JP5852048B2 - アクセス制限された多層細胞培養システム - Google Patents

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本願は、「アクセス制限された多層細胞培養システム（Limited Access Multi-Layer Cell Culture System）」という発明の名称で２００８年１月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／０６２，４０４号の利益を主張する。

本発明は、一般に、培養細胞を含めたシステムに関する。さらに具体的には、本発明は、細胞および培地の無菌制御された封じ込め、ならびに装置の内外への無菌的移送を可能にする、培養細胞を格納するための装置に関する。

細胞のインビトロでの培養は、薬理学、生理学、および毒物学の研究に必要な材料を提供する。薬剤のスクリーニング技術における近年の進歩により、製薬会社は、治療標的に対する膨大な化合物ライブラリを迅速に選別することが可能である。これらの大規模スクリーニング技術は、インビトロにおいて増殖および維持される膨大な数の細胞を必要とする。これら膨大な数の細胞の維持には、大量の細胞増殖培地および試薬、ならびに膨大な数および大量の実験用の細胞培養容器および実験設備が必要とされる。この活動にはまた、大きな労働力も必要とされる。

細胞は、ローラーボトル、細胞培養皿およびプレート、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレート、一般的なフラスコおよび多層化細胞増殖フラスコおよび容器を含めた、特殊化した細胞培養容器内で培養される。培養細胞は、適切な維持培地を入れたフラスコの底面に付着し、その上で増殖する。

細胞系の高スループット用途の出現によって、細胞培養容器は必要なガス交換を提供しつつ、細胞増殖用の表面積の増大も得られるように開発されてきた。これらのシステムはまた、増殖密度および分化因子を含めた細胞培養パラメータを高めるように設計された特殊化した表面を含みうる、多層フラスコ、多層細胞培養皿、バイオリアクター、細胞培養バッグなどを備えた多層化細胞増殖容器と同様に、一般的なフラスコ、ローラーボトル、細胞培養皿を備えた従来の細胞培養容器も採用する。

さらには、細胞系の高スループット用途は自動化されてきた。自動化は、手動操作者に酷似した細胞培養容器操作を可能にする。さらには、細胞増殖表面の多重層を備えたフラスコ容器は、単一の底壁上での細胞増殖を可能にする一般に知られるフラスコよりもはるかに大きい、付着細胞の収量を生じる能力がある。これらの多重層容器は膨大な数の細胞の増殖を可能にするが、それらは、日常的な使用における特別な課題を提示する。

自動化可能で移動の無菌性を向上するような方法で、流体を細胞培養容器の内外に導くための装置を提供することが可能な細胞培養容器が必要とされている。加えて、通常、ロボット操作を採用する高スループットアッセイの用途の実施に使用するのに適しているであろう、これら装置も必要とされている。

本発明の実施の形態は、少なくとも３つの細胞培養チャンバおよび少なくとも２つの一体化した気管チャンバを有する多層細胞培養装置を提供し、ここで、各細胞培養チャンバは少なくとも１つのポートを有し、各ポートはポートカバーを有し、ここで、各ポートは、ポートカバーと係合するように構造化され、配置されて、開放可能な液密封止を提供する。ポートカバーは、コネクタによって多層細胞培養装置に取り付けられて差し支えなく、該コネクタはヒンジ連結コネクタでありうる。実施の形態では、ポートカバーは隔壁を有する場合がある。隔壁は、該隔壁を通じた流体流動装置の導入を可能にし、流体流動装置とポートの間に液密封止を形成する。実施の形態では、流体流動装置は、針、ピペットまたはピペットチップ、管またはカニューレであって差し支えない。実施の形態では、ポートは、環状の構造でありうる、シーラーを有していてもよく、これが、ポートカバーをポート上の相補的構造に接続可能にし、可逆的な液密封止を形成する。

さらなる実施の形態では、本発明は、少なくとも１つのポートを有し、該少なくとも１つのポートに関連したポートカバーの開放位置または閉鎖位置をスライド可能に係合することによってポートの開閉をもたらすように、少なくとも１つのポートと係合するように構造化され、配置された、スライド式ポートカバーを有する、細胞培養装置を提供する。実施の形態では、スライド式ポートカバーは、ヒンジ連結コネクタなどのコネクタによって、細胞培養装置に接続されるか、または、細胞培養装置と一体となりうる。

さらなる実施の形態では、本発明は、少なくとも３つの剛性の細胞培養チャンバを有する細胞培養容器を提供し、各細胞培養チャンバは少なくとも１つのポートを有し、ここで前記少なくとも１つのポートは、メス型流体流動装置と連結するように構造化され、配置された、突出したオス型特徴を有する。さらなる実施の形態では、細胞培養容器は、流体流動装置のオス型構造と連結するように構造化され、配置されたメス型特徴を有する、少なくとも１つのポートを有する。さらなる実施の形態では、細胞培養容器は、オス型構造を備えた幾つかのポートおよびメス型構造を備えた幾つかのポートを有し、流体流動装置の相補的構造と連結する。

さらなる実施の形態では、本発明は、少なくとも３つの細胞培養チャンバおよび少なくとも２つの一体化した気管チャンバを有する多層細胞培養装置を提供し、各細胞培養チャンバは、少なくとも１つのポートおよび、少なくとも１つのポートを有する液密封止を形成するように構造化され、配置された、取り外し可能なマニホールドを有する。さらなる実施の形態では、マニホールドはバルブを有する。さらなる実施の形態では、マニホールドは、２つ以上の多層細胞培養装置の少なくとも１つのポートと連結するか、または、液溜部を有する１つの多層細胞培養装置と連結するように、構造化され、配置される。

さらなる実施の形態では、本発明は、２つ以上の多層細胞培養装置のポートと係合するように構造化され、配置された流体流動装置を有するマニホールドを提供する。加えて、本発明は、少なくとも２つの細胞培養チャンバと、マニホールド本体を有する少なくとも１つの外部マニホールドと、前記多層細胞培養装置の前記少なくとも１つの外部マニホールドと前記少なくとも２つの細胞培養チャンバの間に流体の流動を提供するように構造化され、配置された少なくとも２つの流体流動装置とを有する、少なくとも１つの多層細胞培養装置を備えた細胞培養システムを提供し、ここで、流体は、少なくとも２つの流体流動装置に分配されて、少なくとも１つの外部マニホールドと少なくとも２つの細胞培養チャンバとの間に平行に流れるよりも前に、外部マニホールド内へと流れ、マニホールド本体に貯留される。

本発明は、添付の図面と共に読む場合に、以下の詳細な説明から最もよく理解されよう。

本発明の１つの実施の形態の部分的に切り取った斜視図。 本発明のポートおよびポートカバーの実施の形態を示す図。 本発明のポートおよびスライド式ポートカバーの別の実施の形態を示す図。 本発明のコネクタの３つの実施の形態を示す図。 本発明のシーラーの実施の形態を示す図。 ポート、および本発明の流体流動装置に連結したポートを示す、本発明の多層細胞培養フラスコの実施の形態を示す図。 本発明のポートおよびポート連結の実施の形態を示す図。 本発明のカニューレの実施の形態を示す図。 本発明のバルブの実施の形態を示す、本発明のマニホールドの１つの実施の形態の図。 本発明の流体流動装置の本発明のマニホールドへの連結を示す、本発明の１つの実施の形態のマニホールドの図。 本発明の１つの実施の形態のマニホールドを示す図。 本発明のマニホールドのバルブの実施の形態を示す図。 本発明のマニホールドのバルブの実施の形態を示すさらなる図。 本発明の１つの実施の形態のマニホールドを示す図。 本発明の１つの実施の形態のマニホールドを示すさらなる図。 本発明の１つの実施の形態のマニホールドのさらなる図。 本発明の多層フラスコ、およびその本発明のマニホールドの１つの実施の形態への連結を示す図。 ２つの本発明の多層フラスコ、およびそれらの本発明のマニホールドの１つの実施の形態への連結を示す図。 本発明の多層フラスコ、およびその本発明のマニホールドの１つの実施の形態への連結を示す図。 容器に連結した本発明の１つの実施の形態のマニホールドを示す本発明の１つの実施の形態の斜視図。

本発明の実施の形態は、アクセス制限された細胞培養システムおよび装置に関する。実施の形態では、本発明のアクセス制限された細胞培養装置は、一体化した多層細胞培養装置内に細胞増殖チャンバの多重層を有し、各層は、細胞増殖チャンバの内外への材料の導入及び除去を可能にするポートカバーで可逆的に封止可能なポートを有する。実施の形態では、装置はまた、細胞増殖チャンバの内外への流体の流れを制御するための外部マニホールドも有する。

以下の詳細な説明では、本発明を完全に理解してもらうことを目的として、説明の目的であるが限定ではない、具体的詳細を開示する模範的な実施の形態を記載する。しかしながら、本発明が、本明細書に開示される具体的な説明から逸脱する他の実施の形態で行われうることは、当業者にとって明らかであろう。 他の例では、周知の装置および方法の詳細な説明は、本発明の説明が不明瞭にならないように、省略する場合がある。

細胞培養、特に付着性の細胞培養は、次第に、インキュベーターのスペースを最小限に抑え、細胞培養増殖表面を最大化した、積層された、スペースを取らない高密容器内で増殖されつつある。例えば、米国特許出願公開第２００７／００２６５１６号明細書を参照されたい。細胞培養容器はますます効率的になり、それらの内部空間はますます限られることとなることから、これらの容器の実用的用途は、これらの容器の内外への少量の液体の移動の必要性によって複雑化する。

これらの高密容器およびそれらの内部に含まれる流体および細胞の無菌状態の維持は、何よりも重要である。例えば、培養細胞の増殖および処理に用いられる容器には、細胞が殺菌システム内で増殖することが必要とされる。細胞培養容器の無菌性を最適化するための方法の１つは、閉鎖された、またはアクセス制限された細胞培養システムを提供することである。閉鎖されたシステムは、培養細胞の完全性を維持し、汚染を回避しうる。治療的使用のための培養細胞は、個々に特有であり、また、汚染することなく、増殖および特定の薬物治療を促進するための条件を必要としうる。細胞培養容器は、例えば細胞または培地を添加または除去するためなど、細胞培養容器内へのアクセス用の着脱可能な蓋を有しうる。あるいは、もう１つの方法として、細胞培養容器は蓋の代わりに隔壁を有していてもよい。培養時の汚染は、隔壁が破れる際に、材料が外側から容器内へと押圧される結果として生じる。汚染の危険性は、細胞培養チャンバへのアクセスを最小限に抑えることによって最小限にとどめることができる。例えば、細胞培養容器が無菌であり、細胞培養容器と接触した状態になる相互連結した部品のすべてが無菌であり、かつ、細胞培養容器および相互連結した部品の取り扱いが最小限に抑えられ、フードまたは層流（laminar air flow）の筺体などの無菌環境が存在する場合には、汚染の危険性は軽減される。汚染の危険性を低下させる追加の材料および方法について以下に述べる。

多層細胞培養容器は、細胞培養チャンバの内外への細胞および細胞培養培地の出し入れが可能でなければならない。多層フラスコの設置面積を最小化しつつ、無菌性を維持し、こぼれることを最小限に抑える方法で、多層細胞培養容器の内外への流体の移動を促進することが必要とされている。これらのフラスコおよび容器の設置面積の最小化は、インキュベーター内、ならびに保管および輸送における空間利用の向上を可能にする。加えて、自動化された工程、またはロボット工程をサポートする特徴を有する、これらの多層の細胞培養容器の提供も必要とされている。

本発明の実施の形態では、多層フラスコが提供される。図１に示す部分的に切り取った斜視図には、本発明の多層フラスコ１００の１つの実施の形態が例証されている。多層フラスコ１００は、上面板１１０、受け皿（図示せず）、側壁１１２、および端壁１１４によって画成された外部容器本体１０１を有する。図１の切り取り部分にさらに明確に示されるように、個別の細胞増殖チャンバ１１１がフラスコ１００内に配置される。個別の細胞増殖チャンバ１１１は、それぞれ、底面１１３および上面１１５によって画成される。表面１１３および１１５は、側壁１１２および端壁１１４に沿ってフラスコ本体１０１に取り付けられる。各チャンバ１１１内の少なくとも１つの底面１１３は、細胞増殖のための表面１１７を提供することができる、ガス透過性かつ液体不透過性の材料であることが好ましい。ガス透過性かつ液体不透過性の材料は、細胞が付着する際の表面、または細胞増殖チャンバの床面を提供するか、あるいは、対向する表面、または細胞増殖チャンバの天井であってもよい。底面１１３、または細胞培養表面１１３は柔軟性であっても剛性であってもよい。各上面１１５は、細胞増殖チャンバ１１１に支持体を提供する、剛性かつ一般にガス不透過性の材料であることが好ましい。多層フラスコの表面は、透明、不透明、着色、または無色であって差し支えない。本発明の１つの実施の形態では、各細胞増殖チャンバ１１１の間に気管空間１１８が存在する。チャンバ１１１の対向する上面１１５は、細胞増殖チャンバ１１１の上壁および気管チャンバ１１８の下の部分を画成する。したがって気管チャンバ１１８は、第１の細胞増殖チャンバのガス透過性かつ液体不透過性の表面１１３、および第２の増殖チャンバ１１１の対向する表面１１５を含む。支持体１１９はまた、単一のフラスコ１０１内に交互に気管空間１１８を有する増殖チャンバ１１１を形成する、表面１１３および１１５を一体化して組み込むように構造化された支持体が得られるように存在しうる。したがって、各細胞増殖チャンバ１１１は、垂直の連続方向において、気管チャンバ１１８と交互に存在する。
本発明の１つの実施の形態では、多数の細胞増殖チャンバ１１１は、多層フラスコ１００の本体１０１と一体となり、細胞増殖用の栄養培地で十分に満たされうることから、個別の細胞増殖チャンバ１１１は、ガス透過性の膜１１３上での細胞増殖を可能にする。多層フラスコ１００を貫く一連の気管空間１１８は、ガス透過性表面１１３上で増殖する細胞１１７間、多層フラスコ内部の個別の細胞増殖チャンバ１１１の培地１２７、および外部環境にガス伝達を提供する。気管空間１１８は、ガス透過性表面１１３を通じて、細胞増殖チャンバ１１１内に位置する培地の酸素供給を可能にする。さらには、気管チャンバ１１８は空隙または空間の形をとって差し支えなく、液体の侵入が起きないようにする。結果として、気管空間１１８と交互に存在する多数の増殖チャンバ１１１を有する剛性の細胞培養多層フラスコ１００は、大量の細胞１１７へのガスの均等分配の利益をもたらすように、協同的に構成される。

ガス透過性の膜１１３は、限定はしないが、接着剤または溶剤結合、熱融着または溶接、圧縮、超音波溶接、レーザー溶接、および／または、通常、部品間に封止を生じるのに用いられる他の任意の方法を含むあらゆる方法によって、支持体１１９および側壁１１２に装着することができる。膜１１３の周囲のレーザー溶接は、その膜が支持体１１９の表面とぴったりと重なり、かつ該表面と融合することにより、多層フラスコの内部表面の一体化した部分となるように、膜領域の周りに気密封止を設けることが好ましい。ガス透過性の膜１１３が側壁および端壁に付着後、上面板１１０と受け皿１２０を接合して差し支えない。受け皿１２０および上面板１１０は射出成形されうる。細胞培養容器１００内における細胞培養１１７のための膜性板１１３の位置調整を容易にするため、さまざまな大きさおよび形状の支持体１１９が組み込まれうる。

ガス透過性かつ液体不透過性の膜１１３（図１参照）は、当技術分野で既知の１つ以上の膜から作製されうる。典型的には、膜は適切な材料でできており、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリオレフィン、エチレン酢酸ビニール、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）または適合するフルオロポリマー、シリコーンゴムまたは共重合体、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）またはこれらの材料の組み合わせが挙げられる。製造および細胞増殖への適合が許す限り、さまざまなポリマー材料を用いて差し支えない。既知の能力では、膜としてポリスチレンが好ましい材料であろう（細胞増殖ににはさまざまな厚さが許容されるが、約０．０７６２ｍｍ（約０．００３インチ）の厚さ）。このように、膜は任意の厚さでありうるが、約２５〜２５０μｍが好ましく、約２５〜１２５μｍが理想的である。

本発明の多層フラスコ１００は、当業者に周知の許容されるあらゆる製造方法によって作製されうる。ある方法の１つの実施の形態では、多層フラスコ１００は、別々に射出成形された部品の一群から組み立てられる。成形するのに適切であって、通常は実験用のウエアの製造に用いられる、任意のポリマー（ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリル、ポリスチレン、またはポリエステルなど）を使用して差し支えないが、ポリスチレンが好ましい。必要はないが、光学的透明度にとっては、２ｍｍを超えない厚さを維持することが有利である。別個の部品は、多層フラスコの内部表面の一体化した部分と合うように、あらゆる方法によって組み立てることができ、限定はしないが、接着剤または溶剤結合、熱融着または溶接、圧縮、超音波溶接、レーザー溶接、および／または、通常、部品間に封止を生じるのに用いられる他の任意の方法が挙げられる。上面板１１０および受け皿は、位置合わせされ、レーザー溶接などによって接合されうる。

１つの実施の形態では、部品はまとめて、継ぎ目に沿って接着接合されるか、超音波溶接またはレーザー溶接されるか、あるいは熱盤を使用して、または他の任意の方法によって結合される。部分的にまたは完全に自動化された組立システムには、レーザー溶接設備が使用されることが好ましい。接合部の外周に沿ってレーザー溶接がなされると同時に、上面板および受け皿が適切に位置合わせされる。

有利には、および細胞の付着および増殖を促進するためには、膜層を含めた多層フラスコ１００の内部表面は、細胞増殖できるように処理されうる。処理は、プラズマ放電、コロナ放電、ガスプラズマ放電、イオン衝撃、電離放射線、および高強度のＵＶ光を含む、当技術分野で既知のあらゆる方法によって達成して差し支えない。

代替となる実施の形態では、個別の細胞増殖チャンバは、剛性の層でできた上面によって側壁１１２および別の側に液体不透過性の方式で取り付けられた、ガス透過性の膜１１０の層によって、一方の側に拘束されて、個別の細胞培養増殖チャンバ１１１および多層化フラスコ全体に、より剛性の要素を提供しうる。例えば、個別の細胞増殖チャンバ１１１は、剛性の層１１５によって上面に、側面によってその末端上に、およびガス透過性の膜によって底部側に、拘束される。この個別の細胞増殖チャンバ１１１は、別のこのような個別の細胞増殖チャンバ１１１の上に積層されてもよく、ここで、１つの個別の細胞増殖チャンバ１１１の剛性の層１１５の上部が、隣接した個別の細胞増殖チャンバのガス透過性の膜１１３の下の気管空間を画成する、支持体構造を形成する。１つの実施の形態では、個別の細胞培養チャンバは、さらに大きい多層細胞培養容器へと組み立てられうる。これらの個別の層は、スナップ式に留めることができ、あるいは、別の当技術分野で既知の任意の付着方法を用いて取り付けてもよい。

図１は、気管空間１１８と、フラスコ１００の内部を形成する個別の細胞増殖チャンバ１１１との交互の層を示している。個別の細胞増殖チャンバ１１１は、細胞培養容器の側壁および端壁に液体不透過性の方法で取り付けられた、液体不透過性かつガス透過性の膜１１３によって画成される。細胞増殖培地１２７は膜１１３の間に含まれ、細胞は、これらの膜１１３の液面上で増殖する。この実施の形態では、細胞増殖チャンバ１１１は、個別の細胞増殖チャンバ１１１を形成するように側壁１１２に液体不透過性の方式で取り付けられたガス透過性の膜の２つの層によって、形成されうる。気管空間１１８は、ガス透過性の膜の間に層を形成して空洞部分を形成し、ガス透過性の膜１１３が細胞増殖培地１２７内に空気を交換できるようにする。この実施の形態では、気管空間は、個別の細胞増殖チャンバ１１１を形成するガス透過性の膜１１３の層を分離及び支持する、支持体１１９によってサポートされる。本発明の１つの実施の形態のマニホールドに適合する多層化フラスコのこの実施の形態の利点は、多層フラスコが１８０°回転したときに、対向する表面上で細胞増殖することにより、その収容能力が向上することである。したがって、多層フラスコが回転すると、細胞は代わりのガス透過性の膜表面１１３上で培養される。よって、細胞増殖は、ガス透過性の膜が多層フラスコの中間に積層される場合のみ、そのガス透過性表面１１３の両方で使用可能になる。膜１１３は、個別の細胞培養増殖チャンバ１１１と気管空間１１８の間のガスの自由交換を可能にする。好ましい実施の形態は、加えて、多層フラスコの製造、取り扱い、および操作に耐えることができる膜１１３を備えるであろう。

細胞の増殖チャンバ１１１へのアクセスし易さは、細胞の増殖チャンバの外表面を通じて延在し、細胞の増殖チャンバ１１１の表面に開口または貫通空間を作り出す、ポート１２０を通じて達成される。図１においては、ポート１２０は側壁を通じて延在するように示されているが、ポート１２０は、細胞の増殖チャンバ１１１の端壁または他の任意の表面上に配置されてもよい。本発明の実施の形態では、各細胞の増殖チャンバ１１１は、各細胞培養チャンバ内へのアクセスを可能にする少なくとも１つのポート１２０を有する。実施の形態では、各細胞培養チャンバに２つ以上のポート１２０が存在し、流体が１つのポート１２０を通じて細胞培養チャンバ１１１に流入するのを可能にすると同時に、行き場がなくなったガスは別のポート１２０を通じて細胞培養チャンバから出る。ポートカバー１２１を図１に示す。この実施の形態では、ポートカバーは塞栓である。しかしながら、以下に、ポートカバーの追加の実施の形態も論述および開示する。実施の形態では、ポートカバー１２１は、細胞培養チャンバの内容物の汚染を防止するための隔壁を有しうる。実施の形態では、ポート１２０は、ポートの水密能力を向上させるため、材料の層で処理されうる。これらの材料は、それらの内部に導入されるカニューレまたはポートカバーとの液密封止を、より形成し易くしうる。これらの材料の例としては、ゴム、ＰＶＣ、テフロン（登録商標）、コルク、シリコーン、生ゴム、ウレタン、または当技術分野で既知の他の任意の材料が挙げられる。

図１は、多層フラスコ１００の隅部１０７上に１組の位置合わせしたポート１２０を有する、本発明の１つの実施の形態を例証している。隅部１０７は、図１に示すように平坦であって差し支えなく、あるいは、丸みを帯びているか、または任意の形状であってもよい。図１はまた、ポート１２０上に開放可能な閉鎖を提供する、ポートカバー１２１を例証している。ポートカバー１２１は、図１に示すように、個別のポートカバー１２１であって差し支えなく、あるいは、図２に示すように、ポートのストリップを閉鎖するように構造化され、配置されたストリップの形態で存在していてもよい。

図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは、本発明のポートおよびポートカバーの実施の形態を例証している。図２Ａ〜２Ｃに示すように、ポート２２０は、ポートカバー２２１と可逆的に係合し、水密封止を形成するように構造化され、配置されうる。ポート２２０およびポートカバー２２１は、部品間に摩擦封止を形成することによって、水密封止を形成してもよい。ポートカバー２２１は、複数のポート２２０に対して液密封止を形成するように構造化され、配置されたストリップ２２２の形態で存在しうる。ポート２２０は、多層フラスコの表面と同一表面に存在する開口であって差し支えなく、または、多層フラスコの表面から延在して開口を画成する、隆起構造であって差し支えない。これらの隆起構造は、ポートがメス型ポートカバーまたはメス型流体流動装置と接合できるようにオス型の接続構造を提供する、突出構造であって差し支えない。あるいは、ポートは、オス型ポートカバーまたはオス型流体流動装置に接続構造を提供するメス型構造であってもよい。

図２Ａに示すように、ポートカバー２２１は、ポート２２０と可逆的に係合し、液密封止を形成するように、ポート２２０内に収まる。 あるいは、図２Ｂに示すように、ポート２２０は、可逆的に係合して液密封止を形成するように、ポートカバー２２１内に適合しうる。追加の実施の形態では、図２Ａおよび２Ｂに示すように、ポートカバー２２１は隔膜２２５を含みうる。さらなる実施の形態では、ポート２２０は隔膜２２５を含みうる（図示せず）。

実施の形態では、図２Ｃに示すように、ポートは、該ポートを取り囲む隆起部分である、ポート壁２２６によって取り囲まれてもよい。この実施の形態では、ポートカバー２２７は、ポート壁２２６と可逆的に係合して、液密封止を形成しうる。柔軟性のプラスチックでできたポートカバー２２７は、ポート壁２２６の内側にぴったりと適合するか、あるいはポート壁２２６の外側に摩擦嵌合を形成して可逆的な液密封止を形成するように、ぴったりと適合しうる。実施の形態では、ポートカバー２２１は、コネクタ２３０によって多層フラスコに取り付けられて差し支えない。

図２Ａ〜２Ｃに示す実施の形態では、ポート２２０は開放されるか、またはポートカバー２２１または２２６によって封止されうる。あるいは、ポート２２０は開放されていてもよく、また隔壁２２５を備えていてもよい。開口ポート２２０を備えた、本発明の多層フラスコ１００は、製造され、殺菌され、無菌包装形態へと包装され、輸送されうる。それらの使用準備が整ったら、多層フラスコ１００をフードまたは層流筺体などの無菌環境内に設置し、その無菌包装を開封して差し支えない。液体は、ある場所から別の場所へと流体を導く流体流動装置を使用して多層フラスコ内に導入して差し支えなく、該装置として、針、カニューレまたはピペット、ピペットチップ、管、ライン、チャネル、パイプ、ダクト、導管、または当技術分野で既知の他の任意の流体流動装置が挙げられる。フラスコ１００に充填した後、封止した多層フラスコをインキュベーターなどの実験環境内に取り込む前にそれらを封止するためのポートカバー２２１または２２６が、開口ポート２２０に設置されうる。ポートカバー２２１または２２６は、別個の無菌包装で提供されるか、または、多層フラスコを含めた無菌包装内に含まれうる。

あるいは、代替となる実施の形態では、本発明の多層フラスコは、製造および殺菌してもよく、ポートは無菌のポートカバー２２１または２２６で封止して差し支えない。次に、封止した無菌の多層フラスコを包装および輸送して構わない。使用する準備ができたら、封止フラスコを、フードまたは層流筺体などの無菌環境内に設置し、包装から取り出して差し支えなく、液体は、ポートカバーを除去してポートを開放することによりフラスコ内に導入するか、またはポートカバー２２１内に隔膜２２５を通じて針、カニューレ、ピペットチップ、または他の装置を挿入してフラスコ内に液体を導入することにより、多層フラスコ内に液体を導入する。

図３は、本発明のポートおよびポートカバーの別の実施の形態を例証している。図３は、ポート３２０およびスライド式ポートカバー３５０を例証している。スライド式ポートカバー３５０は、ポート３２０またはポート壁３２６と係合して、開放可能な水密封止を形成する。この実施の形態では、スライド式ポートカバー３５０は、矢印が示すようにハンドル３５１をスライドさせることによって、使用者が所望のポートカバーを選択することができるように、スライドする機構を有する。図３に示すように、スライド式ポートカバー３５０は、ポートを、開放または閉鎖することによって覆うか、あるいは隔膜３２５またはフィルタ３３０によって覆うかを、使用者が選択できるようにする。フィルタ３３０は、培養細胞の汚染を軽減または防止するための当技術分野で既知のフィルタ材料であって差し支えない。スライド式ポートカバーは、開放位置に設定されて差し支えなく、細胞培養チャンバ内外への空気の自由な流れを可能にする。この開放位置では、ポートは、フィルタで覆われうるが、これにより、細胞培養チャンバの内外への空気の流れを可能にすると同時に汚染を防止する。あるいは、スライド式ポートカバーは閉鎖位置に設定されて差し支えなく、この場合、閉鎖位置は隔壁を有し、針またはピペットチップなどの流体流動装置が閉鎖されたポートカバーを通じて細胞培養チャンバに入ることを可能にする。例えば、スライド式ポートカバー３５０は、隔膜３２５がポート３２０と位置合わせするまで、スライド式ポートカバーを図３に示す矢印の方向にスライドさせることによって、ポート３２０を隔膜３２５で覆うように設定されうる。使用者は、隔膜３２５を通じて針またはカニューレまたはピペットチップを挿入することにより、ポート３２０を通じて液体を導入することができよう。隔膜３２５は、細いまたは太い針、カニューレ、またはピペットチップなど、液体処理装置を収容することができるように構造化されるか、または配置されて差し支えない。ポート３２０を通じて液体が導入されると、使用者は、ポートを隔膜３２５で覆われたままにすることを選択して差し支えなく、あるいは使用者は、ポート３２０をフィルタで覆うことを選択してもよい。使用者がポート３２０をフィルタ３３０で覆うことを選択した場合、使用者は、スライド・ハンドルをハンドルの反対方向にスライドさせて、フィルタ３３０をポート３２０と位置合わせするであろう。このような方法で、使用者は、ある位置からもう一方の位置へとポートカバーのハンドルをスライドさせることによって、これらの覆いを変更して差し支えない。この実施の形態では、スライド式ポートカバー３５０は本発明の多層フラスコと一体となっていて差し支えなく、またはスライド式ポートカバーはコネクタ３４０によって多層フラスコに取り付けられてもよい。スライド式ポートカバーは、着脱可能であって構わない。スライド式ポートカバー３５０が着脱可能である場合、それはヒンジ連結コネクタ３４０などの任意のコネクタ３４０によって多層フラスコに取り付けられうる。

ポートカバーが隔壁を備え、ポートと係合して可逆的な液密封止を形成する場合には、隔壁はポートよりも上側に位置されて差し支えない。言い換えれば、ポートカバーが隔壁を含む場合、隔壁自体はポートの上部またはポートよりも上側に設置されうる。

図４を参照すると、図４は、本発明のコネクタ４０１の実施の形態を例証している。コネクタ４０１は、ポートカバー４２１を多層フラスコに接続する特徴的部分である。コネクタ４０１は、ヒンジ連結コネクタ４４０でありうる。ヒンジ連結コネクタは、柔軟性の、薄いプラスチック・リボンであって差し支えなく、これがポートカバーのリボンの一方の側に取り付けられ、リボンのもう一方の側はポート壁または多層フラスコに取り付けられる。この薄い柔軟性のプラスチック・リボンは変形可能であり、したがって、ポートカバーが図４に示すように、多層フラスコの開放位置（図示せず）、または閉鎖位置に取り付けられることを可能にする。ヒンジ連結コネクタ４４０は、プラスチックをスコア線で曲げることができるようにスコアリングされた、より厚いプラスチック・リボンであってもよい。あるいは、ヒンジ連結コネクタは、ピボット・ヒンジ、スプリングヒンジ（ポートカバーが閉鎖位置または開放位置にあることを確実にするため）または当技術分野で既知の他の任意のタイプのヒンジであって差し支えない。これらのヒンジ連結コネクタ４４０は、別々に成形されるか、またはポートカバーの一環として成形されて、上述のプラスチック部品を成型および取り付ける方法を含めた当技術分野で既知の任意の方法によって多層フラスコに取り付けられて差し支えない。

さらなる実施の形態では、コネクタは、ボールおよびソケットコネクタ４５０でありうる。ボールの特徴部分４７０は、ポートカバーまたは多層フラスコから突き出ていて差し支えなく、対向する表面の突出したソケット特徴部分４７１と可逆的に係合しうる。したがって、２つのピースを接続するように、ポートカバーをボールとソケットの接合部で嵌めて差し支えない。さらなる実施の形態では、コネクタは、ホックおよびループファスナー４６０、ジップロックタイプのファスナー、接着剤、または他の連結機構であって差し支えない。

ポートカバー４２１は、コネクタ４０１によって、多層フラスコ１００（図４に示すように）、またはポート壁２２６（図２Ａ〜２Ｃに示すように）などの多層フラスコ１００の構造に連結して差し支えない。あるいは、代替となる実施の形態では、ポートカバー２２１またはポートカバーストリップ２２２は、多層フラスコには取り付けられず、多層フラスコ１００とは分離していてもよい。ポート２２０を通じて細胞増殖チャンバにアクセスするたびごとに、使用するポートカバー２２１またはポートカバーストリップ２２２を取り外し、廃棄し、多層フラスコを閉鎖したいときに、新しいポートカバー２２１またはポートカバーストリップ２２２を施用してポート２２０を閉鎖するように、ポートカバー２２１またはポートカバーストリップ２２２は、使い捨て可能であって差し支えない。ポートカバーまたはポートカバーストリップは、使い捨て可能および、加熱殺菌またはＵＶ殺菌、または当技術分野で既知の他の任意の方法によって殺菌可能でありうる。

実施の形態では、ポート２２０およびポートカバー２２１または２２６は、ポートカバーがポートに係合して、液密封止の提供を可能にするように、内部または外部の封止または係合構造を有しうる。例えば、図５Ａおよび５Ｂを参照されたい。図５Ａは、ジップロックタイプのシーラー５００を例証している。チャネル５０２を形成する、一対の間隔の空いた平行なファスナー突起部５０１が、１つの表面、例えばポートまたはポートカバーの上面、またはポート壁に提供されて差し支えなく、その相補的表面は、 ファスナーチャネルに圧入する際に、開放可能な液密封止を形成する、柔軟性材料の単一のリボン５０５を有しうる。実施の形態では、ファスナーは、封止が形成される際に色が変化するように設計されて差し支えない。例えば、ファスナーの突起部は、例えば青などの色を有し、リボンは例えば赤などの別の色を有し、２つの相補的要素が加圧されて封止を形成する際に、構造を通じて紫色が透けて見えてもよい。

図５Ｂは、シーラー５００の代替となる実施の形態を例証する。レッジ構造５１０または隆起ポート５２０の周囲の環状構造は、相補的構造と係合し、これは、例えば、ポートカバーストリップ５２２とポート５２０の間に開放可能な液密封止を作り出すように、ポートカバー５２１をポートとスライド可能に係合させるための、ポートカバー５２１またはポートカバーストリップ５２２上の柔軟性のキャッチバー５１１でありうる。図５Ｂには１つのポート５２０のみが示されているが、ポートカバーストリップは、同様に構造化された一連のポートとスライド可能に係合して一連のポート５２０とポートカバーストリップ５２２の間に封止を形成するために使用することができる。これらの構造を総合すれば、ポートカバーストリップ５２２とスライド可能に係合して液密封止を形成するレッジ構造５１０は、シーラー５００の１つの実施の形態である。あるいは、さらなる実施の形態では、ポートカバー５２１は、ポートカバー５２１がポート５２０に対して係合して液密封止を提供することができるための構造である、内部または外部のシーラーを有してもよい。図５に示すように、ポートカバー５２１は、ポート５２０の上部にフィットして液密封止を形成するように、ポート５２０上をスライドして構わない。これは、ポート５２０よりも上側のポートカバー５２１に含まれるが、ポートと係合して液密封止を形成する、隔壁５２５を設置する。ポート５２０またはポートカバー５２１は隔壁５２５を有しうる。隔壁５２５がポートカバー５２１に存在する場合、隔壁５２５は下方のポート内には延伸せず、ポートよりも上側かつポートの外側に存在する。隔壁５２５は、針またはカニューレまたは他の装置が隔壁５２５を通じてポートまたはポートカバー内に挿入されるまで、ポートを閉鎖可能にする。針またはカニューレまたは他の装置が隔壁５２５を通じてポート５２０またはポートカバー５２１内に挿入される際に、ポートまたはポートカバーと針またはカニューレとの間の液密封止を維持すると同時に、針またはカニューレは、多層フラスコの細胞培養チャンバ内にアクセスできるように、ポートまたはポートカバーを通過することができる。

図６を参照すると、図６は、多層フラスコ１００の第１の末端６０２上の図３に示すスライド式ポートカバー３５０、および、多層フラスコ１００の第２の末端６０３上でポート（図示せず）と係合した管６０１を組み込んだ、本発明の多層フラスコ１００の１つの実施の形態を例証している。多層フラスコは、多数の細胞増殖チャンバ１１１および一体化した気管空間１１８を有する。各細胞増殖チャンバ１１１は、ポートを通じてアクセスすることができる（図７参照）。本発明の１つの実施の形態では、管６０１を通じて流体を各細胞増殖チャンバ１１１内に揚水することによって、多層フラスコ１００を流体で満たすことができる。例えば、図３に示すように、スライド式ポートカバーをフィルタ位置までスライドさせることによって、フィルタをが多層フラスコ１００の第１の末端６０２上のポートに設置されうる。次に、管６０１を通じて各細胞増殖チャンバ１１１内に、流体を揚水することができる。多層フラスコ１００のポートの第２の末端６０３を通じて細胞増殖チャンバ１１１内に流入する流体によって行き場を失った空気または他のガスは、濾過ポートのスライド式ポートカバー３５０を通じて細胞増殖チャンバから出すことができる。多層フラスコが満たされると、スライド式ポートカバー３５０は、隔膜を備えた多層フラスコのポートの第１の末端６０２を覆うように調整され、液密封止を形成しうる。管６０１は、閉鎖した管をクランプで固定するか、または溶接することによって封止して差し支えない。その後、封止した多層フラスコは、多層フラスコ内で細胞を増殖させることができるように、例えばインキュベーターなどの適切な環境内に設置して構わない。代替となる実施の形態では、流体は、第１の一連の管６０１を通じて一連の細胞増殖チャンバ１１１内に揚水され、細胞増殖チャンバ１１１を貫流し、第２の一連の管または他の流体流動装置に接続した第２の一連のポートを通じて細胞増殖チャンバから流出させて差し支えない。

多層フラスコに取り付けられた管６０１は、多層フラスコの内外への流体のさらなる無菌的移送を可能にしうる。管は、該管が別の管または別の構造体に連結するように管の摩擦接合を適合させた、オス型またはメス型構造などのカプラーを使用して、追加の管または他の流体流動装置と連結することができる。さらなる実施の形態では、管は、途切れのない無菌の流体流動装置を形成するように、互いに熱溶接されうる。例えば、流体が流れる熱溶接された管は、マルチウェルのフラスコを、多層フラスコとは離れているであろう流体源またはシンクと連結させうる。連結を取り外すか妨げるためには、管を切断するか、あるいは折り曲げて固定するか、あるいは管を熱溶接して閉鎖することのみを必要とする。図６に示す多層フラスコは、管を含むように組み立てられ、滅菌され、包装および輸送されて差し支えなく、使用者が無菌包装を開けて、多層フラスコを流体のシンクまたは流体源に連結するように管類を熱溶接し、フラスコを使用しうるようにする。このフラスコの構造は、バルブおよびカプラーなど、液体を取り扱う設備を汚染する可能性を除去することによって、汚染の危険性を低減しうる。

図７は、ポートの領域の拡大図を表し、本発明の実施の形態におけるポートと管またはカニューレとの連結を例証している。ポート７２０は、オス型７３０またはメス型７３１の構造を有しうる。オスポート７３０は、針、ピペットチップ、管７３２、カニューレ、または他の流体流動装置をオスポート７３０の周囲にぴったりと適合させて液密封止を形成する、突出構造を有しうる。メスポート７３１は、カニューレ７３５、針、管またはピペットチップ、または他の流体流動装置をメスポート７３１内にぴったりと適合させて液密封止を形成する、レセプタクル構造でありうる。

流体流動装置は、針、カニューレ、ピペットチップまたは管を備えており、流体を多層フラスコの内外に導くことを可能にする装置である。図８Ａ〜８Ｃは、このような流体流動装置の１つであるカニューレ８０１を例証している。図８Ａはマニホールド８４０に取り付けられた多数のカニューレ８０１を例証している。カニューレはマニホールドの近位端８１３に取り付けられて差し支えない。１つの実施の形態では、本発明のカニューレ８０１は、液体の方向性流れを可能にしうると同時に、分離流、または空気またはガスの換気も可能にしうる。例えば、図８に示すカニューレは、隔壁および第１の先端の近位にある第２の先端８０３に穿孔するための尖った遠位端８０２を有する。第２の先端８０３も尖っていて差し支えなく、第２の流路８１１と関連している。図８Ｂに示す線８−８で切った断面図である、図８Ｃに示す断面で検証すると、カニューレは、２つの分離流路を有し、１つは液体のための流路８１０、もう１つは空気のための流路８１１である。図７に示すように、カニューレ８０２の遠位端が多層フラスコのポート内に挿入される際に、液体は液体通路８１０を通じて多層フラスコ内に流入することができ、行き場を失った空気は、同一のカニューレの空気の流路８１１を通じて多層フラスコから流出することができ、カニューレの近位端８１３に配置されうる換気口８１２を通じて外気が発散される。この換気口は、この空気の流路からの汚染を防ぐために、フィルタ材料で覆われて差し支えない。このカニューレの実施の形態を用いると、液体を閉鎖された細胞培養チャンバ内に導入することができ、それと同時に、各細胞培養チャンバに、行き場を失った空気の放出を可能にするための第２の開放ポートを必要とせずに、行き場を失った空気を発散することができる。カニューレは、流体を導くように構造化され配置された第１の内部通路、および流体を導くように構造化され、配置された第２の内部通路を画成し、かつ、近位端および遠位端を有する、剛性の管状構造でありうる。

これらの流体流動装置はマニホールドと連結しうる。マニホールドは、多数の流体流動装置を保持するように構造化され、配置された装置である。マニホールドはまた、流体を多数の流体流動装置の内外に導くように構造化され、配置されて差し支えない。例えば、マニホールドは、多数の流体流動装置が多層細胞培養構造のポートと一列に揃うことが確保されるように間隔を空けた、多数のカニューレまたは管、またはピペットチップを保持するように構造化され、配置されうる。マニホールドは、内部に（多層細胞培養構造と一体となって）または外部に（多層細胞培養構造とは分離して）存在しうる。

図９Ａは、本発明の外部マニホールド９００の１つの実施の形態を例証している。１つの実施の形態では、マニホールド９００は、フラスコの内容物を多層フラスコから出し入れする際に該内容物を操作するための装置である。外部マニホールド９００は、流体流動装置またはカニューレ９１０をマニホールド９００に連結するためのカプラー９３０を有する。これらのカプラー９３０はメス型構造（図のように）をしていて差し支えなく、ピペットチップまたはカニューレなどの流体流動装置はこれらのメス型構造内に挿入して流体流動装置とマニホールドを連結して差し支えない。あるいは、カプラー９３０は、図１０に示すようにオス型カプラーであってもよい。

図１０は、本発明の外部マニホールド１０００の追加の実施の形態を例証している。図１０に示すマニホールド１０００は、ネック開口１００１と、ネック開口とマニホールド本体１００６の間に入るバルブ１００４と、カニューレ、ピペットチップまたは管類などの流体流動装置１０１０と接続するように構造化され、配置されたオス型カプラー１０３０とを有する。

ピペットチップまたはカニューレなどの流体流動装置は、多層フラスコ１００のポート１２０を通じて細胞増殖チャンバ内に挿入されるように構造化され、配置されうる。例えば、マニホールドのネック開口１００１を通じてマニホールドに入る流体は、マニホールド本体１００６内に流れ、カニューレ１０１０を貫流しうる。これらのカニューレ１０１０が多層フラスコ１００のポート１２０内に挿入される際に（図１参照）、流体はカニューレ１０１０を通じて個別の細胞培養チャンバの内部に流れることができる。

再び図９を参照すると、外部マニホールド９００はバルブ９０４を有しうる。開放位置では、図９Ｂに示すように、流体は、バルブ９０４を通じてネック開口９０１からマニホールド本体９０６まで自由に流れうる。閉鎖位置では、図９Ｃに示すように、流体はネック開口９０１からマニホールド本体９０６まで通過しえないであろう。このバルブは、外部マニホールド９００の外部からアクセス可能なバルブキーを回転させることによって動作可能になりうる。図９に示す外部マニホールドは、多層細胞培養フラスコ内の並行した多数の細胞培養チャンバとは連結していなくてもよい。言い換えれば、ネック開口９０１を通じてマニホールド本体９０６に入る流体は、多数の流体流動装置９０１を貫流して多数の細胞培養チャンバ内に同時に入る。代替となる実施の形態では、本発明の外部マニホールドは、流体が、１つの多層細胞培養装置の細胞培養チャンバから別の多層装置の別の細胞培養チャンバへとマニホールドを通じて、別の細胞培養チャンバに向かう流体と混ざることなく、流れることができるように構造化され、配置されうる。この代替となる実施の形態では、流体は１つの多層細胞培養装置から別の装置へと順次通過する。

図１１Ａおよび１１Ｂは、直列マニホールド１１００の２つの実施の形態を例証している。この事例の管では、流体流動装置１１１０はマニホールド本体１１０６に取り付けられる。マニホールド本体１１０６は、管１１１０と液密封止を形成するように構造化され、配置された、オス型１１２１またはメス型１１２２のいずれかの形態をしたポート１１２０を有する。直列マニホールド１１００は、直列マニホールドの１つの側からもう１つの側へと流体を流すことが可能な、または、流体がマニホールド本体１１０６を貫流するのを妨げることが可能な、バルブを有しうる。図１２Ａおよび１２Ｂは、図１１Ａおよび１１Ｂに示す直列マニホールド１１００のためのバルブ１１０４の１つの実施の形態を例証している。この実施の形態では、バルブは、マニホールドの１つの側からもう一方の側へとマニホールド本体１１０６を貫く通路を、開放（図１２Ａに示す）または閉鎖（図１２Ｂに示す）するように操作されうる。バルブ開放装置１１０８は、開放位置と閉鎖位置の間のスイッチを切り替える動作をする。図１２Ａおよび１２Ｂに示すように、バタフライバルブなどと同様に、バルブ開放装置を回転させてバルブを開閉して差し支えない。代替となる実施の形態では、図１３Ａおよび１３Ｂに例証するように、バルブ開放装置１１０９は、バルブ開放装置１１０９を、矢印が示すように、開放位置から閉鎖位置までスライドさせることによって動作させて差し支えない。バルブ開放時には、通路１１１３は、マニホールド１１００のそれぞれの側の開口１１１４とつながる。バルブ閉鎖時には、通路１１１３は開口１１１４とはつながらず、流体はマニホールドの１つの側からもう一方の側には流れることができない。バルブの３つの実施の形態について具体的に例証してきたが、多くのバルブの機構が当技術分野で知られており、本発明の実施の形態に適用可能であろう。バルブは機械的または電気的であって差し支えなく、例えばソレノイドバルブまたは電磁バルブを使用して構わない。

外部マニホールドの実施の形態が図１４〜１６に例証されている。図１４は、ネック開口１４０１、マニホールド本体１４０６、およびバルブ１４０４を有する外部マニホールド１４００を例証している。ネック開口は蓋１４０２で覆うことができる。蓋１４０２は、存在してもしなくてもよい。存在する場合、蓋は、細胞培養システムの内部空間と外部空間のガス交換を可能にするためのフィルタを組み込んでもよい。さらなる実施の形態では、流体の貯留容器からマニホールドへ、さらには多層フラスコへの流体連通を可能にするように、ネック開口を管類に取り付けることができる（図２０参照）。

図１５は、本発明のマニホールド１５００の追加の実施の形態を示す図である。この実施の形態では、マニホールド本体１５０５は、図１８に示すように、２つの隣接した多層フラスコ内に挿入されるように構造化され、配置された、２組の管１５１０と接続される。この実施の形態を使用すると、隣接した多くの層を接続して、多数の多層フラスコのネットワークを形成することが可能である。加えて、このマニホールドの実施の形態が用いられる場合には、流体を１つの多層フラスコに投入することによって、多数の多層フラスコを流体で満たすことが可能である。例えば、このマニホールドの実施の形態１５００を使用して、２つ以上の多層フラスコを互いに連結することができる。流体は、連結した多層フラスコの積み重ねの一番上の多層フラスコに投入することができる。すべてのフラスコを満たすため、一番上のフラスコから、中間に位置するすべてのフラスコを通過して一番下のフラスコまで、すべてのフラスコが流体で満たされるまで、流体を流すことができる。流体がマニホールド本体１５０５内に貯留されるか否か、またはマニホールド本体の一方の側の管１５１０からマニホールド本体１５１０のもう１つの側の対応する管まで流体が流れるか否かは、マニホールドの内部構造に応じて決まるが、流体は、この実施の形態のマニホールドを通じて直列に、または平行に、多層細胞培養フラスコへと流すことができる。例えば、カニューレからマニホールドに流入する時にマニホールド本体１５０５が流体を混合することができる場合には、このマニホールドが単一の多層フラスコ内の、または多層フラスコ間のすべての層を混合することが可能であり、それによって平行に接続されうる。マニホールド本体が規定された接続を維持する場合には、フラスコからフラスコへと直列に細胞培養チャンバを連結することができる。例えば、マニホールド本体を通過する際に、管１がマニホールド本体を通じて管２とのみ接続され、かつ、管３が管４とのみ接続される場合には、管１にアクセスした細胞培養チャンバは管２にアクセスした細胞培養チャンバと直列に接続され、管３にアクセスした細胞培養チャンバは管４にアクセスした細胞培養チャンバと直列に接続される。

追加の実施の形態では、管１５１０はカニューレまたは針、またはマニホールドおよび多層フラスコに液密方式で連結するように構造化され、配置された他の流体流動装置で代替されうる。例えば、管類は、ポートがある高さを有し、多層フラスコの表面よりも上方に延在する場合、該ポートに摩擦嵌合することができる。あるいは、別の方法では、ポートが管類とポートの間に液密の摩擦嵌合を形成するように構造化され、配置される場合には、管類はポートに挿入されて液密封止を形成しうる。

図１６は、本発明の追加の実施の形態を例証している。図１６は、それぞれ、カニューレ１６１０と接続したマニホールド本体１６０５、バルブ１６０４、および２つのマニホールドを互いに連結する管類１６４２に接続したネック開口１６０１を有する、２つのマニホールド１６００を示している。本発明のマニホールドは任意の配置形態で存在することができ、１つの多重層フラスコを別の多重層フラスコと接続して差し支えなく、多重層フラスコを液溜部または廃棄容器と接続してもよく、１つのマニホールドを別のマニホールドと接続して差し支えなく、既知のコネクタ、バルブ、ポンプ、または他の連結を通じて多数の連結部を提供しうることは、当業者に理解されよう。加えて、本明細書に開示される実施の形態のいずれかに関して記載された任意の特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、異なる組み合わせで実施して差し支えないこともまた当業者に理解されよう。

すべてのマニホールドの実施の形態において、カニューレ間の距離は、多層フラスコの細胞培養チャンバのポート間の距離に対応することができる。存在するカニューレの数は、多層フラスコの層または細胞培養チャンバの数に対応しうる。マニホールドの実施の形態は、使用者によって取り外されるように、多層フラスコに配置された状態で包装されて差し支えなく、あるいは、多層フラスコとは別に包装されて差し支えない。マニホールド、多層フラスコ、ポートカバー、ポートカバーストリップ、管類および本明細書に記載されるすべての設備および付属品は無菌であって差し支えなく、まとめて、または個別に無菌包装で販売されうる。
図１７を参照すると、多層フラスコ１００の２つの側に、入口ポート１７４０および出口ポート１７５０でありうる、ポート１７２０が存在しうる。１つの実施の形態では、入口ポート１７４０に挿入されたマニホールド１７００のカニューレ１７１０を通じて、流体が多層フラスコ１００に入る際に、行き場がなくなった流体またはガスがフラスコのもう１つの側にある出口ポート１７５０を通じて多層フラスコ１００から流出しうる。流体は、例えばマニホールドまたはフラスコに取り付けたポンプまたは真空を使用することによって、マニホールドに陽圧または陰圧を提供することにより、マニホールドを通じて移動させることができる（図２０参照）。多層フラスコ１００の細胞培養チャンバが流体で完全に満たされたら、マニホールド１７００のカニューレ１７１０を入口ポート１７４０から取り外すことができ、入口ポート１７４０と出口ポート１７５０の両方をポートカバー１７２１で塞ぐことができる。入口および出口ポートの両方がポートカバーによって閉鎖されたこの配置では、多層フラスコ１００は閉鎖された多層細胞培養系である。次に、この閉鎖された多層フラスコを、細胞増殖チャンバ内の細胞増殖表面が最大となる（すなわち、底板を下にして置く）ように回転させて、インキュベーターなどの細胞培養に適切な場所に置くことができる。さらなる実施の形態では、マニホールド１７００はカニューレを有さず、ポートと直接液密封止を形成してもよい（例えば、図１０参照）。

細胞培養チャンバが空になったら、多層フラスコ１００を細胞増殖のための位置から取り外し、回転させて、ポートが「上方」の位置になるようにし、手動またはロボット操作によって入口ポートおよび出口ポートのポートカバー１７２１を取り外し、マニホールドのカニューレを多層フラスコ内に挿入して、吸引または重力によって流体を除去することができる。多層フラスコが空になったら、フラスコを傾けて、多層フラスコ１００内に延在するカニューレの先端へと、残った流体を移動させてもよい。

図１８は、本発明の１つの実施の形態のマニホールドによって、多数のフラスコがいかにして互いに連結されうるかを示す、本発明の１つの実施の形態の斜視図である。マニホールド１８００の一方の側のカニューレ１８１０が１つの多層フラスコ１８０１のポート１８０３内に挿入され、マニホールド１８００のもう１つの側のカニューレ１８１１がもう１つの多層フラスコ１８０２のポート１８０４内に挿入される場合、２つのフラスコを互いに連結することができる。培地および細胞は、マニホールド１８００を通じて、１つの容器からもう１つの容器へと移動することができるように連結されうる。例えば、別の容器（または、幾つかの他の細胞増殖用の容器）に分配すべき細胞を有する容器は、図１８に示すように、上方に傾斜させることができ、重力によって、第１の容器１８０２から第２の容器１８０１へと細胞を移動させることができる。代替となる実施の形態では、ポンプは、第１の容器１８０２から第２の容器１８０１へと流体を運ぶための２番目の設置ポート１８３０に取り付けることができる。あるいは、受け入れ容器のポート１８３５に真空ポンプを取り付けて第１の容器１８０２から第２の容器１８０１へと流体を引き込むことも可能であろう。

図１９は、多層フラスコに取り付けられた図１４に示すマニホールドの実施の形態の追加の実施の形態を例証している。図１９は、マニホールド１９００が取り付けられた多層フラスコ１００を示している。マニホールド１９００は、マニホールド本体１９０５、ネック開口１９０１、蓋１９０３、およびバルブ１９０４を有する。マニホールド本体１９０５はポート（図示せず）を通じて多層フラスコ１００と連結しており、流体がネック開口１９０１から入り、マニホールド１９００を貫流して多層フラスコ１００の細胞培養チャンバ内に入ることを可能にする。マニホールド１９００は、多層フラスコに取り外しできないように取り付けられてもよく、あるいは取り外し可能であってもよい。マニホールド１９００は、使い捨て可能であって差し支えなく、また殺菌可能であってもよい。マニホールド１９００を取り外す時には、多層フラスコのポートはポートカバーによって覆われて差し支えなく、多層フラスコの細胞培養チャンバへのアクセスが制限されうる。マニホールド１９００を取り外す時には、多層フラスコは規則的な長方形または正方形の設置面積を有し、不揃いな形状をしたマニホールドまたは開口に適応させる必要なしに、多数の多層フラスコをインキュベーターまたは包装箱などの密閉空間内に設置できるようにする。

図２０は、貯留容器または細胞回収装置２０２０の１つの実施の形態に連結された本発明の１つの実施の形態を例証している。図２０に示す外部マニホールドは図８、９および１０に示す実施の形態であるが、ここでは任意の外部マニホールドの実施の形態が適切であろう。外部マニホールド２０００は、カニューレ２０１０、マニホールド本体２００５、バルブ２００４、およびネック開口２００１を有する。外部マニホールド２０００は多層細胞培養容器と連結するように構造化され、配置される（図示せず）。この実施の形態では、外部マニホールドは、細胞回収装置または培養培地貯留容器でありうる外部の液溜部と接続されうる。細胞回収装置２０２０が図２０に示されている。外部マニホールド２０００は、管類２００２によって細胞回収容器２０２０に取り付けられた容器の蓋２０１５を通じて、細胞回収装置に接続されうる。管類２０２５の容器端は、容器の蓋２０１５を回して締めるか、またはカチッと嵌る際に、容器２０２０の貫通孔２０３０内に入る。代替となる実施の形態では、回収容器は、管類２００２が容器２０２０にすでに取り付けられた状態で、あらかじめ組み立てられていてもよい。容器２０２０は、真空ポンプにつながる管類２０４１（図示せず）と連結するための第２のポート２０４０ を有する。この組立体が多層フラスコのポートを通じて多層フラスコに接続され、第２のポート２０４０を通じて容器に真空が提供される際に、真空は、液体、ならびに幾つかの事例では細胞を、多層フラスコから取り出し、容器２０２０内に堆積させることができる。容器は滅菌容器であって差し支えなく、外部マニホールドおよび管類は無菌であってよく、それによって多層細胞培養フラスコから容器への細胞および流体の無菌状態での取り出しを可能にする。

これらの工程は、自動設定で行うことができる。例えば、図２０に示すように、殺菌した回収容器に接続され外部マニホールドは、多層フラスコに接続して多層フラスコの内容物を除去するために、ロボット制御で操作されうる。この種のロボット操作を用いると、ヒトの接触は軽減され、汚染の危険性および漏出も軽減される。

よって、本発明について説明してきたが、当業者によって本開示の利益を有する多くの方法で変更されうることは明らかであろう。そのような変更は、本発明の精神および範囲からの逸脱とは見なされず、当業者にとって明らかであろうこれらの変更は添付の特許請求の範囲およびそれらの法律上の等価物の範囲内に含まれることが意図されている。

Claims (2)

1. 多層細胞培養装置であって、
   ａ．各細胞培養チャンバが少なくとも１つのポートを有する、少なくとも３つの細胞培養チャンバと、
   ｂ．少なくとも２つの一体化した気管チャンバと、
   ｃ．前記少なくとも３つの細胞培養チャンバの前記少なくとも１つのポートと連結するように構造化され、配置された、取り外し可能なマニホールドと、
   を備え、
   ｄ．前記取り外し可能なマニホールドが、２つ以上の前記多層細胞培養装置の前記少なくとも３つの細胞培養チャンバの前記少なくとも１つのポートと、開放可能な液密封止を形成することを特徴とする多層細胞培養装置。
2. 前記取り外し可能なマニホールドがバルブを含むことを特徴とする請求項１記載の多層細胞培養装置。

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