WO2022158609A1 - 細胞培養容器 - Google Patents

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WO2022158609A1
WO2022158609A1 PCT/JP2022/002732 JP2022002732W WO2022158609A1 WO 2022158609 A1 WO2022158609 A1 WO 2022158609A1 JP 2022002732 W JP2022002732 W JP 2022002732W WO 2022158609 A1 WO2022158609 A1 WO 2022158609A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell culture
recess
culture vessel
protrusion
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/002732
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
良太 吉原
堅一朗 青木
亮介 飯田
雄人 中平
Original Assignee
ニッタ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by ニッタ株式会社 filed Critical ニッタ株式会社
Publication of WO2022158609A1 publication Critical patent/WO2022158609A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus

Definitions

  • the present invention relates to cell culture vessels.
  • three-dimensional cell culture In regenerative medicine and drug discovery research, the importance of three-dimensional cell culture that can construct a three-dimensional tissue equivalent to that in vivo is increasing. In three-dimensional cell culture, interactions such as cell-cell interaction and cell-extracellular matrix interaction, nutrient transport, cell migration, apoptosis, receptor expression, etc. are enhanced and more enhanced than in two-dimensional cell culture. Cell culture close to in vivo is possible.
  • Patent Document 1 discloses a method of injecting a suspension of adherent cells into a culture vessel having a plurality of cell non-adhesive recesses to form spheroids in the recesses of the culture vessel.
  • Patent Document 2 there is at least one culture recess that opens upward and has a bottom portion and a side portion, and the bottom portion has at least one protrusion that extends toward the opening.
  • a culture vessel is disclosed.
  • Patent Document 3 discloses a hepatocyte culture method in which hepatocytes embedded in an extracellular matrix are placed on a gas permeable membrane and the hepatocytes are cultured while oxygen is supplied from the gas permeable membrane side. It is
  • Patent document 2 proposes a culture recess having protrusions, but the problem of cell death due to a decrease in oxygen concentration has not been solved. Patent Document 2 discloses a configuration in which a communication hole is provided to communicate between the inside and the outside of the protrusion. The problem of cell death remains unsolved.
  • the oxygen concentration may decrease and the cells may die, and it is required to reduce the oxygen deficiency in the cell aggregate.
  • an object of the present invention is to provide a cell culture vessel capable of reducing oxygen deficiency in the center of cell aggregates in cell culture.
  • Another object of the present invention is to provide a cell culture vessel capable of reducing oxygen deficiency in cell aggregates in cell culture.
  • a cell culture vessel of the present invention comprises a substrate having a first surface and a second surface facing each other and provided with at least one first recess having an opening in the first surface; and a bottom of the first recess.
  • a second recess is provided extending from the second surface so that at least a part of the interior of the protrusion is hollow.
  • the cell culture vessel of the present invention comprises a substrate having a first surface and a second surface facing each other and having at least one concave portion having an opening in the first surface, and constituting a side wall portion of the concave portion. At least a portion of the wall portion forming the wall portion and the bottom portion is formed thinner than the thickness of the portion of the base body where the concave portion is not provided.
  • the cell culture vessel of the present invention it is possible to provide a cell culture vessel that can reduce oxygen deficiency in the center of cell aggregates in cell culture.
  • the cell culture vessel of the present invention it is possible to provide a cell culture vessel that can reduce oxygen deficiency in cell aggregates in cell culture.
  • FIG. 1 is a plan view of the cell culture vessel of the first embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of a cell culture portion of the cell culture vessel of FIG. 1.
  • FIG. FIG. 3 is a plan view of a cell culture vessel held by a holder.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of a cell culture vessel held by a holder.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram of cell culture in the cell culture section of the cell culture vessel of FIG.
  • FIG. 6 is a graph showing the amount of oxygen permeation with respect to the thickness of polystyrene and polydimethylsiloxane.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view of the cell culture portion of the cell culture vessel of the first modified example.
  • FIG. 8 is an explanatory diagram of cell culture in the cell culture section of the cell culture vessel of FIG. 7.
  • FIG. 9 is a cross-sectional view of the cell culture portion of the cell culture vessel of the second modified example.
  • 10 is an explanatory diagram of cell culture in the cell culture section of the cell culture vessel of FIG. 9.
  • FIG. 11 is a cross-sectional view of the cell culture portion of the cell culture vessel of the third modified example.
  • 12 is an explanatory diagram of cell culture in the cell culture section of the cell culture vessel of FIG. 11.
  • FIG. 13 is a cross-sectional view of the cell culture portion of the cell culture vessel of the fourth modification.
  • FIG. 14 is a cross-sectional view of the cell culture portion of the cell culture vessel of the fifth modification.
  • FIG. 15 is a cross-sectional view of the cell culture portion of the cell culture vessel of the sixth modification.
  • FIG. 16 is a perspective view of a cell culture vessel of a seventh modified example.
  • FIG. 17 is a perspective view of a cell culture vessel of an eighth modification.
  • FIG. 18 is a cross-sectional view of the cell culture portion of the cell culture vessel of the second embodiment.
  • 19 is an explanatory diagram of a cell culture method in the cell culture section of the cell culture vessel of FIG. 18.
  • FIG. FIG. 20 is a microphotograph of cell aggregates obtained in a cell culture test in which a cell culture vessel having a hollow projection provided on the bottom was arranged so as not to allow ventilation from the bottom surface.
  • FIG. 21 is a microphotograph of cell aggregates obtained in a cell culture test in which a cell culture vessel having a hollow projection provided on the bottom was arranged so that ventilation was provided from the bottom surface.
  • FIG. 22 is a micrograph of cell aggregates obtained in a cell culture test in which a cell culture vessel without hollow projections on the bottom was arranged so as not to allow ventilation from the bottom surface.
  • FIG. 23 is a microphotograph of cell aggregates obtained in a cell culture test in which a cell culture vessel without a hollow protrusion on the bottom was arranged so that ventilation was provided from the bottom surface.
  • FIG. 24 is a cross-sectional view of the cell culture portion of the cell culture vessel of the tenth modification.
  • FIG. 25 is a cross-sectional view of the cell culture portion of the cell culture vessel of the eleventh modification.
  • FIG. 26 is a cross-sectional view of the cell culture portion of the cell culture vessel of the twelfth modification.
  • FIG. 27 is a cross-sectional view of the cell culture portion of the cell culture vessel of the thirteenth modification.
  • FIG. 28 is a cross-sectional view of the cell culture portion of the cell culture vessel of the fourteenth modification.
  • FIG. 29 is a graph showing the amount of oxygen permeation with respect to the thickness of polystyrene, polydimethylsiloxane, and polymethylpentene.
  • FIG. 1 is a plan view of the cell culture vessel of the embodiment.
  • the cell culture vessel 1 has at least one cell culture section 20 .
  • 11 ⁇ 10 cell culture sections 20 are arranged in the drawing, the number of arranged cell culture sections 20 is not limited.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of one cell culture section 20 of the cell culture vessel 1 of FIG.
  • a cell culture vessel 1 has a plate-like substrate 10 having a first surface 10A and a second surface 10B facing each other.
  • the substrate 10 is provided with a first recess 21 that constitutes the cell culture section 20 .
  • the first recess 21 has an opening in the first surface 10A.
  • a protrusion 22 is provided on the bottom of the first recess 21 .
  • the projecting portion 22 has a strength that allows it to stand on its own.
  • a second recess 23 extending from the second surface 10B is provided so that at least part of the inside of the protrusion 22 is hollow.
  • the first concave portion 21 is composed of the surface of the protrusion 22, the bottom on which the protrusion 22 is provided, and the side portion that divides the bottom and the edge of the opening of the first surface 10A.
  • the thickness of the substrate 10 is, for example, 200 ⁇ m to 2000 ⁇ m.
  • the opening of the first concave portion 21 on the first surface 10A is, for example, substantially circular when viewed from the direction perpendicular to the first surface 10A, and has a size of 200 ⁇ m ⁇ to 1200 ⁇ m ⁇ .
  • the depth of the first concave portion 21 is, for example, 150 ⁇ m to 800 ⁇ m.
  • the bottom of the first recess 21 is smaller than the opening of the first recess 21 when viewed from the direction perpendicular to the first surface 10A. It has a curved slope.
  • the first recess 21 may be a recess having a curved surface such as a substantially hemispherical surface.
  • the protrusion 22 has a columnar shape, for example, a columnar shape. For example, it has a cylindrical shape with a diameter of 30 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • the second recess 23 has a shape that matches the shape of the protrusion 22 .
  • the average thickness of the protrusion 22 from the surface of the protrusion 22 to the surface of the second recess 23 is 10 ⁇ m to 100 ⁇ m. It is preferable that the thickness of the protrusion 22 from the surface of the protrusion 22 to the surface of the second recess 23 is uniform in the lateral direction of the protrusion 22, or in the lateral direction and the upper surface direction. However, there may be portions that are uneven.
  • the projection 22 has a columnar shape whose upper surface is a circle with a diameter of 100 ⁇ m, and the second recess 23 is formed with a diameter of 50 ⁇ m.
  • the average thickness of the protrusions 22 to the surface is 25 ⁇ m.
  • the projection 22 has a columnar shape whose upper surface is a circle with a diameter of 200 ⁇ m, and the second recess 23 is formed with a diameter of 100 ⁇ m.
  • the average thickness of the protrusions 22 is 50 ⁇ m. Since the average thickness of the protrusion 22 from the surface of the protrusion 22 to the surface of the second recess 23 is formed thin in this manner, the oxygen permeability of the protrusion 22 is enhanced.
  • the average thickness of the protrusion 22 from the surface of the protrusion 22 to the surface of the second recess 23 is 1/2 or less of the diameter or width of the protrusion 22, and such a thickness As a result, the oxygen permeability of the protrusion 22 is enhanced.
  • the protruding part 22 has sufficient strength to stand on its own.
  • the self-sustaining strength means that the cell culture vessel 1 is strong enough not to be deformed by its own weight or the stress applied from the cell aggregates during use when the cell culture vessel 1 is not in use or in use.
  • the first concave portion 21 having the protrusion 22 having the shape described above can be formed by cutting, injection molding, or the like. Further, the second concave portion 23 can be formed by cutting with a drill or the like.
  • At least the protrusions 22 of the cell culture vessel 1 are made of a material with high oxygen permeability.
  • polyamides such as PNIPAM (poly-N-isopropylacrylamide), polyvinyl chloride, polyethylene, polymethylpentene, polystyrene, or silicon-containing resins such as PDMS (polydimethylsiloxane) can be used.
  • the amount of oxygen permeation is expressed, for example, by the volume of oxygen that permeates a sample of each material having a unit area and a unit thickness per unit time and unit pressure.
  • the oxygen permeation amount of the above materials generally tends to be lowest in polyamide, and increases in order of polyvinyl chloride, polyethylene, polystyrene, and silicon-containing resin.
  • the protrusions 22 are more preferably made of a material having higher oxygen permeability than polyamide.
  • the volume (cc) of oxygen permeated per unit pressure (1 atm) per unit time (24 h) for a sample of each material having a thickness of 200 ⁇ m in a unit area (m 2 ) is 80000 cc or more.
  • the portion of the base 10 excluding the protruding portion 22 may be made of any material with an oxygen permeability. However, the portion integrally formed with the protrusion 22 is made of the same material as the protrusion 22 .
  • the surface of the protrusion 22 is a cell non-adhesive surface.
  • a cell non-adhesive surface is, for example, a surface using a highly hydrophilic substance.
  • the surface may be coated with a surfactant, phospholipid, phospholipid/polymer complex, agarose, albumin, or the like, or surface-treated by plasma treatment.
  • Highly hydrophilic substances include polyhydroxyethyl methacrylate, ethylene vinyl alcohol copolymer, saponified polyvinyl acetate, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, polyacrylamide, polymethacrylamide, polyhydroxyethyl methacrylate, polypentaerythritol tri Acrylate, polypentaerythritol tetraacrylate, polydiethylene glycol diacrylate, and the like.
  • the cell non-adhesive surface may be a surface modified by plasma treatment or a surface modified by ultraviolet irradiation treatment.
  • the surface of the protrusion 22 may be a cell-adhesive surface.
  • a cell-adhesive surface is, for example, a surface using a highly hydrophobic substance, such as a surface coated with a highly hydrophobic substance.
  • the surface of the first recess 21 excluding the surface of the protrusion 22 is basically a non-cell-adhesive surface, but a part or the whole of it may be a cell-adhesive surface. In this case, it may be difficult to detach the cell aggregate after culturing.
  • a temperature-responsive material such as PNIPAM
  • cells are aggregated on the surface of the protrusions 22 at the temperature during culturing, and the cell aggregates are formed into protrusions after culturing. It may be configured to be detachable from the portion 22 .
  • FIG. 3 is a plan view of the cell culture vessel 1 held by the holder.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of the cell culture vessel 1 held by the holder, taken from X to X' in FIG.
  • the holder 2 is provided with a holding concave portion 2A for holding the cell culture vessel 1 .
  • six holding recesses 2A are provided.
  • a plate-shaped cell culture vessel 1 is held at the bottom of the holding recess 2A.
  • a locking portion 2B is provided at the end of the bottom of the holding concave portion 2A, and the cell culture vessel 1 is locked by the locking portion 2B and held so as to be separated from the bottom of the holding concave portion 2A. be done.
  • the holder 2 may be covered with a lid (not shown) during cell culture.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram of cell culture in the cell culture section 20 of the cell culture vessel 1 of this embodiment.
  • the culture solution 30 is accommodated in the first concave portion 21 and used.
  • a culture medium is a cell culture medium for culturing cells.
  • the culture medium 30 contains nutrients used for growing cells and provides an environment for growing cells.
  • the culture solution 30 can be a culture solution that is commonly used for culturing cells, and can be appropriately determined depending on the type of cells to be cultured.
  • inorganic salts, carbohydrates, amino acids, vitamins, proteins, peptides, collagen, fatty acids, lipids, serum and the like are contained in buffer solutions.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • the cells to be cultured are not particularly limited as long as they can form cell aggregates by culturing, and examples include cells with adhesiveness.
  • Adhesive cells include liver cancer cells, hepatoblastoma cells, hepatoma cells, liver parenchymal cells, hepatocytes, Kupffer cells, endothelial cells such as vascular endothelial cells and corneal endothelial cells, fibroblasts, and osteoblasts.
  • epithelial cells such as , osteoclasts, periodontal ligament-derived cells, epidermal keratinocytes, epithelial cells such as tracheal epithelial cells, gastrointestinal epithelial cells, cervical epithelial cells, corneal epithelial cells, mammary gland cells, pericytes, smooth muscle cells, muscle cells such as cardiomyocytes, kidney cells, islets of pancreatic Langerhans cells, nerve cells such as peripheral nerve cells and optic nerve cells, chondrocytes, osteocytes, or stem cells, ES cells (embryonic stem cells) and iPS cells (artificial polymorphism) potential stem cells) and the like.
  • epithelial cells such as , osteoclasts, periodontal ligament-derived cells, epidermal keratinocytes, epithelial cells such as tracheal epithelial cells, gastrointestinal epithelial cells, cervical epithelial cells, corneal epithelial cells, mammary gland cells, pericy
  • Stem cells include, for example, bone marrow undifferentiated mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, vascular stem cells, neural stem cells, intestinal stem cells, adipose stem cells, skin stem cells, periodontal stem cells, ciliary body stem cells, corneal limbal stem cells, visceral stem cells, and the like.
  • the cells are suspended in the culture solution 30 contained in the first recess 21, and the cells are cultured in the culture solution 30 while maintaining the temperature and humidity suitable for culture.
  • three-dimensional cell aggregates 50 can be cultured around projections 22 by appropriately selecting conditions.
  • the cell aggregate 50 consumes oxygen, and the oxygen concentration gradually decreases in the center of the cell aggregate 50, possibly causing the cells to die.
  • a second concave portion 23 extending from the second surface 10B is provided so that the inside of the protrusion 22 is hollow, and has oxygen permeability.
  • Oxygen 40 in the air can be supplied to the central part of the three-dimensional cell aggregate 50 through the second concave portion 23 from the second concave portion 23 .
  • Oxygen deficiency in the center of the cell aggregate 50 can be reduced in cell culture.
  • the second concave portion 23 extending from the second surface 10B is provided so that the inside of the protrusion 22 is hollow, and has oxygen permeability.
  • Oxygen 40 in the air can be supplied to the central part of the three-dimensional cell aggregate 50 through the second concave portion 23 from the second concave portion 23 .
  • Oxygen deficiency in the center of the cell aggregate 50 can be reduced in cell culture.
  • FIG. 6 is a graph showing the amount of oxygen permeation with respect to the thickness of PS (polystyrene) and PDMS (polydimethylsiloxane).
  • the amount of oxygen permeation is represented by the volume (cc) of oxygen permeating per unit time (24 h) and unit pressure (1 atm) for a sample of each material with a unit area (m 2 ).
  • the thickness of PS and PDMS ( ⁇ m).
  • square marks ( ⁇ ) indicate the amount of oxygen permeation of PS.
  • a circle (o) indicates the oxygen permeation amount of PDMS. It was confirmed that PDMS has an oxygen permeability that is approximately 10 times or more higher than that of PS.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view of a cell culture portion 20A of the cell culture vessel of the first modified example.
  • the substrate 10 is composed of a single plate member, but is not limited to this, and may be composed of a laminate of multiple layers.
  • a substrate 10SA which is a laminate of the first substrate 11 and the second substrate 12, is provided with a first concave portion 21A that constitutes the cell culture section 20A.
  • the through opening of the first substrate 11 and the second substrate 12 provided with the protrusion 22A are aligned and laminated.
  • the first recess 21A has an opening on the first surface 11A. 22 A of protrusion parts are provided in the bottom part of 21 A of 1st recessed parts.
  • the 22 A of protrusion parts have the intensity
  • a second recess 23A extending from the second surface 12B is provided so that at least part of the inside of the protrusion 22A is hollow. Since the first substrate 11 may have any oxygen permeability, the material forming the first substrate 11 is not particularly limited. Since the first substrate 11 does not require oxygen permeability, a substrate having necessary strength can be used. Since only the through opening is formed in the first substrate 11, processing is easy.
  • the second base 12 is formed integrally with the protrusion 22A, and is preferably made of a material having high oxygen permeability as in the above embodiment.
  • the surface of the first substrate 11 is a cell-adhesive surface
  • the surface of the second substrate 12 is a non-cell-adhesive surface
  • the surface of the first substrate 11 may be a cell non-adhesive surface. Except for the above, it is the same as the above embodiment.
  • FIG. 8 is an explanatory diagram of cell culture in the cell culture section 20A of the cell culture vessel of FIG.
  • the culture solution 30 is accommodated in the first recess 21A, the cells are suspended in the accommodated culture solution 30, and the cells are cultured in the culture solution 30 while maintaining the temperature and humidity suitable for culture.
  • the three-dimensional cell aggregate 50 can be cultured around the protrusion 22A by appropriately selecting the conditions.
  • a second recess 23A extending from the second surface 12B is provided so that the inside of the protrusion 22A is hollow, and has oxygen permeability. It can be supplied to the central part of the three-dimensional cell aggregate 50 . Oxygen deficiency in the center of the cell aggregate 50 can be reduced in cell culture.
  • FIG. 9 is a cross-sectional view of a cell culture portion 20B of a cell culture vessel of the second modified example.
  • the substrate 10 is composed of a single plate-like member, but is not limited to this, and may be composed of a laminate of a plurality of layers.
  • a substrate 10SB which is a laminate of the first substrate 13 and the second substrate 14, is provided with a first concave portion 21B that constitutes the cell culture section 20B.
  • the first base 13 is provided with a first recess 21B, a projection 22B, and a second recess 23B.
  • a through opening is provided in the second base 14 at a position corresponding to the first concave portion 21B.
  • the first concave portion 21B of the first base 13 and the through opening of the second base 14 are aligned and laminated.
  • the second base 14 is a member that increases the strength of the first base 13 . Except for the above, it is the same as the above embodiment.
  • FIG. 10 is an explanatory diagram of cell culture in the cell culture section 20B of the cell culture vessel of FIG.
  • the culture solution 30 is accommodated in the first recess 21B, the cells are suspended in the accommodated culture solution 30, and the cells are cultured in the culture solution 30 while maintaining the temperature and humidity suitable for culture.
  • the three-dimensional cell aggregate 50 can be cultured around the protrusion 22B by appropriately selecting the conditions.
  • a second recess 23B extending from the second surface 14B side is provided so that the inside of the protrusion 22B is hollow, and has oxygen permeability.
  • 40 can be provided in the center of the three-dimensional cell aggregate 50 . Oxygen deficiency in the center of the cell aggregate 50 can be reduced in cell culture.
  • FIG. 11 is a cross-sectional view of a cell culture portion 20C of a cell culture vessel of the third modified example.
  • one protrusion is provided for one first recess, but this is not limiting, and a plurality of protrusions are formed for one first recess. may have been
  • the substrate 10C is provided with a first recess 21C that constitutes the cell culture section 20C.
  • a plurality of protrusions 22CA, 22CB, . . . 22CX are provided on the bottom of the first recess 21C. . . 23CX are provided for each of the protrusions 22CA, 22CB, . Except for the above, it is the same as the above embodiment.
  • FIG. 12 is an explanatory diagram of cell culture in the cell culture section 20C of the cell culture vessel of FIG.
  • the culture solution 30 is accommodated in the first recess 21C, the cells are suspended in the accommodated culture solution 30, and the cells are cultured in the culture solution 30 while maintaining the temperature and humidity suitable for culture.
  • a sheet-like three-dimensional cell aggregate 50C can be cultured around the protrusions 22CA, 22CB, . . . 22CX by appropriately selecting conditions.
  • Oxygen 40 in the air can be supplied to the inside of the three-dimensional cell aggregate 50C from the surface 10CB through the second recesses 23CA, 23CB, . . . 23CX. Oxygen deficiency inside the cell aggregate 50C can be reduced in cell culture.
  • FIG. 13 is a cross-sectional view of a cell culture portion 20D of a cell culture vessel of the fourth modification.
  • the projection has a columnar shape, but is not limited to this and may have other shapes.
  • a protrusion 22D having an inverted truncated cone shape is provided.
  • the projecting portion 22D has a strength that enables it to stand on its own.
  • a second recess 23D extending from the second surface 10DB is provided so that at least part of the inside of the projection 22D is hollow.
  • the second recess 23D may be widened toward the tip of the protrusion 22D in accordance with the shape of the protrusion 22D having an inverted truncated cone shape.
  • the thickness of the protrusion 22D from the surface of the protrusion 22D to the surface of the second recess 23D can be made uniform, for example, in the lateral direction of the protrusion, or in the lateral direction and the upper surface direction. Except for the above, it is the same as the above embodiment.
  • the culture solution 30 is accommodated in the first recess 21D, the cells are suspended in the accommodated culture solution 30, and the three-dimensional cell aggregate 50 is cultured in the culture solution 30 by maintaining the temperature and humidity suitable for culture. be able to.
  • Oxygen 40 in the air can be supplied to the central portion of the three-dimensional cell aggregate 50 from the second surface 10DB through the second concave portions 23D, and oxygen deficiency in the central portion of the cell aggregate 50 can be reduced.
  • it is not easy to detach the cell aggregates 50 from the protrusions 22D having an inverted truncated cone shape unintended detachment of the cell aggregates 50 during culturing can be suppressed.
  • FIG. 14 is a cross-sectional view of a cell culture portion 20E of a cell culture vessel of the fifth modification.
  • the projection has a columnar shape, but is not limited to this and may have other shapes.
  • a protruding portion 22E having a branched tip is provided.
  • the protrusion 22E has branches 22EA, 22EB, 22EC, and 22ED.
  • the projecting portion 22E has a strength that allows it to stand on its own.
  • a second recess 23E extending from the second surface 10EB is provided so that at least part of the inside of the protrusion 22E is hollow.
  • the second recess 23E may have a branched tip to match the shape of the protrusion 22E having a branched tip.
  • the thickness of the protrusion 22E from the surface of the protrusion 22E to the surface of the second recess 23E can be made uniform in any direction, for example, the side direction or the top direction of the protrusion 22E.
  • the second recess 23E may be provided only on the trunk portion excluding the branched portion of the protrusion 22E and may not reach the tip. Except for the above, it is the same as the above embodiment.
  • the culture solution 30 is accommodated in the first recess 21E, the cells are suspended in the accommodated culture solution 30, and the three-dimensional cell aggregate 50 is cultured in the culture solution 30 by maintaining the temperature and humidity suitable for culture. be able to.
  • Oxygen 40 in the air can be supplied to the central portion of the three-dimensional cell aggregate 50 from the second surface 10EB through the second concave portion 23E, and oxygen deficiency in the central portion of the cell aggregate 50 can be reduced.
  • it is not easy to detach the cell aggregates 50 from the projections 22E having the branched outer shape unintended detachment of the cell aggregates 50 during culturing can be suppressed.
  • the shape of the cell aggregate 50 can be further controlled and grown due to the projecting portion 22E having a branched outer shape.
  • FIG. 15 is a cross-sectional view of a cell culture portion 20F of a cell culture vessel of the sixth modification.
  • the projection has a columnar shape, but is not limited to this and may have other shapes.
  • a cylindrical tubular portion 24 is provided at the tip of the columnar protrusion 22F.
  • the tubular portion 24 is a hollow cylinder having the same diameter as the protrusion 22F, and has a lower end connected to the upper surface of the protrusion 22F and an upper end open.
  • a side surface of the tubular portion 24 is provided with openings 24A at a plurality of locations. Except for the above, it is the same as the above embodiment.
  • the culture solution 30 is accommodated in the first recess 21F, the cells are suspended in the accommodated culture solution 30, and the three-dimensional cell aggregate 50 is cultured in the culture solution 30 by maintaining the temperature and humidity suitable for culture. be able to.
  • the tubular portion 24 allows the convection of the culture solution 30 to flow through the opening 24A, so that the elements in the culture solution 30 necessary for the cells can be supplied to the inside and outside of the tubular portion 24 .
  • Oxygen 40 in the air can be supplied to the central portion of the three-dimensional cell aggregate 50 from the second surface 10FB through the second concave portion 23F, and oxygen deficiency in the central portion of the cell aggregate 50 can be reduced.
  • FIG. 16 is a perspective view of a cell culture vessel of a seventh modified example.
  • a total of about 500 cell culture sections 20 are arranged side by side on a plate-shaped substrate 10, for example.
  • the shape of the cell culture section 20 is, for example, an inverted truncated cone shape with an opening diameter of approximately 600 ⁇ m, a bottom diameter of approximately 400 ⁇ m, and a depth of approximately 400 ⁇ m.
  • the cell culture section 20 has a configuration similar to that of the above-described embodiment and modifications.
  • FIG. 17 is a perspective view of a cell culture vessel of an eighth modification.
  • a total of 400 cell culture sections 20 are arranged side by side on a plate-like substrate 10 .
  • the shape of the cell culture section 20 is, for example, an inverted square truncated pyramid with a square opening having a side of about 600 ⁇ m, a square bottom having a side of about 400 ⁇ m, and a depth of about 400 ⁇ m.
  • the cell culture section 20 has a configuration similar to that of the above-described embodiment and modifications.
  • FIG. 18 is a cross-sectional view of two cell culture sections 20G of the cell culture vessel of this embodiment.
  • the cell culture vessel has a plate-like substrate 10G having a first surface 10GA and a second surface 10GB facing each other.
  • the substrate 10G is provided with a first concave portion 21G that constitutes the cell culture portion 20G.
  • the first concave portion 21G has an opening in the first surface 10GA.
  • a protrusion 22G is provided at the bottom of the first recess 21G.
  • the projecting portion 22G has a strength that enables it to stand on its own.
  • a second recess 23G extending from the second surface 10GB is provided so that at least part of the inside of the projection 22G is hollow.
  • the wall portion 25G constituting the side wall portion of the first concave portion 21G and the wall portion 26G constituting the bottom portion of the substrate 10G is not provided with the first concave portion 21G. It is formed thinner than the thickness.
  • the depth of the first recess 21G is greater than the thickness of the portion of the substrate 10G where the first recess 21G is not provided, and the first recess 21G protrudes from the second surface 10GB of the substrate 10G. It has a shape.
  • the wall portion 25G forming the side wall portion of the portion protruding from the second surface 10GB of the base 10G and the wall portion 26G forming the bottom surface portion of the first recess 21G are all the first recess 21G of the base 10G. It is preferably formed thinner than the thickness of the portion where is not provided.
  • the thickness of the wall portion 25G that constitutes the side wall portion of the first concave portion 21G can be adjusted, for example, by the widths of the grooves 29GA and 29GB provided from the second surface 10GB side of the base 10G.
  • the thickness of the wall portion 26G that forms the bottom portion of the first concave portion 21G can be adjusted, for example, by the depth of the first concave portion 21G of the base 10G.
  • the thickness of the wall portion 25G forming the side wall portion and the wall portion 26G forming the bottom portion of the first recess portion 21G which is formed thinner than the thickness of the portion of the base 10G where the first recess portion 21G is not provided, is 25 ⁇ m. It is preferably ⁇ 500 ⁇ m, for example 100 ⁇ m.
  • the wall portion 25G forming the side wall portion of the first recess 21G and the wall portion 26G forming the bottom portion may have different thicknesses. It may be provided thinner than the wall portion 26G that constitutes the portion.
  • the entire wall portion 26G constituting the bottom portion of the is made of a material having oxygen permeability.
  • the entire cell culture vessel may be made of a material with high oxygen permeability.
  • Examples of materials with high oxygen permeability include polyamides such as PNIPAM (poly-N-isopropylacrylamide), polyvinyl chloride, polyethylene, polymethylpentene, polystyrene, and silicon-containing resins such as PDMS (polydimethylsiloxane).
  • the oxygen permeability is generally the lowest in polyamide, and increases in the order of polyvinyl chloride, polyethylene, polystyrene, and silicon-containing resin.
  • a material with high oxygen permeability a material with higher oxygen permeability than polyamide is preferable, and examples thereof include polydimethylsiloxane, polystyrene, and polymethylpentene.
  • FIG. 19 is an explanatory diagram of a cell culturing method in the cell culturing section of the cell culturing vessel of this embodiment.
  • the culture solution 30G is accommodated in the first concave portion 21G and used.
  • Cells are suspended in the culture solution 30G contained in the first recess 21G, and the cells are cultured in the culture solution 30G while maintaining the temperature and humidity suitable for culture.
  • three-dimensional cell aggregates 50G can be cultured around the projections 22G by appropriately selecting conditions.
  • the cell aggregate 50G consumes oxygen, the oxygen concentration gradually decreases in the center of the cell aggregate 50G, and the cells may die.
  • a second recess 23G extending from the second surface 10GB is provided so that the inside of the projection 22G is hollow, and has oxygen permeability.
  • Oxygen 40GA in the air can be supplied to the central portion of the three-dimensional cell aggregate 50G through the second concave portion 23G. Oxygen deficiency in the center of the cell aggregate 50G can be reduced in cell culture.
  • the oxygen concentration may decrease and the cells may die.
  • the wall portion 25G constituting the side wall portion of the first concave portion 21G and the wall portion 26G constituting the bottom portion of the substrate 10G is not provided with the first concave portion 21G. It is formed thinner than the thickness and has oxygen permeability.
  • 40 GB of oxygen in the air can be supplied to the surface of the three-dimensional cell aggregate 50 through the wall portion 25G that constitutes the side wall portion of the first recess 21G.
  • 40 GC of oxygen in the air can be supplied to the surface of the three-dimensional cell aggregate 50 through the wall portion 26G forming the bottom portion. In this way, oxygen deficiency of cell aggregates can be reduced in cell culture.
  • the second concave portion 23G extending from the second surface 10GB is provided so that the inside of the protrusion 22G is hollow, and has oxygen permeability.
  • Oxygen 40GA in the air can be supplied to the center of the three-dimensional cell aggregate 50G through the second recess 23G. Oxygen deficiency in the center of cell aggregates can be reduced in cell culture.
  • the wall portion 25G forming the side wall portion of the first recess 21G and the wall portion 26G forming the bottom portion thereof is formed thinner than the portion of the base 10G where the first recess 21G is not provided. Since it has oxygen permeability, 40 GB of oxygen in the air is supplied to the surface of the three-dimensional cell aggregate 50G through the wall portion 25G constituting the side wall portion of the first recess 21G, and the bottom portion of the first recess 21G is Oxygen 40GC in the air can be supplied to the surface of the three-dimensional cell aggregate 50G through the constituting wall portion 26G. Oxygen deficiency in cell aggregates can be reduced in cell culture.
  • the cell culture vessel of this modified example has a configuration in which the protrusion is not provided in the cell culture vessel of the second embodiment. Except for this, it is the same as the second embodiment.
  • At least a part of the wall portion constituting the side wall portion and the wall portion constituting the bottom portion of the first recess is formed thinner than the thickness of the portion of the substrate where the first recess is not provided, and has oxygen permeability. Therefore, oxygen in the air can be supplied to the surface of the three-dimensional cell aggregate 50 through the wall. Oxygen deficiency in cell aggregates can be reduced in cell culture.
  • a petri dish with and without ventilation holes is prepared as a petri dish for holding the cell culture vessel, and cell culture is carried out.
  • a cell culture test was performed with and without ventilation from the bottom of the container.
  • the obtained cell aggregates were cut so that the vicinity of the central part was exposed, only viable cells were stained by HE (hematoxylin and eosin) staining, and micrographs were taken.
  • HE hematoxylin and eosin
  • FIG. 20 is a micrograph of cell aggregates obtained in a cell culture test in which a cell culture vessel with a hollow protrusion provided on the bottom was arranged so as not to allow ventilation from the bottom surface.
  • FIG. 21 is a microphotograph of cell aggregates obtained in a cell culture test in which a cell culture vessel having a hollow projection provided on the bottom was arranged so that ventilation was provided from the bottom surface.
  • FIG. 22 is a micrograph of cell aggregates obtained in a cell culture test in which a cell culture vessel without hollow projections on the bottom was arranged so as not to allow ventilation from the bottom surface.
  • FIG. 23 is a microphotograph of cell aggregates obtained in a cell culture test in which a cell culture vessel without a hollow protrusion on the bottom was arranged so that ventilation was provided from the bottom surface.
  • the use of a cell culture vessel with hollow protrusions on the bottom reduced the death of cells in the center H of the cell aggregate CA. Some of the cell aggregates CA were dead due to lack of ventilation from the bottom surface of the cell culture vessel.
  • the use of a cell culture vessel having a hollow protrusion at the bottom reduced the death of cells in the center H of the cell aggregate CA.
  • the overall death of cell aggregates CA was reduced by providing ventilation from the bottom surface of the cell culture vessel.
  • FIG. 22 by using a cell culture vessel with no projections and culturing the cell culture vessel without aeration from the bottom surface, the entire cell aggregate CA including the central part was some had died.
  • FIG. 23 although a cell culture vessel having no projections was used, the overall death of cell aggregates CA was reduced by allowing air to flow from the bottom surface of the cell culture vessel.
  • FIG. 24 is a cross-sectional view of a cell culture section 20H of a cell culture vessel of the tenth modification.
  • the shape of the bottom portion 27H of the first concave portion 21H of the cell culture portion 20H is such that the opening area of the first concave portion 21H becomes smaller as it approaches the deepest portion of the bottom portion 27H from the first surface 10HA side.
  • a bottom portion 27H of the first concave portion 21H has a U-shaped cross section perpendicular to the base 10H. Except for the above, it is the same as the first embodiment, and a projection 22H is provided in the deepest part of the bottom 27H of the first recess 21H, which is hollow due to the second recess 23H being provided therein.
  • oxygen deficiency in cell aggregates can be reduced in cell culture. Furthermore, in cell culture, cells accumulate and aggregate at the bottom 27H of the first concave portion 21H, which can help the growth of cell aggregates.
  • FIG. 25 is a cross-sectional view of a cell culture portion 20I of a cell culture vessel of the eleventh modification.
  • the shape of the bottom portion 27I of the first concave portion 21I of the cell culture portion 20I is such that the opening area of the first concave portion 21I becomes smaller as it approaches the deepest portion of the bottom portion 27I from the first surface 10IA side.
  • a bottom portion 27I of the first concave portion 21I has a V-shaped cross section perpendicular to the base 10I.
  • this embodiment is the same as the first embodiment, and a protruding portion 22I is provided in the deepest portion of the bottom portion 27I of the first recess portion 21I so that the second recess portion 23I is provided therein and becomes hollow.
  • oxygen deficiency in cell aggregates can be reduced in cell culture. Furthermore, in cell culture, cells accumulate and aggregate on the bottom portion 27I of the first recess 21I, which can help the growth of cell aggregates.
  • FIG. 26 is a cross-sectional view of a cell culture portion 20J of a cell culture vessel of the twelfth modification.
  • the shape of the bottom portion 27J of the first concave portion 21J of the cell culture portion 20J is such that the opening area of the first concave portion 21J becomes smaller as it approaches the deepest portion of the bottom portion 27J from the first surface 10JA side.
  • a bottom portion 27J of the first concave portion 21J has a U-shaped cross section perpendicular to the base 10J.
  • this embodiment is the same as the second embodiment, and the deepest portion of the bottom 27J of the first recess 21J is provided with a projection 22J which is hollow and has a second recess 23J provided therein. Further, the wall portion 28J forming the bottom portion 27J of the first concave portion 21J is thinner than the base 10J and is made of a material having oxygen permeability.
  • oxygen deficiency in cell aggregates can be reduced in cell culture. Furthermore, in cell culture, cells accumulate and aggregate at the bottom 27J of the first concave portion 21J, which can help the growth of cell aggregates.
  • FIG. 27 is a cross-sectional view of a cell culture section 20K of a cell culture vessel of the thirteenth modification.
  • the shape of the bottom 27K of the first concave portion 21K of the cell culture portion 20K is such that the opening area of the first concave portion 21K decreases as it approaches the deepest portion of the bottom portion 27K from the first surface 10KA side.
  • a bottom portion 27K of the first concave portion 21K has a V-shaped cross section perpendicular to the base 10K. Except for the above, it is the same as the second embodiment, and a projection 22K is provided in the deepest part of the bottom 27K of the first recess 21K, which is hollow due to the second recess 23K being provided therein.
  • a wall portion 28K forming a bottom portion 27K of the first concave portion 21K is thinner than the base 10K and made of a material having oxygen permeability.
  • oxygen deficiency in cell aggregates can be reduced in cell culture. Furthermore, in cell culture, cells accumulate and aggregate at the bottom 27K of the first concave portion 21K, which can help the growth of cell aggregates.
  • FIG. 28 is a cross-sectional view of two cell culture sections 20L of the cell culture vessel of this modified example.
  • the cell culture vessel has a plate-like substrate 10L having a first surface 10LA and a second surface 10LB facing each other.
  • the substrate 10L is provided with a first recess 21L that constitutes the cell culture section 20L.
  • the first concave portion 21L has an opening on the first surface 10LA.
  • a protrusion 22L is provided at the bottom of the first recess 21L. 22 L of protrusion parts have the intensity
  • a second recess 23L extending from the second surface 10LB is provided so that at least part of the inside of the protrusion 22L is hollow.
  • the wall portion 25L forming the side wall portion of the first recess portion 21L and the wall portion 26L forming the bottom portion portion is the portion of the substrate 10L where the first recess portion 21L is not provided. It is formed thinner than the thickness.
  • the thickness of the wall portion 25L forming the side wall portion of the first recess portion 21L and the wall portion 26L forming the bottom portion thereof is preferably 25 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the wall portion 25L forming the side wall portion of the first recess portion 21L is provided thinner than the wall portion 26L forming the bottom portion.
  • the thickness of the wall portion 25L forming the side wall portion of the first recess portion 21L formed thinner than the thickness of the portion of the base body 10L where the first recess portion 21L is not provided is, for example, 50 ⁇ m.
  • the thickness of the wall portion 26L forming the bottom portion of the first recess 21L formed thinner than the thickness of the portion of the base 10L where the first recess 21L is not provided is, for example, 100 ⁇ m.
  • a groove 29LA and a groove 29LB are provided on the base 10L from the second surface 10LB side.
  • the groove 29LA is provided so as to divide the cell culture sections 20L in a set when two cell culture sections 20L are set as one set.
  • the groove 29LB is provided so as to separate the other set of cell culture sections 20L.
  • the groove 29LA has, for example, a tapered shape in which the opening width narrows as it approaches the second surface 10LB, and the opening width at the narrowest position is equivalent to the opening diameter of the second recess 23L. Except for the above, it is the same as the second embodiment.
  • FIG. 29 is a graph showing the amount of oxygen permeation with respect to the thickness of polydimethylsiloxane, polystyrene, and polymethylpentene.
  • the amount of oxygen permeation is represented by the volume (cc) of oxygen permeated per unit pressure (1 atm) per unit time (24 h) for each material sample of unit area (m 2 ). , and the thickness ( ⁇ m) of polymethylpentene.
  • graph a shows the oxygen permeability of polydimethylsiloxane
  • graph b shows the oxygen permeability of polystyrene
  • graph c shows the oxygen permeability of polymethylpentene.
  • the walls constituting the bottom surface of the projections and recesses and the walls constituting the sidewalls are made of polydimethylsiloxane or polymethylpentene, thereby reducing oxygen permeation. It is possible to realize projections and walls that are highly flexible.
  • a plurality of inverted truncated conical projections may be provided in one first recess.
  • a configuration may be adopted in which a plurality of protrusions each having a branched tip are provided in one first recess.
  • one first recess may be provided with a plurality of columnar protrusions each having a cylindrical portion at its tip.
  • the substrate may be composed of a laminate of a plurality of layers.

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Abstract

細胞培養において細胞集合体の中心部の酸素不足を低減できる細胞培養容器を提供する。細胞培養容器は、互いに対向する第１面１０Ａ及び第２面１０Ｂを有し、第１面１０Ａに開口を有する少なくとも１個の第１凹部２１が設けられた基体１０と、第１凹部２１の底部に設けられるとともに自立可能な強度を有する突起部２２とを備え、突起部２２の内部の少なくとも一部が中空になるように第２面１０Ｂから延びる第２凹部２３が設けられている構成とする。

Description

細胞培養容器
　本発明は、細胞培養容器に関する。
　再生医療や創薬の研究において、生体内と同等な三次元組織を構築できる三次元細胞培養の重要性が高まっている。三次元細胞培養では、細胞－細胞の相互作用や細胞－細胞外基質の相互作用等の相互作用、栄養素の輸送、細胞移動、アポトーシス、レセプター発現等の作用が二次元細胞培養より高められ、より生体内に近い細胞培養が可能である。
　三次元細胞培養の方法として、複数の培養凹部を有する細胞培養容器を用い、各培養凹部において三次元の細胞集合体を形成させることが知られている。
　例えば、特許文献１には、細胞非接着性の凹陥部を複数有する培養容器に、付着性細胞の懸濁液を注入し、培養容器の凹陥部においてスフェロイドを形成させる方法が開示されている。
　例えば、特許文献２には、上方に開口し、底面部と側面部とを有する培養凹部を少なくとも一つ有し、底面部に開口に向かって延設する突起部が少なくとも一つ設けられた細胞培養容器が開示されている。
　例えば、特許文献３には、ガス透過性膜上に細胞外マトリクスで包埋された肝細胞を配置し、ガス透過性膜側から酸素を供給しつつ肝細胞を培養する肝細胞培養方法が開示されている。
特開２０１０－０８８３４７号公報 特開２０１９－０５０７３４号公報 特許第５８１８００１号公報
　細胞集合体は、その細胞活動により、培養液中の酸素を消費し、表面から中央に向けて拡散により酸素が供給されることを繰り返すため、細胞集合体の中心部で徐々に酸素濃度が低下し、細胞が死滅する可能性がある。特許文献２では、培養凹部に突起部を有するものが提案されているが、酸素濃度の低下による細胞死滅の問題は解決できていない。特許文献２に突起部の内部と外部とを連通する連通孔が開いている構成が開示されているが、連通孔により培養液が循環するものの培養液中の酸素濃度は徐々に低下するため、細胞死滅の問題は解決できていない。
　このため、細胞培養において細胞集合体の中心部の酸素不足を低減することが求められている。
　また、細胞培養において細胞集合体の中心部に限らず酸素濃度が低下して細胞が死滅する可能性があり、細胞集合体の酸素不足を低減することが求められている。
　そこで、本発明は、細胞培養において細胞集合体の中心部の酸素不足を低減できる細胞培養容器を提供することを目的とする。
　また、本発明は、細胞培養において細胞集合体の酸素不足を低減できる細胞培養容器を提供することを目的とする。
　本発明の細胞培養容器は、互いに対向する第１面及び第２面を有し、前記第１面に開口を有する少なくとも１個の第１凹部が設けられた基体と、前記第１凹部の底部に設けられるとともに自立可能な強度を有する突起部とを備え、前記突起部の内部の少なくとも一部が中空になるように前記第２面から延びる第２凹部が設けられている。
　本発明の細胞培養容器は、互いに対向する第１面及び第２面を有し、前記第１面に開口を有する少なくとも１個の凹部が設けられた基体を備え、前記凹部の側壁部を構成する壁部及び底面部を構成する壁部の少なくとも一部が前記基体の前記凹部が設けられていない部分の厚さよりも薄く形成されている。
　本発明の細胞培養容器によれば、細胞培養において細胞集合体の中心部の酸素不足を低減できる細胞培養容器を提供することができる。
　本発明の細胞培養容器によれば、細胞培養において細胞集合体の酸素不足を低減できる細胞培養容器を提供することができる。
図１は、第１実施形態の細胞培養容器の平面図である。 図２は、図１の細胞培養容器の細胞培養部の断面図である。 図３は、ホルダに保持された細胞培養容器の平面図である。 図４は、ホルダに保持された細胞培養容器の断面図である。 図５は、図１の細胞培養容器の細胞培養部における細胞培養の説明図である。 図６は、ポリスチレンとポリジメチルシロキサンの厚みに対する酸素透過量を示すグラフである。 図７は、第１変形例の細胞培養容器の細胞培養部の断面図である。 図８は、図７の細胞培養容器の細胞培養部における細胞培養の説明図である。 図９は、第２変形例の細胞培養容器の細胞培養部の断面図である。 図１０は、図９の細胞培養容器の細胞培養部における細胞培養の説明図である。 図１１は、第３変形例の細胞培養容器の細胞培養部の断面図である。 図１２は、図１１の細胞培養容器の細胞培養部における細胞培養の説明図である。 図１３は、第４変形例の細胞培養容器の細胞培養部の断面図である。 図１４は、第５変形例の細胞培養容器の細胞培養部の断面図である。 図１５は、第６変形例の細胞培養容器の細胞培養部の断面図である。 図１６は、第７変形例の細胞培養容器の斜視図である。 図１７は、第８変形例の細胞培養容器の斜視図である。 図１８は、第２実施形態の細胞培養容器の細胞培養部の断面図である。 図１９は、図１８の細胞培養容器の細胞培養部における細胞培養方法の説明図である。 図２０は底部に中空の突起部が設けられた細胞培養容器を下面からの通気がないように配置して行った細胞培養試験において得られた細胞集合体の顕微鏡写真である。 図２１は底部に中空の突起部が設けられた細胞培養容器を下面からの通気があるように配置して行った細胞培養試験において得られた細胞集合体の顕微鏡写真である。 図２２は底部に中空の突起部が設けられていない細胞培養容器を下面からの通気がないように配置して行った細胞培養試験において得られた細胞集合体の顕微鏡写真である。 図２３は底部に中空の突起部が設けられていない細胞培養容器を下面からの通気があるように配置して行った細胞培養試験において得られた細胞集合体の顕微鏡写真である。 図２４は、第１０変形例の細胞培養容器の細胞培養部の断面図である。 図２５は、第１１変形例の細胞培養容器の細胞培養部の断面図である。 図２６は、第１２変形例の細胞培養容器の細胞培養部の断面図である。 図２７は、第１３変形例の細胞培養容器の細胞培養部の断面図である。 図２８は、第１４変形例の細胞培養容器の細胞培養部の断面図である。 図２９は、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン及びポリメチルペンテンの厚みに対する酸素透過量を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態について説明する。以下に説明する形態はあくまで例示であり、当業者にとって自明な範囲で適宜修正することができる。
＜第１実施形態＞
（細胞培養容器）
　図１は、実施形態の細胞培養容器の平面図である。細胞培養容器１は、少なくとも１個の細胞培養部２０を有する。細胞培養容器１は、例えば、ａ×ｂ＝３０ｍｍ×３０ｍｍの大きさのプレート状の基体１０に、複数個、例えば１１×１０個の細胞培養部２０が、例えば１ｍｍ等の所定のピッチで並べて設けられているマルチウェルプレートである。図面上は１１×１０個の細胞培養部２０が並べられているが、並べられた細胞培養部２０の個数に限定はない。
　図２は、図１の細胞培養容器１の１個の細胞培養部２０の断面図である。細胞培養容器１は、互いに対向する第１面１０Ａ及び第２面１０Ｂを有するプレート状の基体１０を有する。基体１０に、細胞培養部２０を構成する第１凹部２１が設けられている。第１凹部２１は、第１面１０Ａに開口を有する。第１凹部２１の底部に突起部２２が設けられている。突起部２２は自立可能な強度を有する。突起部２２の内部の少なくとも一部が中空になるように第２面１０Ｂから延びる第２凹部２３が設けられている。
　第１凹部２１は、突起部２２の表面と、突起部２２が設けられた底部と、底部と第１面１０Ａの開口の縁部との間を区画する側面部とから構成されている。ここで、基体１０の厚さ（第１面１０Ａ及び第２面１０Ｂに垂直な方向の厚さ）は、例えば２００μｍ～２０００μｍである。第１凹部２１の第１面１０Ａにおける開口は、例えば、第１面１０Ａに垂直な方向から見て略円形であり、２００μｍφ～１２００μｍφの大きさである。第１凹部２１の深さは、例えば１５０μｍ～８００μｍである。第１凹部２１の底部は第１面１０Ａに垂直な方向から見て第１凹部２１の開口より小さく形成されており、第１凹部２１の側面部は開口側ほど広がり、底部側ほど狭まる順テーパー状の斜面となっている。あるいは、第１凹部２１は、略半球面等の曲面を有する凹部であってもよい。
　突起部２２は柱状形状であり、例えば円柱状形状を有する。例えば３０μｍ～２００μｍの径の大きさの円柱状形状である。第２凹部２３は、突起部２２の形状に合わせた形状である。好ましくは、突起部２２の表面から第２凹部２３の表面までの突起部２２の平均の厚さが１０μｍ～１００μｍである。突起部２２の表面から第２凹部２３の表面までの突起部２２の厚さは、突起部２２の側面方向に、あるいは側面方向及び上面方向に、均等になるように設けられていることが好ましいが、不均等である部分があってもよい。例えば、製造上実現できる均等な厚さの範囲内であることが好ましい。具体的には、突起部２２は上面が１００μｍφの大きさの円である円柱形状であり、第２凹部２３は５０μｍφの大きさで形成されており、突起部２２の表面から第２凹部２３の表面までの突起部２２の平均の厚さが２５μｍである。あるいは、突起部２２は上面が２００μｍφの大きさの円である円柱形状であり、第２凹部２３は１００μｍφの大きさで形成されており、突起部２２の表面から第２凹部２３の表面までの突起部２２の平均の厚さが５０μｍである。このように突起部２２の表面から第２凹部２３の表面までの突起部２２の平均の厚さが薄く形成されていることにより、突起部２２の酸素透過性が高められている。
　あるいは、好ましくは、突起部２２の表面から第２凹部２３の表面までの突起部２２の平均の厚さが、突起部２２の径又は幅の１／２以下であり、このような厚さであることで突起部２２の酸素透過性が高められている。
　突起部２２は自立可能な強度を有する。ここで、自立可能な強度とは、細胞培養容器１の未使用時及び使用時において、自重あるいは使用時において細胞集合体からかかる応力等によって変形しない程度の強度を有することを示す。
　上記の形状の突起部２２を有する第１凹部２１は、切削加工あるいは射出成型等により形成できる。また、第２凹部２３は、ドリルによる切削加工等により形成できる。
　細胞培養容器１は、少なくとも突起部２２が酸素透過性の高い材料で形成されていることが好ましい。例えば、ＰＮＩＰＡＭ（ポリＮ－イソプロピルアクリルアミド）等のポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン、あるいはＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等のシリコン含有樹脂を用いることができる。
　酸素透過量は、例えば単位面積、単位厚さの各材料の試料に対して、単位時間、単位圧力あたりにおいて透過する酸素の体積で表される。上記の材料の酸素透過量は、概ねの傾向で、ポリアミドが最も低く、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリスチレン、シリコン含有樹脂の順に高くなってゆく。突起部２２は、より好ましくは、ポリアミドより酸素透過性が高い材料で構成されている。例えば、単位面積（ｍ２）の２００μｍの厚さの各材料の試料に対する単位時間（２４ｈ）、単位圧力（１ａｔｍ）あたりにおいて透過する酸素の体積（ｃｃ）が、８００００ｃｃ以上であることが好ましい。
　基体１０の突起部２２を除く部分は、どのような酸素透過量の材料で形成されていてもよい。但し、突起部２２と一体に形成されている部分については、突起部２２と同一の材料で形成されている。
　突起部２２の表面は、細胞非接着性の表面である。細胞非接着性の表面は、例えば親水性の高い物質を用いた表面である。あるいは、界面活性剤、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、アガロース、及びアルブミンなどのコーティング、プラズマ処理などの表面処理を行った表面であってもよい。親水性の高い物質としては、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリ酢酸ビニルのケン化物、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、ポリペンタエリスリトールトリアクリレート、ポリペンタエリスリトールテトラアクリレート、ポリジエチレングリコールジアクリレート等が挙げられる。細胞非接着性の表面は、プラズマ処理により表面改質をされた表面、あるいは紫外線照射処理により表面改質をされた表面であってもよい。
　あるいは、突起部２２の表面は細胞接着性の表面であってもよい。細胞接着性の表面は、例えば疎水性の高い物質を用いた表面であり、例えば疎水性の高い物質でコーティングされた表面である。また、突起部２２の表面を除く第１凹部２１の表面については、基本的に細胞非接着性の表面であるが、一部あるいは全部について、細胞接着性の表面であってもよい。この場合、培養後の細胞集合体の脱着が困難となることがある。これに対応するため、突起部２２の表面のみをＰＮＩＰＡＭのような温度応答性材料でコーティングすることで、培養中の温度では突起部２２の表面に細胞を凝集させ、培養後に細胞集合体を突起部２２から脱着可能とする構成としてもよい。
　図３は、ホルダに保持された細胞培養容器１の平面図である。図４は、図３のＸ～Ｘ’における、ホルダに保持された細胞培養容器１の断面図である。ホルダ２は、細胞培養容器１を保持するための保持用凹部２Ａが設けられている。図面上は６個の保持用凹部２Ａが設けられている。保持用凹部２Ａの底に、プレート状の細胞培養容器１が保持される。ここで、保持用凹部２Ａの底の端部には係止部２Ｂが設けられており、細胞培養容器１は係止部２Ｂで係止して保持用凹部２Ａの底から離間するように保持される。ホルダ２は、細胞培養時において不図示の蓋部で覆われていてもよい。
（細胞培養方法）
　図５は、本実施形態の細胞培養容器１の細胞培養部２０における細胞培養の説明図である。図５に示すように、細胞培養容器１の細胞培養部２０において、第１凹部２１に培養液３０が収容されて用いられる。培養液とは、細胞を培養するための細胞培養液である。培養液３０は、細胞の育成に用いられる栄養分を含み、細胞の生育環境を提供する。培養液３０は、細胞を培養するために通常使用される培養液を使用することが可能であり、培養する細胞の種類によって適宜決定できる。例えば、無機塩、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、タンパク質、ペプチド、コラーゲン、脂肪酸、脂質、血清等を、緩衝溶液中に含有させたものである。具体的には、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地)を用いることができる。
　培養される細胞は、培養により細胞集合体を形成可能であれば特に限定されず、例えば接着性を有する細胞等が挙げられる。接着性を有する細胞として、肝臓癌細胞、肝芽腫細胞、ヘパトーマ細胞、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞、又は幹細胞、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）及びｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）等が挙げられる。幹細胞は、例えば骨髄未分化間葉幹細胞、造血幹細胞、血管幹細胞、神経幹細胞、小腸幹細胞、脂肪幹細胞、皮膚幹細胞、歯周組織幹細胞、毛様体幹細胞、角膜輪部幹細胞、内臓幹細胞等である。
　図５に示すように、第１凹部２１に収容された培養液３０に細胞を懸濁し、培養に適した温湿度で保持して、培養液３０中で細胞を培養する。ここで、適切に条件を選択することで突起部２２の周りに三次元の細胞集合体５０を培養することができる。
　ここで、細胞集合体５０は酸素を消費し、細胞集合体５０の中心部において徐々に酸素濃度が低下し、細胞が死滅する可能性がある。本実施形態では、図５に示すように、突起部２２の内部が中空になるように第２面１０Ｂから延びる第２凹部２３が設けられており、酸素透過性を有するので、第２面１０Ｂから第２凹部２３を通して空気中の酸素４０を三次元の細胞集合体５０の中心部に供給することができる。細胞培養において細胞集合体５０の中心部の酸素不足を低減できる。
（細胞培養容器の作用・効果）
　本実施形態の細胞培養容器１によれば、突起部２２の内部が中空になるように第２面１０Ｂから延びる第２凹部２３が設けられており、酸素透過性を有するので、第２面１０Ｂから第２凹部２３を通して空気中の酸素４０を三次元の細胞集合体５０の中心部に供給することができる。細胞培養において細胞集合体５０の中心部の酸素不足を低減できる。
（第１実施例）
　図６は、ＰＳ（ポリスチレン）とＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）の厚みに対する酸素透過量を示すグラフである。酸素透過量は、単位面積（ｍ２）の各材料の試料に対する単位時間（２４ｈ）、単位圧力（１ａｔｍ）あたりにおいて透過する酸素の体積（ｃｃ）で表され、図６ではＰＳとＰＤＭＳの厚み（μｍ）に対して示されている。図６中、四角印（□）でＰＳの酸素透過量を示す。また丸印（〇）でＰＤＭＳの酸素透過量を示す。ＰＤＭＳは、ＰＳよりも酸素透過量が概ね１０倍以上高いことが確認された。本実施形態の細胞培養容器１において少なくとも突起部２２をＰＤＭＳで形成することで、酸素透過性の高い突起部を実現することができる。
（第１変形例）
　図７は、第１変形例の細胞培養容器の細胞培養部２０Ａの断面図である。上記の実施形態では、基体１０は１枚のプレート上の部材で構成されているが、これに限らず、複数層の積層体で構成されてもよい。第１基体１１及び第２基体１２の積層体である基体１０ＳＡに、細胞培養部２０Ａを構成する第１凹部２１Ａが設けられている。例えば、第１基体１１の貫通開口と突起部２２Ａが設けられた第２基体１２とを位置合わせして積層して形成されている。第１凹部２１Ａは、第１面１１Ａに開口を有する。第１凹部２１Ａの底部に突起部２２Ａが設けられている。突起部２２Ａは自立可能な強度を有する。突起部２２Ａの内部の少なくとも一部が中空になるように第２面１２Ｂから延びる第２凹部２３Ａが設けられている。第１基体１１は、酸素透過性がどのようなものでもよいので、第１基体１１を構成する材料に特に限定はない。第１基体１１は、酸素透過性が問われないので、必要な強度の基体を用いることができる。第１基体１１に対しては貫通開口が形成されるのみであるので、加工が容易である。第２基体１２は、突起部２２Ａと一体に形成されており、上記の実施形態と同様に酸素透過性が高い材料で構成されていることが好ましい。また、例えば第１基体１１の表面を細胞接着性の表面とし、第２基体１２の表面を細胞非接着性の表面とする。第１基体１１の表面は、細胞非接着性の表面であってもよい。上記を除いては、上記の実施形態と同様である。
　図８は、図７の細胞培養容器の細胞培養部２０Ａにおける細胞培養の説明図である。第１凹部２１Ａに培養液３０を収容し、収容された培養液３０に細胞を懸濁し、培養に適した温湿度で保持して、培養液３０中で細胞を培養する。ここで、適切に条件を選択することで突起部２２Ａの周りに三次元の細胞集合体５０を培養することができる。突起部２２Ａの内部が中空になるように第２面１２Ｂから延びる第２凹部２３Ａが設けられており、酸素透過性を有するので、第２面１２Ｂから第２凹部２３Ａを通して空気中の酸素４０を三次元の細胞集合体５０の中心部に供給することができる。細胞培養において細胞集合体５０の中心部の酸素不足を低減できる。
（第２変形例）
　図９は、第２変形例の細胞培養容器の細胞培養部２０Ｂの断面図である。上記の実施形態では、基体１０は１枚のプレート上の部材で構成されているが、これに限らず、複数層の積層体で構成されてもよい。第１基体１３及び第２基体１４の積層体である基体１０ＳＢに、細胞培養部２０Ｂを構成する第１凹部２１Ｂが設けられている。例えば、上記の実施形態同様に、第１基体１３に第１凹部２１Ｂ、突起部２２Ｂ、及び第２凹部２３Ｂが設けられている。第２基体１４には第１凹部２１Ｂに相当する位置に貫通開口が設けられている。第１基体１３の第１凹部２１Ｂと第２基体１４の貫通開口とが位置合わせして積層して形成されている。第２基体１４は、第１基体１３の強度を高める部材である。上記を除いては、上記の実施形態と同様である。
　図１０は、図９の細胞培養容器の細胞培養部２０Ｂにおける細胞培養の説明図である。第１凹部２１Ｂに培養液３０を収容し、収容された培養液３０に細胞を懸濁し、培養に適した温湿度で保持して、培養液３０中で細胞を培養する。ここで、適切に条件を選択することで突起部２２Ｂの周りに三次元の細胞集合体５０を培養することができる。突起部２２Ｂの内部が中空になるように第２面１４Ｂの側から延びる第２凹部２３Ｂが設けられており、酸素透過性を有するので、第２面１４Ｂから第２凹部２３Ｂを通して空気中の酸素４０を三次元の細胞集合体５０の中心部に供給することができる。細胞培養において細胞集合体５０の中心部の酸素不足を低減できる。
（第３変形例）
　図１１は、第３変形例の細胞培養容器の細胞培養部２０Ｃの断面図である。上記の実施形態では、１個の第１凹部に対して１個の突起部が設けられた構成であるが、これに限らず、１個の第１凹部に対して複数個の突起部が形成されていてもよい。基体１０Ｃに、細胞培養部２０Ｃを構成する第１凹部２１Ｃが設けられている。第１凹部２１Ｃの底部に、複数個の突起部２２ＣＡ、２２ＣＢ、・・・２２ＣＸが設けられている。突起部２２ＣＡ、２２ＣＢ、・・・２２ＣＸのそれぞれに対して、第２凹部２３ＣＡ、２３ＣＢ、・・・２３ＣＸが設けられている。上記を除いては、上記の実施形態と同様である。
　図１２は、図１１の細胞培養容器の細胞培養部２０Ｃにおける細胞培養の説明図である。第１凹部２１Ｃに培養液３０を収容し、収容された培養液３０に細胞を懸濁し、培養に適した温湿度で保持して、培養液３０中で細胞を培養する。ここで、適切に条件を選択することで突起部２２ＣＡ、２２ＣＢ、・・・２２ＣＸの周りにシート状の三次元の細胞集合体５０Ｃを培養することができる。突起部２２ＣＡ、２２ＣＢ、・・・２２ＣＸの内部が中空になるように第２面１０ＣＢから延びる第２凹部２３ＣＡ、２３ＣＢ、・・・２３ＣＸが設けられており、酸素透過性を有するので、第２面１０ＣＢから第２凹部２３ＣＡ、２３ＣＢ、・・・２３ＣＸを通して空気中の酸素４０を三次元の細胞集合体５０Ｃの内部に供給することができる。細胞培養において細胞集合体５０Ｃの内部の酸素不足を低減できる。
（第４変形例）
　図１３は、第４変形例の細胞培養容器の細胞培養部２０Ｄの断面図である。上記の実施形態では、突起部は円柱状形状であったが、これに限らず、その他の形状であってもよい。本変形例では、逆円錐台形状の外形の突起部２２Ｄが設けられている。突起部２２Ｄは自立可能な強度を有する。突起部２２Ｄの内部の少なくとも一部が中空になるように第２面１０ＤＢから延びる第２凹部２３Ｄが設けられている。第２凹部２３Ｄは、逆円錐台形状の外形の突起部２２Ｄの形状に合わせて、突起部２２Ｄの先端に近づくほど広くなっていてもよい。これにより、突起部２２Ｄの表面から第２凹部２３Ｄの表面までの突起部２２Ｄの厚さが、例えば突起部の側面方向に、あるいは側面方向及び上面方向に均等になるようにできる。上記を除いては、上記の実施形態と同様である。
　第１凹部２１Ｄに培養液３０を収容し、収容された培養液３０に細胞を懸濁し、培養に適した温湿度で保持して、培養液３０中で三次元の細胞集合体５０を培養することができる。第２面１０ＤＢから第２凹部２３Ｄを通して空気中の酸素４０を三次元の細胞集合体５０の中心部に供給することができ、細胞集合体５０の中心部の酸素不足を低減できる。また、逆円錐台形状の外形の突起部２２Ｄからの細胞集合体５０の脱離は容易ではないので、培養中の細胞集合体５０の意図しない脱離を抑制できる。
（第５変形例）
　図１４は、第５変形例の細胞培養容器の細胞培養部２０Ｅの断面図である。上記の実施形態では、突起部は円柱状形状であったが、これに限らず、その他の形状であってもよい。本変形例では、先端が枝別れした形状を有する突起部２２Ｅが設けられている。突起部２２Ｅは、枝部２２ＥＡ、２２ＥＢ、２２ＥＣ、２２ＥＤを有する。突起部２２Ｅは自立可能な強度を有する。突起部２２Ｅの内部の少なくとも一部が中空になるように第２面１０ＥＢから延びる第２凹部２３Ｅが設けられている。第２凹部２３Ｅは、先端が枝分かれした突起部２２Ｅの形状に合わせて、先端が枝分かれした形状となっていてもよい。これにより、突起部２２Ｅの表面から第２凹部２３Ｅの表面までの突起部２２Ｅの厚さが、例えば突起部２２Ｅの側面方向や上面方向等のいずれの方向にも均等になるようにできる。あるいは、第２凹部２３Ｅは、突起部２２Ｅの枝分かれした部分を除く幹の部分のみに設けられ、先端までは達していなくてもよい。上記を除いては、上記の実施形態と同様である。
　第１凹部２１Ｅに培養液３０を収容し、収容された培養液３０に細胞を懸濁し、培養に適した温湿度で保持して、培養液３０中で三次元の細胞集合体５０を培養することができる。第２面１０ＥＢから第２凹部２３Ｅを通して空気中の酸素４０を三次元の細胞集合体５０の中心部に供給することができ、細胞集合体５０の中心部の酸素不足を低減できる。また、枝分かれした形状の外形の突起部２２Ｅからの細胞集合体５０の脱離は容易ではないので、培養中の細胞集合体５０の意図しない脱離を抑制できる。また、枝分かれした形状の外形の突起部２２Ｅであることにより、細胞集合体５０の形状をより制御して成長させることができる。
（第６変形例）
　図１５は、第６変形例の細胞培養容器の細胞培養部２０Ｆの断面図である。上記の実施形態では、突起部は円柱状形状であったが、これに限らず、その他の形状であってもよい。本変形例では、円柱状の突起部２２Ｆの先端に円筒状の筒状部２４が設けられている。筒状部２４は、突起部２２Ｆと同一の径の中空円筒であり、下端が突起部２２Ｆの上面に接続し、上端は解放されている。筒状部２４の側面には、複数箇所において開口部２４Ａが設けられている。上記を除いては、上記の実施形態と同様である。
　第１凹部２１Ｆに培養液３０を収容し、収容された培養液３０に細胞を懸濁し、培養に適した温湿度で保持して、培養液３０中で三次元の細胞集合体５０を培養することができる。筒状部２４は、開口部２４Ａを通して培養液３０の対流が流れることが可能であり、細胞に必要な培養液３０中の要素を筒状部２４の内外に供給できる。第２面１０ＦＢから第２凹部２３Ｆを通して空気中の酸素４０を三次元の細胞集合体５０の中心部に供給することができ、細胞集合体５０の中心部の酸素不足を低減できる。また、培養中に行われる培養液交換の効果が細胞集合体５０の内部にも付与されるという利点がある。この場合、筒状部２４の上方の開口部２４Ａから新鮮な培養液３０を供給するため、細胞集合体５０が開口部２４Ａを塞がないように、細胞集合体５０の形状がドーナツ状となるように成長させる。
（第７変形例）
　図１６は、第７変形例の細胞培養容器の斜視図である。細胞培養容器１Ａは、プレート状の基体１０に、例えば総計約５００個の細胞培養部２０が並べて設けられている。細胞培養部２０の形状は、例えば、開口部の直径が約６００μｍ、底面の直径が約４００μｍ、深さが約４００μｍの、逆円錐台の形状である。細胞培養部２０は、上記の実施形態及び各変形例と同様の構成を有する。
（第８変形例）
　図１７は、第８変形例の細胞培養容器の斜視図である。細胞培養容器１Ｂは、プレート状の基体１０に、例えば総計４００個の細胞培養部２０が並べて設けられている。細胞培養部２０の形状は、例えば、開口部が一辺約６００μｍの正方形、底面が一辺約４００μｍの正方形、深さが約４００μｍの、逆正四角錐台の形状である。細胞培養部２０は、上記の実施形態及び各変形例と同様の構成を有する。
＜第２実施形態＞
（細胞培養容器）
　図１８は、本実施形態の細胞培養容器の２個の細胞培養部２０Ｇの断面図である。細胞培養容器は、互いに対向する第１面１０ＧＡ及び第２面１０ＧＢを有するプレート状の基体１０Ｇを有する。基体１０Ｇに、細胞培養部２０Ｇを構成する第１凹部２１Ｇが設けられている。第１凹部２１Ｇは、第１面１０ＧＡに開口を有する。第１凹部２１Ｇの底部に突起部２２Ｇが設けられている。突起部２２Ｇは自立可能な強度を有する。突起部２２Ｇの内部の少なくとも一部が中空になるように第２面１０ＧＢから延びる第２凹部２３Ｇが設けられている。
　本実施形態の細胞培養容器は、第１凹部２１Ｇの側壁部を構成する壁部２５Ｇ及び底面部を構成する壁部２６Ｇの少なくとも一部が基体１０Ｇの第１凹部２１Ｇが設けられていない部分の厚さよりも薄く形成されている。図１８に示す細胞培養容器では、第１凹部２１Ｇの深さは基体１０Ｇの第１凹部２１Ｇが設けられていない部分の厚さより大きく、第１凹部２１Ｇは基体１０Ｇの第２面１０ＧＢから突出している形状となっている。この場合、基体１０Ｇの第２面１０ＧＢから突出している部分の側壁部を構成する壁部２５Ｇ、及び第１凹部２１Ｇの底面部を構成する壁部２６Ｇの全部が、基体１０Ｇの第１凹部２１Ｇが設けられていない部分の厚さよりも薄く形成されていることが好ましい。第１凹部２１Ｇの側壁部を構成する壁部２５Ｇの厚さは、例えば基体１０Ｇの第２面１０ＧＢ側から設けられた溝２９ＧＡ、２９ＧＢの幅により調整可能である。第１凹部２１Ｇの底面部を構成する壁部２６Ｇの厚さは、例えば基体１０Ｇの第１凹部２１Ｇの深さにより調整可能である。
　基体１０Ｇの第１凹部２１Ｇが設けられていない部分の厚さよりも薄く形成されている第１凹部２１Ｇの側壁部を構成する壁部２５Ｇ及び底面部を構成する壁部２６Ｇの厚さは、２５μｍ～５００μｍであることが好ましく、例えば１００μｍである。第１凹部２１Ｇの側壁部を構成する壁部２５Ｇ及び底面部を構成する壁部２６Ｇの厚さは、互いに異なっていてもよく、例えば第１凹部２１Ｇの側壁部を構成する壁部２５Ｇは底面部を構成する壁部２６Ｇより薄く設けられていてもよい。
　基体１０Ｇの第１凹部２１Ｇが設けられていない部分の厚さよりも薄く形成されている第１凹部２１Ｇの側壁部を構成する壁部２５Ｇ及び底面部を構成する壁部２６Ｇの少なくとも一部は、酸素透過性を有する材料で形成されていることが好ましい。基体１０Ｇの第１凹部２１Ｇが設けられていない部分の厚さよりも薄く形成されている、基体１０Ｇの第２面１０ＧＢから突出している部分の側壁部を構成する壁部２５Ｇ、及び第１凹部２１Ｇの底面部を構成する壁部２６Ｇの全部が、酸素透過性を有する材料で形成されていることがさらに好ましい。また、細胞培養容器全体が酸素透過性の高い材料で形成されていてもよい。
　酸素透過性の高い材料としては、例えば、ＰＮＩＰＡＭ（ポリＮ－イソプロピルアクリルアミド）等のポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン、あるいはＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等のシリコン含有樹脂を用いることができる。酸素透過性は、概ねの傾向で、ポリアミドが最も低く、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリスチレン、シリコン含有樹脂の順に高くなってゆく。酸素透過性が高い材料としては、ポリアミドより酸素透過性を高い材料が好ましく、例えば、ポリジメチルシロキサン、ポリスチレン、ポリメチルペンテンが挙げられる。
　上記を除いては第１実施形態と同様である。
（細胞培養方法）
　図１９は、本実施形態の細胞培養容器の細胞培養部における細胞培養方法の説明図である。図１９に示すように、細胞培養容器の細胞培養部２０Ｇにおいて、第１凹部２１Ｇに培養液３０Ｇが収容されて用いられる。第１凹部２１Ｇに収容された培養液３０Ｇに細胞を懸濁し、培養に適した温湿度で保持して、培養液３０Ｇ中で細胞を培養する。ここで、適切に条件を選択することで突起部２２Ｇの周りに三次元の細胞集合体５０Ｇを培養することができる。
　ここで、細胞集合体５０Ｇは酸素を消費し、細胞集合体５０Ｇの中心部において徐々に酸素濃度が低下し、細胞が死滅する可能性がある。本実施形態では、図１９に示すように、突起部２２Ｇの内部が中空になるように第２面１０ＧＢから延びる第２凹部２３Ｇが設けられており、酸素透過性を有するので、第２面１０ＧＢから第２凹部２３Ｇを通して空気中の酸素４０ＧＡを三次元の細胞集合体５０Ｇの中心部に供給することができる。細胞培養において細胞集合体５０Ｇの中心部の酸素不足を低減できる。
　さらに、細胞培養において細胞集合体５０Ｇの中心部に限らず酸素濃度が低下して細胞が死滅する可能性がある。本実施形態の細胞培養容器では、第１凹部２１Ｇの側壁部を構成する壁部２５Ｇ及び底面部を構成する壁部２６Ｇの少なくとも一部が基体１０Ｇの第１凹部２１Ｇが設けられていない部分の厚さよりも薄く形成されており、酸素透過性を有する。これにより、第１凹部２１Ｇの側壁部を構成する壁部２５Ｇを通して空気中の酸素４０ＧＢを三次元の細胞集合体５０の表面に供給することができる。また、底面部を構成する壁部２６Ｇを通して空気中の酸素４０ＧＣを三次元の細胞集合体５０の表面に供給することができる。このようにして、細胞培養において細胞集合体の酸素不足を低減できる。
（細胞培養容器の作用・効果）
　本実施形態の細胞培養容器によれば、突起部２２Ｇの内部が中空になるように第２面１０ＧＢから延びる第２凹部２３Ｇが設けられており、酸素透過性を有するので、第２面１０ＧＢから第２凹部２３Ｇを通して空気中の酸素４０ＧＡを三次元の細胞集合体５０Ｇの中心部に供給することができる。細胞培養において細胞集合体の中心部の酸素不足を低減できる。
　また、第１凹部２１Ｇの側壁部を構成する壁部２５Ｇ及び底面部を構成する壁部２６Ｇの少なくとも一部が基体１０Ｇの第１凹部２１Ｇが設けられていない部分の厚さよりも薄く形成されており、酸素透過性を有するので、第１凹部２１Ｇの側壁部を構成する壁部２５Ｇを通して空気中の酸素４０ＧＢを三次元の細胞集合体５０Ｇの表面に供給し、第１凹部２１Ｇの底面部を構成する壁部２６Ｇを通して空気中の酸素４０ＧＣを三次元の細胞集合体５０Ｇの表面に供給することができる。細胞培養において細胞集合体の酸素不足を低減できる。
（第９変形例）
　本変形例の細胞培養容器は、第２実施形態の細胞培養容器において、突起部が設けられていない構成である。これを除いては第２実施形態と同様である。
　第１凹部の側壁部を構成する壁部及び底面部を構成する壁部の少なくとも一部が基体の第１凹部が設けられていない部分の厚さよりも薄く形成されており、酸素透過性を有するので、壁部を通して空気中の酸素を三次元の細胞集合体５０の表面に供給することができる。細胞培養において細胞集合体の酸素不足を低減できる。
（第２実施例）
　第２実施形態の細胞培養容器及び第９変形例の細胞培養容器を用いて、細胞培養容器を保持するシャーレとして通気用の孔が設けられたシャーレと設けられていないシャーレを準備し、細胞培養容器を下面からの通気があるようにした場合及び通気がないようした場合でそれぞれ細胞培養試験を行った。得られた細胞集合体を中心部近傍が露出するように切断し、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色によって生存している細胞のみを染色し、顕微鏡写真を撮影した。突起部を有する細胞培養容器を用いて培養した細胞集合体を切断する場合は、突起部が設けられたことに対応する孔部を横切るようにして切断した。
　図２０は底部に中空の突起部が設けられた細胞培養容器を下面からの通気がないように配置して行った細胞培養試験において得られた細胞集合体の顕微鏡写真である。図２１は底部に中空の突起部が設けられた細胞培養容器を下面からの通気があるように配置して行った細胞培養試験において得られた細胞集合体の顕微鏡写真である。図２２は底部に中空の突起部が設けられていない細胞培養容器を下面からの通気がないように配置して行った細胞培養試験において得られた細胞集合体の顕微鏡写真である。図２３は底部に中空の突起部が設けられていない細胞培養容器を下面からの通気があるように配置して行った細胞培養試験において得られた細胞集合体の顕微鏡写真である。
　図２０からわかるように、底部に中空の突起部が設けられた細胞培養容器を用いることで細胞集合体ＣＡの中心部Ｈの細胞の死滅が低減された。細胞培養容器を下面からの通気がないことで、細胞集合体ＣＡの一部が死滅していた。図２１からわかるように、底部に中空の突起部が設けられた細胞培養容器を用いることで細胞集合体ＣＡの中心部Ｈの細胞の死滅が低減された。細胞培養容器を下面からの通気があることで、細胞集合体ＣＡの全体的な死滅が低減された。図２２からわかるように、突起部が設けられていない細胞培養容器を用いて細胞培養容器を下面からの通気がないように培養したことで、細胞集合体ＣＡの中心部を含めて全体的に一部が死滅していた。図２３からわかるように、突起部が設けられていない細胞培養容器を用いたが細胞培養容器を下面からの通気があることで、細胞集合体ＣＡの全体的な死滅が低減された。
（第１０変形例）
　図２４は、第１０変形例の細胞培養容器の細胞培養部２０Ｈの断面図である。細胞培養部２０Ｈの第１凹部２１Ｈの底部２７Ｈの形状が、第１面１０ＨＡの側から底部２７Ｈの最も深い部分に近づくにつれて第１凹部２１Ｈの開口面積が小さくなる形状である。第１凹部２１Ｈの底部２７Ｈの形状が、基体１０Ｈに垂直な断面でＵ字型の形状である。上記を除いては第１実施形態と同様であり、第１凹部２１Ｈの底部２７Ｈの最も深い部分に、内部に第２凹部２３Ｈが設けられて中空となった突起部２２Ｈが設けられている。
　本変形例の細胞培養容器によれば、細胞培養において細胞集合体の酸素不足を低減できる。さらに、細胞培養において細胞が第１凹部２１Ｈの底部２７Ｈにたまって凝集し、細胞集合体の成長を助けることができる。
（第１１変形例）
　図２５は、第１１変形例の細胞培養容器の細胞培養部２０Ｉの断面図である。細胞培養部２０Ｉの第１凹部２１Ｉの底部２７Ｉの形状が、第１面１０ＩＡの側から底部２７Ｉの最も深い部分に近づくにつれて第１凹部２１Ｉの開口面積が小さくなる形状である。第１凹部２１Ｉの底部２７Ｉの形状が、基体１０Ｉに垂直な断面でＶ字型の形状である。上記を除いては第１実施形態と同様であり、第１凹部２１Ｉの底部２７Ｉの最も深い部分に、内部に第２凹部２３Ｉが設けられて中空となった突起部２２Ｉが設けられている。
　本変形例の細胞培養容器によれば、細胞培養において細胞集合体の酸素不足を低減できる。さらに、細胞培養において細胞が第１凹部２１Ｉの底部２７Ｉにたまって凝集し、細胞集合体の成長を助けることができる。
（第１２変形例）
　図２６は、第１２変形例の細胞培養容器の細胞培養部２０Ｊの断面図である。細胞培養部２０Ｊの第１凹部２１Ｊの底部２７Ｊの形状が、第１面１０ＪＡの側から底部２７Ｊの最も深い部分に近づくにつれて第１凹部２１Ｊの開口面積が小さくなる形状である。第１凹部２１Ｊの底部２７Ｊの形状が、基体１０Ｊに垂直な断面でＵ字型の形状である。上記を除いては第２実施形態と同様であり、第１凹部２１Ｊの底部２７Ｊの最も深い部分に、内部に第２凹部２３Ｊが設けられて中空となった突起部２２Ｊが設けられている。また、第１凹部２１Ｊの底部２７Ｊを構成する壁部２８Ｊが基体１０Ｊより薄く、酸素透過性を有する材料で形成されている。
　本変形例の細胞培養容器によれば、細胞培養において細胞集合体の酸素不足を低減できる。さらに、細胞培養において細胞が第１凹部２１Ｊの底部２７Ｊにたまって凝集し、細胞集合体の成長を助けることができる。
（第１３変形例）
　図２７は、第１３変形例の細胞培養容器の細胞培養部２０Ｋの断面図である。細胞培養部２０Ｋの第１凹部２１Ｋの底部２７Ｋの形状が、第１面１０ＫＡの側から底部２７Ｋの最も深い部分に近づくにつれて第１凹部２１Ｋの開口面積が小さくなる形状である。第１凹部２１Ｋの底部２７Ｋの形状が、基体１０Ｋに垂直な断面でＶ字型の形状である。上記を除いては第２実施形態と同様であり、第１凹部２１Ｋの底部２７Ｋの最も深い部分に、内部に第２凹部２３Ｋが設けられて中空となった突起部２２Ｋが設けられている。また、第１凹部２１Ｋの底部２７Ｋを構成する壁部２８Ｋが基体１０Ｋより薄く、酸素透過性を有する材料で形成されている。
　本変形例の細胞培養容器によれば、細胞培養において細胞集合体の酸素不足を低減できる。さらに、細胞培養において細胞が第１凹部２１Ｋの底部２７Ｋにたまって凝集し、細胞集合体の成長を助けることができる。
（第１４変形例）
　図２８は、本変形例の細胞培養容器の２個の細胞培養部２０Ｌの断面図である。細胞培養容器は、互いに対向する第１面１０ＬＡ及び第２面１０ＬＢを有するプレート状の基体１０Ｌを有する。基体１０Ｌに、細胞培養部２０Ｌを構成する第１凹部２１Ｌが設けられている。第１凹部２１Ｌは、第１面１０ＬＡに開口を有する。第１凹部２１Ｌの底部に突起部２２Ｌが設けられている。突起部２２Ｌは自立可能な強度を有する。突起部２２Ｌの内部の少なくとも一部が中空になるように第２面１０ＬＢから延びる第２凹部２３Ｌが設けられている。
　本変形例の細胞培養容器は、第１凹部２１Ｌの側壁部を構成する壁部２５Ｌ及び底面部を構成する壁部２６Ｌの少なくとも一部が基体１０Ｌの第１凹部２１Ｌが設けられていない部分の厚さよりも薄く形成されている。第１凹部２１Ｌの側壁部を構成する壁部２５Ｌ及び底面部を構成する壁部２６Ｌの厚さは、２５μｍ～５００μｍであることが好ましい。本変形例では、第１凹部２１Ｌの側壁部を構成する壁部２５Ｌは底面部を構成する壁部２６Ｌより薄く設けられている。基体１０Ｌの第１凹部２１Ｌが設けられていない部分の厚さよりも薄く形成されている第１凹部２１Ｌの側壁部を構成する壁部２５Ｌの厚さは、例えば５０μｍである。基体１０Ｌの第１凹部２１Ｌが設けられていない部分の厚さよりも薄く形成されている第１凹部２１Ｌの底面部を構成する壁部２６Ｌの厚さは、例えば１００μｍである。
　基体１０Ｌには第２面１０ＬＢ側から溝２９ＬＡ及び溝２９ＬＢが設けられている。溝２９ＬＡは、２個の細胞培養部２０Ｌを１組としたときの組内の細胞培養部２０Ｌを区分するように設けられている。溝２９ＬＢは他の組の細胞培養部２０Ｌとの間を区分するように設けられている。溝２９ＬＡは、例えば第２面１０ＬＢに近づくほど開口幅が狭まるテーパー形状であり、最も狭い位置での開口幅は第２凹部２３Ｌの開口径と同等である。上記を除いては第２実施形態と同等である。
（第３実施例）
　図２９は、ポリジメチルシロキサン、ポリスチレン、及びポリメチルペンテンの厚みに対する酸素透過量を示すグラフである。酸素透過量は、単位面積（ｍ２）の各材料の試料に対する単位時間（２４ｈ）、単位圧力（１ａｔｍ）あたりにおいて透過する酸素の体積（ｃｃ）で表され、図２９ではポリジメチルシロキサン、ポリスチレン、及びポリメチルペンテンの厚み（μｍ）に対して、対数グラフで示されている。図２９中、グラフａはポリジメチルシロキサンの酸素透過量を示し、グラフｂはポリスチレンの酸素透過性を示す、グラフｃはポリメチルペンテンの酸素透過性を示す。ポリジメチルシロキサンは、ポリスチレンよりも酸素透過量が概ね１０倍以上高く、ポリメチルペンテンはポリジメチルシロキサンとポリスチレンとの間の酸素透過量であることが確認された。上記の各実施形態及び各変形例の細胞培養容器において突起部や凹部の底面部を構成する壁部及び側壁部を構成する壁部をポリジメチルシロキサンあるいはポリメチルペンテンで形成することで、酸素透過性の高い突起部や壁部を実現することができる。
　上記の実施形態及び変形例において、本発明の趣旨を変更しない範囲で以下のように種々の改変が可能である。
　上記の実施形態及び各変形例は、適宜組み合わせ可能である。例えば、１個の第１凹部において、逆円錐台形状の突起部が複数個設けられている構成であってもよい。あるいは、１個の第１凹部において、先端が枝分かれした形状の突起部が複数個設けられている構成であってもよい。あるいは、１個の第１凹部において、先端に筒状部が設けられた円柱状の突起部が複数個設けられている構成であってもよい。突起部の形状が上記の各形状である場合に、基体が複数層の積層体で構成されていてもよい。
１、１Ａ、１Ｂ　細胞培養容器
２　ホルダ
２Ａ　保持用凹部
２Ｂ　係止部
１０、１０ＳＡ、１０ＳＢ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、１０Ｇ、１０Ｈ、１０Ｉ、１０Ｊ、１０Ｋ、１０Ｌ　基体
１０Ａ、１１Ａ、１３Ａ、１０ＧＡ、１０ＨＡ、１０ＩＡ、１０ＪＡ、１０ＫＡ、１０ＬＡ　第１面
１０Ｂ、１２Ｂ、１４Ｂ、１０ＧＢ、１０ＬＢ　第２面
１１、１３　第１基体
１２、１４　第２基体
２０、２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｄ、２０Ｅ、２０Ｆ、２０Ｇ、２０Ｈ、２０Ｉ、２０Ｊ、２０Ｋ、２０Ｌ　細胞培養部
２１、２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ、２１Ｄ、２１Ｅ、２１Ｆ、２１Ｇ、２１Ｈ、２１Ｉ、２１Ｊ、２１Ｋ、２１Ｌ　第１凹部
２２、２２Ａ、２２Ｂ、２２ＣＡ～２２ＣＸ、２２Ｄ、２２Ｅ、２２Ｆ、２２Ｇ、２２Ｈ、２２Ｈ、２２Ｉ、２２Ｊ、２２Ｋ、２２Ｌ　突起部
２２ＥＡ、２２ＥＢ、２２ＥＣ、２２ＥＤ　枝部
２３、２３Ａ、２３Ｂ、２３ＣＡ～２３ＣＸ、２３Ｄ、２３Ｅ、２３Ｆ、２３Ｇ、２３Ｈ、２３Ｉ、２３Ｊ、２３Ｋ、２３Ｌ　第２凹部
２４　筒状部
２４Ａ　開口部
２５Ｇ、２５Ｌ　壁部
２６Ｇ、２６Ｌ　壁部
２７Ｈ、２７Ｉ、２７Ｊ、２７Ｋ　底部
２８Ｈ、２８Ｉ、２８Ｊ、２８Ｋ　壁部
２９ＧＡ、２９ＧＢ、２９ＬＡ、２９ＬＢ　溝
３０、３０Ｇ　培養液
４０、４０ＧＡ、４０ＧＢ、４０ＧＣ　酸素
５０、５０Ｃ、５０Ｇ　細胞集合体

 

Claims (20)

  1. 　互いに対向する第１面及び第２面を有し、前記第１面に開口を有する少なくとも１個の第１凹部が設けられた基体と、
    　前記第１凹部の底部に設けられるとともに自立可能な強度を有する突起部とを備え、
    　前記突起部の内部の少なくとも一部が中空になるように前記第２面から延びる第２凹部が設けられている
    　細胞培養容器。
  2. 　少なくとも前記突起部がポリアミドより酸素透過性が高い材料で構成されている
    　請求項１に記載の細胞培養容器。
  3. 　前記突起部の表面から前記第２凹部の表面までの前記突起部の平均の厚さが１０μｍ～１００μｍである
    　請求項１または２に記載の細胞培養容器。
  4. 　前記突起部の表面から前記第２凹部の表面までの前記突起部の平均の厚さが、前記突起部の径又は幅の１／２以下である
    　請求項１または２に記載の細胞培養容器。
  5. 　前記第１凹部は、前記突起部の表面と、前記突起部が設けられた底部と、前記底部と前記第１面の前記開口の縁部との間を区画する側面部とから構成されている
    　請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
  6. 　前記突起部の表面は細胞非接着性の表面である
    　請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
  7. 　前記突起部の表面は細胞接着性の表面である
    　請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
  8. 　前記突起部は柱状形状を有する
    　請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
  9. 　前記突起部は逆円錐台形状を有する
    　請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
  10. 　前記突起部は先端が枝別れした形状を有する
    　請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
  11. 　前記突起部の先端に筒状部が設けられている
    　請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
  12. 　１個の前記第１凹部に前記突起部が複数個設けられている
    　請求項１～１１のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
  13. 　前記第１凹部の側壁部を構成する壁部及び底面部を構成する壁部の少なくとも一部が前記基体の前記第１凹部が設けられていない部分の厚さよりも薄く形成されている
    　請求項１～１２のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
  14. 　前記基体の前記第１凹部が設けられていない部分の厚さよりも薄く形成されている前記第１凹部の側壁部を構成する壁部及び底面部を構成する前記壁部の厚さが２５μｍ～５００μｍである
    　請求項１３に記載の細胞培養容器。
  15. 　前記第１凹部の前記底部の形状が、前記第１面の側から前記底部の最も深い部分に近づくにつれて前記第１凹部の開口面積が小さくなる形状である
    　請求項１～１４のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
  16. 　前記第１凹部の前記底部の形状が、前記基体に垂直な断面でＵ字型の形状である
    　請求項１５に記載の細胞培養容器。
  17. 　前記第１凹部の前記底部の形状が、前記基体に垂直な断面でＶ字型の形状である
    　請求項１５に記載の細胞培養容器。
  18. 　互いに対向する第１面及び第２面を有し、前記第１面に開口を有する少なくとも１個の凹部が設けられた基体を備え、
    　前記凹部の側壁部を構成する壁部及び底面部を構成する壁部の少なくとも一部が前記基体の前記凹部が設けられていない部分の厚さよりも薄く形成されている
    　細胞培養容器。
  19. 　前記基体の前記凹部が設けられていない部分の厚さよりも薄く形成されている前記凹部の側壁部を構成する壁部及び底面部を構成する前記壁部が、ポリアミドより酸素透過性が高い材料で構成されている
    　請求項１８に記載の細胞培養容器。
  20. 　前記基体の前記凹部が設けられていない部分の厚さよりも薄く形成されている前記凹部の側壁部を構成する前記壁部及び底面部を構成する前記壁部の厚さが２５μｍ～５００μｍである
    　請求項１８または１９に記載の細胞培養容器。

     
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