CN111094535A - 细胞培养容器 - Google Patents

Abstract

细胞培养容器具有壁以及具有多个微腔体的细胞培养表面，其用于以三维形式培养被称为“球体”的细胞。壁的内表面和细胞培养表面限定了容器的细胞培养室。所述壁以不在细胞培养表面上或周围提供平坦表面的方式附接于细胞培养表面，以使容器提供适于生产均匀的三维细胞簇或球体群的环境。

Description

细胞培养容器

相关申请的交叉参引

本申请要求以下申请的优先权权益：2018年3月13日提交的题为“Cell CultureContainer and Methods of Culturing Cells(细胞培养容器和培养细胞的方法)”的系列号为62/642,427的美国临时申请；2017年7月14日提交的题为“Cell Culture Containerand Methods of Culturing Cells(细胞培养容器和培养细胞的方法)”的系列号为62/532,681的美国临时申请；2017年7月14日提交的题为“Cell Culture Containers andMethods of Culturing Cells(细胞培养容器及培养细胞的方法)”的系列号为62/532,639的美国临时申请；2017年7月14日提交的题为“Cell Culture Container and Methods ofCulturing Cells(细胞培养容器和培养细胞的方法)”的系列号为62/532,648的美国临时申请；以及2017年7月14日提交的题为“Cell Culture Containers and Methods ofCulturing Cells(细胞培养容器和培养细胞的方法)”的系列号为62/532,671的美国临时申请；本文以上述临时申请的内容为基础，并通过参考将其全文纳入本文。

技术领域

本公开一般涉及细胞培养容器和培养细胞的方法，更具体地，涉及用于容纳三维细胞的细胞培养容器以及在所述细胞培养容器中培养三维细胞的方法。

背景技术

在细胞培养容器中容纳三维细胞是已知的。在细胞培养容器中培养三维细胞也是已知的。

发明内容

下文给出了本公开的简化归纳，以便提供对具体实施方式所描述的一些示例性实施方式的基本理解。

在一些实施方式中，一种细胞培养容器具有侧壁和底表面。在实施方式中，底表面是具有多个微腔体的细胞培养表面。在实施方式中，细胞培养表面是附接于侧壁的基材。在实施方式中，侧壁附接于基材，使得围绕细胞培养表面的周围没有平坦表面。

在实施方式中，所述容器可包括顶部、底部、侧壁、颈缩开口或孔以及与颈缩开口相对的端壁。或者，在实施方式中，细胞培养容器可以具有盖。或者，在实施方式中，细胞培养容器可以具有盖和颈缩开口或孔，所述盖可以是容器的顶部。在实施方式中，容器的底部的内表面是细胞培养表面。细胞培养表面可跨越细胞培养室的长度。所述容器可包括壁的内表面的颈部部分，其以某角度从孔延伸到细胞培养表面。一种在所述细胞培养容器中培养细胞的方法可包括：使液体通过孔而从容器之外进入到细胞培养室中，由此向细胞培养室提供预定量的液体。

在实施方式中，多个微腔体中的每个微腔体具有凹形底表面以及在顶部处的开口。液体通过在每个微腔体的顶部处的开口进入每个微腔体。

在实施方式中，所述容器可具有颈缩开口或孔，其可用帽闭合。在实施方式中，所述容器的顶壁可以是盖。在实施方式中，所述盖可以采用滑动开口或采用铰接开口，或采用任何其他已知的开口机构而被打开。在实施方式中，所述容器不具有颈缩开口，而是具有盖。

一种在所述细胞培养容器中培养细胞的方法可包括：将含有细胞的预定量的液体(例如液体培养基)引入到细胞培养室中，以及使至少一部分的预定量的液体沉积在多个微腔体的至少一个微腔体中。所述方法还可包括：在所述至少一个微腔体中沉积至少一部分的预定量的液体之后，在所述多个微腔体的所述至少一个微腔体中培养细胞。

以上实施方式是示例性的，并且可单独或与本文提供的任意一个或多个实施方式以任意形式组合来提供而不会偏离本公开的范围。另外，应当理解的是，前面的一般性描述和以下的具体实施方式都呈现了本公开的实施方式，且都旨在提供用于理解所描述和所要求保护的实施方式的性质和特性的总体评述或框架。包括的附图提供了对实施方式的进一步理解，附图结合于本说明书中并构成说明书的一部分。附图例示了本公开的各个实施方式，并与说明书一起用来解释其原理和操作。

附图说明

当参照附图阅读时，可以进一步理解本公开的这些特征、实施方式和优点以及其他特征、实施方式和优点，附图中：

图1根据本公开的实施方式，示意性例示了细胞培养容器的侧视图；

图2根据本公开的实施方式，示出了细胞培养容器沿着图1的线2-2的平面图；

图3根据本公开的实施方式，示出了细胞培养容器沿着图1的线3-3的截面图；

图4根据本公开的实施方式，示出了细胞培养容器沿着图1的线4-4的截面图；

图5根据本公开的实施方式，例示了以图4的视图5获取的包括具有多个微腔体的细胞培养表面的细胞培养容器的放大示意图；

图6根据本公开的实施方式，示出了沿着图5的线6-6的具有细胞培养表面且该细胞培养表面具有多个微腔体的细胞培养容器的截面图；

图7根据本公开的实施方式，示出了图6的包括细胞培养表面且该细胞培养表面具有多个微腔体的细胞培养容器的截面图的替代性实施方式；

图8根据本公开的实施方式，示出了沿着图2的线8-8的细胞培养容器的局部截面图，其包括盖部分和凹槽；

图9根据本公开的实施方式，示出了沿着图2的线9-9的细胞培养容器的局部截面图，其包括盖和铰接件；

图10根据本公开的实施方式，示意性例示了堆叠在一起的三个细胞培养容器的侧视图；

图11根据本公开的实施方式，示出了图3的细胞培养容器的替代性实施方式的截面图，其包括在第五示例性细胞培养容器中培养细胞的方法；

图12根据本公开的实施方式，示出了在图11的细胞培养容器中培养细胞的方法的一个步骤；

图13是根据本公开的实施方式，以图12的视图13获取的包括具有多个微腔体的细胞培养表面的细胞培养容器的放大示意图；

图14根据本公开的实施方式，示出了在图11的细胞培养容器中培养细胞的方法的一个步骤；

图15是根据本公开的实施方式，以图14的视图15获取的细胞培养容器的放大示意图，其包括具有多个微腔体的细胞培养表面，以及在多个微腔体的至少一个微腔体中培养细胞的方法；和

图16根据本公开的实施方式，示出了在图4的细胞培养容器中培养细胞的方法的一个步骤；

图17根据本公开的实施方式，例示了细胞培养容器的侧视图；

图18是根据本公开的实施方式，沿着图17的线18-18的细胞培养容器的平面图；

图19是根据本公开的实施方式，沿着图18的线19-19的包括凹部的细胞培养容器的一个实施方式的截面图；

图20是根据本公开的实施方式的图29的包括凹部的细胞培养容器的一个替代性实施方式的截面图；

图21是根据本公开的实施方式，以图19的视图21获取的第三示例性细胞培养容器的一部分的放大示意图，其包括位于凹部中的细胞培养表面，并且所述细胞培养表面包括多个微腔体；

图22根据本公开的实施方式，示出了图21的在凹部中具有细胞培养表面并且所述细胞培养表面具有多个微腔体的细胞培养容器的部分的一个替代性实施方式，其包括阶梯状部分；

图23根据本公开的实施方式，示出了图21的在凹部中具有细胞培养表面并且所述细胞培养表面具有多个微腔体的细胞培养容器一个替代性实施方式，其包括细胞培养表面的周围表面；

图24根据本公开的实施方式，示出了沿着图17的线24-24的包括凹部的第三示例性细胞培养容器的一个示例性实施方式的截面图；

图25根据本公开的实施方式，示出了包括突出部的图19的一个示例性细胞培养容器的截面图；

图26是根据本公开的实施方式的图25的包括突出部的细胞培养容器的截面图；

图27是根据本公开的实施方式，以图25的视图28获取的细胞培养容器的一部分的实施方式的放大示意图，其包括定位在突出部上的细胞培养表面，并且所述细胞培养表面包括多个微腔体；

图28根据本公开的实施方式，示出了图27的包括定位在突出部上的细胞培养表面并且所述细胞培养表面包括多个微腔体的细胞培养容器的部分的一个实施方式，其包括阶梯状部分；

图29是根据本公开的实施方式的图24的包括突出部的细胞培养容器的截面图；

图30是根据本公开的实施方式的图19的细胞培养容器的截面图，其包括预定量的液体；

图31是根据本公开的实施方式的图30的包括预定量液体的细胞培养容器的截面图；

图32是根据本公开的实施方式的以图30的视图32获取的细胞培养容器的一部分的一个实施方式的放大示意图，其包括容器的浸没表面；

图33根据本公开的实施方式，示出了图32的包括容器的浸没表面的部分细胞培养容器的替代性实施方式，其包括凹部；

图34根据本公开的实施方式，示出了图32的包括容器的浸没表面的部分细胞培养容器的替代性示例实施方式，其包括突出部；

图35A和图35B是例示了在微腔体中作为球体生长的细胞以及在细胞培养容器中的平坦表面上以不规则形状生长的细胞的图。

图36A是在微腔体阵列中的球体的照片。图36B是在以不规则细胞聚集团(conglomerate)生长的细胞的照片。

具体实施方式

下文将参照附图更完整地描述各个特征，附图中示出了本公开的示例性实施方式。只要可能，在所有附图中使用相同的附图标记来表示相同或类似的部分。但是，本公开可以以许多不同的形式实施并且不应被解读成限于本文中提出的实施方式。

细胞培养容器(例如烧瓶)可提供用于培养细胞的无菌细胞培养室。在一些实施方式中，培养细胞可提供关于疾病和毒理学研究，药剂和治疗的功效，肿瘤特性、生物体、遗传学以及细胞和与细胞相关的其他科学、生物学和化学原理的信息。

相比于二维细胞培养物，在一些实施方式中，三维细胞培养物可产生多细胞结构，其在生理学上更精确，并且相比于实验室中的模拟条件更逼真地代表细胞可在实际生命应用中存在和生长的环境。例如，发现三维细胞培养物更接近地提供模拟“体内”(即，在活体内，在真实环境中)细胞生长的真实环境；而发现二维细胞培养物提供模拟“体外”(即，在玻璃中，在实验室环境中)细胞生长的环境，其不能那么好地代表实验室外发生的真实环境。通过与三维细胞培养物的相互作用以及观察其性质和行为，可实现关于以下方面的细胞理解的进步，例如，疾病和毒理学研究，药剂和治疗的功效，肿瘤特性、生物体、遗传学以及细胞和与细胞相关的其他科学、生物学和化学原理。在某些条件下，细胞会成丛地在一起而形成三维细胞“球”，其被称为球体或类器官。

对于这些类型的研究和使用，期望提供受控的、均匀的球体群。可对细胞培养容器进行结构化和布置，以为细胞在培养中形成球体提供合适的环境。细胞培养容器可包括细胞培养表面，其包括多个微腔体(例如，微腔体、微尺寸孔穴、亚毫米尺寸孔穴)。当这些微腔体以阵列布置，以在单个细胞培养容器中提供大量微腔体时，可培养大量的球体，并因此可对大量的细胞进行分析和实验。

然而，当在旨在用于生长球体的细胞培养容器中存在平坦表面时，细胞可沉降到这些平坦表面上并形成不规则的细胞聚集团。这些是不期望的。在实施方式中，本公开提供的细胞培养容器不具有细胞能够沉降在其上并以不规则的多细胞形式生长的平坦表面。也就是说，容器的细胞培养表面基本上由微腔体组成。

在实施方式中，细胞培养表面可以是被放置在烧瓶中的插入件，或者细胞培养表面可以结合于细胞培养容器的壁。具有微腔体阵列的细胞培养表面可以通过例如胶粘、激光焊接、超声焊接或某种其他方法结合于细胞培养容器的壁。细胞培养表面可包括顶侧和/或底侧，其包括形成多个微腔体的波状(例如正弦曲线形)表面。

在培养细胞时，容器可填充有促进三维细胞培养物(例如细胞团、球体)的生长的材料(例如，培养基、固体、液体、气体)。例如，可向容器的细胞培养室添加包含悬浮在液体中的细胞的培养基。悬浮的细胞可被聚集在多个微腔体中并且可形成(例如，生长)为细胞组或细胞簇。这些细胞组或细胞簇为球体或类器官。

例如，在一些实施方式中，至少基于重力——所述重力造成悬浮在液体中的一个或多个细胞降落通过液体并沉积在每个微腔体中，在多个微腔体的每个微腔体中可形成单个球体。微腔体的形状(例如，限定孔穴的凹表面或底部)，以及防止细胞粘附于表面的微腔体的表面涂层也可促进在每个微腔体中的三维细胞培养物的生长。也就是说，细胞形成球体并且受制于微腔体的尺寸而生长到某尺寸。在培养期间，球体可消耗培养基(例如，养料、营养物)并且产生作为副产物的代谢物(例如废物)。因此，在一些实施方式中，在培养期间可向细胞培养室添加养料培养基，并且在培养期间可从细胞培养室移除废培养基。当添加和移除培养基时可尝试避免使球体从微腔体移位，以及促进对球体进行期望的细胞培养。

现将参考图1-37描述细胞培养容器100以及在细胞培养容器100中培养细胞的方法的实施方式。图1例示了细胞培养容器100的一个实施方式的侧视图，图2示出了容器100沿着图1的线2-2的平面图。在一些实施方式中，细胞培养容器100可包括顶部101、底部108、颈缩开口112和端口，所述端口在图1中显示被帽104覆盖。图2的平面图示出了围绕细胞培养表面115的壁107。顶部101、底部108和壁107(示于图2)以及颈缩开口112的这些特征各自具有内表面。也就是说，顶部101具有内表面201，壁107具有内表面207，底部108具有内表面208，以及颈缩开口112具有内表面212。这些内表面限定了细胞培养室103。容器100的底部108的内表面208是细胞培养表面115。该细胞培养表面115具有用于容纳和培养球体的微腔体阵列(参见图5-7)。如图2所示，壁的内表面邻接细胞培养表面115。在实施方式中，在细胞培养表面115与壁107的内表面207之间不具有平坦表面。也就是说，细胞培养表面115基本上不含平坦表面。换言之，细胞培养表面115全部由微腔体构成。细胞培养表面基本上由微腔体组成。

所述容器可由某种材料制造，所述材料包括但不限于聚合物、聚碳酸酯、玻璃和塑料。在附图中，容器100例示为由清澈(例如透明)材料制造；但是在一些实施方式中，容器100可替代性地由半透明材料、半不透明材料或不透明材料制造而不会偏离本公开的范围。图3示出了容器100沿着图1的线3-3的截面图。在一些实施方式中，细胞培养表面115和壁107的内表面207限定了容器100的细胞培养室103，并且孔105延伸通过壁107而与细胞培养室103流体连通。例如，在一些实施方式中，细胞培养室103可包括容器100的内部空间体积。

回到图1和图2，在一些实施方式中，容器100可包括帽104，其被取向成覆盖孔105以密封和/或阻塞孔105，从而阻挡从容器100外侧经过孔105到达细胞培养室103中的路径。为了清楚起见，将帽104移除，因此，在其他附图中未示出帽104，但是应理解，在一些实施方式中，可提供帽104并将其选择性地添加到容器100的孔105中或从中移除而不偏离本公开的范围。在一些实施方式中，帽104可包括过滤器，其允许气体传递到容器100的细胞培养室103中和/或从中传递出。例如，在一些实施方式中，帽104可包括透气性过滤器，其被取向成调节细胞培养室103中的气体压力，从而防止细胞培养室103相对于容器100外侧的环境(例如，大气)的压力而加压(例如，超压)。

如示出了沿图2的线3-3的截面图的图3以及如示出了沿着图1的线4-4的截面图的图4所示，在一些实施方式中，细胞培养表面115可跨越细胞培养室103的长度“L1”，所述长度“L1”沿着轴线510延伸。图5示出了以图4的视图5获取的细胞培养表面115的一部分的放大示意图。此外，图6示出了沿着图5的线6-6的细胞培养表面115的部分的截面图，并且图7示出了图6的截面图的替代性实施方式。如图5所示，在一些实施方式中，微腔体120可成对角阵列布置，但是在另一些实施方式中可提供其他布置。此外，在一些实施方式中，每个微腔体120a、120b、120c可包括限定孔穴122a、122b、122c的凹形底部121a、121b、121c(参见图6和图7)。此外，每个微腔体120a、120b、120c可包括在每个微腔体120的顶部中的开口123a、123b、123c。如图6所示，在一些实施方式中，细胞培养表面115的第一侧125可包括非线性(例如，波状、正弦曲线形)轮廓，并且细胞培养表面115的第二侧126可以是平坦的。类似地，如图7所示，在一些实施方式中，细胞培养表面115的第一侧125和第二侧126均可包括非平面(例如，波状、正弦曲线形)轮廓。

在一些实施方式中，细胞培养表面115和容器100(如图1-16中论述的)和300(如图17-34中论述的)可包含聚合材料，包括但不限于聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、聚苯乙烯共聚物、含氟聚合物、聚酯、聚酰胺、聚苯乙烯丁二烯共聚物、完全氢化的苯乙烯类聚合物、聚碳酸酯PDMS共聚物和聚烯烃，如聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚丙烯共聚物和环烯烃共聚物。另外，在一些实施方式中，由凹形底部121a、121b、121c限定的孔穴122a、122b、122c的至少一部分可涂覆有超低结合性材料，从而使所述孔穴122a、122b、122c的至少一部分对细胞无粘附性。例如，在一些实施方式中，可向由凹表面121a、121b、121c限定的孔穴122a、122b、122c的至少一部分施涂以下中的一种或多种：全氟聚合物，烯烃，琼脂糖，非离子性水凝胶，例如聚丙烯酰胺，聚醚，例如聚环氧乙烷，多元醇，例如聚乙烯醇，或者它们的混合物。

另外，在一些实施方式中，所述多个微腔体120中的每个微腔体120a、120b、120c(如图1-16所论述的)和多个微腔体320(如图17-34所论述的)可包括各种特征及这些特征的变化形式而不偏离本公开的范围。例如，在一些实施方式中，所述多个微腔体120可被布置成阵列，包括线性阵列(如图所示)、对角阵列、矩形阵列、圆形阵列、径向阵列、六角密堆布置等。此外，在一些实施方式中，开口123a、123b、123c可包含各种形状。在一些实施方式中，开口123a、123b、123c可包括圆形、椭圆形、矩形、四边形、六边形及其他多边形形状中的一种或多种。此外，在一些实施方式中，开口123a、123b、123c可包括约100微米(μm)至约5000μm的尺寸(例如，直径、宽度、正方形或矩形的对角线等)。例如，在一些实施方式中，开口123a、123b、123c可包括以下尺寸：100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm、1500μm、2000μm、2500μm、3000μm、3500μm、4000μm、4500μm、5000μm以及在约100μm至约5000μm的范围中涵盖的任何尺寸或尺寸范围。

在一些实施方式中，由凹表面121a、121b、121c限定的孔穴122a、122b、122c(如图1-16中论述的)和孔穴322(如图17-34中论述的)可包括各种形状。在一些实施方式中，由凹表面121a、121b、121c限定的孔穴122a、122b、122c可包括圆形、椭圆形、抛物线形、双曲线形、人字形、倾斜的或其他截面轮廓形状中的一种或多种形状。此外，在一些实施方式中，孔穴122a、122b、122c的深度(例如，从由开口123a、123b、123c限定的平面到凹表面121a、121b、121c的深度)可包括约100微米(μm)至约5000μm的尺寸。例如，在一些实施方式中，孔穴122a、122b、122c的深度可包括以下尺寸：100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm、1500μm、2000μm、2500μm、3000μm、3500μm、4000μm、4500μm、5000μm，在约100μm至约5000μm的范围中涵盖的任何尺寸或尺寸范围。

在一些实施方式中，可在多个微腔体120的至少一个微腔体120a、120b、120c中培养的三维细胞150(例如，球体、类器官150a、150b、150c)(参见图16)(如在图1-16中所论述的)和350(如在图17-34中所论述的)可包括约50μm至约5000μm的尺寸(例如直径)，以及在约50μm至约5000μm范围内涵盖的任何尺寸或尺寸范围。在一些实施方式中，可提供比所公开的确切尺寸更大或更小的尺寸，因此，除非另有说明，否则比所公开的确切尺寸更大或更小的尺寸被认为是在本公开的范围内。例如，在一些实施方式中，开口123a、123b、123c的一种或多种尺寸，孔穴122a、122b、122c的深度，以及三维细胞150(例如球体150a、150b、150c)的尺寸可以比所公开的确切尺寸更大或更小而不偏离本公开的范围。

回到图1-4，在一些实施方式中，容器100可包括从孔105延伸到细胞培养表面115的颈部部分555。在一些实施方式中，颈部部分555可包括以下一种或多种轮廓：倾斜的(例如，有角的(canted))轮廓，在朝向和/或远离孔105的方向上变窄的轮廓，以及在朝向和/或远离细胞培养表面115的方向上变宽的轮廓。如图3所示，在一些实施方式中，颈部部分555相对于细胞培养室103成角度。此外，在一些实施方式中，容器的颈部部分555可具有弯部158。在实施方式中，弯部158比细胞培养表面115更高。然而，应理解，在一些实施方式中，弯部可以为任何形状。例如，弯部158可以是弯曲的或斜的或成角度的或阶梯状的。

附加或替代性地，如图3和图4所示，在一些实施方式中，细胞培养容器100可包括从颈部部分112的内表面212延伸的堰板130。在一些实施方式中，堰板130可包括面向端口的表面131，该堰板130阻挡限定在孔105与细胞培养表面115之间的路径。在一些实施方式中，堰板130的面向端口的表面131可以基本上垂直于容器100的轴线510。另外，如图3所示，在一些实施方式中，堰板130的自由端部135的至少一部分可与顶部101的内表面201间隔距离“d10”。在一些实施方式中，通过使堰板130的自由端部135的至少一部分与内表面201间隔开，在一些实施方式中，可提供可到容器100的尾部(例如与孔105相对)的入口。例如，在一些实施方式中，可将一种或多种仪器(未示出)插入到容器100的孔105中，通过堰板130(例如，通过距离“d10”)以进入位于堰板130后方的细胞培养室103的区域。因此，例如，如关于第一示例性细胞培养容器100的堰板130所公开的，在一些实施方式中，细胞培养容器100的堰板130同样可阻碍和/或减慢流到容器100中的材料(例如，养料、营养物)和/或从容器100流出的材料(例如，废物)的速度，但还是允许大量地进入到容器100的细胞培养室103中。

如图1所示，在一些实施方式中，容器100可包括盖137。在一些实施方式中，当盖137关闭时，其可以是容器100的顶部101。(还参见图3)。在一些实施方式中，第一主表面538可限定至少一部分的细胞培养室103。此外，在一些实施方式中，盖137可以打开或关闭，或者部分打开(或部分关闭)。盖137可以滑动附接于容器100，或者在一些实施方式中，盖137可以铰接地附接于容器100。在一些实施方式中，孔536可与细胞培养室103流体连通。

另外，如图3所示，在一些实施方式中，从细胞培养表面115到顶部101或盖137的第一距离“d11”可以小于从细胞培养表面115到孔105的开口507的第二距离“d12”。在一些实施方式中，可在开口507的任何位置处限定从细胞培养表面115到孔105的开口507的第二距离“d12”。然而，在一些实施方式中，从细胞培养表面115到孔105的开口507的第二距离“d12”可被限定为孔105的开口507相对于细胞培养表面115的最近位置。例如，在一些实施方式中，当容器100的取向为轴线510在垂直于重力“g”的方向上延伸(参见图17)时，从细胞培养表面115到孔105的开口507的第二距离“d12”可被限定为孔105的开口507相对于重力“g”的方向的最低位置。

因此，在一些实施方式中，相比于相当的容器，例如，从细胞培养表面115延伸到盖部分137的距离大于从细胞培养表面115到孔105的开口507的第二距离的容器，容器100的一个或多个特征单独或组合地可提供包含材料可容纳于其中的更大体积的细胞培养室103。也就是说，当容器100的取向为轴线510在垂直于重力“g”的方向上延伸时，从细胞培养表面115到孔105的开口507的第二距离“d12”(其被限定为孔105的开口507相对于重力“g”的方向的最低位置)可限定关于容器100的细胞培养室103中可容纳的材料体积的最大填充线。例如，如果第二距离“d12”小于第一距离“d11”，并且容器100的取向为轴线510在垂直于重力“g”的方向上延伸，则细胞培养室103中容纳的材料体积的最大填充线将与到盖137的距离相称，因为任何添加到细胞培养室103的额外的材料将会从孔105的开口流出而不是被容纳在细胞培养室103中。因此，如果第二距离“d12”小于第一距离“d11”，并且容器100取向为轴线510在垂直于重力“g”的方向上延伸，则容器100可包括的体积包含就容纳材料而言未被使用的细胞培养室103的部分。因此，在一些实施方式中，通过提供本公开实施方式的容器100——其包括比第一距离“d11”更大的第二距离“d12”，细胞培养室103的全部体积均可用于容纳材料，在细胞培养室103中可容纳更大的材料体积，并且可实现材料的有效分配和容器100的空间的总体利用。同样地，在一些实施方式中，第二距离“d12”可等于第一距离“d11”而不会偏离本公开的范围。

另外，在一些实施方式中，对于细胞培养表面115的单位面积(例如，提供可在其上培养一个或多个细胞的相应表面的单位面积)，相比于例如相当的二维细胞培养，三维细胞培养可消耗更多的培养基(例如，养料、营养物)并且产生更多的作为副产物的培养基(例如，废物)。因此，在一些实施方式中，例如，相比于相当的二维细胞培养，对于相当的时间，根据本公开实施方式所述的三维细胞培养可包括更频繁的培养基更换(例如，加入养料、营养物和/或移除废物)。附加或替代性地，在一些实施方式中，例如，相比于相当的二维细胞培养，对于相当的时间，根据本公开实施方式所述的三维细胞培养可包括更大的培养基体积(例如，消耗更多养料、营养物和/或产生更多废物)。因此，在一些实施方式中，细胞培养容器100以及在细胞培养容器100中培养细胞150的方法的一个或多个特征可提供关于容器100的细胞培养室103中可容纳的培养基体积，可向细胞培养室103添加的培养基体积，和可从细胞培养室103移除的培养基体积中的一项或多项以及培养基更换的频率的优点，从而提供在其中培养三维细胞的有利、有效的环境。

如示出了容器100沿着图2的线8-8的局部截面图的图8所示，在一些实施方式中，顶壁101可包括凹槽180，并且盖137可在凹槽180中滑动(如图2中的箭头181所示)，以选择性地提供进入细胞培养室103的入口，例如，通过孔136的开口进入。附加或替代性地，如示出了容器100沿着图2的线9-9的局部截面图的图9所示，在一些实施方式中，容器100可包括将盖137连接到壁101的铰接件182。在一些实施方式中，盖137可围绕铰接件182旋转(如箭头183所示)，以选择性地提供进入细胞培养室103的入口，例如通过孔136的开口进入。另外，在一些实施方式中，盖137可通过一个或多个紧固件(未示出)和/或粘合剂(未示出)(包括可重复使用和不可重复使用的粘合剂)连接到壁101，以例如选择性地提供进入细胞培养室103的入口，例如通过孔136的开口进入。

此外，在一些实施方式中，沿着容器的轴线510延伸的从端口105到端壁107所测得的容器100的长度“L2”可等于或大于细胞培养表面115的长度“L1”。因此，在一些实施方式中，可堆叠多个容器100(例如，相对于重力方向垂直)以例如减少被多个容器100占据的表面积(例如，实验室表面积、台表面积)。例如，图10根据本公开的实施方式，示意性例示了堆叠在一起的多个容器100、100a、100b的侧视图。

如图10示意性所示，在一些实施方式中，可在另一个容器的顶上堆叠容器100a，所述容器100a包括壁101a、帽104a、颈部部分555a、盖137a和底部108a。例如，在一些实施方式中，容器100b的底部部分108b以及壁101、101a、101b，可被置于水平表面(未示出)，所述水平表面限定了与重力方向垂直的主表面。在一些实施方式中，容器100的底部部分108可位于容器100b的盖137b上(例如，面向盖137b)。同样地，在一些实施方式中，容器100a的底部部分108a可位于容器100的盖137上(例如，面向盖137)。通过定位(例如，堆叠)本公开实施方式的多个容器100、100a、100b，在用容器100、100a、100b储存、清洁和培养的一项或多项期间，多个容器100、100a、100b可有效地利用在其中提供容器100、100a、100b的空间(例如，面积、体积)。虽然显示多个为三个堆叠容器100、100a、100b，但应理解，在一些实施方式中，根据本公开的实施方式，可堆叠两个容器或不止三个容器而不会偏离本公开的范围。另外，在一些实施方式中，多个容器100、100a、100b可独立地和/或一起(例如堆叠)以各种构造定位，包括本公开未明确公开的构造，而不会偏离本公开的范围。

在一些实施方式中，容器是可堆叠的。另外，至少部分基于颈部112中的弯部158的一个或多个特征，当根据本公开的实施方式堆叠时，可维持对端口105、105a、105b的可及，以例如允许在多个容器100、100a、100b堆叠(例如静止)时，向相应的细胞培养室103、103a、103b添加材料(例如，养料、营养物)和/或从其中移除材料(例如，废物)。例如，在一些实施方式中，堆叠不包括本公开的一个或多个特征的容器可限制和/或阻碍和/或阻止进入到孔的开口的可及性。在一些实施方式中，在培养过程期间，可使包括可及性受到限制和/或阻碍和/或阻止的孔的开口的堆叠容器相对于彼此移动(例如平移和/或旋转)以例如提供对孔的开口的可及性。然而，在一些实施方式中，在培养过程期间使容器相对于彼此移动可能移出和/或干扰在容器中培养的细胞，由此不利地影响细胞培养过程。因此，至少部分基于容器100、100a、100b的颈部555、555a、555b的弯部158、158a、158b的一个或多个特征，当根据本公开的实施方式堆叠时，可实现对端口的开口的可及性，并且可获得与细胞培养过程有关的益处。

现将参考图11-16描述在细胞培养容器100中培养细胞的方法。如图11所示，在一些实施方式中，一种在细胞培养容器100中培养细胞150(参见图15)的方法可包括：使液体通过(例如，如箭头106所示)孔105而从容器100之外进入到细胞培养室103中，由此在细胞培养室103中提供预定量的液体140。在实施方式中，所述方法可在具有或不具有任选堰板130的容器中进行。

还示出了容器100的颈部112的弯部158。在一些实施方式中，所述方法可包括倾斜容器100以使弯部158形成颈部112中的低位。引入到容器中的液体140可在弯部158处积聚在颈部112中。也就是说，容器可在颈部112的弯部158中容纳预定量的液体140，并且液体140不接触微腔体阵列115。如下文更完整论述地，在所述方法的这一阶段，防止液体140接触含有微腔体120的阵列的细胞培养表面115的一个或多个微腔体120可提供多个优点，例如，其促进改进了细胞150(参见图15)的培养。接着，可将容器缓慢倾斜回，以使轴线510垂直于重力“g”，从而允许液体140在具有微腔体120的阵列的细胞培养表面115上缓慢流动，以允许液体缓慢填充微腔体120。图12示意性示出了该步骤。

例如，图13例示了以图12的视图13获取的细胞培养容器100的放大示意图，其示出了至少一部分液体140沿着细胞培养室103的长度“L1”从颈部112流到细胞培养表面115上并进入微腔体阵列120的微腔体120a、120b、120c中。在一些实施方式中，可控制及减慢(例如，在几分钟的持续时间期间内进行)造成液体流动的容器100的移动。例如，已经观察到，用液体直接填充多个微腔体120中的微腔体120a、120b、120c(例如，不是基于本公开的方法)可导致在微腔体中形成气泡。这种向微腔体120缓慢引入液体使得在气泡形成减少的情况下使液体流到微腔体中。气泡破坏细胞生长。液体培养基可具有高的表面张力(其可以是稠的)，并且微腔体120非常小。不旨在受理论束缚，认为，当用液体直接并迅速(例如，在约几秒的持续时间期间进行)填充微腔体120a、120b、120c时，由于表面张力，气泡可能被困在微腔体中。然而，通过采用本公开方法的一个或多个特征，已经观察到，例如，通过先将液体引入到颈部112的弯部158中，然后将容器100缓慢倾斜到其细胞培养位置(其中细胞培养表面垂直于重力“g”)，可减少气泡形成。

此外，对于长期的细胞培养，需更换培养基以确保细胞维持新鲜的营养物供应。这要求移除培养基并替换培养基，同时使球体处于每个微腔体120中的适当位置。在培养基更换期间，不使球体从微腔体120移出是重要的。当球体150“跳”出其微腔体时，其可沉积到另一个早已被占据的微腔体中。当球体彼此接触时，它们形成不规则的细胞聚集团801(参见图35和36)，导致不均匀的细胞培养。

在一些实施方式中，颈部112的弯部158可邻接细胞培养表面115，并且流体140可从颈部112中的弯部158流动并沉积到微腔体120a、120b、120c中，并且具有受控的流动(例如，减少了或没有液体飞溅以及减少了或没有湍流)，从而在从孔穴122a、122b、122c置换气体时，提供通过所述微腔体120a、120b、120c的相应开口123a、123b、123c的一部分沉积到微腔体120a、120b、120c的孔穴122a、122b、122c中的液体的稳定流。在实施方式中，细胞培养表面115从壁107延伸到壁107。在实施方式中，细胞培养表面115不具有任何平坦区域。也就是说，细胞培养表面从壁到壁均是微腔体阵列，并且在细胞培养表面与壁107之间没有边界，没有平坦区域。在实施方式中，细胞培养表面基本上由多个微腔体组成。在实施方式中，在细胞培养室中没有平坦区域用于细胞沉降在上面。这对于确保细胞不沉降在微孔穴之外的细胞培养室中是重要的。当细胞在微孔穴之外沉降在细胞培养表面之外的平坦区域上时，细胞可生长为不规则的细胞聚集团，并且在容器中产生不均匀的多细胞3D结构群。在实施方式中，细胞培养表面基本上由多个微腔体组成。当细胞在微孔穴之外沉降在细胞培养表面之外的平坦区域上时，细胞可生长为不规则的细胞聚集团801(参见图35A和35B、36A和36B)，并且在容器中产生不均匀的多细胞3D结构群。在实施方式中，细胞培养表面基本上由多个微腔体组成。

在实施方式中，细胞培养表面115从壁107延伸到壁107。在实施方式中，细胞培养表面115不具有任何平坦区域。也就是说，细胞培养表面是从壁延伸到壁的微腔体120的阵列，并且在细胞培养表面与壁107之间没有边界，没有平坦区域。在实施方式中，细胞培养表面基本上由多个微腔体组成。在实施方式中，在细胞培养室中没有平坦区域用于细胞沉降在上面。这对于确保细胞不沉降在微孔穴之外的细胞培养室中是重要的。当细胞在微孔穴之外沉降在细胞培养表面之外的平坦区域上时，细胞可生长为不规则的细胞聚集团801(参见图35A和35B、36A和36B)，并且在容器中产生不均匀的多细胞3D结构群。在实施方式中，细胞培养表面基本上由多个微腔体组成。

如图14所示，在一些实施方式中，至少基于容器100的移动，可造成液体140从颈部112流到整个细胞培养表面115上。此外，图15例示了以图14的视图15获取的细胞培养容器100的放大示意图，其包括在细胞培养容器100中培养细胞150的方法。例如，在一些实施方式中，所述方法可包括：在所述至少一个微腔体120a、120b、120c中沉积所述至少一部分的预定量的液体140后，在多个微腔体120的至少一个微腔体120a、120b、120c中培养细胞150(例如，球体150a、球体150b、球体150c)。如图14和图15所示，在一些实施方式中，当在微腔体120中培养细胞150时，容器100的轴线510相对于重力“g”的方向可基本上垂直。

如图16示意性所示，在一些实施方式中，所述方法还可包括：向细胞培养室103添加另外的液体培养基140(如箭头508所示)。例如，在一些实施方式中，当在细胞培养容器100中培养细胞150(参见图15)时，可向细胞培养室103添加液体培养基140(细胞养料、含有营养物的液体)。由于端口105升高并朝上，因此可将液体140添加到最高至离端口105的孔507的最低位为距离“d13”的位置。也就是说，在一些实施方式中，可将容器填充到刚好最高到容器100的盖137处或顶部101处。由此，相比于如果端口相对于容器100的顶部101被布置得更低时细胞培养室103能够容纳的液体140的体积，细胞培养室103可容纳更大的液体140的体积。

现将参考图17-34描述细胞培养容器300以及在细胞培养容器300中培养细胞的方法的其他实施方式。虽然图17-34所示的实施方式示出了不具有颈缩开口或端口的实施方式，但应理解，可将图17-34所示的实施方式并入到图1-16例示的具有端口的容器的实施方式中。例如，图17示意性例示了细胞培养容器300的侧视图，图18示意性例示了容器300沿着图17的线18-18的平面图。在一些实施方式中，细胞培养容器300可包括壁301和盖304。在附图中，容器300例示为由清澈(例如透明)材料制造；但是在一些实施方式中，容器300可替代性地由半透明材料、半不透明材料或不透明材料制造而不会偏离本公开的范围。在一些实施方式中，盖304可被取向成覆盖容器300的开口以密封和/或阻塞开口，从而阻挡从容器300外侧经过开口进入到细胞培养室303中的路径。为了清楚起见，将盖304移除，因此，在其他附图中未示出盖304，但是应理解，在一些实施方式中，可提供盖304并将其选择性地添加到容器300的开口中或从中移除而不偏离本公开的范围。在一些实施方式中，盖304可包括过滤器，其允许气体传递到容器300的细胞培养室303(参见图19)中和/或从中传递出。例如，在一些实施方式中，盖304可包括透气性过滤器，其被取向成调节细胞培养室303中的气体压力，从而防止细胞培养室303相对于容器300外侧的环境(例如，大气)的压力而加压(例如，超压)。

图19示出了沿着图18的线19-19的细胞培养容器300的一个示例性实施方式的截面图，并且图20示出了图19的细胞培养容器300的截面图的替代示例性实施方式。此外，图25示出了图18的细胞培养容器300的截面图的替代示例性实施方式，并且图26示出了图25的细胞培养容器300的截面图的替代示例性实施方式。在一些实施方式中，壁301可包括内表面302，并且容器300可包括具有多个微腔体320的细胞培养表面315。如图19和图25所示，在一些实施方式中，细胞培养表面315和壁301的内表面302限定了容器300的细胞培养室303。或者，如图20和图26所示，在一些实施方式中，壁301的内表面302可限定容器300的细胞培养室303，其例如包括第一区域303a和第二区域303b，并且细胞培养表面315可位于细胞培养室303中，并且在第一区域303a与第二区域303b之间。

如图19和图20所示，在一些实施方式中，细胞培养表面315的外周界330可围绕多个微腔体320，并且外周界330的至少一部分331可位于容器300的壁301的内表面302的凹部335中。例如，图24示出了沿着图30的线24-24截取的容器300的一个示例性截面图，其中，整个外周界330侧向包围多个微腔体320，并且整个外周界330位于凹部335中。或者，如图25和图26所示，在一些实施方式中，细胞培养表面315的外周界330可围绕多个微腔体320，并且外周界330的至少一部分331可位于容器300的壁301的内表面302的突出部337上。例如，图29示出了图24的第三示例性细胞培养容器300的截面图的一个替代性示例实施方式，其中，整个外周界330侧向包围多个微腔体320，并且整个外周界330位于凹部335突出部337上。在本公开中，“围绕”意为在垂直于细胞培养表面315的主特征的方向上的顶视图或底视图中，例如，由第一特征限定的第一外周围围绕由第二特征限定的第二外周围。因此，例如，如图24和图42的视图所示，细胞培养表面315的外周围(由外周界330限定)围绕细胞培养表面315的外周围(由多个微腔体320限定)。

在实施方式中，细胞培养表面315从壁301延伸到壁301。在实施方式中，细胞培养表面315不具有任何平坦区域。也就是说，细胞培养表面是从壁延伸到壁的微腔体320的阵列，并且在细胞培养表面与壁301之间没有边界，没有平坦区域。在实施方式中，细胞培养表面基本上由多个微腔体组成。在实施方式中，在细胞培养室中没有平坦区域用于细胞沉降在上面。这对于确保细胞不沉降在微孔穴之外的细胞培养室中是重要的。当细胞在微孔穴之外沉降在细胞培养表面之外的平坦区域上时，细胞可生长为不规则的细胞聚集团801(参见图35A和35B、36A和36B)，并且在容器中产生不均匀的多细胞3D结构群。在实施方式中，细胞培养表面基本上由多个微腔体组成。

图21-23示出了以图19的视图21获取的一部分容器300的放大图的示例性实施方式，其包括位于凹部335中的细胞培养表面315的外周界330的至少一部分331。类似地，图27和图28示出了以图25的视图28获取的容器300的放大图的示例性实施方式，其包括位于突出部337上的外周界330的至少一部分331。在一些实施方式中，多个微腔体320中的每个微腔体320a、320b、320c可包括限定孔穴322a、322b、322c的凹表面321a、321b、321c以及开口323a、323b、323c。液体通过开口323a、323b、323c进入和离开微腔体。在一些实施方式中，细胞培养表面315可附接于容器300的壁301。例如，在一些实施方式中，细胞培养表面315可利用粘合剂(未示出)、溶剂(未示出)或紧固件(未示出)，通过焊接(激光焊接或超声焊接)而附接于容器300的壁301，或者壁和细胞培养表面315可模制在一起。附加或替代性地，在一些实施方式中，至少部分基于例如塑性焊接工艺、激光焊接工艺、超声焊接工艺的操作，细胞培养表面315可附接于容器300的壁301的内表面302。在一些实施方式中，壁301和外周界330中的至少一者可包括能量引导器(未示出)以至少部分基于塑性焊接工艺的操作而促进细胞培养表面315结合于容器300的壁301。

此外，如图22所示，在一些实施方式中，容器300可包括从细胞培养表面315向外延伸并且形成凹部335的阶梯状部分306。在一些实施方式中，阶梯状部分306可增加细胞培养室303的体积和/或细胞培养室303内的多个微腔体320的微腔体320a、320b、320c的量。附加或替代性地，相比于例如图21中所示的对应的凹部335和壁301厚度，阶梯状部分306可提供相对更大的凹部335而不会增加容器300的壁301的厚度。在一些实施方式中，由阶梯状部分306形成的凹部335可被取向成容纳位于凹部335中的细胞培养表面315的外周界330的至少一部分331。类似地，如图28所示，在一些实施方式中，容器300可包括向内延伸向细胞培养表面315并且形成突出部337的阶梯状部分308。在一些实施方式中，相比于例如图28中所示的对应的突出部337和壁301厚度，阶梯状部分308可提供相对更大的突出部337而不会增加容器300的壁301的厚度。在一些实施方式中，由阶梯状部分308形成的突出部337可被取向成容纳位于突出部337上的细胞培养表面315的外周界330的所述至少一部分331。

在实施方式中，细胞培养表面315从壁301延伸到壁301。在实施方式中，细胞培养表面315不具有任何平坦区域。也就是说，细胞培养表面是从壁延伸到壁的微腔体320的阵列，并且在细胞培养表面与壁301之间没有边界，没有平坦区域。在实施方式中，细胞培养表面基本上由多个微腔体组成。在实施方式中，在细胞培养室中没有平坦区域用于细胞沉降在上面。这对于确保细胞不沉降在微孔穴之外的细胞培养室中是重要的。当细胞在微孔穴之外沉降在细胞培养表面之外的平坦区域上时，细胞可生长为不规则的细胞聚集团801(参见图35A和35B、36A和36B)，并且在容器中产生不均匀的多细胞3D结构群。在实施方式中，细胞培养表面基本上由多个微腔体组成。

此外，如图23、图25和图28所示，在一些实施方式中，细胞培养表面315的外周界330的至少一部分331在远离多个微腔体320中的每个微腔体320a、320b、320c的凹表面321a、321b、321c的方向上可与包含微腔体320a、320b、320c的开口323a、323b、323c的细胞培养表面315的部分间隔开。例如，在一些实施方式中，细胞培养表面315可包括周围表面332，其从外周界330的至少一部分331延伸到包含开口323a,323b,323c的细胞培养表面315的部分。在一些实施方式中，周围表面332可包括垂直取向(例如，在重力的方向上延伸)；然而，在一些实施方式中，周围表面332可相对于重力方向倾斜，以例如向微腔体320a、320b、320c的开口323a、323b、323c引导细胞。

另外，通过使细胞培养表面315的外周界330的至少一部分331位于凹部335中，在一些实施方式中，微腔体320a的开口323a例如可定位成在凹部335的位置处邻接壁301的内表面302。例如，在一些实施方式中，微腔体320a的开口323a可与壁301的内表面302齐平，使得悬浮在液体中的细胞将掉落(例如，至少基于重力)和/或通过内表面302被引导到微腔体320a的孔穴322a中而不会沉降或粘附在容器300的表面上。同样地，通过使细胞培养表面315的外周界330的至少一部分331位于突出部337上，在一些实施方式中，微腔体320a的开口323a例如可定位成邻接细胞培养表面315的周围表面332并且外周界330由突出部337支承。例如，在一些实施方式中，微腔体320a的开口323a可与细胞培养表面315的周围表面332齐平，使得悬浮在液体中的细胞将掉落(例如，至少基于重力)和/或通过周围表面332被引导到微腔体320a的孔穴322a中而不会沉降或粘附在容器300的任何其他表面上。在实施方式中，细胞培养表面315从壁301延伸到壁301。在实施方式中，细胞培养表面115不具有任何平坦区域。也就是说，细胞培养表面是从壁延伸到壁的微腔体320的阵列，并且在细胞培养表面与壁301之间没有边界，没有平坦区域。在实施方式中，细胞培养表面基本上由多个微腔体组成。在实施方式中，在细胞培养室中没有平坦区域用于细胞沉降在上面。这对于确保细胞不沉降在微孔穴之外的细胞培养室中是重要的。当细胞在微孔穴之外沉降在细胞培养表面之外的平坦区域上时，细胞可生长为不规则的细胞聚集团201(参见图35A和35B、36A和36B)，并且在容器中产生不均匀的多细胞3D结构群。在实施方式中，细胞培养表面基本上由多个微腔体组成。

在一些实施方式中，沉降或粘附在容器300的表面上的细胞可在微腔体320a、320b、320c之外积聚并生长(例如，繁殖)，从而引起与在微腔体320a、320b、320c内进行期望的三维细胞生长有关的问题。图35A和图35B是在微腔体周围上的平坦区域中积聚的细胞的示意图。例如，在一些实施方式中，未掉落(至少基于重力)到孔穴322a、322b、322c中并且积聚或粘附于容器300的其他表面的细胞可在孔穴322a、322b、322c之外生长。当细胞沉降在微孔穴之外并且沉降在细胞培养表面之外的平坦区域上时，细胞可生长为不规则的细胞聚集团801，其是不利的。此外，这些不规则的细胞聚集团801可蠕动到附近的微腔体中并破坏(例如，阻碍、改变、变慢或阻止)孔穴322a、322b、322c内的三维细胞的期望的生长。类似地，在一些实施方式中，积聚或粘附于容器300的其他表面的细胞可生长并且将孔穴322a、322b、322c中的三维细胞移出，从而破坏或毁坏在孔穴322a、322b、322c内的三维细胞的期望的生长并且改变细胞的期望的尺寸均匀性。因此，在一些实施方式中，通过使细胞培养表面315的外周界330的至少一部分331位于凹部335中或突出部337上，悬浮在液体中的所有细胞均可被引导到孔穴322a、322b、322c中，因此减少并消除了如果细胞粘附于孔穴322a、322b、322c之外的容器300的表面而可能发生的问题。

图30的截面图示出了细胞培养容器300的另一个示例性实施方式。在一些实施方式中，细胞培养容器300和细胞培养表面315可由相同材料制造。例如，在一些实施方式中，包括多个微腔体320的细胞培养表面315可作为容器300的壁301的整体部分来制造(例如，成形、机械加工、压制、挤出、模制、通过3D打印操作来打印等)，使得在细胞培养表面315与容器300的壁301之间没有明显分界。如图30所示，在一些实施方式中，细胞培养表面315和壁301的内表面302(一起整体成形)可限定容器300的细胞培养室303。或者，如图31所示，在一些实施方式中，壁301的内表面302可限定容器300的细胞培养室303，其包括第一区域303a和第二区域303b，并且细胞培养表面315(与壁301整体成形)可位于细胞培养室303中，并且在第一区域303a与第二区域303b之间。在一些实施方式中，包括一起整体制造的壁301和细胞培养表面315的容器300可包括非渗透性材料。或者，在一些实施方式中(例如，其中细胞培养表面315附接于容器300的壁301)，容器300的壁301可由非渗透性材料制造，而细胞培养表面315可由非渗透性材料、非多孔材料、透气性材料或多孔材料中的一种或多种制造，所述细胞培养表面315与壁301整体成形。

在细胞培养表面315和壁301作为单一部件来制造的该实施方式中，细胞培养表面315从壁301延伸到壁301。在实施方式中，细胞培养表面315不具有任何平坦区域。也就是说，细胞培养表面是从壁延伸到壁的微腔体320的阵列，并且在细胞培养表面与壁301之间没有边界，没有平坦区域。在实施方式中，细胞培养表面基本上由多个微腔体组成。在实施方式中，在细胞培养室中没有平坦区域用于细胞沉降在上面。这对于确保细胞不沉降在微孔穴之外的细胞培养室中是重要的。当细胞在微孔穴之外沉降在细胞培养表面之外的平坦区域上时，细胞可生长为不规则的细胞聚集团201(参见图35A和35B、36A和36B)，并且在容器中产生不均匀的多细胞3D结构群。在实施方式中，细胞培养表面基本上由多个微腔体组成。

此外，在一些实施方式中，容器300可包括预定量的液体370，并且在细胞培养容器300中培养细胞的方法可包括：将液体370沉积在多个微腔体320的至少一个微腔体320a、320b、320c中，以及在将液体370沉积在所述至少一个微腔体320a、320b、320c中之后，在所述至少一个微腔体320a、320b、320c中培养细胞。

图45示出了以图43的视图45获取的容器300的整体成形的细胞培养表面315和壁301的放大图，如图45所示，预定量的液体370可接触容器300的浸没表面325并占据容器300的细胞培养室303的区域。图46示出了图45的一个替代示例性实施方式，其包括以下特征：细胞培养表面315的外周界330的至少一部分331位于容器300的壁301的凹部335中，并且预定量的液体接触容器300的浸没表面325(包括细胞培养表面315的周围表面332)并且占据容器300的细胞培养室303的区域。类似地，图34示出了图32的一个替代示例性实施方式，其包括以下特征：细胞培养表面315的外周界330的至少一部分331位于容器300的壁301的突出部337上，并且预定量的液体370接触容器300的浸没表面325(包括细胞培养表面315的周围表面332)并且占据容器300的细胞培养室303的区域。

仅是出于例示的目的，在图32-34中，浸没表面325显示为具有更粗的线宽，并且应理解，在一些实施方式中，浸没表面325可包括与预定量的液体370接触的容器300的表面。在一些实施方式中，可在容器300中培养细胞的方法的规定步骤中或期间相对于重力“g”的方向限定浸没表面325。例如，在一些实施方式中，预定量的液体370可限定液位371，其中浸没表面325包括与预定量的液体370接触的容器300的表面，相对于重力“g”的方向，其位于液位371下方，因此其浸没在预定量的液体370中。在一些实施方式中，预定量的液体370的液位371可限定预定量的液体370的平面自由表面，其与细胞培养表面315的一部分375间隔一定距离。例如，细胞培养表面315的部分375可包括开口323a、323b、323c并且由预定量的液体370的液位371限定的平面自由表面在远离多个微腔体320的每个微腔体320a、320b、320c的凹表面321a、321b、321c的方向上可与部分375间隔一定距离。

此外，在一些实施方式中，容器300的浸没表面325不包括与预定量的液体370的平面自由表面平行的平面表面部分。通过使提供的浸没表面325不包括与预定量的液体370的液位371的平面自由表面平行的平面表面部分，悬浮在液体370中的细胞将掉落(例如，至少基于重力)和/或通过浸没表面325引导到微腔体320a、320b、320c的孔穴322a、322b、322c中，这是因为，不存在细胞可沉降在其上或细胞可与其粘附的浸没表面325。如上所述，在一些实施方式中，沉降或粘附在容器300的表面上的细胞可在微腔体320a、320b、320c之外积聚并生长(例如，繁殖)，从而引起与在微腔体320a、320b、320c内进行期望的三维细胞生长有关的问题。例如，在一些实施方式中，(例如，如果浸没表面325包括与预定量的液体370的平面自由表面平行的平面表面部分)未掉落(至少基于重力)到孔穴322a、322b、322c中并且积聚或粘附于容器300的其他表面的细胞可在孔穴322a、322b、322c之外生长，并且破坏(例如，阻碍、改变、减慢或阻止)孔穴322a、322b、322c内的三维细胞的期望的生长。类似地，在一些实施方式中，如果浸没表面325包括与预定量的液体370的平面自由表面平行的平面表面部分，则细胞可积聚或粘附于平面表面部分并且可生长并且将孔穴322a、322b、322c中的三维细胞移出，从而破坏或毁坏在孔穴322a、322b、322c内的三维细胞的期望的生长。因此，在一些实施方式中，通过使提供的浸没表面325不包括与预定量的液体370的液位371的平面自由表面平行的平面表面部分，悬浮在液体370中的所有细胞均可被引导到孔穴322a、322b、322c中，因此减少并消除了如果细胞粘附于孔穴322a、322b、322c之外的容器300的表面而可能发生的问题。

如图33所示，在一些实施方式中，细胞培养表面315的外周界330的至少一部分331在远离多个微腔体320中的每个微腔体320a、320b、320c的凹表面321a、321b、321c的方向上可与细胞培养表面315的部分375间隔距离“d4”。此外，细胞培养表面315可包括周围表面332，其从外周界330的至少一部分331延伸到细胞培养表面315的部分375。在一些实施方式中，沿着所述方向从限定平面自由表面的液位371到细胞培养表面315的部分375的预定量的液体370的深度“d5”可小于距离“d4”。同样地，如图47所示，在一些实施方式中，细胞培养表面315的外周界330的至少一部分331在远离多个微腔体320中的每个微腔体320a、320b、320c的凹表面321a、321b、321c的方向上可与细胞培养表面315的部分375间隔距离“d6”。细胞培养表面315可包括周围表面332，其从外周界330的至少一部分331延伸到细胞培养表面315的部分375。在一些实施方式中，沿着所述方向从限定平面自由表面的液位371到细胞培养表面315的部分375的预定量的液体370的深度“d7”可小于距离“d6”。

因此，在一些实施方式中，通过使提供的浸没表面325不包括与预定量的液体370的液位371的平面自由表面平行的平面表面部分，其单独地或结合：沿着所述方向从限定平面自由表面的液位371到细胞培养表面315的部分375的预定量的液体370的深度“d5”可小于距离“d4”(例如，图33，包括凹部335)以及沿着所述方向从限定平面自由表面的液位371到细胞培养表面315的部分375的预定量的液体370的深度“d7”可小于距离“d6”(例如，图34，包括突出部337)，悬浮在液体370中的所有细胞可被引导到孔穴322a、322b、322c中，因此减少并消除了如果细胞粘附于孔穴322a、322b、322c之外的容器300的表面而可能发生的问题。此外，虽然未明确说明，但是在一些实施方式中，在容器300中培养细胞的方法(参见图16)可包括：将预定量的液体370的一部分沉积在多个微腔体320a、320b、320c的至少一个微腔体320a、320b、320c中；以及在将预定量的液体370的部分沉积在所述至少一个微腔体320a、320b、320c中之后，在所述至少一个微腔体320a、320b、320c中培养细胞。

参考图32-34，在一些实施方式中，在细胞培养容器300中培养细胞的方法可包括：用预定量的液体370填充容器300的细胞培养室303的区域。在一些实施方式中，细胞培养室303可至少部分由容器300的壁301的内表面302限定，并且所述方法可包括：在细胞培养表面315的多个微腔体320的至少一个微腔体320a、320b、320c中沉积预定量的液体370的一部分。细胞培养表面315可限定所述区域的至少一部分331，并且多个微腔体320中的每个微腔体320a、320b、320c可包括限定孔穴322a、322b、322c的凹表面321a、321b、321c以及在细胞培养表面315的部分375中的开口323a、323b、323c，其限定了进入到孔穴322a、322b、322c中的路径。在一些实施方式中，所述方法还可包括：在所述至少一个微腔体320a、320b、320c中沉积部分的预定量的液体370后，在所述至少一个微腔体320a、320b、320c中培养细胞，其中所述预定量的液体370接触容器300的浸没表面325。在一些实施方式中，当在所述至少一个微腔体320a、320b、320c中培养细胞时，浸没表面325不包括含有与重力“g”的方向相反的表面法线的平面表面部分。任选地，在一些实施方式中，当在多个微腔体320的至少一个微腔体320a、320b、320c中培养细胞时，预定量的液体370的液位371可限定相对于重力“g”的方向垂直的预定量的液体370的平面自由表面。

通过使提供的浸没表面325不包括含有与重力“g”的方向相反的表面法线的平面表面部分，悬浮在液体370中的细胞将掉落(例如，至少基于重力)和/或通过浸没表面325引导到微腔体320a、320b、320c的孔穴322a、322b、322c中，这是因为，不存在细胞可沉降在其上或细胞可与其粘附的浸没表面325。如上所述，在一些实施方式中，沉降或粘附在容器300的表面上的细胞可在微腔体320a、320b、320c之外积聚并生长(例如，繁殖)，从而引起与在微腔体320a、320b、320c内进行期望的三维细胞生长有关的问题。例如，在一些实施方式中，(例如，如果浸没表面325包括含有与重力“g”的方向相反的表面法线的平面表面部分)未掉落(至少基于重力)到孔穴322a、322b、322c中并且积聚或粘附于容器300的其他表面的细胞可在孔穴322a、322b、322c之外生长，并且破坏(例如，阻碍、改变、减慢或阻止)孔穴322a、322b、322c内的三维细胞的期望的生长。类似地，在一些实施方式中，如果浸没表面325包括含有与重力“g”的方向相反的表面法线的平面表面部分，则细胞可积聚或粘附于平面表面部分并且可生长并且将孔穴322a、322b、322c中的三维细胞移出，从而破坏或毁坏在孔穴322a、322b、322c内的三维细胞的期望的生长。因此，在一些实施方式中，通过使提供的浸没表面325不包括含有与重力“g”的方向相反的表面法线的平面表面部分，悬浮在液体370中的所有细胞均可被引导到孔穴322a、322b、322c中，因此减少并消除了如果细胞沉降或粘附于孔穴322a、322b、322c之外的容器300的表面而可能发生的问题。

另外，出于本公开的目的，除非另有说明，否则“平面表面部分”旨在意为包括大于约5微米的平面尺寸的任何平面表面部分。例如，在一些实施方式中，浸没表面325不包括与预定量的液体370的液位371的平面自由表面平行的平面表面部分，该浸没表面325可被定义为不包括平面表面部分并且所述平面表面部分与预定量的液体370的液位371的平面自由表面平行且含有大于约5微米的平面尺寸的浸没表面325。类似地，在一些实施方式中，浸没表面325不包括含有与重力“g”的方向相反的表面法线的平面表面部分，该浸没表面325可被定义为不包括平面表面部分并且所述平面表面部分包括大于约5微米的平面尺寸且含有与重力“g”的方向相反的表面法线的浸没表面325。

例如，在一些实施方式中，浸没表面325可包括平面部分；然而，在一些实施方式中，如果平面表面部分的平面尺寸例如小于或等于5微米，则该平面表面部分被认为过小而不能使细胞合理地积聚或粘附。因此，在一些实施方式中，通过使提供的浸没表面325不包括含有大于约5微米的平面尺寸的平面表面部分，悬浮在液体370中的所有细胞均可被引导到孔穴322a、322b、322c中，因此减少并消除了如果细胞沉降或粘附于孔穴322a、322b、322c之外的容器300的表面而可能发生的问题。然而，在一些实施方式中，浸没表面325可完全不含平面表面部分，从而与限定平面表面部分的阈值尺寸无关。

图35A和图35B是例示了在微腔体中作为球体生长的细胞以及作为不规则细胞聚集团201生长的细胞的图。如果在容器中出现平坦表面，则在图1-16(细胞培养表面115)所示的实施方式中或者在图17-34(细胞培养表面315)所示的实施方式中可出现这些不规则细胞聚集团。避免在细胞培养室103或303中有平坦表面对于避免这些不规则细胞聚集团是重要的。

图36A是在合适的条件下的微腔体阵列中的球体照片，在容器中提供了均匀的球体群。图36B是从在细胞生长室103、303中具有平坦表面的容器中分离出的不规则细胞聚集团801的照片。为了避免产生这些不规则的细胞聚集团801，提供了细胞培养容器的实施方式，其在细胞培养表面中不具有平坦表面，或者在细胞培养表面的浸没区域中不具有平坦表面。也就是说，在细胞培养容器的实施方式中，细胞培养表面基本上由微腔体阵列组成，并且不提供可产生不期望的不规则细胞聚焦团801的平坦表面。

在本公开中，术语“材料”、“液体”和“气体”可用于描述当例如在细胞培养容器中培养细胞时，所用材料的性质。除非另有说明，否则出于本公开的目的，“材料”可包括流体材料(例如，液体或气体)。另外，材料可包括培养溶液或者培养基，其包括含有悬浮在液体中的固体颗粒(例如细胞)的液体。除非另有说明，否则出于本公开的目的，“液体”可包括清洁或清洗溶液、水溶液、或可添加到容器中或从容器中移除的其他液体，例如，用于清洁细胞培养室，对细胞培养表面和容器的一个或多个特征进行灭菌，为细胞生长准备细胞培养表面，以及液体的其他用途。另外，液体可包括培养溶液或者培养基，其包括含有悬浮在液体中的固体颗粒(例如细胞)的液体。除非另有说明，否则出于本公开的目的，“气体”可包括空气、经过滤或处理的空气或其他气体。

在本公开中，术语“非渗透性”、“透气性”和“多孔”可用于描述细胞培养表面的一个或多个特征的性质(例如，材料性质、特性、参数)。

除非另有说明，否则出于本公开的目的，“非渗透性”细胞培养表面(例如，非渗透性细胞培养表面材料)被认为是在正常条件下(例如，无外界影响，包括但不限于压力和力)对固体、液体和气体不可渗透，因此，其不允许固体、液体或气体在正常条件下进入、通过或离开非渗透性细胞培养表面。在一些实施方式中，非渗透性细胞培养表面可形成容器壁的一部分。另外，当非渗透性细胞培养表面形成容器壁的一部分时，容器的细胞培养室被认为是无菌的，这是因为，例如细菌不能通过非渗透性细胞培养表面。然而，当用材料填充细胞培养表面的多个微腔体时，基于液体的表面张力，气体可被困在非渗透性细胞培养表面的微腔体中，在一些实施方式中，由此阻止材料填充微腔体并且阻止球体的生长。

除非另有说明，否则出于本公开的目的，“透气性”细胞培养表面(例如，透气性细胞培养表面材料)被认为在正常条件下对固体和液体不可渗透，而对气体可渗透。因此，透气性细胞培养表面不允许固体和液体进入、通过或离开透气性细胞培养表面，但允许气体进入、通过或离开透气性细胞培养表面。在一些实施方式中，渗气性细胞培养表面可形成容器壁的一部分。另外，当透气性细胞培养表面形成容器壁的一部分时，容器的细胞培养室被认为是无菌的，这是因为，例如细菌不能合理地通过透气性细胞培养表面。然而，虽然细胞培养表面是透气性的，但是在用材料填充期间，气体仍可被困在微腔体中，这是因为在普通操作条件下，通过透气性细胞培养表面的气体渗透速率比从腔体置换气体所需的速率慢，并因此可消耗不可接受的长时间来渗透通过细胞培养表面。因此，在一些实施方式中，缓慢填充微腔体允许液体前沿以某角度进入每个微腔体，由此在液体填充微腔体时，置换气体。在一些实施方式中，在用液体填充腔体后，气体可渗透(缓慢)通过透气性细胞培养表面。

除非另有说明，否则出于本公开的目的，“多孔”细胞培养表面(例如，多孔细胞培养表面材料)被认为在正常条件下对固体不可渗透，而对液体和气体可渗透。因此，多孔细胞培养表面不允许固体进入、通过或离开多孔细胞培养表面，但允许液体和气体进入、通过或离开多孔细胞培养表面。多孔细胞培养表面不能形成容器的一部分，因为细菌可通过多孔细胞培养表面，因此导致细胞培养室中的无菌性问题。因此，当使用多孔细胞培养表面时，该细胞培养表面需被包封(完全包封)在容器的无菌细胞培养室中。然而，在用材料填充微腔体期间，气体可通过多孔细胞培养表面逸出(例如穿过)。因此，可迅速进行微腔体的填充而不会有气体被困在微腔体中的担忧。在一些实施方式中，液体只能在压力增加或物理接触及干扰细胞培养表面的情况下通过多孔细胞培养表面。因此，在一些实施方式中，只要细胞培养表面不暴露于加压或物理接触和干扰的情况中，包含液体的材料可被包含在细胞培养表面的微腔体中。例如，在一些实施方式中，可将多孔细胞培养表面支承在细胞培养室中以在填充期间以及培养期间允许气体通过细胞培养表面，并且使细胞培养表面与加压或物理接触及被外力干扰(例如，在细胞培养室之外的)隔离。

本文公开了细胞培养容器和培养细胞的方法的多个方面。下文是一些选定方面的概述。

在第1方面中，本公开提供了一种细胞培养容器，其包括：基本上由多个微腔体组成的细胞培养表面；附接于细胞培养表面的壁，所述细胞培养表面和壁的内表面限定了容器的细胞培养室。

在第2方面中，本公开提供了如方面1所述的细胞培养容器，多个微腔体中的每个微腔体包括凹形底部和开口。

在第3方面中，本公开提供了如方面1或方面2所述的细胞培养容器，其还包括颈缩开口。

在第4方面中，本公开提供了如方面3所述的细胞培养容器，其还包括在颈缩开口中的堰板。

在第5方面中，本公开提供了如方面1或2所述的细胞培养容器，其还包括盖。

在第6方面中，本公开提供了如方面3或4所述的细胞培养容器，其还包括盖。

在第7方面中，本公开提供了如方面6所述的细胞培养容器，其中，所述盖包括铰接开口。

在第8方面中，本公开提供了如方面4所述的细胞培养容器，其中，所述盖包括滑动开口。

在第9方面中，本公开提供了如方面3、4或6-8所述的细胞培养容器，其中，颈缩开口包括弯部。

在第10方面中，本公开提供了如方面1-9中任一方面所述的细胞培养容器，其中，所述壁包括凹部并且细胞培养表面附接于凹部。

在第11方面中，本公开提供了如方面1-9中任一方面所述的细胞培养容器，其中，所述壁包括突出部并且细胞培养表面附接于突出部。

在第12方面中，本公开提供了一种细胞培养容器，其包括：包括多个微腔体的细胞培养表面，所述微腔体具有非平坦的正弦曲线形状；附接于细胞培养表面的壁，所述细胞培养表面和壁的内表面限定了容器的细胞培养室；其中，所述细胞培养表面基本上不含平坦区域。

在第13方面中，本公开提供了如方面12所述的细胞培养容器，多个微腔体中的每个微腔体包括凹形底部和开口。

在第14方面中，本公开提供了如方面12或方面13所述的细胞培养容器，其还包括颈缩开口。

在第15方面中，本公开提供了如方面14所述的细胞培养容器，其还包括在颈缩开口中的堰板。

在第16方面中，本公开提供了如方面12或13所述的细胞培养容器，其还包括盖。

在第17方面中，本公开提供如方面14或15所述的细胞培养容器，其还包括盖。

在第18方面中，本公开提供了如方面17所述的细胞培养容器，其中，所述盖包括铰接开口。

在第19方面中，本公开提供了如方面17所述的细胞培养容器，其中，所述盖包括滑动开口。

在第20方面中，本公开提供了如方面14、15或17-19中任一方面所述的细胞培养容器，其中，颈缩开口包括弯部。

在第21方面中，本公开提供了如方面12-17中任一方面所述的细胞培养容器，其中，所述壁包括凹部并且细胞培养表面附接于凹部。

在第22方面中，本公开提供了如方面12-17中任一方面所述的细胞培养容器，其中，所述壁包括突出部并且细胞培养表面附接于突出部。

应理解，各个公开的实施方式可以涉及与特定实施方式一起描述的特定特征、要素或步骤。还应理解，虽然以涉及一个特定实施方式的形式进行描述，但是特定特征、要素或步骤可以与各个未例示的组合或排列方式中的替代性实施方式互换或组合。

应理解的是，本文所用术语“该”、“一个”或“一种”表示“至少一个(一种)”，而不应局限为“仅一个(一种)”，除非有明确相反的说明。因此，例如，提到的“一个”部件包括具有两个或更多个这类部件的实施方式，除非上下文有另外明确的表示。

在本文中，范围可以表述为自“约”某一具体值始和/或至“约”另一具体值止。当表述这种范围时，实施方式包括自某一具体值始和/或至另一具体值止。类似地，当使用先行词“约”表示数值为近似值时，应理解，具体数值构成了另一个方面。还应理解，每个范围的端点在与另一个端点有关及独立于另一个端点时都是重要的。

除非另有表述，否则都不旨在将本文所述的任意方法理解为需要使其步骤以具体顺序进行。因此，当方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，都不旨在暗示该任意特定顺序。

虽然使用连接词“包含”可以公开特定实施方式的各个特征、元素或步骤，但是应理解的是，这暗示了包括可采用连接词“由……构成”或“基本上由……构成”描述在内的替代性实施方式。因此，例如，包括A+B+C的设备的暗示替代实施方式包括其中设备由A+B+C组成的实施方式以及其中设备基本上由A+B+C组成的实施方式。

对本领域的技术人员而言，显而易见的是，可以对本公开进行各种修改和变动而不偏离本公开的范围和精神。因此，本公开旨在涵盖对本公开的这些修改和变动，只要这些修改和变动在所附权利要求及其等同方案的范围之内。

Claims (22)

1.一种细胞培养容器，其包括：

基本上由多个微腔体组成的细胞培养表面；

附接于细胞培养表面的壁，所述细胞培养表面和壁的内表面限定了容器的细胞培养室。

2.如权利要求1所述的细胞培养容器，多个微腔体中的每个微腔体包括凹形底部和开口。

3.如权利要求1或2所述的细胞培养容器，其还包含颈缩开口。

4.如权利要求3所述的细胞培养容器，其还包含在颈缩开口中的堰板。

5.如权利要求1或2所述的细胞培养容器，其还包含盖。

6.如权利要求3或4所述的细胞培养容器，其还包含盖。

7.如权利要求6所述的细胞培养容器，其中，所述盖包含铰接开口。

8.如权利要求4所述的细胞培养容器，其中，所述盖包含滑动开口。

9.如权利要求3、4或6-8中任一项所述的细胞培养容器，其中，所述颈缩开口包含弯部。

10.如权利要求1-9中任一项所述的细胞培养容器，其中，所述壁包括凹部并且细胞培养表面附接于凹部。

11.如权利要求1-9中任一项所述的细胞培养容器，其中，所述壁包括突出部并且细胞培养表面附接于突出部。

12.一种细胞培养容器，其包括：

包括多个微腔体的细胞培养表面，所述微腔体具有非平坦的正弦曲线形状；

附接于细胞培养表面的壁，所述细胞培养表面和壁的内表面限定了容器的细胞培养室；

其中，所述细胞培养表面基本上不含平坦区域。

13.如权利要求12所述的细胞培养容器，多个微腔体中的每个微腔体包括凹形底部和开口。

14.如权利要求12或13所述的细胞培养容器，其还包含颈缩开口。

15.如权利要求14所述的细胞培养容器，其还包含在颈缩开口中的堰板。

16.如权利要求12或13所述的细胞培养容器，其还包含盖。

17.如权利要求14或15所述的细胞培养容器，其还包含盖。

18.如权利要求17所述的细胞培养容器，其中，所述盖包含铰接开口。

19.如权利要求17所述的细胞培养容器，其中，所述盖包含滑动开口。

20.如权利要求14、15或17-19中任一项所述的细胞培养容器，其中，所述颈缩开口包含弯部。

21.如权利要求12-17中任一项所述的细胞培养容器，其中，所述壁包括凹部并且细胞培养表面附接于凹部。

22.如权利要求12-17中任一项所述的细胞培养容器，其中，所述壁包括突出部并且细胞培养表面附接于突出部。

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