CN101978041B - 通道受限制的多层细胞培养系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供具有矩形轨迹和由导管空气空间隔开的多个细胞培养室的多层细胞培养装置，各细胞培养室具有端口和端口盖或外部歧管，其构造和布置成将液体转移进出该细胞培养装置，同时降低了污染风险，本发明还涉及该装置的使用方法。

Description

通道受限制的多层细胞培养系统

相关申请的交叉引用

本申请要求2008年1月25日提交，名为“通道受限制的多层细胞培养系统(Limited Access Multi-Layer Cell Culture System)”的美国临时申请序列号61/062,404的优先权。

领域

本发明总体上涉及容纳培养的细胞的系统。更具体地说，本发明涉及用来容纳培养的细胞的装置，从而能无菌控制污染和将细胞和培养基无菌转移进出该装置。

背景

体外培养细胞提供药理学、生理学和毒理学研究所需的材料。药物筛选技术的最新进展使得药物公司能快速筛选针对治疗靶标的大量化合物。这些大规模筛选技术需要体外生长和维持的大量细胞。维持如此大量的细胞需要大体积的细胞生长介质和试剂以及许多数量和类型的实验室细胞培养容器和实验室设备。该工作亦是劳动密集型的。

细胞在专门的细胞培养容器中生长，包括滚瓶、细胞培养皿和平板、多孔板、微量滴定板、普通烧瓶和多层细胞生长烧瓶及容器。培养的细胞在烧瓶的底表面上粘附并生长，浸没在合适的维持培养基中。

随着细胞高通量应用的进步，现已开发了细胞培养容器来增加细胞生长表面积，同时提供必需的气体交换。这些系统还利用传统细胞培养容器，包括普通烧瓶，滚瓶，细胞培养皿以及多层细胞生长容器，包括多层烧瓶、多层细胞培养皿，生物反应器，细胞培养袋等，这些容器可包括为提高细胞培养参数，包括生长密度和分化因素而设计的专门表面。

此外，现已自动化进行细胞高通量应用。自动化使得细胞培养容器的操作非常类似于手工操作者进行的。此外，具有多层细胞生长表面的烧瓶容器产生的粘附细胞量高于在单一底壁上培养细胞的通常已知的烧瓶。虽然这些多层容器能培养大量细胞，但它们在每日应用中存在不足。

本领域需要细胞培养容器，从而能提供自动引导液体进出细胞培养容器并改进转移无菌度的装置。此外，本领域需要适用于通常利用机器人操作进行高通量试验的装置。

发明概述

本发明的实施方式提供具有至少3个细胞培养室和至少两个整体型导管室(integral tracheal chamber)的多层细胞培养装置，各细胞培养室具有至少一个端口，各端口具有一个端口盖(port cover)，各端口构造和布置成与端口盖接合从而能提供可释放的液密密封。端口盖可以通过连接器(connector)与多层细胞培养装置相连，所述连接器可以是铰接的连接器。在诸多实施方式中，端口盖可具有隔片。该隔片可使得通过该隔片引入的流体流动器件(fluid flow device)在该流体流动器件和该端口之间形成液密密封。在诸多实施方式中，流体流动器件可以是针头、移液管或移液管尖端、试管或套管。在诸多实施方式中，端口可具有密封器，所述密封器可以是环状结构，从而端口盖能连接端口上的互补结构，进而形成可逆的液密密封。

在其它实施方式中，本发明提供具有至少一个端口和具有滑动端口盖的细胞培养装置，所述滑动端口盖构造和布置成与所述至少一个端口接合从而通过将该端口盖以相对于所述至少一个端口的开放位置或封闭位置滑动接合于所述至少一个端口，而提供开放或封闭的端口。在诸多实施方式中，该滑动端口盖可通过连接器，例如铰接的连接器连接于细胞培养装置，或者该滑动端口盖可以与该细胞培养装置一体化。

在其它实施方式中，本发明提供具有至少三个刚性细胞培养室的细胞培养容器，单独的细胞培养室具有至少一个端口；其中所述至少一个端口具有突出的凸形特征件(male feature)，其构造和布置成与凹形流体流动器件偶连。在其它实施方式中，细胞培养容器具有至少一个端口，该端口具有凹形特征件(female feature)，其构造和布置成与流体流动器件的凸形结构偶连。在其它实施方式中，细胞培养容器具有含凸形结构的一些端口和含凹形结构的一些端口以便与流体流动器件的互补结构偶连。

在其它实施方式中，本发明提供具有至少三个细胞培养室和至少两个整体型导管室的多层细胞培养装置，各细胞培养室具有至少一个端口和一个可拆卸歧管，其构造和布置成与所述至少一个端口形成液密密封。在进一步的实施方式中，所述歧管具有阀门。在还要进一步的实施方式中，所述歧管构造和布置成与多个多层细胞培养装置的至少一个端口偶连，或与带有液体储器的一个多层细胞培养装置偶连。

在进一步的实施方式中，本发明提供具有流体流动器件的歧管，其构造和布置成与多个多层细胞培养装置的端口接合。此外，本发明提供具有至少一个多层细胞培养装置的细胞培养系统，该装置具有至少两个细胞培养室、具有歧管本体和至少两个流体流动器件的至少一个外部歧管，其构造和布置成在所述多层细胞培养装置的所述至少一个外部歧管和所述至少两个细胞培养室之间提供流体流；其中流体流入外部歧管，在歧管本体内汇集，然后分配至所述至少两个流体流动器件，从而液体能在所述至少一个外部歧管和所述至少两个细胞培养室之间平行流动。

附图简述

一起阅读附图与以下详述将最好地理解本发明。

图1是本发明实施方式的部分剖面透视图(partial cut-away perspectiveview)。

图2A、2B和2C显示了本发明的端口和端口盖的实施方式。

图3显示了本发明的端口和滑动端口盖的另一实施方式。

图4显示了本发明的连接器的三个实施方式。

图5A和5B显示了本发明的密封器的实施方式。

图6显示了本发明的多层细胞培养烧瓶的实施方式，显示了端口和与本发明流体流动器件偶连的端口。

图7显示了本发明的端口和端口偶连件(port coupling)的实施方式。

图8A、8B和8C显示了本发明的套管的实施方式。

图9A、9B和9C显示了本发明的歧管的实施方式，显示了本发明阀门的实施方式。

图10显示了本发明歧管的实施方式，显示了本发明流体流动器件与本发明歧管的偶连。

图11A和11B显示了本发明的歧管的实施方式。

图12A和12B显示了本发明歧管的阀门的实施方式。

图13A和13B显示了本发明歧管的阀门的另外的实施方式。

图14显示了本发明歧管的实施方式。

图15显示了本发明歧管的其它实施方式。

图16显示了本发明歧管的其它实施方式。

图17显示了本发明的多层烧瓶及其与本发明歧管的一种实施方式的偶连。

图18显示了本发明的两个多层烧瓶及它们与本发明歧管的一种实施方式的偶连。

图19显示了本发明的多层烧瓶及其与本发明歧管的一种实施方式的偶连。

图20是本发明一种实施方式的透视图，显示了连接于容器的本发明歧管的一种实施方式。

详述

本发明的实施方式涉及通道受限制的细胞培养系统和装置。在诸多实施方式中，本发明的通道受限制的细胞培养装置在整体型多层细胞培养装置中具有多层细胞生长室，各层具有可用端口盖可逆密封的端口，从而能将物质引入和引出该细胞生长室。在诸多实施方式中，该装置还具有外部歧管以控制流体流入和流出该细胞生长室。

在以下详述中，出于解释而非限制性的目的，列举披露特定细节的示范性实施方式是为了彻底理解本发明。然而，本领域普通技术人员应知道可采用不同于本文披露的特定细节的其它实施方式实施本发明。在其它例子中，省略了熟知装置和方法的详述以免混淆本发明说明书。

细胞培养物，特别是粘附细胞培养物越来越多地采用堆叠的、省空间的高密度容器培养，该容器最大程度减小培养箱空间并最大程度增加细胞培养生长表面。参见，流入美国公布号2007/0026516。随着细胞培养容器越来越有效，其内的空间变得越来越有限，由于需要将少量液体输入和输出这些容器，这些容器的实际使用变得更复杂。

维持这些高密度容器以及其中所含流体和细胞的无菌度是最重要的。例如，用于扩增和处理所培养细胞的容器需要在无菌系统中培养细胞。优化细胞培养容器的无菌度的一种方法是提供封闭的或通道受限制的细胞培养系统。封闭的系统可维持所培养细胞的完整性并防止污染。就治疗应用而言，所培养的细胞对于个体可能是独特的，并可能需要促进增殖和特定医学治疗而没有污染的条件。细胞培养容器可具有交替除去并应用于进入细胞培养容器的通道的盖，例如为加入或取出细胞或培养基。或者，细胞培养容器可具有隔片而非盖。随着隔片被刺穿而自外进入容器的物质可造成培养物污染。通过最大程度减少通向细胞培养室的通道可最大程度降低污染的风险。例如，如果细胞培养容器是无菌的，与细胞培养容器接触的所有互连元件是无菌的，尽可能减少细胞培养容器和互连元件的操作并且在无菌环境，例如罩或层流罩中操作，则可降低污染的风险。下文将讨论降低污染风险的其它材料和方法。

多层细胞培养容器必须能使得细胞和细胞培养基进入和离开细胞培养室。本领域需要促进流体以特定方式流入和流出多层细胞培养容器，该方式能维持无菌度并最大程度减少溢出，同时能最大程度减小多层烧瓶的轨迹(footprint)。最大程度减小这些烧瓶和容器的轨迹能提高培养箱空间利用率，以及储存和运输中空间的利用。此外，本领域需要提供具有支持自动化或机器人工艺的特征的这些多层细胞培养容器。

在本发明的实施方式中，提供了多层烧瓶。图1所示的部分剖面透视图显示了本发明的多层烧瓶100的实施方式。多层烧瓶100具有顶板110、底盘(未显示)、侧壁112和端壁114限定的外容器体101。烧瓶100内安置了单独的细胞生长室111，在图1的剖面部分可更清楚地看见。底表面113和顶表面115各自限定了单独的细胞生长室(individual cell growth chamber)111。表面113和115沿侧壁112和端壁114而连接于烧瓶体101。优选各室111内的至少一个底表面113是能提供表面以供细胞117生长的气体可透过、液体不可透过的材料。该气体可透过、液体不可透过的材料可提供细胞粘附的表面，或细胞生长室的底面，或者其可以是细胞生长室的相对表面或顶板。底表面113，或者细胞培养表面113可以是柔性或刚性的。各顶表面115优选是刚性的，通常是支持细胞生长室111的气体不可透过性材料。所述多层烧瓶的表面可以是清澈、不透明、有色或无色的。在本发明的实施方式中，每个细胞生长室111之间有导管空间118。室111的相对顶表面115限定了细胞生长室111的上壁以及导管室118的底部分。因此，导管室118包括第一细胞生长室的气体可透过、液体不可透过表面113和第二生长室111的相对表面115。还可存在支持物119以提供结构支撑从而完全整合表面113和115以形成与单一烧瓶101内的导管空气空间118交替出现的生长室111。因此，各细胞生长室111在垂直的连续方向上与导管室118交替出现。

在本发明的一个实施方式中，单独的细胞生长室111允许细胞在气体可透过的膜113上生长，从而多个细胞生长室111与多层烧瓶100的主体101整合，并能被细胞生长所用的营养培养基完全填充。通过多层烧瓶100的一系列导管空气空间118在细胞117和外部环境之间提供气体交流，所述细胞生长在多层烧瓶内个体细胞生长室111中的培养基127中、气体可透过表面113上。导管空间118使得能通过气体可透过表面113氧化细胞生长室111内的培养基。此外，导管室118可采取任何空气间隙或空间的形式，并且不允许液体进入。因此，共同构建了具有与导管空间118交替出现的多重生长室111的刚性细胞培养多层烧瓶100以提供与大体积细胞117相当的气体分布的益处。

可通过任何方法将气体透过性膜113固定支持物119和侧壁112，包括但不限于粘合剂或溶剂粘合、热密封或焊接、压缩、超声焊接、激光焊接和/或通常用于在零件之间产生密封的任何其它方法。优选围绕膜113的周边进行激光焊接，以围绕膜区域产生气密性密封，从而该膜与支持物119的面平齐并融合，进而成为多层烧瓶内表面整体的一部分。一旦其它气体透过性膜113粘合于侧壁和端壁，可连接顶板110和底盘120。底盘120和顶板110可以是注塑的。可结合各种大小和形状的支持物119以促进细胞培养容器100内细胞培养物117的膜层113的定位。

可用一种或多种本领域已知的膜制备气体可透过、液体不可透过的膜113(参见图1)。膜通常由合适的材料制成，所述材料可包括，例如：聚苯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚烯烃、乙烯-乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚砜、聚四氟乙烯(PTFE)或相容的含氟聚合物、聚硅酮橡胶或共聚物、聚(苯乙烯-丁二烯-苯乙烯)或这些材料的组合。如制备和细胞生长的相容性允许，可利用各种聚合材料。就其已知的能力而言，聚苯乙烯可以是膜(厚约0.003英寸，但细胞生长还需要各种厚度)的优选材料。因此，膜可以是任何厚度，优选约25-250微米，但理想的是约25-125微米。

可通过本领域技术人员已知的任何可接受的制备方法制造本发明的多层烧瓶100。在方法的一种实施方式中，用单独注塑的零件的组合装配所述多层烧瓶100。虽然可利用适用于模塑和通常用于制备实验室制品的任何聚合物(例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、丙烯酸、聚苯乙烯或聚酯)，但优选聚苯乙烯。虽然对光学透明度未作要求，但最好维持厚度不超过2mm。可通过任何方法装配各零件，包括但不限于：粘合剂或溶剂粘合、热密封或焊接、压缩、超声焊接、激光焊接和/或通常用于在零件之间形成密封的任何其它方法，从而其成为多层烧瓶内表面整体的一部分。可通过例如激光焊接对齐并连接顶板110和底盘。

在一个实施方式中，使零件固定在一起并沿接缝进行粘合剂粘合、超声焊接或激光焊接，利用热辊筒(heat platen)或通过任何其它方法结合。部分或完全自动化装配系统中优选利用激光焊接设备。在沿着对接处的外周进行激光焊接时将顶板和盘适当对齐。

优选地并且为了增强细胞粘附和生长，可处理多层烧瓶100的内部表面，包括膜层以使细胞生长。可通过本领域已知的任何方法进行处理，包括等离子体放电、电晕放电、气体等离子体放电(gas plasma discharge)、离子轰击、电离辐射和高强度紫外光。

在其它实施方式中，单独的细胞生长室的一侧可通过一层气体透过性膜110限定边界，以液体不可透过的方式连接于侧壁112并且通过作为刚性层的顶表面在另一侧限定边界，从而为单独的细胞培养生长室111和多层烧瓶作为整体提供更具刚性的元件。例如，单独的细胞生长室111在顶侧由刚性层115限定边界，在侧面由其边缘限定边界，在底侧通过气体透过性膜限定边界。该单独的细胞生长室111可堆叠在另一此类单独的细胞生长室111的顶部，在此处一个单独的细胞生长室111的刚性层115的顶部形成限定毗邻的单独细胞生长室的气体透过性膜113之下的导管空间的支持结构。在一个实施方式中，可将单独的细胞培养室装配成较大的多层细胞培养容器。这些个体层可以咬合(snap)在一起，或者采用本领域已知的任何结合方法彼此结合。

图1显示了构成烧瓶100内部的导管空气空间118和单独的细胞生长室111的交替层。以液体不可透过方式结合于细胞培养容器的侧壁和端壁的液体不可透过、气体透过性膜113限定了单独的细胞生长室111。细胞生长培养基127包含在膜113之间，细胞在这些膜113的液体表面上生长。在该实施方式中，以液体不可透过方式结合于侧壁112的两层气体透过性膜可形成细胞生长室111，从而形成单独的细胞生长室111。导管空气空间118在气体透过性膜之间形成多层，从而形成气囊以便气体透过性膜113将空气交换入细胞生长培养基127内。在该实施方式中，分隔并支持构成单独的细胞生长室111的多层气体透过性膜113的支持物119支持导管空气空间。与本发明歧管的实施方式相容的这种多层烧瓶的实施方式的一个优点是当该多层烧瓶旋转180°时，其在相对表面上培养细胞的能力提高。因此，当多层烧瓶旋转时，可在另一气体透过性膜表面113上培养细胞。因此，当只有气体透过性膜在多层烧瓶之间分层时，细胞能在其两个气体透过性表面113上生长。膜113允许在单独的细胞培养生长室111和导管空间118之间自由交换气体。优选的实施方式包括还能耐受多层烧瓶的制造、处理和操作的膜113。

通过延伸穿过细胞生长室的外部表面的端口120到达细胞生长室111，从而在细胞生长室111的表面中产生开口或通过空间。虽然图1中显示端口120延伸通过侧壁，但端口120可以位于细胞生长室111的端壁或任何其它表面上。在本发明的实施方式中，各细胞生长室111具有至少一个端口120允许进入各细胞生长室。在诸多实施方式中，各细胞生长室中可存在多于一个端口120以允许液体经一个端口120进入细胞培养室111，同时被代替的气体经另一端口120排出细胞培养室111。端口盖121示于图1。在该实施方式中，端口盖是活塞。然而，下文讨论并公开了端口盖的其它实施方式。在诸多实施方式中，端口盖121可具有隔片以防细胞培养室的内含物受污染。在诸多实施方式中，可用一层材料处理端口120以提高端口的水密性能。这些材料可以更适合形成将套管引入其中，或具有端口盖的液密性密封。这些材料的例子包括橡胶、PVC、软木塞、硅酮、树胶、氨基甲酸酯或本领域已知的任何其它材料。

图1显示了在多层烧瓶100的角107上具有一组对齐的端口120的本发明实施方式。角107可以如图1所示为平的，或是圆的，或是任何形状。图1还显示在端口120上提供可释放的闭合作用的端口盖121。端口盖121可以是图1所示单独的端口盖121，或者是图2所示的条状，其构造和布置成使一条的端口闭合。

图2A、2B和2C显示了本发明端口和端口盖的实施方式。如图2A-2C所示，端口220构造和布置成与端口盖221可逆地接合从而形成水密密封。端口220和端口盖221可通过在零件之间形成摩擦密封(friction seal)而形成水密密封。端口盖221可以是条带222，其构造和布置成对多个端口220形成液密性密封。端口220可以是与多层烧瓶表面平齐的开口，或者可以是从多层烧瓶的表面延伸的升高结构，从而限定开口。这些升高的结构可以是提供凸形偶连结构的突出结构，从而能将端口与凹形端口盖或凹形流体流动器件偶连。或者，端口可以是凹形结构从而为凸形端口盖或凸形流体流动器件提供偶连结构。

如图2A所示，端口盖221可适配在端口220之内，从而与端口220可逆地接合，形成液密性密封。或者如图2B所示，端口220可适配在端口盖221之内从而可逆地接合，以形成液密性密封。在额外的实施方式中，如图2A和2B所示，端口盖221可包含隔片225。在额外的实施方式中，端口220可包含隔片225(未显示)。

在图2C所示的实施方式中，端口壁226可围绕各端口，所述端口壁是围绕端口的升高部分。在该实施方式中，端口盖227可以与端口壁226可逆地接合，从而形成液密性密封。柔性塑料制成的端口盖227可贴合地适配在端口壁226内，或可贴合地安装在端口壁226外形成摩擦配件(friction fitting)，从而形成可逆的液密性密封。在诸多实施方式中，端口盖221可通过连接器230连接于多层烧瓶。

在图2A-2C所示的实施方式中，端口220可以是打开的或由端口盖221或226密封。或者，端口220可以是打开的，可以包含隔片225。可将本发明的多层烧瓶100制造、灭菌、包装成带有开放端口220的无菌包装并运输。要使用它们时，可将多层烧瓶100置于无菌环境，例如罩或层流罩中，然后可打开其无菌包装。可利用流体流动器件将液体引入多层烧瓶，该装置用于将流体从一处引向另一处，可包括针头、套管或移液管、移液管尖端、试管、管线、通道、管道、导管、线管或本领域已知的任何其它流体流动器件。一旦填充了烧瓶100，可将端口盖221或226置于开放端口220上以对其进行密封，然后将该密封的多层烧瓶引入实验环境，例如培养箱中。可在独立的无菌包装中提供端口盖221或226，或者端口盖可以包括在包含多层烧瓶的无菌包装中。

或者，在备选实施方式中，可制造本发明的多层烧瓶并进行灭菌，可用无菌端口盖221或226密封端口。然后可包装并运输密封的无菌多层烧瓶。要使用时，可将密封的烧瓶置于无菌环境，例如罩或层流罩中，除去其包装，通过除去端口盖来打开端口而将液体引入该烧瓶，或经端口盖221内的隔片225插入针头、套管、移液管尖端或其它器件并将液体引入该多层烧瓶。

图3显示了本发明端口和端口盖的另一实施方式。图3显示了端口320和滑动端口盖350。滑动端口盖350与端口320或端口壁326相接合，从而形成可释放的水密密封。在该实施方式中，滑动端口盖350具有滑动机构以便用户通过滑动手柄351来选择所需的端口盖，如箭头所示。如图3所示，滑动端口盖350使得用户能通过打开或关闭来选择是否覆盖端口，或用隔片325或过滤器330来选择是否覆盖端口。过滤器330可以是本领域已知的过滤材料以降低或防止污染所培养的细胞。可将滑动端口盖设置在打开位置，从而空气能自由进出细胞培养室。在该打开位置，可用过滤器覆盖端口以使空气进出细胞培养室，但防止污染。或者，可将滑动端口盖设置在关闭位置，该关闭位置具有隔片，从而流体流动器件，例如针头或移液管尖端能穿过关闭的端口盖进入细胞培养室。例如，可以图3所示箭头的方向移动滑动端口盖直至隔片325与端口320对齐，从而将滑动端口盖350设置为用隔片325覆盖端口320。用户可通过隔片325插入针头或套管或移液管尖端而经端口引入液体。隔片325的结构或布置能容纳液体操纵器件，例如小的或大的钻孔针、套管或移液管尖端。一旦经端口320引入了液体，用户可选择用隔片325覆盖端口，或者用户可选择用过滤器覆盖端口320。如果用户选择用过滤器330覆盖端口320，用户可以沿着滑动手柄相反的方向移动该手柄，从而使得滤器330与端口320对齐。采用此方式，用户可通过将端口盖的手柄从一处滑移向另一处而改变这些覆盖物。在该实施方式中，滑动端口盖350可以与本发明多层烧瓶一体化，或者该滑动端口盖可通过连接器340连接于多层烧瓶。滑动端口盖可以是可拆卸的。如果滑动端口盖350是可拆卸的，其可通过任何连接器340，例如铰接的连接器340连接于多层烧瓶。

当端口盖含有隔片时，该端口盖与端口相接合从而形成可逆的液密密封，隔片可以位于端口之上。即，当端口盖含有隔片时，该隔片本身可位于端口之上。

现在看图4，图4显示了本发明连接器401的实施方式。连接器401是将端口盖421与多层烧瓶相连接的元件。连接器401可以是铰接的连接器440。铰接的连接器可以是一侧连接于端口盖，另一侧连接于端口壁或多层烧瓶的薄的柔性塑料带。这种薄的柔性塑料带是可变形的，因而能将端口盖以打开位置(未显示)或关闭位置的形式连接于多层烧瓶，如图4所示。铰接的连接器440可以是较厚的塑料带，该带上划有刻痕线从而塑料能在刻痕标记处弯曲。或者，铰接的连接器可以是枢轴式铰链、弹簧铰链(以确保端口盖处于关闭位置或打开位置)或本领域已知的任何其它类型铰链。这些铰接的440连接器可分别模塑，或作为端口盖的一部分进行模塑，通过本领域已知的任何方法连接于多层烧瓶，包括上文讨论的用于模塑和连接塑料部件的方法。

在额外的实施方式中，连接器可以是球窝式连接器450。球形元件470可从端口盖或多层烧瓶伸出，可以可逆地结合相对表面的伸出窝槽元件471。然后可将端口盖与该球窝式接头咬合以连接两部分。在额外的实施方式中，连接器可以是钩环紧固件(hook and loop fastener)460，拉锁型紧固件(zip-lock typefastener)、粘合剂或其它连接机构。

可将端口盖421连接于多层烧瓶100(如图4所示)，或通过连接器401连接于多层烧瓶100的某结构，例如端口壁226(如图2A-2C所示)。或者，在备选实施方式中，端口盖221或端口盖条带222可以不连接于多层烧瓶，可与多层烧瓶100隔开。端口盖221或端口盖条带222可以是一次性的，因此每次通过端口220进入细胞生长室之时，除去用过的端口盖221或端口盖条带222并弃去，当用户需要关闭多层烧瓶时，可用新的端口盖221或端口盖条带222以关闭端口220。端口盖或端口盖条带可以是一次性的，可经热灭菌或紫外灭菌或本领域已知的任何其它方法灭菌。

在诸多实施方式中，端口220和端口盖221或226可具有内部或外部密封或接合结构以使端口盖与端口接合，从而提供液密密封。参见，例如图5A和5B。图5A显示了拉锁型密封器(zip-lock type sealer)500。可在一个表面，例如端口或端口盖的顶表面或端口壁上提供一对隔开的平行紧固件脊501从而形成通道502，互补的表面可具有一条柔性材料带505，当压入紧固件通道时，其形成可释放的液密密封。在诸多实施方式中，可将紧固件设计成当密封形成时可改变颜色。例如，紧固件脊可带有某种颜色，例如蓝色，缎带可带有另一种颜色，例如红色，当两个互补元件压在一起形成密封时，该结构可呈现紫色。

图5B显示密封器500的备选实施方式。横档结构(ledge structure)510或围绕升高的端口520的环状结构与互补结构相接合，所述互补结构可以是，例如端口盖521或端口盖条带522上的柔性推动杆(catch bar)511，从而端口盖521能滑动结合诸端口进而在端口盖条带522和端口520之间产生可释放的液密密封。虽然图5B中只显示了一个端口520，但可利用端口盖条带以滑动结合一系列类似结构的端口，从而在一系列端口520和端口盖条带522之间形成密封。综合来看，这些结构，滑动结合端口盖条带522以形成液密密封的横档结构510是密封器500的一个实施方式。或者，在额外的实施方式中，端口盖521可具有内部或外部密封器，这些结构使得端口盖521能与端口520接合从而提供液密密封。如图5所示，端口盖521可滑动到端口520上以便适配在端口520之上从而形成液密密封。该操作将包含在端口盖521中的隔片525置于端口520之上，但与该端口接合从而形成液密密封。端口520或端口盖521可具有隔片525。如果隔片525在端口盖521中，该隔片525不向下延伸入端口，而是在该端口之上和之外。隔片525能封闭端口直至针头或套管或其它器件经隔片525插入该端口或端口盖。当针头或套管或其它器件经隔片525插入端口520或端口盖521时，该针头或套管可经过该端口或端口盖进入多层烧瓶的细胞培养室，同时能在该端口或端口盖和针头或套管之间维持液密密封。

现在看图6，图6显示本发明多层烧瓶100的一个实施方式，包括在多层烧瓶100的第一末端602上的图3所示滑动端口盖350，和与多层烧瓶100的第二末端603上的端口(未显示)接合的试管601。该多层烧瓶具有多个细胞生长室111和内部导管空气空间118。可通过端口进入各细胞生长室111(参见图7)。在本发明的一个实施方式中，可通过试管601将流体泵入各细胞生长室111来填充多层烧瓶100。例如，通过将滑动端口盖移动至过滤器位置而将过滤器置于多层烧瓶100的第一末端602上的端口之上，如图3所示。然后可经试管601将液体泵入各细胞生长室111。通过多层烧瓶100的第二末端603上的端口进入细胞生长室111的液体所替代的空气或其它气体可经滑动端口盖350上的过滤端口排出细胞生长室。一旦填充了多层烧瓶，可调整滑动端口盖350，从而用隔片覆盖多层烧瓶的第一末端602上的端口以便形成液密密封。可通过夹紧或焊接闭合的试管来密封试管601。然后将密封的多层烧瓶置于合适环境，例如培养箱中以使细胞在多层烧瓶中生长。在备选的实施方式中，液体可经第一组试管601泵入一组细胞生长室111，可通过细胞生长室111流动，可通过与第二组试管或其它流体流动器件偶连的第二组端口排出细胞生长室。

连接于多层烧瓶的试管601可使液体更为无菌地进出多层烧瓶。可利用联接器，例如凸形或凹形结构将试管与额外的试管或其它流体流动器件偶连，所述联接器适应试管的摩擦连接从而将某试管偶连于另一试管或另一结构。在额外的实施方式中，可将试管热焊接在一起从而形成连续的无菌流体流动器件。例如，经热焊接试管的液流可将多孔烧瓶连接于与多层烧瓶有一定距离的液体源或槽。要除去或打断该连接，只需切割或折叠或夹住或热焊接封闭试管。可将图6显示的多层烧瓶组装成包括试管，将其灭菌、包装和运输，从而用户可打开无菌包装，热焊接管道以连接多层烧瓶与液体槽或源，进而利用该烧瓶。该烧瓶构型可通过去除可能有污染性的液体操作元件，例如阀门和联接器而降低污染风险。

图7是端口区域的展开图，显示了本发明诸实施方式中端口和试管或套管之间的连接情况。端口720可具有凸形730或凹形731结构。凸形端口730可具有突出的结构，从而能将针头、移液管尖端、试管、732套管或其它流体流动器件贴合地安装在凸形端口730周围以形成液密密封。凹形端口731可具有承受结构从而能将套管735、针头、试管或移液管尖端或其它流体流动器件贴合地安装入凹形端口731以形成液密密封。

流体流动器件，包括针头、套管、移液管尖端或试管是能将流体引入和引出多层烧瓶的器件。图8A-8C显示了一种此类流体流动器件--套管801。图8A显示了连接于歧管840的多个套管801。这些套管可在它们的近端813连接于歧管。在一个实施方式中，本发明的套管801可使液体定向流动，还能进行不同的流动，或排出空气或气体。例如，图8所示套管具有锐利的远侧尖端802以便刺穿隔片和接近第一尖端的第二尖端803。第二尖端803也可以是锐利的，并与第二流动路径811相关。当如图8C(截面图)所示，采取图8B所示线8-8以截面观察时，套管具有两条不同流动路径，一条用于液体810，一条用于空气811。当将套管802的远端插入图7所示多层烧瓶的端口时，液体可通过液体路径810流入该多层烧瓶，所替代的空气可经同一套管的空气路径811离开该多层烧瓶，该空气路径通过可位于套管近端813的通气孔812向外排出空气。可用过滤材料覆盖该通气孔以防污染该空气路径。采用该套管实施方式，可将液体引入封闭的细胞培养室，所替代的空气可同时排出，而各细胞培养室中无需第二开放端口以释放所替代的空气。套管可以是限定第一内部路径和第二内部路径并具有近端和远端的刚性管状结构，所述第一和第二内部路径构造和布置成引导液体。

这些流体流动器件可与歧管偶连。歧管是构造和布置成固定多个流体流动器件的器件。还可将歧管构造和布置成将液体引入和引出多个流体流动器件。例如，歧管构造和布置成固定多个套管或试管或移液管尖端，这些套管或试管或移液管尖端的间隔方式能确保多个流体流动器件对齐多层细胞培养结构的端口。歧管可以是内部的(多层细胞培养结构整体的一部分)或外部的(与多层细胞培养结构隔开)。

图9A显示了本发明外部歧管900的一个实施方式。在一个实施方式中，歧管900是操作烧瓶内含物进出多层烧瓶的器件。外部歧管900具有联接器930以便将流体流动器件或套管910与歧管900偶连。这些联接器930可以是凹形结构(如图所示)，可将流体流动器件，例如移液管尖端或套管插入这些凹形结构以便将流体流动器件与歧管偶连。或者，联接器930可以是图10所示凸形联接器。

图10显示本发明外部歧管1000的额外实施方式。图10所示歧管1000具有颈缩开口(necked opening)1001，介于颈缩开口和歧管本体1006之间的阀门1004，构造和布置用来偶连流体流动器件1010，例如套管、移液管尖端或试管的凸形联接器1030。

流体流动器件，例如移液管尖端或套管构造和布置成通过多层烧瓶100的端口120插入细胞生长室。例如，通过歧管的颈缩开口1001进入歧管的液体可流入歧管本体1006并通过套管1010。当这些套管1010插入多层烧瓶100的端口120(参见图1)时，液体可经套管1010流入个体细胞培养室的内部。

再次参考图9，外部歧管900可具有阀门904。如图9B所示，在打开位置，流体可经阀门904从颈缩开口901自由流向歧管本体906。如图9C所示，在关闭位置，液体不能从颈缩开口901流向歧管本体906。可通过旋转可从外部歧管900以外接触的阀门键(valve key)来操作该阀门。图9所示的外部歧管可同时连接多层细胞培养烧瓶中的多个细胞培养室。即，经颈缩开口901进入歧管本体906的液体可通过多个流体流动器件901同时进入多个细胞培养室。在备选的实施方式中，可将本发明的外部歧管构造和布置成使得流体从一个多层细胞培养装置的一个细胞培养室经歧管流向另一多层装置的另一细胞培养室，而无需与流向另一细胞培养室的液体混合。在该备选的实施方式中，流体从一个多层细胞培养装置流向串联的另一装置。

图11A和11B说明了串联歧管1100的两个实施方式。流体流动器件1110(在此例中是试管)连接于歧管本体1106。歧管本体1106具有端口1120，其是凸形1121或凹形1122，其构造和布置成与试管1110形成液密密封。串联歧管1100可具有阀门以使液体从该串联歧管的一侧流向该串联歧管的另一侧，或终止液体通过歧管本体1106的流动。图12A和12B说明了图11A和11B所示串联歧管1100的阀门1104的两个实施方式。在该实施方式中，可操作该阀门以打开(如图12A所示)或关闭(如图12B所示)经歧管本体1106而从歧管一侧通向另一侧的通道。操作阀门打开器件1108在打开和关闭位置之间转换阀门。如图12A和12B所示，可旋转阀门打开器件以打开或关闭该阀门，例如蝶形阀。在备选的实施方式中，如图13A和13B所示，可如箭头所示将阀门打开器件1109从打开位置移动到关闭位置来操作阀门打开器件1109。阀门打开时，歧管1100各侧上的通道1113与开口1114对齐。阀门关闭时，通道1113与开口1114未对齐，液体不能从歧管的一侧流向另一侧。虽然专门说明了阀门的3个实施方式，但许多阀门机构是本领域已知的，可适用于本发明的诸多实施方式。阀门可以是机械的或电子的，例如可利用螺线管阀门或磁力阀门。

图14-16显示了外部歧管的诸多实施方式。图14显示了具有颈缩开口1401、歧管本体1406和阀门1404的外部歧管1400。可用罩子1402覆盖颈缩开口。可以存在或不存在罩子1402。如果存在，该罩子可结合过滤器以便在细胞培养系统内外交换气体。在其它实施方式中，颈缩开口可连接于多层烧瓶的管道，以使液体储器与歧管液体连通(参见图20)。

图15显示了本发明歧管1500的其它实施方式。在该实施方式中，歧管本体1505连接两套试管1510，其构造和布置成插入两个毗邻的多层烧瓶，如图18所示。采用该实施方式，可能连接毗邻的多层以形成多个多层烧瓶网络。此外，如果采用该歧管实施方式，可能通过将流体给予一个多层烧瓶而用流体填充多个多层烧瓶。例如，可采用该歧管实施方式1500将两个或更多个多层烧瓶连接在一起。可以控制将流体给予一叠相连的多层烧瓶顶部的多层烧瓶。为填充所有烧瓶，使流体从顶烧瓶，经过所有中间烧瓶流向底烧瓶，直至所有烧瓶充满液体。按照歧管的内部结构，无论流体在歧管本体1505中汇集，还是流体从歧管本体的一侧1510流向歧管本体另一侧的相应试管1510，流体可通过该实施方式的歧管流向串联或并联的多层细胞培养烧瓶。例如，如果歧管本体1505使得流体在其从套管进入歧管时混合，该歧管能使单一多层烧瓶内的所有层，或在多层烧瓶之间进行混合，从而能并联连接。如果歧管本体维持限定的连接，其能串联多个烧瓶的细胞培养室。例如，如果试管1通过歧管本体仅连接于试管2，并且如果试管3在通过歧管本体时仅连接于试管4，则试管1进入的细胞培养室与试管2进入的细胞培养室串联，而试管3进入的细胞培养室与试管4进入的细胞培养室串联。

在额外的实施方式中，可用构造和布置成以液密方式连接于歧管和多层烧瓶的套管或针头或其它流体流动器件替代试管1510。例如，当端口具有一定高度并向多层烧瓶表面以上延伸时，可将管道以摩擦适配(friction fit)方式安装在端口上。或者，在备选方案中，当将端口构造和布置成在管道和端口之间形成液密摩擦适配时，可将管道插入端口以形成液密密封。

图16显示了本发明的额外实施方式。图16显示了两个歧管1600，各自具有连接套管1610的歧管本体1605，阀门1604和连接管道1642的颈缩开口1601，所述管道将两个歧管连接在一起。本领域技术人员应知道，本发明歧管可存在任何构型，可将一个多层烧瓶与另一多层烧瓶连接，可将多层烧瓶与液体储器或废液容器连接，可将一个歧管与另一歧管连接，可通过已知的连接器、阀门、泵或其它连接方式提供多种连接。此外，本领域技术人员应知道，可采用不同组合实施本文公开的任何实施方式所述的任何特征而不脱离本发明的构思。

在所有歧管实施方式中，套管之间的距离可对应于多层烧瓶中细胞培养室的端口之间的距离。存在的套管数量可对应于多层烧瓶的层数或细胞培养室的数量。歧管的诸多实施方式可在多层烧瓶中原位(in-place)包装，由用户取出，或可独立于多层烧瓶地进行包装。歧管、多层烧瓶、端口盖、端口盖条带、管道和本文所述的所有元件和附件可灭菌并以无菌包装一起或单独出售。

现在看图17，多层烧瓶100的两侧有多个端口1720，可以是进入端口1740和排出端口1750。在一个实施方式中，流体通过插入进入端口1740的歧管1700的套管1710进入多层烧瓶100，替代的流体或气体通过该烧瓶另一侧的排出端口1750离开该多层烧瓶100。可向歧管提供正压或负压使得流体体通过歧管移动，例如利用连接于歧管或烧瓶的泵或真空装置(参见图20)提供正压或负压。一旦多层烧瓶100的细胞培养室完全充满流体，可从进入端口1740上取下歧管1700的套管1710，并用端口盖1721塞住进入端口1740和排出端口1750。具有端口盖封闭的进入和排出端口的此构型多层烧瓶100是封闭的多层细胞培养系统。然后可旋转该封闭的多层烧瓶以最大程度提高细胞生长室内的细胞生长表面(即，底板向下放置)，并置于细胞培养的合适位置，例如培养箱中。在额外的实施方式中，歧管1700可不具有套管，但可与端口直接形成液密密封(参见，例如图10)。

要清空细胞培养室之时，可将多层烧瓶100从其用于细胞生长的位置移出，旋转从而端口处于“向上”的位置，可手动或机器人操作除去进入和排出端口上的端口盖1721，可将歧管的套管插入多层烧瓶从而通过抽吸或重力作用除去流体。多层烧瓶清空时，可将烧瓶倾斜从而剩余的流体存在于套管的顶端，伸入多层烧瓶100。

图18是本发明实施方式的透视图，显示了如何通过本发明歧管的一种实施方式将多个烧瓶连接在一起。当歧管1800一侧的套管1810插入一个多层烧瓶1801的端口1803时，歧管1800另一侧的套管1811插入其它多层烧瓶1802的端口1804，从而将两个烧瓶连接在一起。培养基和细胞可通过如此连接的歧管1800从一个容器转移至其它容器。例如，可如图18所示向上倾斜容器，该容器含有要分配到另一容器(或几个其它容器以供细胞增殖)中的细胞，细胞可通过重力作用从第一容器1802转移至第二容器1801。在备选的实施方式中，可将泵连接于第二组端口1803以驱动流体从第一容器1802流向第二容器1801。或者，可将真空泵连接于接收容器的端口1835以将液体从第一容器1802引向第二容器1801。

图19显示了图14所示连接于多层烧瓶的歧管的额外实施方式。图19显示连接有歧管1900的多层烧瓶100。歧管1900具有歧管本体1905、颈缩开口1901、罩子1903和阀门1904。歧管本体1905通过端口(未显示)偶连于多层烧瓶100，从而进入颈缩开口1901的液体能通过歧管1900流入多层烧瓶100的细胞培养室。歧管1900可以永久连接于多层烧瓶，或是可拆卸的。歧管1900可以是一次性的，还可灭菌。当除去歧管1900时，可用端口盖覆盖多层烧瓶的端口，则多层烧瓶的细胞培养室的通道受限制。当除去歧管1900时，多层烧瓶具有规则的矩形或正方形轨迹，从而能将多个多层烧瓶置于封闭的空间，例如培养箱或包装盒内，而无需容纳形状不规则的歧管或开口。

图20显示与储器或细胞收集装置2020的一种实施方式相连的本发明实施方式。虽然图20所示的外部歧管是图8、9和10所示的实施方式，但此处适合任何外部歧管实施方式。外部歧管2000具有套管2010、歧管本体2005、阀门2004和颈缩开口2001。将外部歧管2000构造和布置成偶连多层细胞培养容器(未显示)。在该实施方式中，外部歧管可以是外部液体储器的联接器，所述外部液体储器可以是细胞收集装置或培养基储器。图20所示是细胞收集装置2020。外部歧管2000可以通过容器罩子2015偶连于细胞收集装置，而该罩子通过管道2002连接于细胞收集容器2020。当容器罩子2015拧入或压入其位置时，管道2025的容器端滑入容器2020的穿孔2030中。在备选的实施方式中，可用早已连接于容器2020的管道2002预先组装收集容器。容器2020具有第二端口2040以便连接通向真空泵(未显示)的管道2041。当该装配体通过多层烧瓶的端口连接于多层烧瓶，并且通过第二端口2040给容器提供真空装置时，该真空装置可从多层烧瓶中取出液体(有时候是细胞)并保存入容器2020。容器可以是无菌容器，外部歧管和管道可以灭菌，从而能将细胞和液体自多层细胞培养烧瓶中无菌取至容器中。

这些过程可自动进行。例如，可通过机器人操作连接于图20所示无菌收集容器的外部歧管以偶连多层烧瓶并取出多层烧瓶的内含物。采用此类机器人操作，减少了人接触并降低污染和泄漏的风险。

如上所述描述了本发明，本领域普通技术人员明显可采用许多方法改变本发明而具有本发明的益处。此类改变不应视作脱离了本发明的构思和范围，本领域技术人员显而易见的此类改进应包括在随附权利要求及其法律等价物的范围内。

Claims (2)

1.一种多层细胞培养装置，其包括：

a.至少三个细胞培养室，各细胞培养室具有至少一个端口；

b.至少两个整体型导管室；和

c.滑动端口盖，所述滑动端口盖构造和布置成与所述多层细胞培养装置的至少三个细胞培养室的至少一个端口接合，并提供开放或封闭的端口，其中，开放或封闭的通道是通过以下方式决定的：将该端口盖相对于所述至少一个端口以开放位置或封闭位置滑动接合，其中，开放位置的端口盖包括过滤器，封闭位置的端口盖包括隔片;

所述滑动端口盖通过铰接的连接器连接于所述多层细胞培养装置。

2.如权利要求1所述的多层细胞培养装置，其特征在于，所述滑动端口盖是与所述多层细胞培养装置一体化的。