JP6447125B2 - 細胞培養容器 - Google Patents

Description

本発明は、細胞を培養するための細胞培養容器に関する。

再生医療の分野では、細胞をシート状に培養した細胞シートが用いられている。細胞シートは、例えば、厚さが数μｍから１０μｍ程度の非常に薄い膜であり、回収時の取り扱いに注意を要する。このような細胞シート等の培養後の培養組織を容易に回収することができる培養装置が開示されている（下記特許文献１を参照）。

特許文献１の培養装置は、培養キャビティを形成可能なチャンバーと、該チャンバーが培養体を培養する培養面と、該培養面の外周側を包囲し培地を保持する外周堤部と、を備えている。そして、外周堤部の少なくとも一部が前記包囲部位から変位されて当該変位部位において前記培養面の外周側が開放状態となるように形成されている。

特許文献１の培養装置によれば、培養面と外周底部とによって培地を保持して培養キャビティを形成し、細胞や組織片等の培養体は、培養キャビティの培養面上で培養される。また、外周堤部は、その少なくとも一部が所定の包囲部位から変位されて当該変位部位において培養面の外周側の少なくとも一部を開放状態とする。そのため、培養工程後に得られる培養組織は、当該変位部位、すなわち、培養面の開放部位を介して作業者等により操作され回収される。

また、特許文献１には、培養面の表面を温度感応性ポリマーで形成することが記載されている（例えば、第００３４段落を参照）。温度感応性ポリマーは、温度制御によりポリマーの親水性と疎水性とを制御可能なポリマーであり、温度制御によって細胞接着性を変化させることができる。そのため、培養面の表面を温度感応性ポリマーで形成することで、細胞接着性を持たせた培養面で細胞シートを培養した後、温度制御によって培養面の細胞接着性を喪失させ、培養面から細胞シートを剥離させて回収することができる。

特開２００５−８７０３０号公報

培養面から剥離させた細胞シートは、例えば、細胞シート表面の水分の表面張力によって高分子膜等の支持体に吸着させてハンドリングすることができる。しかし、特許文献１の培養装置は、細胞シートを培養面から剥離させた状態で、培養キャビティを画定する外周堤部を変位させて培養面の外周側の一部を開放すると、そこから流れ出した培地の流れに乗って細胞シートが一方向に移動する。

この場合、細胞シートは、外周堤部の開放された部分に凝集し、皺が寄ったり折り重なったりして伸展した状態を維持できなくなる虞がある。また、培養キャビティを画定する外周堤部の全体を変異させて培養面の外周側の全体を開放すると、培地の流れに乗って移動する細胞シートの移動方向が予測できず、細胞シートを所定の位置に配置できなくなる虞がある。

本発明は、前記課題に鑑みてなされたものであり、細胞シートを細胞培養領域から剥離させた状態で培地を排出しても、細胞シートの凝集を防止することができ、細胞シートを容器内の所定の位置に配置することができる細胞培養容器を提供することを目的とする。

前記目的を達成すべく、本発明の細胞培養容器は、培地を収容する容器を備え、該容器の底部に細胞培養領域を有する細胞培養容器であって、前記容器の前記底部に設けられ前記細胞培養領域の周囲に配置された複数の培地排出孔と、該培地排出孔を開口可能に密閉する封止部材とを備えることを特徴とする。また、前記複数の培地排出孔は、前記細胞培養領域の周囲に該細胞培養領域の中心線に線対称に配置されていてもよい。

前記容器は、前記培地を収容する培地収容部と、気体を収容する気体収容部とを有し、前記培地排出孔は、前記培地収容部に設けられていてもよい。また、前記培地排出孔は、前記容器の底壁に設けられていてもよい。また、前記底壁は、前記容器の側壁の下端に剥離可能に接合されたフィルム部材であってもよい。また、前記フィルム部材は、分断可能な切取線が形成されてもよい。また、前記細胞培養容器は、前記細胞培養領域に温度応答性ポリマーを備えてもよい。また、前記封止部材の厚さは、前記容器の厚さよりも薄くてもよい。

前記封止部材は、前記容器に貼着された自己吸着性シートであってもよい。また、前記培地排出孔は、楕円孔又は丸長孔であってもよい。また、前記封止部材は、前記容器に設けられ前記容器の外部の圧力を低下させることで開放可能な圧力弁であってもよい。また、前記封止部材は、弾性を有し、前記培地排出孔を開口させた状態で前記培地排出孔に挿入される部分の外径が前記培地排出孔の内径よりも大きくてもよい。また、前記封止部材は、前記容器に設けられたスライド溝によってスライド可能に保持され、前記培地排出孔を閉塞する閉塞位置と前記培地排出孔を開口させる開口位置との間でスライド可能に設けられていてもよい。

本発明の細胞培養容器によれば、細胞シートを細胞培養領域から剥離させた状態で培地を排出したときに、細胞シートの凝集を防止することができ、細胞シートを容器内の所定の位置に配置することができる。

本発明の細胞培養容器の実施形態１を示す上面側の外観斜視図。 図１Ａに示す細胞培養容器の下面側の外観斜視図。 図１ＡのII−II線に沿う断面図。 図１Ｂに示す細胞培養容器の底壁の変形例を示す平面図。 本発明の細胞培養容器の実施形態２を示す下面図。 図４に示す細胞培養容器のV−V線に沿う断面図。 図４に示す細胞培養容器のVI−VI線に沿う断面図。 図４に示す細胞培養容器のVII−VII線に沿う断面図。 本発明の細胞培養容器の実施形態３を示す断面図。 本発明の細胞培養容器の実施形態４を示す断面図。 図９Ａに示す細胞培養容器の下面図。

以下、図面を参照して本発明の細胞培養容器の実施形態を説明する。

（実施形態１）
図１Ａは、本発明の実施形態１に係る細胞培養容器１の上面側の外観斜視図である。図１Ｂは、図１Ａに示す細胞培養容器１の下面側の外観斜視図である。図２は、図１Ａに示す細胞培養容器１のII−II線に沿う断面図である。

本実施形態の細胞培養容器１は、主に動物細胞の培養に用いられるフラスコ型の培養容器であり、例えば、可視光を透過する透明な材料によって製作された扁平角形の容器１０を備えている。容器１０は、細胞及び培地Ｍを導入する開口部１１を有し、開口部１１から導入した細胞及び培地Ｍを内部に収容する。容器１０は、培地Ｍを収容する培地収容部１０ｄと、気体を収容する気体収容部１０ａとを有している。容器１０は、最も大きい面積を有する一対の壁面のうち一方が底面、他方が上面とされ、一側面に開口部１１が形成されている。培地収容部１０ｄは、容器１０内の底面側の部分であり、気体収容部１０ａは、容器１０内の上面側の部分である。

開口部１１は、例えば、スクリューキャップである蓋部材２０によって、開閉可能に閉塞されている。すなわち、蓋部材２０の内周面に設けられたねじが、容器１０の開口部１１の外周面に設けられたねじに螺合することで、蓋部材２０が容器１０に締結されて開口部１１を閉塞している。本実施形態の蓋部材２０は、例えば、疎水性フィルター２１を有している。疎水性フィルター２１は、通気性を有し、容器１０の内部から外部へ培地Ｍ及び細胞が流出するのを防止するとともに、容器１０の外部から内部へ細菌等が侵入するのを防止している。

容器１０及び蓋部材２０は、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロプレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）等の樹脂材料によって製作することができる。なお、細胞培養に適した表面処理を容易にする観点から、容器１０は、ＰＳ製であることが好ましい。また、容器１０及び蓋部材２０は、樹脂材料に限定されず、例えば、ガラス、石英、セラミックス、金属等によって製作してもよい。

容器１０は、底壁１０ｂの内表面の中央部に細胞を培養するための細胞培養領域Ａを有している。本実施形態において、細胞培養領域Ａは、長方形の平面形状を有している。なお、細胞培養領域Ａの形状は長方形に限定されず、正方形やその他の多角形、円形、楕円形等の任意の形状を採用することができる。本実施形態において、容器１０の底部の細胞培養領域Ａは、温度応答性ポリマーＰを備えている。

温度応答性ポリマーＰとしては、細胞を培養する温度では細胞接着性を示し、作製した細胞シートＳを剥離するときの温度では細胞非接着性を示すものを用いるとよい。例えば、温度応答性ポリマーＰは、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込んで膨潤して表面に細胞を接着しにくくする性質（細胞非接着性）を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮して表面に細胞を接着しやすくする性質（細胞接着性）を示すものを用いるとよい。このような臨界溶解温度は、下限臨界溶解温度と呼ばれる。下限臨界溶解温度が０℃〜８０℃、さらに好ましくは０℃〜５０℃である温度応答性ポリマーを用いるとよい。下限臨界溶解温度が０℃〜８０℃であると、細胞を安定的に培養できるからである。

好適な温度応答性ポリマーとしてはアクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーが挙げられる。具体的に好適な温度応答性ポリマーとしては、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)等が挙げられる。

細胞培養容器１は、容器１０の底部に設けられ、細胞培養領域Ａの周囲に配置された複数の培地排出孔１２と、該培地排出孔１２を開口可能に密閉する封止部材１３とを備えている。本実施形態において、複数の培地排出孔１２は、細胞培養領域Ａの周囲に該細胞培養領域Ａの中心線Ｃに線対称に配置され、細胞培養領域Ａの中心線Ｃに沿う方向の両側と、細胞培養領域Ａの中心線Ｃに交差する方向の両側にそれぞれ設けられている。なお、培地排出孔１２は、細胞培養領域Ａの中心線Ｃに沿う方向の両側のみに設けられてもよく、細胞培養領域Ａの中心線Ｃに交差する方向の両側のみに設けられてもよい。また、複数の培地排出孔１２は、細胞培養領域Ａの周囲に配置されていれば、中心線Ｃに線対称に配置されていなくてもよい。例えば、複数の培地排出孔１２は、中心線Ｃの両側に中心線Ｃを挟んで異なる数が形成されていてもよい。また、複数の培地排出孔１２は、中心線Ｃを挟んで開口面積は異なるが、開口の中心位置が中心線Ｃに線対称であってもよく、中心線Ｃを挟んで開口面積は等しいが、開口の中心位置が中心線Ｃに線対称でなくてもよい。

また、培地排出孔１２は、容器１０の底部の培地収容部１０ｄに設けられている。すなわち、培地排出孔１２は、容器１０の培地収容部１０ｄに収容される培地Ｍの液面よりも低い位置に設けられている。より具体的には、本実施形態において、培地排出孔１２は、容器１０の底壁１０ｂに設けられている。なお、培地排出孔１２は、容器１０の培地収容部１０ｄと気体収容部１０ａとの境界、すなわち、容器１０に収容される培地Ｍの液面よりも低い位置であれば、容器１０の側壁１０ｓに設けられていてもよい。

本実施形態において、容器１０の底壁１０ｂは、容器１０の側壁１０ｓの下端に剥離可能に接合されたフィルム部材である。フィルム部材である底壁１０ｂは、例えば、ロール状に巻き取り可能な可撓性を有し、ロール・ツー・ロール法により製作されている。底壁１０ｂは、例えば、熱溶着又は接着剤によって容器１０の側壁１０ｓの下端に剥離可能に接合されている。

フィルム部材である底壁１０ｂは、細胞培養領域Ａ１の中心線Ｃに沿って分断可能な切取線１４を有している。切取線１４は、例えば、底壁１０ｂに破線状に設けられた薄肉部である。そのため、底壁１０ｂを容器１０の側壁１０ｓの下端から剥離させた後、底壁１０ｂを切取線１４の両側で把持し、切取線１４を境に反対方向の引っ張り応力を作用させることで、切取線１４に応力を集中させ、底壁１０ｂを切取線１４に沿って破断させることができる。

底壁１０ｂに形成された培地排出孔１２の形状は特に限定されず、円形、楕円形、正方形、長方形、菱形、平行四辺形、その他の多角形等、任意の形状を採用することができるが、楕円形の楕円孔、又は、両端部が円弧状に形成され中間部が直線状に形成された丸長孔であることが好ましい。本実施形態の培地排出孔１２は、容器１０の長手方向、すなわち、細胞培養領域Ａの中心線Ｃに沿う方向に延びる丸長孔である。

培地排出孔１２を密閉する封止部材１３は、例えば、容器１０に貼着された自己吸着性シートである。自己吸着性シートとしては、例えば、表面にμｍ単位の微小な凹凸を有する発泡樹脂材料を用いることができる。より具体的には、自己吸着性シートの材料として、例えば、アクリル系発泡材、シリコーン系発泡材等のエラストマー発泡材を用いることができる。容器１０内の顕微鏡観察を容易にする観点から、封止部材１３は可視光を透過する透明性を有することが好ましい。また、封止部材１３は、酸素や二酸化炭素等のガスを透過させるガス透過性を有してもよい。図２に示すように、封止部材１３の厚さｔは、容器１０の厚さＴよりも薄くてもよいが、例えば、培地Ｍに対する封止性を考慮して容器１０の厚さＴ以上にしてもよい。

封止部材１３は、容器１０に吸着して密着することで、培地排出孔１２を封止して密閉するとともに、必要に応じて容器１０から剥離させることで、培地排出孔１２を容易に開口させることができる。また、培地排出孔１２を開口させた後、再び封止部材１３を容器１０に密着させて吸着させることで、封止部材１３によって培地排出孔１２を再度密閉し、再封することが可能である。すなわち、封止部材１３は、容器１０に密着及び剥離可能に設けられ、培地排出孔１２を開口可能に密閉している。

なお、封止部材１３は、一部を容器１０に接合してフラップ状に設けてもよい。また、封止部材１３は、培地排出孔１２をそれぞれ開口可能に密閉することができる構成であれば、自己吸着性シートに限定されず、例えば、細胞の培養に影響を与えない粘着層を使用した粘着シートであってもよい。また、培地排出孔１２を開口させる際には、封止部材１３を容器１０から剥離させるだけでなく、例えば、封止部材１３をニードル等によって穿刺したり、メスや生検パンチ等によって切開したりしてもよい。

以下、本実施形態の細胞培養容器１の作用について説明する。

本実施形態の細胞培養容器１によって細胞を培養する際には、まず、容器１０の開口部１１を閉塞する蓋部材２０を取り外し、開口部１１を開放する。次に、開口部１１から容器１０の内部に、培地Ｍ及び細胞を導入し、開口部１１を蓋部材２０によって閉塞する。この段階で、細胞培養容器１をインキュベーターに収容してもよい。この際、培地排出孔１２を密閉する封止部材１３は、薄いシート状であるため、複数の細胞培養容器１を積み重ねて収容する際の支障にならない。

細胞培養容器１は、容器１０の底部の細胞培養領域Ａに温度応答性ポリマーＰを備えている。温度応答性ポリマーＰは、細胞を培養する温度では細胞接着性を示すため、細胞の培養時に温度応答性ポリマーＰに細胞が接着してシート状に培養され、細胞培養領域Ａに細胞シートＳが作製される。その後、容器１０内の培地Ｍの温度を下限臨界溶解温度まで低下させて、作製した細胞シートＳを温度応答性ポリマーＰから剥離させる。これにより、細胞シートＳは培地Ｍに浮遊した状態になる。

その後、細胞培養領域Ａの周囲に設けられた培地排出孔１２を密閉する封止部材１３の少なくとも一部を剥離して培地排出孔１２を開口させ、培地排出孔１２を介して容器１０の内部の培地Ｍを容器１０の外部に排出する。そして、最終的には、容器１０の底壁１０ｂ上の培地Ｍをすべて排出し、細胞シートＳを細胞培養領域Ａの中心線Ｃに線対称に配置する。より好ましくは、細胞シートＳを底壁１０ｂ上の細胞培養領域Ａに配置する。

ここで、細胞シートＳが浮遊した状態の培地Ｍを排出して細胞シートＳを底壁１０ｂ上の所定の位置に配置するために、細胞シートＳの位置に応じて封止部材１３を剥離して培地排出孔１２を開口させ、細胞シートＳの位置を制御することができる。例えば、細胞シートＳが容器１０の開口部１１側に移動した場合、開口部１１と反対側の端部において封止部材１３を剥離して培地排出孔１２を開口させて培地Ｍを排出することで、細胞シートＳが開口部１１と反対側の端部に移動する。

細胞シートＳが所定の位置まで移動したら、開口部１１側の端部の封止部材１３を剥離して培地排出孔１２を開口させて培地Ｍを排出することで、細胞培養領域Ａの中心線Ｃに沿う方向の両側で流出させる培地Ｍの量を均等にすることができる。これにより、細胞シートＳを所定の位置に配置したまま、培地Ｍを容器１０の外部に排出することができる。また、容器１０の底壁１０ｂを僅かに傾斜させ、細胞培養領域Ａの中心線Ｃに沿う方向の両側で流出させる培地Ｍの量を微妙に異ならせることによって、細胞シートＳの細胞培養領域Ａの中心線Ｃに沿う方向の位置を微調整することができる。また、細胞培養領域Ａの中心線Ｃに交差する方向についても、細胞培養領域Ａの中心線Ｃに沿う方向と同様の手順で細胞シートＳの位置を制御することができる。

すなわち、細胞培養容器１は、容器１０に設けられ細胞培養領域Ａの周囲に配置された複数の培地排出孔１２と、培地排出孔１２を開口可能に密閉する封止部材１３を備えている。これにより、細胞シートＳが浮遊した状態の培地Ｍを排出して細胞シートＳを容器１０内の所定の位置に配置する際に、細胞シートＳの位置を制御することができる。また、複数の培地排出孔１２が、細胞培養領域Ａの周囲にその中心線Ｃに線対称に配置されていることで、中心線Ｃの両側で培地Ｍの排出を均等にして細胞シートＳの位置の制御をより容易かつ正確に行うことができる。また、封止部材１３を剥離して培地排出孔１２を開口させた後は、容器１０の傾きを調節することで、細胞シートＳの位置を微調整することができる。したがって、本実施形態の細胞培養容器１によれば、細胞シートＳを浮遊させた状態で培地Ｍを排出したときに、細胞シートＳの凝集を防止することができ、細胞シートＳを容器１０内の所定の位置に配置することができる。

また、培地排出孔１２は、容器１０の培地収容部１０ｄに設けられているので、培地排出孔１２を介して培地収容部１０ｄに収容された培地Ｍを効率よく排出することができる。また、培地Ｍを排出する際の容器１０の傾きを小さくすることができ、細胞シートＳの位置の制御を容易にすることができる。特に、本実施形態では、培地排出孔１２が容器１０の底壁１０ｂに設けられているで、これらの効果をより効果的に得ることができる。

また、本実施形態の細胞培養容器１は、容器１０の底壁１０ｂが容器１０の側壁１０ｓの下端に剥離可能に接合されたフィルム部材である。そのため、底壁１０ｂ上の培地Ｍをすべて排出し、底壁１０ｂ上の所定の位置に細胞シートＳを配置した後は、底壁１０ｂを容器１０の側壁１０ｓの下端から剥離させて容器１０から取り外すことができる。そして、底壁１０ｂを支持体とし、細胞シートＳと底壁１０ｂとの間の水分の表面張力によって、細胞シートＳを底壁１０ｂに吸着させて搬送することができる。これにより、細胞シートＳのハンドリングを容易にすることができる。

また、フィルム部材である底壁１０ｂは、分断可能な切取線１４を有している。そのため、細胞シートＳを底壁１０ｂに吸着させて所定の位置まで搬送した後、底壁１０ｂに対して切取線１４の両側に切取線１４に垂直な方向の引っ張り応力を作用させることで、底壁１０ｂを切取線１４に沿って破断させることができる。これにより、例えば、底壁１０ｂ上の細胞シートＳの移植又は移設を必要とする領域に、凝集を防止しつつ細胞シートＳを配置することができる。また、切取線１４を細胞培養領域Ａの中心線Ｃに沿って設けることで、細胞培養領域Ａの中心線Ｃに位置合わせして底壁１０ｂ上に配置した細胞シートＳの中央部を、分断した底壁１０ｂから露出させることができ、移植先又は移設先に対する細胞シートＳの位置合わせ及び配置が容易になる。

封止部材１３の厚さｔが容器１０の厚さＴよりも薄い場合には、例えば、封止部材１３を剥離させず、穿刺又は切開によって培地排出孔１２を開口させる場合に、例えば、メスや生検パンチ、ニードル等によって、開口を容易に形成することができる。また、封止部材１３が自己吸着性シートである場合には、吸着及び剥離を繰り返し行うことができ、培地排出孔１２を開口した後に再封止することができる。また、自己吸着性シートは粘着層を有しないので、粘着シートを用いる場合と比較して、容器１０内のコンタミネーションのリスクを低減することができる。また、培地排出孔１２を、楕円孔又は丸長孔とすることで、例えば、円形の丸孔と比較して、より効率よく培地Ｍを排出することが可能になる。

以上説明したように、本実施形態の細胞培養容器１によれば、細胞シートＳを浮遊させた状態で培地Ｍを排出したときに、細胞シートＳの凝集を防止することができ、細胞シートＳを容器１０内の所定の位置に配置することができる。なお、本発明の細胞培養容器は、本実施形態で説明した細胞培養容器１の構成に限定されない。以下、本実施形態の細胞培養容器１の変形例について説明する。

図３は、図１Ｂに示す容器１０の底壁１０ｂの変形例を示す平面図である。

本変形例の底壁１０ｂは、前述の実施形態１の底壁１０ｂと同様のフィルム部材であり、細胞培養領域Ａの周囲に複数の培地排出孔１２ａ，１２ｂが設けられている。細胞培養領域Ａに近い位置に形成された培地排出孔１２ａは、細胞培養領域Ａ１から離れた位置にある培地排出孔１２ｂよりも小さい。これらの培地排出孔１２ａ，１２ｂは、実施形態１の培地排出孔１２と同様に封止部材１３によって開口可能に封止される。

本変形例によれば、細胞シートＳが浮遊した状態の培地Ｍを排出して細胞シートＳを容器１０内の所定の位置に配置する際に、底壁１０ｂに設けられた大小の培地排出孔１２ａ，１２ｂによって細胞シートＳの段階的な位置制御を行うことができる。具体的には、容器１０の内部の培地Ｍの量が多い段階では、細胞培養領域Ａから離れた位置にある比較的大きな培地排出孔１２ｂから培地Ｍを排出することによって、細胞シートＳの大まかな位置調整を行うことができる。また、容器１０の内部の培地Ｍの量が少なくなった段階では、細胞培養領域Ａに近い比較的小さい培地排出孔１２ａから培地Ｍを排出することによって、細胞シートＳのより微細な位置調整を行うことができる。

（実施形態２）
以下、本発明の細胞培養容器の実施形態２について、図１Ａ及び図２を援用し、図４から図７を用いて説明する。図４は、本実施形態の細胞培養容器１Ａを示す下面図である。図５は、図４に示す細胞培養容器１ＡのV−V線に沿う断面図である。図６は、図４に示す細胞培養容器１ＡのVI−VI線に沿う断面図である。図７は、図４に示す細胞培養容器１ＡのVII−VII線に沿う断面図である。

本実施形態の細胞培養容器１Ａは、容器１０Ａの底壁１０ｂがフィルム部材ではなく、容器１０Ａの側壁１０ｓと一体に成形されている点、及び、培地排出孔１２Ａ〜１２Ｃを開口可能に密閉する封止部材１３Ａ〜１３Ｃの構成が、前述の実施形態１の細胞培養容器１と異なっている。本実施形態の細胞培養容器１Ａのその他の点は、実施形態１の細胞培養容器１と同様であるので、同一の部分には同一の符号を付して説明を省略する。

細胞培養容器１Ａは、容器１０Ａの底部に設けられ細胞培養領域Ａの周囲に配置された複数の培地排出孔１２Ａ〜１２Ｃと、該培地排出孔１２Ａ〜１２Ｃを、それぞれ開口可能に密閉する封止部材１３Ａ〜１３Ｃとを備えている。培地排出孔１２Ａ〜１２Ｃは、容器１０Ａの培地収容部１０ｄに設けられ、より具体的には、容器１０Ａの底壁１０ｂに設けられている。また、複数の培地排出孔１２Ａ〜１２Ｃは、細胞培養領域Ａの周囲にその中心線Ｃに線対称に配置されていてもよい。

容器１０Ａの細胞培養領域Ａの開口部１１側に隣接する位置には、容器１０Ａの幅方向に延びるスリット状の培地排出孔１２Ａが設けられている。培地排出孔１２Ａは、容器１０Ａの下面視で長方形の形状を有し、封止部材１３Ａによって開口可能に密閉されている。封止部材１３Ａは、容器１０Ａに設けられ、容器１０Ａの外部の圧力を内部の圧力よりも低下させることで、培地排出孔１２Ａを開口可能な圧力弁である。より詳細には、図５（ａ）に示すように、封止部材１３Ａは、容器１０Ａの底壁１０ｂに固定された第１弁体１３Ａ１と、第２弁体１３Ａ２とを備えている。

第１弁体１３Ａ１及び第２弁体１３Ａ２は、例えば、合成ゴム等、可撓性を有する材料によって製作された板状の部材である。第１弁体１３Ａ１及び第２弁体１３Ａ２は、それぞれ、一端が容器１０Ａの底壁１０ｂに、例えば、熱溶着や接着剤等によって固定され、他端が培地排出孔１２Ａの内側で互いに重なり合って密着することで、培地排出孔１２Ａを密閉している。なお、本実施形態の細胞培養容器１Ａでは、容器１０Ａの底壁１０ｂの内面に第１弁体１３Ａ１及び第２弁体１３Ａ２を固定する例を示したが、第１弁体１３Ａ１及び第２弁体１３Ａ２は、底壁１０ｂの外面に固定してもよい。

封止部材１３Ａによって密閉された培地排出孔１２Ａを開口させるには、例えば、容器１０Ａの底壁１０ｂの外面に、培地排出孔１２Ａを覆うように吸引装置の吸引口を密着させ、吸引装置によって培地排出孔１２Ａの外側の気圧を低下させる。これにより、図５（ｂ）に示すように、封止部材１３Ａの第１弁体１３Ａ１及び第２弁体１３Ａ２が培地排出孔１２Ａの外側に撓んで培地排出孔１２Ａが開口し、容器１０Ａの内部の培地Ｍが培地排出孔１２Ａを介して排出される。

また、容器１０Ａの開口部１１の反対側の端部で細胞培養領域Ａに隣接する位置にも、容器１０Ａの幅方向に延びるスリット状の培地排出孔１２Ｂが設けられている。培地排出孔１２Ｂは、図６に示すように、容器１０Ａの底壁１０ｂの一部である封止部材１３Ｂによって密閉されている。封止部材１３Ｂは、厚さｔが容器１０Ａの厚さＴよりも薄く、例えば、培地排出孔１２Ｂを密閉することができ、かつ、メスや生検パンチ、ニードル等によって容易に開口させることができる程度に薄肉化されている。

また、容器１０Ａの底壁１０ｂの幅方向の両側には、細胞培養領域Ａに隣接して複数の円形の培地排出孔１２Ｃが設けられている。培地排出孔１２Ｃは、少なくとも一部が培地排出孔１２Ｃに挿入された封止部材１３Ｃによって開口可能に密閉されている。封止部材１３Ｃは、弾性を有し、培地排出孔１２Ｃに挿入される前の培地排出孔１２Ｃを開口させた状態で、培地排出孔１２Ｃに挿入される部分の外径が培地排出孔１２Ｃの内径よりも大きい。封止部材１３Ｃは、弾性材料、例えば合成ゴムによって製作されている。封止部材１３Ｃは、培地排出孔１２Ｃに挿入された部分が弾性変形することで、その部分の外周面が培地排出孔１２Ｃの内周面に密着して、培地排出孔１２Ｃを封止している。

本実施形態の細胞培養容器１Ａによれば、細胞シートＳを細胞培養領域Ａから剥離させた状態で培地Ｍを排出する際に、容器１０Ａの底部に設けられ、細胞培養領域Ａの周囲に配置された複数の培地排出孔１２Ａ〜１２Ｃを開口させることができる。したがって、本実施形態の細胞培養容器１Ａによれば、前述の実施形態１の細胞培養容器１と同様に、細胞シートＳの凝集を防止することができ、細胞シートＳを容器１０Ａ内の所定の位置に配置することができる。

（実施形態３）
以下、本発明の細胞培養容器の実施形態３について、図１Ａ及び図１Ｂを援用し、図８を用いて説明する。図８は、本実施形態の細胞培養容器１Ｂを示す実施形態１の図２に相当する断面図である。

本実施形態の細胞培養容器１Ｂは、容器１０Ｂの底壁１０ｂがフィルム部材ではなく、容器１０Ｂの側壁１０ｓと一体に成形されている点、及び、容器１０Ｂの開口部１１と反対側の端部において、底壁１０ｂに培地排出孔１２が設けられず、側壁１０ｓの一部が開放されて培地排出孔１２Ｄが設けられている点で、前述の実施形態１の細胞培養容器１と異なっている。本実施形態の細胞培養容器１Ｂのその他の点は、実施形態１の細胞培養容器１と同様であるので、同一の部分には同一の符号を付して説明を省略する。

本実施形態の細胞培養容器１Ｂは、容器１０Ｂの開口部１１と反対側の端部において、側壁１０ｓの一部が開放されて培地排出孔１２Ｄが設けられている。培地排出孔１２Ｄは、容器１０Ｂの底部の培地収容部１０ｄに設けられている。すなわち、培地排出孔１２Ｄは、空気収容部１０ａと培地収容部１０ｄとの境界である培地Ｍの液面よりも下方を含む位置に設けられている。容器１０Ｂは、培地排出孔１２Ｄに細胞シートＳの流出を防止し、培地Ｍを透過させるフィルター１６を備えていてもよい。また、培地排出孔１２Ｄは、細胞培養領域Ａの中心線Ｃに線対称に設けられていてもよい。

容器１０Ｂは、培地排出孔１２Ｄの周囲、より具体的には、培地排出孔１２Ｄの両側及び下方に、封止部材１３Ｄをスライド可能に係合させるスライド溝１５を備えている。スライド溝１５は、培地排出孔１２Ｄの両側及び下方の三方を取り囲むように設けられ、上方が開放されている。

封止部材１３Ｄは、例えば、容器１０Ｂと同一の材料によって製作され、所定の剛性を有し、培地排出孔１２Ｄを密閉する板状の部材である。封止部材１３Ｄは、容器１０Ｂに設けられたスライド溝１５によってスライド可能に保持され、下端が容器１０Ｂに当接して培地排出孔１２Ｄを閉塞する閉塞位置と、下端が容器１０Ｂから離れて培地排出孔１２Ｄを開口させる開口位置との間でスライド可能に設けられている。なお、封止部材１３Ｄは、複数の開口位置を設定することが可能である。すなわち、封止部材１３Ｄの上方へのスライド量を調節することで、培地排出孔１２Ｄの開口面積を調節することが可能であり、培地排出孔１２Ｄを全開にすることも可能である。

本実施形態の細胞培養容器１Ｂによれば、細胞シートＳを細胞培養領域Ａから剥離させた状態で培地Ｍを排出する際に、容器１０Ｂの底部に設けられ、細胞培養領域Ａの周囲に配置された複数の培地排出孔１２、１２Ｄを開口させることができる。したがって、本実施形態の細胞培養容器１Ｂによれば、前述の実施形態１の細胞培養容器１と同様に、細胞シートＳの凝集を防止することができ、細胞シートＳを容器１０Ａ内の所定の位置に配置することができる。

（実施形態４）
以下、本発明の細胞培養容器の実施形態４について、図９Ａ及び図９Ｂを用いて説明する。図９Ａは、本実施形態の細胞培養容器１Ｃを示す断面図である。図９Ｂは、図９に示す細胞培養容器１Ｃの下面図である。なお、図９Ｂは、細胞培養容器１Ｃから封止部材１３を取り外した状態を示している。

本実施形態の細胞培養容器１Ｃは、上部が開放された培養皿３１と、培養皿３１の上部の開口部３１ａを閉塞する蓋部材３２とによって容器３０が構成されている点で、前述の実施形態１の細胞培養容器１と異なっている。本実施形態の細胞培養容器１Ｂの培地排出孔１２、封止部材１３、及び細胞培養領域Ａの構成は、実施形態１の細胞培養容器１と同様であるので、同様の部分には同一の符号を付して説明を省略する。

細胞培養容器１Ｃは、培地Ｍを収容する容器３０と、該容器３０の底部の細胞培養領域Ａとを備えている。容器３０は、上部が開放された培養皿３１と、培養皿３１の上部の開口部３１ａを閉塞する蓋部材３２とによって構成されている。培養皿３１及び蓋部材３２は、例えば、実施形態１の細胞培養容器１の容器１０と同様の材料によって製作されている。細胞培養容器１Ｃは、培養皿３１の底部の細胞培養領域Ａの周囲に配置された複数の培地排出孔１２と、該培地排出孔１２を開口可能に密閉する封止部材１３とを備えている。細胞培養容器１Ｃは、個々の培地排出孔１２を密閉する複数の封止部材１３を備えてもよいし、複数の培地排出孔１２を一括して密閉する１以上の封止部材１３を備えてもよい。複数の培地排出孔１２は、細胞培養領域Ａの周囲にその中心線Ｃ１，Ｃ２に線対称に配置されていてもよい。

本実施形態の細胞培養容器１Ｃによれば、細胞シートＳを細胞培養領域Ａから剥離させた状態で培地Ｍを排出する際に、容器３０の培養皿３１の底部に設けられ、細胞培養領域Ａの周囲に配置された複数の培地排出孔１２を開口させることができる。したがって、本実施形態の細胞培養容器１Ｃによれば、蓋部材３２を取り外して培養皿３１の比較的大きな開口部３１ａを開放することなく、前述の実施形態１の細胞培養容器１と同様に、細胞シートＳの凝集を防止しつつ培地Ｍを排出し、細胞シートＳを培養皿３１内の所定の位置に配置することができる。

以上、図面を用いて本発明の実施の形態を詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲における設計変更等があっても、それらは本発明に含まれるものである。例えば、前述の実施形態では、主に動物細胞の培養に用いられる細胞培養容器について説明したが、本発明の細胞培養容器は、動物細胞の培養に限られず、植物細胞の培養に適用することも可能である。

１，１Ａ〜１Ｃ 細胞培養容器
１０，１０Ａ〜１０Ｃ，３０ 容器
１０ａ 気体収容部
１０ｂ 底壁
１０ｄ 培地収容部
１０ｓ 側壁
１２，１２ａ，１２ｂ，１２Ａ〜１２Ｄ 培地排出孔
１３，１３Ａ〜１３Ｄ 封止部材
１４ 切取線
１５ スライド溝
Ａ 細胞培養領域
Ｃ，Ｃ１，Ｃ２ 中心線
Ｍ 培地
Ｐ 温度応答性ポリマー
Ｔ 容器の厚さ
ｔ 封止部材の厚さ

Claims (9)

1. 培地を収容する容器を備え、該容器の底部に細胞培養領域を有する細胞培養容器であって、
   前記容器の前記底部に設けられ前記細胞培養領域の周囲に配置された複数の培地排出孔と、該培地排出孔を開口可能に密閉する封止部材とを備え、
   前記容器は、前記培地を収容する培地収容部と、気体を収容する気体収容部とを有し、
   前記培地排出孔は、前記容器の底壁に設けられて前記培地収容部に設けられており、
   前記底壁は、前記容器の側壁の下端に剥離可能に接合されたフィルム部材であり、
   前記フィルム部材は、分断可能な切取線を有していることを特徴とする細胞培養容器。
2. 前記複数の培地排出孔は、前記細胞培養領域の周囲に該細胞培養領域の中心線に線対称に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
3. 前記細胞培養領域に温度応答性ポリマーを備えることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の細胞培養容器。
4. 前記封止部材の厚さは、前記容器の厚さよりも薄いこと特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
5. 培地を収容する容器を備え、該容器の底部に細胞培養領域を有する細胞培養容器であって、
   前記容器の前記底部に設けられ前記細胞培養領域の周囲に配置された複数の培地排出孔と、該培地排出孔を開口可能に密閉する封止部材とを備え、
   前記封止部材は、前記容器に貼着された自己吸着性シートであることを特徴とする細胞培養容器。
6. 前記培地排出孔は、楕円孔又は丸長孔であることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
7. 培地を収容する容器を備え、該容器の底部に細胞培養領域を有する細胞培養容器であって、
   前記容器の前記底部に設けられ前記細胞培養領域の周囲に配置された複数の培地排出孔と、該培地排出孔を開口可能に密閉する封止部材とを備え、
   前記封止部材は、前記容器に設けられ前記容器の外部の圧力を低下させることで開放可能な圧力弁であることを特徴とする細胞培養容器。
8. 培地を収容する容器を備え、該容器の底部に細胞培養領域を有する細胞培養容器であって、
   前記容器の前記底部に設けられ前記細胞培養領域の周囲に配置された複数の培地排出孔と、該培地排出孔を開口可能に密閉する封止部材とを備え、
   前記封止部材は、弾性を有し、前記培地排出孔を開口させた状態で前記培地排出孔に挿入される部分の外径が前記培地排出孔の内径よりも大きいことを特徴とする細胞培養容器。
9. 培地を収容する容器を備え、該容器の底部に細胞培養領域を有する細胞培養容器であって、
   前記容器の前記底部に設けられ前記細胞培養領域の周囲に配置された複数の培地排出孔と、該培地排出孔を開口可能に密閉する封止部材とを備え、
   前記封止部材は、前記容器に設けられたスライド溝によってスライド可能に保持され、前記培地排出孔を閉塞する閉塞位置と前記培地排出孔を開口させる開口位置との間でスライド可能に設けられていることを特徴とする細胞培養容器。

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