CN107354094B

CN107354094B - 细胞均匀分布的微流控细胞培养芯片及细胞进样方法

Info

Publication number: CN107354094B
Application number: CN201710667551.7A
Authority: CN
Inventors: 张荣标; 黄林奎; 张业成
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Nanjing Jiuchuan Science And Technology Co ltd
Priority date: 2017-08-07
Filing date: 2017-08-07
Publication date: 2019-12-03
Anticipated expiration: 2037-08-07
Also published as: CN107354094A

Abstract

本发明公开一种细胞均匀分布的微流控细胞培养芯片及细胞进样方法，基底上设有呈十字交叉相互垂直的主流道和辅助流道，辅助流道是由外端向中间逐渐变宽的台阶形流道，辅助流道的底面高于主流道的底面；先将培养液注入培养室，待培养液充满培养室底部后，再将细胞悬浮液注入，当一定量的细胞悬浮液注入主流道后，再往主流道注入培养液，培养液将注入的细胞悬浮液推动到培养室，混合气体通过辅助流道进入培养室两侧的缓冲区，使主流道中间的培养室底部充满细胞悬浮液，而主流道的其他空间为培养液，因此，保证了细胞只分布在培养室底部，不会在非培养室区域残留细胞，保证了细胞均匀地分布在培养室底部。

Description

细胞均匀分布的微流控细胞培养芯片及细胞进样方法

技术领域

本发明涉及微流控和细胞进样技术领域，特别是细胞均匀分布的微流控细胞培养芯片及细胞进样方法。

背景技术

细胞培养是指从生物体内取出组织，于模拟体内生理环境等待定的体外条件下，进行孵育培养，使之生存并繁殖。虽然传统的细胞培养一直在努力创造条件以模拟生物体内的状况，但是还不能精确重现体内的细胞外微环境的实际状况。而微流控芯片能对流体从时间和空间上进行精确控制，在微流控芯片上进行细胞培养具有优势。细胞在微流控芯片内部培养室的分布均匀程度，往往会造成培养室不同区域细胞的生长情况不一致。在微流控芯片培养室内部培养液供应均匀的情况下，细胞分布密集的地方，由于消耗的营养成分相对较多，造成细胞生长繁殖缓慢，甚至会出现细胞死亡情况，而细胞分布分布稀疏的地方，由于消耗的营养成分相对较少，细胞生长繁殖得快。微流控芯片培养室内部的细胞生长不均匀将会影响后续的细胞活性等研究工作的准确性。

目前，微流控细胞培养芯片的结构主要是针对灌流过程中培养液均匀分布在培养室，却很难保证细胞进样过程中细胞均匀分布在培养室。中国专利申请号为200910243816、名称为“一种微流控细胞培养单元”的专利文献中公开细胞培养单元包括一个细胞培养区、两个液体过渡区和两个液体传输区，细胞培养区有一个入口和一个出口，用于传输细胞，液体传输区有一个入口和一个出口，用于传输细胞培养液以及指示细胞的试剂，该微流控芯片存在以下缺点：第一，细胞培养区为圆形，细胞进样口只有一个，细胞在细胞培养区入口和出口之间的区域分布较多，而两边区域细胞分布少，这种细胞进样方式使得细胞在培养区中分布不均匀，对后续细胞培养造成不利影响；第二，细胞培养液从左边入口进入，从右边出口流出，由于细胞培养区为圆形，入口和出口之间的区域培养液流速较大，而两边区域的培养液流速较小，造成细胞培养区的培养液更换不均匀，导致细胞生长不均匀。

发明内容

本发明的目的是为解决现有细胞在微流控芯片培养室内部分布不均匀的缺点，提出一种细胞均匀分布的微流控细胞培养芯片及细胞进样方法，在细胞进样过程中，实现细胞均匀分布在微流控芯片培养室内部。

本发明细胞均匀分布的微流控细胞培养芯片采用的技术方案是：由下方的基底和上方的盖片键合而成，基底上设有呈十字交叉相互垂直的主流道和辅助流道，交叉处形成的区域是培养室，辅助流道是由外端向中间逐渐变宽的台阶形流道，辅助流道的底面高于主流道的底面，主流道和辅助流道的上表面平齐；在培养室两侧的辅助流道内的正中间各设一个长阻块，两个长阻块相对于培养室的中心对称，长阻块将同侧的辅助流道分隔成两个相同的第一辅助分流道，在培养室两侧的每个第一辅助分流道内的正中间各设有一个短阻块，四个短阻块相对于培养室的中心两两对称，每个短阻块将其所在的第一辅助分流道分隔成两个相同的第二辅助分流道；长阻块和短阻块的内端面与培养室之间留有距离，之间的区域是缓冲区。

所述的微流控细胞培养芯片的细胞进样方法采用的技术方案是包括以下步骤：

A、通过第二微量注射泵吸取培养液，将培养液从被主流道入口注入微流控芯片中，同时，通过第一微量注射泵和第三微量注射泵吸取含有CO₂浓度是5%的混合气体，将混合气体从辅助流道两端同时注入微流控芯片中，培养液沿培养室的底部流动；

B、将第二微量注射泵里的培养液全部排到废液池中，再吸取细胞悬浮液，将细胞悬浮液从被主流道入口注入微流控芯片中，第一微量注射泵和第三微量注射泵同时工作，

C、将第二微量注射泵里的细胞悬浮液全部排到废液池中，第二微量注射泵再次吸取培养液，培养液再次被注入微流控芯片中，第一微量注射泵和第三微量注射泵同时工作，培养液将主流道中的细胞悬浮液推动至培养室，细胞进样结束。

本发明与已有方法和技术相比，具有如下优点：

1、本发明先将培养液注入培养室，为后面注入的细胞提供稳定的生存环境。待培养液充满培养室底部后，再将一定量的细胞悬浮液注入主流道。当一定量的细胞悬浮液注入主流道后，再往主流道注入一定量的培养液，培养液将注入的细胞悬浮液推动到培养室，使主流道中间的培养室底部充满细胞悬浮液，而主流道的其他空间为培养液，因此，保证了细胞只分布在培养室底部，不会在非培养室区域残留细胞。

2、本发明微流控细胞培养芯片，培养液或细胞悬浮液都从芯片主流道的连接口注入，同时，含有CO₂浓度是5%的无菌空气从辅助流道的两个进口一起注入，培养液或细胞悬浮液和混合气体最终汇合到培养室，然后从主流道流出。混合气体通过辅助流道进入培养室两侧的缓冲区，混合气体的作用是防止液体向培养室两边的缓冲区流动，由主流道比辅助流道高，因此流过培养室的培养液或细胞悬浮液受到两侧缓冲区的混合气体的挤压，培养液或细胞悬浮液就能够沿着主流道流动，而不向缓冲区流动。由于培养室的高度比缓冲区高20，因此，培养液或细胞悬浮液就沿着培养室底部流动，培养液从细胞上方流动，因此，细胞所承受的剪切力很小，不会造成贴壁细胞脱落或损坏细胞。无菌空气和培养液或细胞悬浮液的速度可以保证培养室液体高度为20左右，又因大多数的细胞直径为5～20，因此，培养室的细胞悬浮液只有一层或两层细胞，细胞能够均匀地分布在培养室底部，这对于细胞悬浮液高度太大以至细胞悬浮液上层大量细胞落到底层细胞周围，造成细胞不均匀分布的情况几乎不会出现。因此，本发明使培养液或细胞悬浮液流过培养室而不会残留在缓冲区以及辅助流道，还保证了细胞均匀地分布在培养室底部。

3、本发明在细胞进样过程中，三个微量注射泵分别连接到微流控细胞培养芯片上三个连接头，使用MCU控制器控制三个微量注射泵。进样过程中，只需要更换微量注射泵的培养液或细胞悬浮液，并设定相应的微量注射泵的步进电机转速和注射时间，就能实现自动进样，提高进样的精度和自动化程度。

附图说明

图1是本发明细胞均匀分布的微流控细胞培养芯片的细胞进样整体装置图；

图2是图1中微流控芯片的基底结构俯视放大图；

图3是图1中微流控芯片的基底结构的立体放大图；

图4是图3所示基底结构的俯视图以及部分尺寸标注图；

图5是图4所示基底结构中，当微流控芯片进样后的培养液、细胞悬浮液和含有CO₂浓度是5%的混合气体的流动方向示意图；

图6是图5所示基底结构中的细胞最终分布示意图；

图7是图6所示基底结构的主流道横截面示意图以及培养液位置图；

图中：1.电源模块；2.接线端子;3.电源插头；4.步进电机；5.固定螺母；6.第一固定块；7.长固定杆；8.滑块；10.第二固定块；11.注射器；12.含有CO₂浓度是5%的混合气体；13.第一导管；14.短固定杆；15.丝杆；16.第一微量注射泵；17.轴承；18.培养液或细胞悬浮液；20.第一导管连接头；21.微流控芯片；22.基底；23.盖片；24.第二微量注射泵；25.第二导管连接头；26.第三导管连接头；27.第三导管；28.第四导管连接头；29.第四导管；30.废液；31.废液池；32.第三微量注射泵；33.MCU控制器；34.第一通道口；35.辅助流道；36.第二通道口；37.主流道；38.培养室；39.第三通道口；40.长阻块；41.第四通道口；42.第一辅助分流道；43.短阻块；44.第二辅助分流道；46.缓冲区。

具体实施方式

参见图1，为本发明培养液均匀分布的微流控细胞培养芯片的细胞进样整体装置图，主要包括：微流控芯片21、三个微量注射泵、MCU控制器33、电源模块1和废液池31。

电源模块1通过电源插头3接到市电，有10个接线端子2，通过电源线A1和地线B1为第一微量注射泵16供电，通过电源线A2和地线B2为第二微量注射泵24供电，通过电源线A3和地线B3为第三微量注射泵32供电，通过电源线A4和地线B4为MCU控制器33供电。

MCU控制器33通过三根控制线C1、C2、C3分别连接对应的第一微量注射泵16、第二微量注射泵24和第三微量注射泵32，对其进行控制。

微流控芯片21是长宽相等、高度为毫米级别的长方体结构，由下方的基底22和上方的盖片23键合而成。盖片23上方有四个导管连接头，四个导管连接头分别靠近盖片23的四条边缘的中间，四个导管连接头两两相对，呈十字交叉布置。这四个导管连接头分别是第一导管连接头20、第二导管连接头25、第三导管连接头26、第四导管连接头28。第三导管连接头26通过第三导管27连接到废液池31，用于排出废液30。

第一微量注射泵16、第二微量注射泵24和第三微量注射泵32这三个微量注射泵的结构相同，以第一微量注射泵16的结构为例：包括步进电机4、第一固定块6、滑块8、丝杆15、第二固定块10、注射器11以及多个固定螺母5。第一固定块6在步进电机4和滑块8之间，滑块8在第一固定块6和第二固定块10之间。步进电机4水平放置，电机壳体通过固定螺母5固定连接相互平行的长固定杆7和短固定杆14一端，短固定杆14的另一端通过固定螺母5固定在第一固定块6上，长固定杆7另一端依次有间隙地穿过第一固定块6和滑块8上的通孔，并通过固定螺母5固定连接于第二固定块10上。步进电机4的输出轴同轴固定连接丝杆15的一端，丝杆15的中间通过螺孔配合连接滑块8，由丝杆15和滑块8形成丝杆螺母机构。丝杆15的另一端通过轴承17连接第二固定块10。丝杆15、长固定杆7、短固定杆14三者水平布置且相互平行。注射器11水平布置，里面存放的是含有CO₂浓度是5%的混合气体，是由CO₂和空气组成的混合气体12，滑块8固定连接注射器11一端的活塞9，注射器11的中间有间隙地穿过第二固定块10上的通孔，注射器11另一端是注射口，通过注射口连接第一导管13的一端，第一导管13的另一端连接微流控芯片21上的第一导管连接头20。步进电机4旋转，带动丝杆15转动，通过丝杆15带动滑块8水平移动，活塞9也水平移动，从而将注射器11内部的混合气体12注射入微流控芯片21内。

第二微量注射泵24和第三微量注射泵32的结构与第一微量注射泵16相同，所不同的是第二微量注射泵24的注射器11里面存放的是培养液或细胞悬浮液18，第二微量注射泵24的注射器11的注射口通过第二导管19连接微流控芯片21上的第二导管连接头25。

第三微量注射泵32的注射器11里面存放的是混合气体12，和第一微量注射泵16的注射器11里面存放的气体是一样的。第三微量注射泵32的的注射器11的注射口通过第四导管29连接微流控芯片21上的第四导管连接头28。

参见图2、3、4，基底22是一个长和宽相等，高度为毫米级别的长方体结构。在基底22的顶部刻有上下垂直的四个通道口、一个主流道37和一个辅助流道35。四个通道口分别对应地位于盖板23上四个导管连接头的正下方，并且一一对应地与盖板23上的导管连接头相连接。四个通道口也两两相对，呈十字交叉布置，交叉点是基底22的中心。第一通道口34与第一导管连接头20连接，第二通道口36与第三导管连接头25连接，第三通道口39与第三导管连接头26连接，第四通道口41与第四导管连接头28连接。第一通道口34和第四通道口41都是直径为d、高度为h2的圆柱孔，第二通道口36和第三通道口39都是直径为d、高度为h1的圆柱孔，但h1大于h2，h1-h2=20。在第一通道口34和第四通道口41之间连通的是主流道37，在第二通道口36与和第三通道口39之间连通的是辅助流道35。主流道37和辅助流道35相互垂直，呈十字交叉，交叉点是基底22的中心。主流道37和辅助流道35的上表面平齐，主流道37和辅助流道35的交叉处形成的区域是培养室38，培养室38参见图2和图4中的虚线所示。辅助流道35是由外端向中间逐渐变宽的台阶形流道。辅助流道35最外段的宽度是w1，最外段的宽度与主流道37的宽度相等。辅助流道35的高度为h2、长度为厘米级别，主流道37是宽度为w1、高度为h1、长度为厘米级别的长方体流道，h1＞h2，主流道37的流道高度比辅助流道35的流道高度大20。主流道37和辅助流道35的高度不同，两者有高度差，辅助流道35的底面高于主流道37的底面。培养室38也是长方体流道，流道高度为h1，培养室38的底面与主流道37底面高度相同。因此，培养室38可以看作是主流道37的一部分且位于主流道37的中间区域，即图3和图4中的两虚线之间的区域。培养室38的中心即基底22的中心，培养室38关于中心点对称。

在培养室38两侧的辅助流道35内的正中间各有一个长阻块40，共两个长阻块40，两个长阻块40相对于培养室38的中心对称，长阻块40的上表面和辅助流道35的上表面平齐，长阻块40的外端和辅助流道35的外端之间留有一定的距离，长阻块40的内端靠近培养室38但和培养室38之间也留有距离，长阻块40将辅助流道35分隔成两个相同的第一辅助分流道42。

在培养室38两侧的每个第一辅助分流道42内的正中间各有一个短阻块43，共四个短阻块43，四个短阻块43两两面对面，相对于培养室38的中心两两对称。短阻块43的上表面和辅助流道35的上表面平齐，每个短阻块43将其所在的第一辅助分流道42分隔成两个相同的第二辅助分流道44。短阻块43的长度小于长阻块40的长度，短阻块43的内端靠近培养室38但和培养室38之间也留有距离，短阻块43的内端面与长阻块40的内端面平齐。

再参见图4，第一辅助分流道42的宽度是w3，宽度w3是辅助流道35宽度w1的一半，即：w1=2w3。第二辅助分流道44的宽度是w2，宽度w2为第一辅助分流道42的宽度w3的一半，即：w3=2w2。

长阻块40的横截面是T型结构，外段的宽度大于内段，短阻块43是矩形结构。短阻块43的宽度等于长阻块40内段的宽度，都是的长度w2。短阻块43的长度小于长阻块40内段的长度。第一辅助分流道42的的宽度是w3，长阻块40外段的宽度也是w3。相邻两个第二辅助分流道44之间的间距是w2，短阻块43的宽度以及长阻块40内段的宽度均是w2。长阻块40和短阻块43的内端面与培养室38之间的区域是缓冲区46，培养室38两侧各有一个缓冲区46，两个缓冲区46面对面对称布置。

参见图5，在细胞进样过程中，由第二微量注射泵24向微流控芯片21注入培养液或细胞悬浮液18，图5中带箭头的实线代表培养液或细胞悬浮液18的流动方向，培养液或细胞悬浮液18从主流道37一端进入培养室38。同时，第一微量注射泵16和第三微量注射泵32向微流控芯片21中注入含有CO₂浓度是5%的混合气体12，图5中带箭头的虚线代表混合气体12的流动方向，含有CO₂浓度是5%的混合气体在培养室38的两侧经辅助流道35外段、第一辅助分流道42、第二辅助分流道44和缓冲区46后进入培养室38，与经过培养室38的培养液或细胞悬浮液18汇合，然后同时从主流道37另一端流出。在此过程中，培养液或细胞悬浮液在主流道37的底部流动，培养液及细胞悬浮液的液面高度为20左右，主流道37的顶部充满含有CO₂浓度是5%的混合气体12。细胞最终分布在培养室38，主流道37的培养液中没有细胞，如图6所示。

细胞进样时，先接通电源模块1，MCU控制器33通过控制线C2控制第二微量注射泵24的步进电机以恒定转速V1反向转动一段时间T1，从培养液瓶中吸取x₀mL培养液。同时，MCU控制器33通过控制线C1和控制线C3，控制第一微量注射泵16和第三微量注射泵32的步进电机以恒定转速V1反向转动一段时间T2，从CO₂培养箱中吸取x₁mL含有CO₂浓度是5%的混合气体12。然后，将第一微量注射泵16的第一导管13连接到微流控芯片21的第一导管连接头20、第二微量注射泵24的第二导管19连接到微流控芯片21第二导管连接头25、第三微量注射泵32的第四导管29连接到微流控芯片21的第四导管连接头28。

MCU控制器33通过控制线C2，控制第二微量注射泵24的步进电机以恒定转速V2正向转动，培养液从主流道37入口注入微流控芯片21中，进入培养室38。同时，MCU控制器33通过控制线C1和控制线C3分别控制第一微量注射泵16和第三微量注射泵32的步进电机以恒定转速V3正向转动，含有CO₂浓度是5%的混合气体12从辅助流道35的两端同时注入微流控芯片21中，由于培养室38的高度比其两侧的缓冲区46的高度高，高出20，因此，培养室38两侧的含有CO₂浓度是5%的混合气体12对流过培养室38的培养液产生一定的压力，使培养液沿着培养室38的底部流动，而且培养室38中的培养液的液面高度保持在20左右。如此，MCU控制器33控制三个微量注射泵同时工作，经过一段时间T3后，同时停止。此时，培养液充满了微流控芯片21的培养室38底部，如图7所示。先使微流控芯片21中注入培养液，是为后面注入的细胞悬浮液后提供细胞稳定的生存环境。

将第二微量注射泵24的第二导管19插入废液池31中，MCU控制器33控制第二微量注射泵24的步进电机以恒定转速V1正向转动一段时间T4，将第二微量注射泵24的注射器11里的培养液全部排到废液池31中。

将第二微量注射泵24的第二导管19插入细胞悬浮液器皿中，MCU控制器33控制第二微量注射泵24的步进电机以恒定转速V1反向转动一段时间T1，吸取x₂mL的细胞悬浮液，然后将第二微量注射泵24的第二导管19连接到微流控芯片21的第二导管连接头25。

MCU控制器33控制第二微量注射泵24的步进电机以恒定转速V2正向转动，细胞悬浮液被注入微流控芯片21的主流道37中，细胞悬浮液的注入量刚好能使细胞分布在培养室38而不残留在主流道37的其他位置。MCU控制器33分别控制第一微量注射泵16和第三微量注射泵32的步进电机以恒定转速V3正向转动。如此MCU控制器33控制三个微量注射泵16、24、32同时工作，经过一段时间T5后，同时停止。此时，将x₃mL的细胞悬浮液进入微流控芯片21的主流道37。

将第二微量注射泵24的第二导管19插入废液池31中，MCU控制器33控制第二微量注射泵24的步进电机以恒定转速V1正向转动一段时间T6，将第二微量注射泵24的注射器11里的细胞悬浮液全部排出。然后，将第二微量注射泵24的第二导管19插入培养液瓶中，MCU控制器33控制第二微量注射泵24的步进电机以恒定转速V1反向转动一段时间T1，第二微量注射泵24再次吸取x₄mL的培养液。最后，将第二微量注射泵24的第二导管19连接到微流控芯片21的第二导管连接头25。

MCU控制器33控制第二微量注射泵24的步进电机以恒定转速V2正向转动，培养液再次被注入微流控芯片21的主流道37中，将主流道37中的细胞悬浮液推动至培养室38。MCU控制器33分别控制第一微量注射泵16和第三微量注射泵32的步进电机以恒定转速V3正向转动。MCU控制器33控制三个微量注射泵同时工作，经过一段时间T7后，同时停止。此时，细胞悬浮液进入微流控芯片21的培养室38，细胞进样过程结束。

Claims

1.一种细胞均匀分布的微流控细胞培养芯片，由下方的基底（22）和上方的盖片（23）键合而成，其特征是：基底（22）上设有呈十字交叉相互垂直的主流道（37）和辅助流道（35），交叉处形成的区域是培养室（38），辅助流道（35）是由外端向中间逐渐变宽的台阶形流道，辅助流道（35）的底面高于主流道（37）的底面，主流道（37）和辅助流道（35）的上表面平齐；在培养室（38）两侧的辅助流道（35）内的正中间各设一个长阻块（40），两个长阻块（40）相对于培养室（38）的中心对称，长阻块（40）将同侧的辅助流道（35）分隔成两个相同的第一辅助分流道（42），在培养室（38）两侧的每个第一辅助分流道（42）内的正中间各设有一个短阻块（43），四个短阻块（43）相对于培养室（38）的中心两两对称，每个短阻块（43）将其所在的第一辅助分流道（42）分隔成两个相同的第二辅助分流道（44）；长阻块（40）和短阻块（43）的内端面与培养室（38）之间留有距离，之间的区域是缓冲区（46）。

2.根据权利要求1所述的细胞均匀分布的微流控细胞培养芯片，其特征是：长阻块（40）和短阻块（43）的上表面与辅助流道（35）的上表面平齐，短阻块（43）的长度小于长阻块（40）的长度，短阻块（43）的内端面与长阻块（40）的内端面平齐，长阻块（40）的外端和辅助流道（35）的外端之间留有距离。

3.根据权利要求1所述的细胞均匀分布的微流控细胞培养芯片，其特征是：

辅助流道（35）最外段的宽度与主流道（37）的宽度相等，长阻块（40）的横截面是T型结构，长阻块（40）外段的宽度大于内段的宽度；短阻块（43）是矩形结构，短阻块（43）的宽度等于长阻块（40）内段的宽度；第一辅助分流道（42）的宽度是辅助流道（35）宽度的一半，第二辅助分流道（44）的宽度是第一辅助分流道（42）宽度的一半，相邻两个第二辅助分流道（44）之间的间距等于短阻块（43）的宽度。

4.根据权利要求1所述的细胞均匀分布的微流控细胞培养芯片，其特征是：主流道（37）的流道高度比辅助流道（35）的流道高度大20。

5.一种采用如权利要求1所述的细胞均匀分布的微流控细胞培养芯片进行细胞进样的方法，其特征是包括以下步骤：

A、通过第二微量注射泵吸取培养液，将培养液从被主流道（37）入口注入微流控芯片（21）中，同时，通过第一微量注射泵（16）和第三微量注射泵（32）吸取含有CO₂浓度是5%的混合气体（12），将混合气体（12）从辅助流道（35）两端同时注入微流控芯片（21）中，培养液沿培养室（38）的底部流动；

B、将第二微量注射泵（24）里的培养液全部排到废液池中，再吸取细胞悬浮液，将细胞悬浮液从被主流道（37）入口注入微流控芯片（21）中，第一微量注射泵（16）和第三微量注射泵（32）同时工作，

C、将第二微量注射泵（24）里的细胞悬浮液全部排到废液池中，第二微量注射泵（24）再次吸取培养液，培养液再次被注入微流控芯片（21）中，第一微量注射泵（16）和第三微量注射泵（32）同时工作，培养液将主流道（37）中的细胞悬浮液推动至培养室（38），细胞进样结束。