JP2012060903A

JP2012060903A - マルチウエルプレート用粘着シート及び細胞培養方法

Info

Publication number: JP2012060903A
Application number: JP2010206178A
Authority: JP
Inventors: Takafumi Kajitani; 隆文梶谷
Original assignee: KAJIXX KK
Current assignee: KAJIXX KK
Priority date: 2010-09-14
Filing date: 2010-09-14
Publication date: 2012-03-29

Abstract

【課題】細胞培養容器としてのマルチウエルプレートの各ウエルを通気性を確保しながらコンタミを確実に防いで密封することができるマルチウエルプレート用粘着シート１を提供する。
【解決手段】複数のウエル４０１が配列されているマルチウエルプレート４００の上面を覆う通気性で不透水性のシート本体１０と、シート本体１０に設けられた、それぞれのウエル４０１の開口部４０３の全周囲に貼着して各ウエル４０１を密封する粘着剤層１１と、ウエル４０１の開口部４０３に対応して設けられた、粘着剤層１１が設けられていないシート露出部１２とを有する構成とする。また、かかるマルチウエルプレート用粘着シート１を用いてマルチウエルプレート４００の各ウエル４０１を密封して細胞培養を行う。
【選択図】図５

Description

本発明は、マルチウエルプレートの各ウエルを密封するマルチウエルプレート用粘着シート及びそのシートを用いた細胞培養方法に関するものである。

培養している細胞を顕微鏡などで観察することが行われている。例えば、iPS細胞（人工多能性幹細胞）の研究においては、万能細胞が組織細胞に変化していく際の過程が不明であり、その解明には、細胞を生きたまま継続的に観察することが必要になる。生きている細胞の培養は、生物の体内と同じ温度37℃、湿度95％、CO₂濃度5％に管理されたインキュベータの中で行われる。

こうした細胞培養と観察を行うために、例えばウエルの底壁が板状でポリスチレン等の透明なプラスチックで形成されているマルチウエルプレートが用いられる。このマルチウエルプレートは底壁を介してウエル内部の細胞を顕微鏡などで観察することができる。また、特許文献１に示されているように、ウエルの底部を蛍光を有さない合成石英で形成し、蛍光による細胞観察に適したマルチウエルプレートも提案されている。
特開２００２−１２５６５６号公報

しかしながら、マルチウエルプレートを培養容器として用いる細胞培養方法は、培養容器を密栓する密閉系とすることができないため、開放系となるが、開放系では、細胞培養における一番の問題点であるコンタミが生じやすい。

そのため、マルチウエルプレートを細胞培養容器として用いる場合に、密閉系とすることが要望されている。密閉系とするためには、酸素と炭酸ガス等の通気性を確保しつつ、コンタミを防ぐために水が入らないように密封する必要がある。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたもので、細胞培養容器としてのマルチウエルプレートの各ウエルを通気性を確保しながらコンタミを確実に防いで密封することができるマルチウエルプレート用粘着シートを提供することを目的とする。

また、本発明は、このようなマルチウエルプレート用粘着シートを用いる細胞培養方法を提供することを目的とする。

請求項１にかかる本発明は、上記目的を達成するため、複数のウエルが配列されているマルチウエルプレートの上面を覆う通気性で不透水性のシート本体と、前記シート本体に設けられた、それぞれの前記ウエルの開口部の全周囲に貼着して前記各ウエルを密封する粘着剤層と、前記ウエルの前記開口部に対応して設けられた、前記粘着剤層が設けられていないシート露出部とを有することを特徴とするマルチウエルプレート用粘着シートを提供する。

このマルチウエルプレート用粘着シートを、各ウエルの開口部とシート露出部とを位置合わせをしてマルチウエルプレートの上面に貼り付けると、マルチウエルプレートの各ウエルの開口部の全周囲に粘着剤層が貼着して各ウエルの開口部を粘着剤層とシート本体で閉塞して密封することができる。マルチウエルプレート用粘着シートをマルチウエルプレートの上面に貼着した状態では、各ウエルの開口部に粘着剤層が設けられていないシート露出部が位置するので、シート露出部においてシート本体の通気性が発揮され、酸素や二酸化炭素等がシート本体を透過し、各ウエルの中の環境をインキュベータの環境に速やかに入れ替えることができるため、ウエル内を細胞の培養に適した環境に保つことができる。また、シート本体が不透水性であるので、一旦マルチウエルプレートにマルチウエルプレート用粘着シートを貼り付ければ、コンタミは生じない。

また、請求項２にかかる本発明は、請求項１にかかるマルチウエルプレート用粘着シートにおいて、シート本体が透明性を有することを特徴とする。
これにより、シート露出部において、シート露出部のシート本体を通してウエル内部を観察することが可能となる。

また、本発明は、請求項１又は２記載のマルチウエルプレート用粘着シートにおいて、前記シート本体の素材が、ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリスルフォン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリシリコーン及びエチレンビニルアセテートから選ばれることを特徴とするマルチウエルプレート用粘着シートを提供する。
シート本体にこのような素材を用いることにより、通気性と透明性を確保することができる。

また、請求項４にかかる発明は、底面が平坦な複数のウエルが配列されている少なくとも底部が透明なマルチウエルプレートの前記ウエルに細胞と培養液を入れる工程と、前記ウエルの各開口部を請求項１に記載されたマルチウエルプレート用粘着シートで密封する工程と、前記細胞を培養する工程と、培養工程中に、前記ウエルの内部を前記マルチウエルプレート用粘着シートを介して及び／又は前記ウエルの底面を介して観察する工程を有することを特徴とする細胞培養方法を提供する。

かかる細胞培養方法は、マルチウエルプレートの各ウエルを通気性を保ちながら密封して細胞を培養する際に、ウエル内部をウエルの底面を通して又はシート露出部を通して観察することができる。

本発明のマルチウエルプレート用粘着シートによれば、細胞培養容器としてのマルチウエルプレートの各ウエルを、通気性を確保しながらコンタミを確実に防いで密封することができる。
また、本発明の細胞培養方法によれば、マルチウエルプレートを密閉系の細胞培養容器として使用しながら、ウエル内部を観察することができる。

本発明のマルチウエルプレート用粘着シートの一実施形態を示す平面図である。図１のＡ−Ａ矢視断面図である。本発明のマルチウエルプレート用粘着シートをマルチウエルプレートの上面に貼着した状態を示す平面図である。市販の９６ウエルのマルチウエルプレートを示すもので、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＢ−Ｂ矢視断面図である。マルチウエルプレートの上面にマルチウエルプレート用粘着シートを貼着したときのウエルの状態を模式的に示す断面図である。

以下、本発明のマルチウエルプレート用粘着シート及び細胞培養方法の実施の形態について説明するが、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではない。
まず、本発明のマルチウエルプレート用粘着シートが貼着される対象となるマルチウエルプレートについて説明する。マルチウエルプレートの大きさ及び形は世界的にほぼ統一されており、形状は同じであるが、ウエルの大きさにより、４ウエル、１２ウエル、２４ウエル、４８ウエル、９６ウエル、３８４ウエルなどのバリエーションがあり、使用目的によって使い分けされる。

図４に示したマルチウエルプレート４００は、横１２列、縦８行の合計９６のウエル４０１が設けられている９６ウエルである。ウエル４０１の底壁４０２が平板状で全体が透明なポリスチレン等で一体に成形されている。各ウエル４０１の開口部４０３の全周縁には、コンタミを避けるために上面からやや突き出たリング状の周縁リブ４０４が設けられている。周縁リブの幅は約１ｍｍで上端面が平坦に形成されている。また、マルチウエルプレート４００の上面の外周縁に亘って上面から突出した外周リブ４０５が設けられている。また、マルチウエルプレート４００の一角に位置決めのための切り欠き部４０６が設けられている。上面の左端と上端にはそれぞれのウエルの番号を示す記号の刻印が形成されている。また、ウエルの底壁を蛍光を有さない合成石英で形成し、蛍光による細胞観察に適したマルチウエルプレートも存在する。

本発明のマルチウエルプレート用粘着シート１は、いずれのマルチウエルプレートにも適用することができる。以下では、図４に示した９６ウエルのマルチウエルプレート４００に適合したマルチウエルプレート用粘着シートの一実施形態について説明を行う。

図１に示すように、本発明のマルチウエルプレート用粘着シート１の一実施形態においては、マルチウエルプレート４００の上面の形状とほぼ同一か、又は上面からややはみ出す大きさのプラスチックシート乃至フィルムで構成されるシート本体１０を有する。シート本体１０は、少なくとも、全てのウエル４０１を覆う大きさが必要であり、マルチウエルプレート４００の外周リブ４０５を覆う大きさとすることが好ましい。本実施形態では、マルチウエルプレート４００の平面形状とほぼ同一の形状、大きさの矩形状となっている。

シート本体１０の材質は、透明性に優れると共に、酸素、二酸化炭素等の気体透過性に優れ、かつ、水を通さない不透水性であることが好ましく、例えばポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリスルフォン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリシリコーン及びエチレンビニルアセテート等が用いられる。通気性ではあるが、不透明なメンブランフィルタや不織布は適さない。中でも、低密度（０．９１〜０．９４）ポリエチレンシート乃至フィルムが、透明性に優れ、気体透過性が大きいことから、好ましく用いられる。シート本体１０の厚さは、気体透過性を確実にするため、１〜５００μｍの範囲、特に１０〜２５０μｍの範囲とすることが好ましい。

本発明のマルチウエルプレート用粘着シート１は、シート本体１０に粘着剤層１１とシート露出部１２が形成されている。粘着剤層１１は、シート本体１０の一面側の全面に設けられており、シート露出部１２の部分だけが粘着剤層１１が設けられていない部分となっている。シート露出部１２の位置と形状は、ウエル４０１の開口部４０３の周縁リブ４０４の内周縁の円形に合致するように形成されている。実際には、シート本体１０の一面側の全面に粘着剤層１１を設け、マルチウエルプレート４００の各ウエル４０１の開口部４０３の周縁リブ４０４の内径とほぼ一致するか、叉は中心が一致して０．１〜２ｍｍ小径の円形に粘着剤層１１が打ち抜かれた箇所が、粘着剤層１１が形成されていないシート露出部１２となっている。また、図２の断面図では、粘着剤層１１の上に剥離紙１３が積層されている。

本発明のマルチウエルプレート用粘着シート１を、剥離紙１３を剥がした後、シート露出部１２の中心をマルチウエルプレート４００の各ウエル４０１の開口部４０３の中心と一致させてマルチウエルプレート４００の上面に貼り付けると、図３に示すように、シート露出部１２の周縁の粘着剤層１１が、各ウエルの周縁リブ４０４の上面の全面に貼着されると共に、粘着シート１の外周部の粘着剤層１１が、マルチウエルプレート４００の外周リブ４０５の上面に貼着する。これによって、図５に示すように、各ウエル４０１の開口部４０３は、シート本体１０の粘着剤層１１が各ウエル４０１の開口部４０３の全周囲に亘る周縁リブ４０４の上面に貼着することによって閉塞され、各ウエル４０１はマルチウエルプレート用粘着シート１によってそれぞれ密封される。切り欠き部４０６ではシート本体１０が三角形状にはみ出している。この部分はマルチウエルプレート用粘着シート１を剥離するときの手がかりとなる。

密封された各ウエル４０１の開口部４０３にはシート露出部１２が対応しており、粘着剤層１１が存在しないことから、シート本体１０の通気性が粘着剤層１１によって阻害されず、シート露出部１２においてはシート本体１０を通して良好な通気性を有する。また、シート本体１０が不透水性であるので、各ウエル４０１はそれぞれ独立してシート本体１０と粘着剤層１１とで密封され、コンタミが生じるおそれがない。また、ウエル４０１内部の液体はシート本体１０によってシールされ、外部に流出しない。

本発明のマルチウエルプレート用粘着シート１をマルチウエルプレート４００の上面に貼り付けると、図５に示す如く、シート本体１０が透明性を有すれば、シート露出部１２においては、シート本体１０を通して上からウエル４０１内部を観察することができる。また、透明なウエル底壁４０２を通して培養中の細胞を観察することができる。更に、シート本体１０とウエル底壁４０２とを通して、ウエル４０１内を透視することができる。

本発明のマルチウエルプレート用粘着シート１は、例えば、剥離紙１３の上に粘着剤を塗布して粘着剤層１１を形成した後、別の図示しない剥離紙を被せ、剥離紙１３と粘着剤層１１とをシート露出部１２の形状に打ち抜いて除去し、打ち抜かなった剥離紙を剥がし、最後に基材シート１０に粘着剤層１１を貼り付けるという工程で製造することができる。粘着剤層１１は、細胞培養に影響を及ぼさないものが好ましく、アクリル系粘着剤、シリコーン系粘着剤を用いることができる。

次に、本発明のマルチウエルプレート用粘着シート１を用いた細胞培養方法について説明する。本発明の細胞培養方法は、細胞を生きたまま観察することに適しており、例えば、予め公知の方法で滅菌した剥離紙１３が粘着剤層１１に貼り付けられたマルチウエルプレート用粘着シート１とマルチウエルプレート４００を準備する。ウエル４０１の内面に細胞を付着させるための処理をしていても良い。適切な培養液（培地）２に細胞３を懸濁させ、各ウエル４０１に懸濁液を注入する。次に、マルチウエルプレート用粘着シート１をマルチウエルプレート４００の上面にウエル４０１の中心とシート露出部１２の中心とを合わせて貼り付けることによって、図５に示すように、各ウエル４０１をマルチウエルプレート用粘着シート１で密封する。これによって、各ウエル４０１は不透水性シート１０で密封されるため、水の滲入や細菌の汚染が無くなり、コンタミが生じない状態となる。

マルチウエルプレート用粘着シート１を貼り付けたマルチウエルプレート４００をインキュベータの中に入れて細胞３を培養する。このとき、各ウエル４０１の開口部４０３に対向しているシート露出部１２を構成するシート基材１０が通気性を有するので、各ウエル４０１の内部の空気がインキュベータの雰囲気ガスによって速やかに置換され、細胞３の培養が進行する。

各ウエル４０１の内部の細胞３を観察するには、インキュベータから取りだして、又はインキュベータの中で、透明性を有するシート露出部１２のシート基材１０を通して観察することができる。また、ウエル底壁４０２を介して、ウエル４０１内部の細胞の状態を位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡等で観察することができる。場合によっては、シート露出部１２のシート基材１０とウエル底壁４０２を通してウエル４０１内部を透視することも可能である。

このように、本発明のマルチウエルプレート用粘着シート１は、これまで開放系の培養容器としか使えなかったマルチウエルプレート４００を、内部観察が可能な密閉系の培養容器へと簡便に変更することができる。

本発明のマルチウエルプレート用粘着シート及び細胞培養方法は、細胞培養の研究分野に利用することができる。

１：マルチウエルプレート用粘着シート
１０：シート本体
１１：粘着剤層
１２：シート露出部
１３：剥離紙
２：培養液（培地）
３：細胞
４００：マルチウエルプレート
４０１：ウエル
４０２：底壁
４０３：開口部
４０４：周縁リブ
４０５：外周リブ

Claims

複数のウエルが配列されているマルチウエルプレートの上面を覆う通気性で不透水性のシート本体と、前記シート本体に設けられた、それぞれの前記ウエルの開口部の全周囲に貼着して前記各ウエルを密封する粘着剤層と、前記ウエルの前記開口部に対応して設けられた、前記粘着剤層が設けられていないシート露出部とを有することを特徴とするマルチウエルプレート用粘着シート。
請求項１記載のマルチウエルプレート用粘着シートにおいて、
前記シート本体が透明性を有することを特徴とするマルチウエルプレート用粘着シート。
請求項１又は２記載のマルチウエルプレート用粘着シートにおいて、
前記シート本体の素材が、ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリスルフォン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリシリコーン及びエチレンビニルアセテートから選ばれることを特徴とするマルチウエルプレート用粘着シート。
底面が平坦な複数のウエルが配列されている少なくとも底部が透明なマルチウエルプレートの前記ウエルに細胞と培養液を入れる工程と、前記ウエルの各開口部を請求項１に記載されたマルチウエルプレート用粘着シートで密封する工程と、前記細胞を培養する工程と、培養工程中に、前記ウエルの内部を前記マルチウエルプレート用粘着シートを介して及び／又は前記ウエルの底面を介して観察する工程を有することを特徴とする細胞培養方法。