CN110862905B - 用于细胞迁移实验的芯片装置、制备方法及实验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的一种用于细胞迁移实验的芯片装置、制备方法及实验方法，可解决使用细胞布置器过程繁琐，且对细胞污染几率大影响实验精度的技术问题。所述芯片表面包含多个重复功能单元；每个功能单元至少包含接种区、隔离区和迁移区三个功能区域；接种区是细胞起始接种黏附的区域，接种区表面具有疏水性；隔离区是位于接种区外围设置隔离柱体阵列，隔离柱体阵列将接种区包围形成一个环形结构，相邻隔离柱体之间保留设定的间隙，隔离柱体外表面具有疏水性；迁移区位于隔离区外围。本发明实现细胞起始接种范围的限定，并能控制细胞向指定区域范围和方向迁移，同时能模拟体内不同迁移界面的结构，无需对细胞进行损伤操作，也不需要对芯片进行拆卸和组装。
Description
技术领域
本发明涉及细胞迁移分析技术领域，具体涉及一种用于细胞迁移实验的芯片装置、制备方法及实验方法。
背景技术
细胞迁移与肿瘤发生和发展、干细胞归巢、胚胎形成、伤口愈合和炎症反应、宿主防御都有密切关系。研究细胞迁移对于我们理解这些生命活动背后的原理，以及相关疾病的治疗有重要意义。传统研究细胞迁移的方法传统体外研究细胞迁移速率的方法中广泛使用的是划痕法。该方法不对接种起始位置和指定目标迁移区域进行划分，而是在细胞接种后在细胞黏附区域用外力划去一部分黏附的细胞，造成一个没有细胞黏附的区域，最后观察细胞向该区域迁移的速度。罗春雄等人在专利中公布了一种细胞迁移研究的方法，采用细胞布置器件中的细胞群体限制腔室培养贴壁生长的细胞，得到贴壁生长的细胞群。将贴壁生长的细胞群放在迁移测试器件中的迁移测试腔室中培养，获取细胞生长过程中的图片，以通过图片记录的细胞群的生长所覆盖的区域，计算细胞迁移的迁移距离。
而上述相关技术存在以下问题：
划痕法不对接种起始位置和指定目标迁移区域进行划分，而是在细胞接种后在细胞黏附区域用外力划去一部分黏附的细胞，造成一个没有细胞黏附的区域，最后观察细胞向该区域迁移的速度。该方法虽然操作简单，但划痕的尺寸不易控制，实验重复性差，且划痕的过程会对细胞造成损伤。细胞布置器可以限制细胞起始接种范围，但操作时首先要细胞布置器件的底盘与洁净的培养皿粘附，然后要对所述细胞布置器件进行等离子体处理，之后再进行细胞接种；接种完成后，还需要将布置器去掉，更换为迁移器件再研究细胞迁移行为；整个过程中不仅需要将无菌器件取出进行等力推出来，还要涉及到对布置器的拆卸操作，过程繁琐，细胞污染几率大。
发明内容
本发明提出的一种用于细胞迁移实验的芯片装置、制备方法及实验方法，可解决当前相关实验使用细胞布置器过程繁琐，且对细胞污染几率大影响实验精度的技术问题。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种用于细胞迁移实验的芯片装置，包括芯片基层，
所述芯片表面包含多个重复功能单元；
每个功能单元至少包含接种区、隔离区和迁移区三个功能区域；
其中，
所述接种区是细胞起始接种黏附的区域，接种区表面具有疏水性；
所述隔离区是位于接种区外围设置隔离柱体阵列，所述隔离柱体阵列将接种区包围形成一个环形结构，相邻隔离柱体之间保留设定的间隙，隔离柱体外表面具有疏水性；
所述迁移区位于隔离区外围。
进一步的，所述隔离区的相邻柱体之间的设定的间隙尺寸范围是10微米到4毫米。
进一步的，所述隔离柱体的形状是直立柱、椎体、柱体面或底面不规则柱体、底面不规则球面体。
进一步的，所述隔离柱体高度范围为50微米～4毫米；
所述隔离柱体最长径范围是50微米～5厘米；
所述隔离柱体最短径范围是50微米～5厘米。
进一步的，所述迁移区内设置有不同高度、深度、曲率、倾角的界面。
进一步的，接种区表面设置疏水材料，其中疏水材料的滚动角与液面高度及隔离柱体间隙满足以下条件：
设液体表面张力为F，张力系数为γ，液面高度为h，柱体间隙宽为d，柱体与液面相切的角度值为θ，表面张力的作用面积为S，表面张力造成的向液体内部的压强为Pγ，液体对器壁造成的向外的压强为P；
根据拉普拉斯方程的推导：
F＝(2h+d)*γ*COS(π-θ)
液体受到的表面张力造成的压强Pγ＝F/S＝F/dh＝(2h+d)*γ*COS(π-θ)/dh
液体对器壁的最大压强P＝ρgh
P<Pγ时液体不溢出；随着液面身高P＝Pγ，液面高度达到最大值；当P>Pγ时液体溢出隔离柱外，隔离作用消失；
则液面高度的最大值
其中θ∈(π/2,π)。
进一步的，所述材料包括PDMS、PS、PC、PP、PE、PET、PEG、PLA、PGA、PLGA、PMMA、COC、COP。
进一步的，所述接种区为直径4mm的圆形；
所述隔离区为长方柱体，柱底面为边长200微米的正方形，柱体高度为500微米；
所述迁移区为直径200微米，深度60微米的圆坑；
所述芯片基层直径为35mm的圆形，内部包含21个重复单元。
第二，本发明还公开一种用于细胞迁移实验的芯片装置的制备方法，包括以下步骤：
S100、首先设计芯片图纸；
S200、再根据图纸进行3D打印或激光刻蚀；或根据图纸制备模具，再用铺膜或注塑的方式进行成品加工；
其中，模塑法制备芯片时：
首先将PDMS溶液与固化剂以10:1的比例混合，真空除泡；
接着将PDMS浇注于模具表面，再次抽真空排除模具内气泡；
最后将模具放入100℃烘箱，恒温两小时，取出冷却、脱模。
第三、本发明还公开一种细胞迁移实验方法，采用上述用于细胞迁移实验的芯片装置，包括以下步骤：
将芯片装置放在6孔板内；
首先将消化好的HUVEC细胞用培养基稀释到5*105/mL的浓度；
接着在每个单元内的接种区内，接种10微升的含细胞的培养基；
培养基被隔离区的柱体限定在接种区内，待细胞黏附稳定后，吸掉隔离区的培养基，向6孔板孔内加入5mL培养基，将芯片装置表面完全浸没；
之后用显微镜记录细胞向迁移区迁移的过程。
由上述技术方案可知，本发明设计了一种包含多功能区的生物芯片，实现细胞起始接种范围的限定，并能控制细胞向指定区域范围和方向迁移，同时能模拟体内不同迁移界面的结构，无需对细胞进行损伤操作，也不需要对芯片进行拆卸和组装。
本发明加工工艺简单，可通过3D打印、激光刻蚀、铺膜法或者注塑发一次加工形成芯片。芯片包含多个重复单元，可进行高通量研究；每个单元将控制细胞的功能区整合为一体。实际应用中，仅需一次接种就可实现黏附控制；不需对芯片结构做任何改变，只要改变培养基的覆盖方式即可实现对细胞迁移的研究。在一块芯片上可同时完成黏附和迁移的共同控制。避免了传统划痕法重复性差对细胞有损伤的缺点，也避免了细胞布置器技术操作繁琐，容易污染的缺点。
附图说明
图1是本发明芯片的阵列结构示意图；
图2是本发明的一个芯片结构单元包含的功能区示例图；
图3是本发明的隔离区隔离液体示意图；
图4是本发明实施例用用铺膜法制备的芯片照片；
图5用铺膜法制备的芯片限制细胞接种范围图片；
图6为细胞被微柱隔离在接种区内的图片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
如图1所示，本实施例所述的用于细胞迁移实验的芯片装置，具体为生物芯片可用于高通量细胞迁移研究；
包括芯片基层，其中芯片基层表面包含多个重复功能单元，每个功能单元内包含控制细胞迁移和黏附的功能区域。功能单元至少包含接种区、隔离区和迁移区三个功能区域。
接种区是细胞起始接种黏附的区域。接种区表面具有疏水性。为满足疏水性能，有两种方式。一是采用疏水的材料制备芯片，材料包括但不限于PDMS、PS、PC、PP、PE、PET、PEG、PLA、PGA、PLGA、PMMA、COC、COP。另一种方式是对材料表面进行疏水改性。接种区形状不限，尺寸也可以不限；形状上圆形和正多边形为优选；尺寸上1mm～10cm为优选。
隔离区是位于接种区外围的柱体结构阵列。柱体阵列将接种区包围形成一个环形结构，相邻柱体之间需要保持一定的间隙。柱体外表面具有疏水性，由于表面张力的作用，对于疏水材料而言，当柱体间隙低于一定值时，液体不会流过间隙，而被限定在柱体圈地的范围内。该值的大小与材料的滚动角值和最终加入的培养基液面高度有关。此外，为保证细胞迁移，柱体间隙宽度至少能够允许一个细胞通过。根据实际操作的情况，间隙的尺寸范围是10微米到4毫米。隔离柱体的形状可以是直立柱、椎体、柱体面和底面不规则柱体和球面体。柱体高度范围为50微米～4毫米。柱体最长径范围是50微米～5厘米。柱体最短径范围是50微米～5厘米。
迁移区位于隔离区外围，在细胞接种时，迁移区不被培养基覆盖，因此没有细胞黏附。在接种后，待细胞铺展，将接种区内的培养基吸走，将芯片整体浸没在培养基内，细胞即可向迁移区内迁移。记录细胞在不同时间点的图片，即可对细胞迁移行为进行分析。迁移区内可以设置与接种区不同的物理结构和化学环境，以研究细胞对不对物理结构和化学环境的迁移响应。比如，在迁移区内设置不同高度、深度、曲率、倾角的界面，研究这些因素对细胞迁移的影响。比如，在迁移区内用凝胶负载浓度和种类不同的药物或因子，研究细胞趋化效应。还可以在迁移区内预先接种细胞，研究多种细胞之间的侵袭。
芯片的加工采用3D打印、激光刻蚀、铺膜或注塑的方式均可实现，首先需要完成芯片图纸的设计，再根据图纸进行3D打印或激光刻蚀；或者根据图纸制备模具，再用铺膜或注塑的方式进行成品加工。模塑法制备芯片时：首先将PDMS溶液与固化剂以10:1的比例混合，真空除泡。接着将PDMS浇注于模具表面，再次抽真空排除模具内气泡。最后将模具放入100℃烘箱，恒温两小时，取出冷却、脱模。
以下对利用材料的疏水性能，在开放的空间形成闭合的力，使得培养基溶液能够被限定在固定范围内的技术进行说明：
液体在缺口处的张力等于液体与材料接触边界的长度与张力系数的乘积。设表面张力为F，张力系数为γ，液面高度为h，柱体间隙宽为d，柱体与液面相切的角度值为θ，表面张力的作用面积为S，表面张力造成的向液体内部的压强为Pγ，液体对器壁造成的向外的压强为P。根据拉普拉斯方程的推导：
F＝(2h+d)*γ*COS(π-θ)
液体受到的表面张力造成的压强Pγ＝F/S＝F/dh＝(2h+d)*γ*COS(π-θ)/dh
液体对器壁的最大压强P＝ρgh
P<Pγ时液体不溢出；随着液面身高P＝Pγ，液面高度达到最大值；当P>Pγ时液体溢出隔离柱外，隔离作用消失。
液面高度的最大值
其中θ∈(π/2,π)。当液体与界面发生相对运动时临界接触角为滚动角。设计芯片时，综合考虑最终的液面高度和材料的滚动角来决定柱体之间的间隙值。
下面以研究细胞向微坑结构中迁移的行为为例，说明细胞迁移的研究过程。首先将芯片结构设计为接种区为直径4mm的圆；隔离区长方柱体，柱底面为边长200微米的正方形，柱体高度为500微米；迁移区为直径200微米，深度60微米的圆坑。芯片直径为35mm，内部包含21个重复单元。研究细胞迁移时，将芯片放在6孔板内。首先将消化好的HUVEC细胞用培养基稀释到5*105/mL的浓度。接着在每个单元内的接种区内，接种10微升的含细胞的培养基。培养基被隔离区的柱体限定在接种区内。待细胞黏附稳定后，吸掉隔离区的培养基，向6孔板孔内加入5mL培养基，将芯片表面完全浸没。之后用显微镜记录细胞向迁移区迁移的过程。图6中方形柱体形成了隔离区，隔离区上方圆坑为迁移区，隔离区下方为接种区。
综上所述，本发明加工工艺简单，可通过3D打印、激光刻蚀、铺膜法或者注塑法一次加工形成芯片。芯片包含多个重复单元，可进行高通量研究。每个单元将控制细胞的功能区整合为一体。实际应用中，仅需一次接种就可实现黏附控制；不需对芯片结构做任何改变，只要改变培养基的覆盖方式即可实现对细胞迁移的研究。在一块芯片上可同时完成黏附和迁移的共同控制。避免了传统划痕法重复性差对细胞有损伤的缺点，也避免了细胞布置器技术操作繁琐，容易污染的缺点。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种用于细胞迁移实验的芯片装置，其特征在于：包括芯片基层，
所述芯片表面包含多个重复功能单元；
每个功能单元至少包含接种区、隔离区和迁移区三个功能区域；
其中，
所述接种区是细胞起始接种黏附的区域，接种区表面具有疏水性；
所述隔离区是位于接种区外围设置隔离柱体阵列，所述隔离柱体阵列将接种区包围形成一个环形结构，相邻隔离柱体之间保留设定的间隙，隔离柱体外表面具有疏水性；
所述迁移区位于隔离区外围；
接种区表面设置疏水材料，其中疏水材料的滚动角与液面高度及隔离柱体间隙满足以下条件：
设液体表面张力为F，张力系数为γ，液面高度为h，柱体间隙宽为d，柱体与液面相切的角度值为θ，表面张力的作用面积为S，表面张力造成的向液体内部的压强为Pγ，液体对器壁造成的向外的压强为P；
根据拉普拉斯方程的推导：
F＝(2h+d)*γ*COS(π-θ)
液体受到的表面张力造成的压强Pγ＝F/S＝F/dh＝(2h+d)*γ*COS(π-θ)/dh
液体对器壁的最大压强P＝ρgh
P<Pγ时液体不溢出；随着液面身高P＝Pγ，液面高度达到最大值；当P>Pγ时液体溢出隔离柱外，隔离作用消失；
则液面高度的最大值
其中θ∈(π/2,π)。
2.根据权利要求1所述的用于细胞迁移实验的芯片装置，其特征在于：所述隔离区的相邻柱体之间的设定的间隙尺寸范围是10微米到4毫米。
3.根据权利要求1所述的用于细胞迁移实验的芯片装置，其特征在于：所述隔离柱体的形状是直立柱、椎体、柱体面或底面不规则柱体、底面不规则球面体。
4.根据权利要求1所述的用于细胞迁移实验的芯片装置，其特征在于：所述隔离柱体高度范围为50微米～4毫米；
所述隔离柱体最长径范围是50微米～5厘米；
所述隔离柱体最短径范围是50微米～5厘米。
5.根据权利要求1所述的用于细胞迁移实验的芯片装置，其特征在于：所述迁移区内设置有不同高度、深度、曲率、倾角的界面。
6.根据权利要求1所述的用于细胞迁移实验的芯片装置，其特征在于：所述材料包括PDMS、PS、PC、PP、PE、PET、PEG、PLA、PGA、PLGA、PMMA、COC、COP。
7.根据权利要求1所述的用于细胞迁移实验的芯片装置，其特征在于：
所述接种区为直径4mm的圆形；
所述隔离区为长方柱体，柱底面为边长200微米的正方形，柱体高度为500微米；
所述迁移区为直径200微米，深度60微米的圆坑；
所述芯片基层直径为35mm的圆形，内部包含21个重复单元。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的用于细胞迁移实验的芯片装置的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S100、首先设计芯片图纸；
S200、再根据图纸进行3D打印或激光刻蚀；或根据图纸制备模具，再用铺膜或注塑的方式进行成品加工；
其中，模塑法制备芯片时：
首先将PDMS溶液与固化剂以10:1的比例混合，真空除泡；
接着将PDMS浇注于模具表面，再次抽真空排除模具内气泡；
最后将模具放入100℃烘箱，恒温两小时，取出冷却、脱模。
9.一种细胞迁移实验方法，采用权利要求1-7任意一项所述的用于细胞迁移实验的芯片装置，其特征在于：
包括以下步骤：
将芯片装置放在6孔板内；
首先将消化好的HUVEC细胞用培养基稀释到5*105/mL的浓度；
接着在每个单元内的接种区内，接种10微升的含细胞的培养基；
培养基被隔离区的柱体限定在接种区内，待细胞黏附稳定后，吸掉隔离区的培养基，向6孔板孔内加入5mL培养基，将芯片装置表面完全浸没；
之后用显微镜记录细胞向迁移区迁移的过程。
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