘干后烧结，得到预改性纳米二氧化钛；将预改性纳米二氧化钛溶于氧化石墨烯的水溶液，搅拌，超声分散均匀后，水热反应完全，冷却后过滤清洗、干燥，得到改性纳米二氧化钛。所述烧结温度为600℃，烧结1.5h。所述水热反应的温度为110℃，反应1.5h。所述氧化石墨烯为改性氧化石墨烯，所述改性氧化石墨烯的制备方法为：取氧化石墨烯12质量份，硝酸镍11质量份，KBH4 6质量份，去离子水1100质量份；将氧化石墨烯分散在去离子水中，加入硝酸镍，搅拌均匀后缓慢加入KBH4，进行水热反应4h，得到黑色溶液，离心后过滤，将滤渣洗涤至洗出液呈中性，真空干燥后，研磨得到改性氧化石墨烯。所述水热反应的温度为70℃，所述真空干燥的温度为85℃。
纳米二氧化钛分布在培养基，可以促进干细胞的增殖，提高干细胞增殖的效率。
通过在培养基中增加纳米二氧化钛可以提高干细胞增殖的效率，可以加快干细胞的规模化。通过优化纳米二氧化钛在培养基中的含量可以进一步提高干细胞增殖的效率。培养基中含有20μg/ml的纳米二氧化钛可以充分的促进干细胞的增殖，加快自体干细胞的增殖效率。改性的纳米二氧化钛可以更进一步的提高干细胞的增殖效率。通过铈、钼对纳米二氧化钛改性后再通过氧化石墨烯改性可以更进一步的促进干细胞的增殖，为干细胞的规模化应用提供了条件。通过优化纳米二氧化钛改性的配方可以更进一步的提高干细胞的增殖效率。改性的氧化石墨烯可以有效的提高纳米二氧化钛促进干细胞增殖的效果。
实施例2
一种自体干细胞规模化的方法，包括：S11.取自体干细胞支撑单细胞悬液；S12.将单细胞悬液计数后用培养基将其稀释成10-5~10-3cells/mL的干细胞悬液，接种到培养基进行规模化扩增；所述培养基中包括纳米二氧化钛，所述纳米二氧化钛在培养基中的含量为10μg/ml。所述纳米二氧化钛为改性纳米二氧化钛。所述改性纳米二氧化钛的制备方法为：取钛酸四丁酯10质量份，无水乙醇40质量份，硝酸铈0.5质量份，硝酸钼0.2质量份，硝酸锰0.1质量份，氧化石墨烯2质量份，NaBH4 0.5质量份；将钛酸四丁酯溶于无水乙醇，搅拌均匀后调节pH为2，继续搅拌2h，得到均匀的溶液；将硝酸铈和硝酸钼溶于去离子水后同溶液混合得到，加入硝酸锰，搅拌均匀后陈化得到凝胶；将凝胶烘干后烧结，得到预改性纳米二氧化钛；将预改性纳米二氧化钛溶于氧化石墨烯的水溶液，搅拌，超声分散均匀后，水热反应完全，冷却后过滤清洗、干燥，得到改性纳米二氧化钛。所述烧结温度为550℃，烧结1h。所述水热反应的温度为100℃，反应1h。所述氧化石墨烯为改性氧化石墨烯，所述改性氧化石墨烯的制备方法为：取氧化石墨烯10质量份，硝酸镍10质量份，KBH4 5质量份，去离子水1000质量份；将氧化石墨烯分散在去离子水中，加入硝酸镍，搅拌均匀后缓慢加入KBH4，进行水热反应4h，得到黑色溶液，离心后过滤，将滤渣洗涤至洗出液呈中性，真空干燥后，研磨得到改性氧化石墨烯。所述水热反应的温度为60℃，所述真空干燥的温度为80℃。
实施例3
一种自体干细胞规模化的方法，包括：S11.取自体干细胞支撑单细胞悬液；S12.将单细胞悬液计数后用培养基将其稀释成10-5~10-3cells/mL的干细胞悬液，接种到培养基进行规模化扩增；所述培养基中包括纳米二氧化钛，所述纳米二氧化钛在培养基中的含量为40μg/ml。所述纳米二氧化钛为改性纳米二氧化钛。所述改性纳米二氧化钛的制备方法为：取钛酸四丁酯30质量份，无水乙醇120质量份，硝酸铈1质量份，硝酸钼0.5质量份，硝酸锰0.3质量份，氧化石墨烯5质量份，NaBH4 1质量份；将钛酸四丁酯溶于无水乙醇，搅拌均匀后调节pH为2~3，继续搅拌2h，得到均匀的溶液；将硝酸铈和硝酸钼溶于去离子水后同溶液混合得到，加入硝酸锰，搅拌均匀后陈化得到凝胶；将凝胶烘干后烧结，得到预改性纳米二氧化钛；将预改性纳米二氧化钛溶于氧化石墨烯的水溶液，搅拌，超声分散均匀后，水热反应完全，冷却后过滤清洗、干燥，得到改性纳米二氧化钛。所述烧结温度为650℃，烧结2h。所述水热反应的温度为120℃，反应2h。所述氧化石墨烯为改性氧化石墨烯，所述改性氧化石墨烯的制备方法为：取氧化石墨烯15质量份，硝酸镍12质量份，KBH4 7质量份，去离子水1200质量份；将氧化石墨烯分散在去离子水中，加入硝酸镍，搅拌均匀后缓慢加入KBH4，进行水热反应4h，得到黑色溶液，离心后过滤，将滤渣洗涤至洗出液呈中性，真空干燥后，研磨得到改性氧化石墨烯。所述水热反应的温度为80℃，所述真空干燥的温度为90℃。
实施例4
一种自体干细胞规模化的方法，包括：S11.取自体干细胞支撑单细胞悬液；S12.将单细胞悬液计数后用培养基将其稀释成10-5~10-3cells/mL的干细胞悬液，接种到培养基进行规模化扩增；所述培养基中包括纳米二氧化钛，所述纳米二氧化钛在培养基中的含量为20μg/ml。
实施例5
实施例5同实施1不同之处在于，所述改性二氧化钛的配方中不含氧化石墨烯。
实施例6
实施例6同实施例1不同之处在于，所述氧化石墨烯未改性。
实施例7
实施例7同实施例1不同之处在于，所述氧化石墨烯改性过程中未加入硝酸镍。
对比例
对比例同实施例1不同之处在于，所述培养基中不含纳米二氧化钛。
实验例
将实施例1~7和对比例的方法用于培养脊髓间充质干细胞，以MTT比色法确定不同方法培养出的细胞的增殖率，以对比例的吸光度为基准，判断实施例中增殖率的变化。
实施例1~7在对比例的基础上，增值率增加了65~153%，表明在培养基中引入了纳米二氧化钛可以显著地提高干细胞的增殖效率，为自体干细胞的应用提供了条件。
实施例1~3中的干细胞增值率均产生了翻倍的效果，表明经过改性的氧化石墨烯改性纳米二氧化钛可以有效促进干细胞增殖，实施例1的干细胞增值率优于实施例2和3，表明经过优化的用于改性二氧化钛的配方可以进一步提高干细胞的增值率。
实施例4中仅添加了纳米二氧化钛，其增殖率一定的提高，但提升的效果弱于实施例1~3，表明改性的二氧化钛可以更进一步的提高干细胞的增值率。
实施例5中用于改性纳米二氧化钛的配方中不含氧化石墨烯，其效果弱于实施例6和7，因此，向改性的纳米二氧化钛中引入氧化石墨烯可以有效的促进干细胞增殖。
上列详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，以上实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (10)

1.一种自体干细胞规模化的方法，其特征在于，包括：S11.取自体干细胞支撑单细胞悬液；S12.将单细胞悬液计数后用培养基将其稀释成10-5~10-3cells/mL的干细胞悬液，接种到培养基进行规模化扩增；所述培养基中包括纳米二氧化钛，所述纳米二氧化钛在培养基中的含量为10~40μg/ml。
2.根据权利要求1所述的一种自体干细胞规模化的方法，其特征在于，所述培养基中包括纳米二氧化钛在培养基中的含量为20~40μg/ml。
3.根据权利要求2所述的一种自体干细胞规模化的方法，其特征在于，所述培养基中包括纳米二氧化钛在培养基中的含量为20μg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种自体干细胞规模化的方法，其特征在于，所述纳米二氧化钛为改性纳米二氧化钛。
5.根据权利要求4所述的一种自体干细胞规模化的方法，其特征在于，所述改性纳米二氧化钛的制备方法为：取钛酸四丁酯10~30质量份，无水乙醇40~120质量份，硝酸铈0.5~1质量份，硝酸钼0.2~0.5质量份，硝酸锰0.1~0.3质量份，氧化石墨烯2~5质量份，NaBH4 0.5~1质量份；将钛酸四丁酯溶于无水乙醇，搅拌均匀后调节pH为2~3，继续搅拌2h，得到均匀的溶液；将硝酸铈和硝酸钼溶于去离子水后同溶液混合，加入硝酸锰，搅拌均匀后陈化得到凝胶；将凝胶烘干后烧结，得到预改性纳米二氧化钛；将预改性纳米二氧化钛溶于氧化石墨烯的水溶液，搅拌，超声分散均匀后，水热反应完全，冷却后过滤清洗、干燥，得到改性纳米二氧化钛。
6.根据权利要求5所述的一种自体干细胞规模化的方法，其特征在于，所述钛酸四丁酯20质量份，无水乙醇80质量份，硝酸铈0.8质量份，硝酸钼0.4质量份，硝酸锰0.2质量份，氧化石墨烯3质量份，NaBH4 0.8质量份。
7.根据权利要求4所述的一种自体干细胞规模化的方法，其特征在于，所述烧结温度为550~650℃，烧结1~2h。
8.根据权利要求4所述的一种自体干细胞规模化的方法，其特征在于，所述水热反应的温度为100~120℃，反应1~2h。
9.根据权利要求4所述的一种自体干细胞规模化的方法，其特征在于，所述氧化石墨烯为改性氧化石墨烯，所述改性氧化石墨烯的制备方法为：取氧化石墨烯10~15质量份，硝酸镍10~12质量份，KBH4 5~7质量份，去离子水1000~1200质量份；将氧化石墨烯分散在去离子水中，加入硝酸镍，搅拌均匀后缓慢加入KBH4，进行水热反应4h，得到黑色溶液，离心后过滤，将滤渣洗涤至洗出液呈中性，真空干燥后，研磨得到改性氧化石墨烯。
10.根据权利要求9所述的一种自体干细胞规模化的方法，其特征在于，所述水热反应的温度为60~80℃，所述真空干燥的温度为80~90℃。
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