WO2023144933A1 - 細胞培養容器 - Google Patents

Abstract

閉鎖系で灌流培養を行う場合の不都合を改善するのに適した細胞培養容器を提供する。　第１方向一方側ｘ１端に開口１１０を有し、且つ第１方向他方側ｘ２端を塞ぐ容器底部１４を有する有底筒状の容器体１と、開口１１０を塞いで容器体１の内側空間を密閉する閉塞体２と、を備える。閉塞体２は、フィルター押え２２と、フィルター押え２２に対して第１方向他方側ｘ２に配置された膜フィルター２３と、を有する。膜フィルター２３と容器底部１４とに挟まれた第１閉鎖エリアＳ１、およびフィルター押え２２と膜フィルター２３とに挟まれた第２閉鎖エリアＳ２が形成されている。閉塞体２は、第１流路２１１および第２流路２２３を有し、第１流路２１１は、一方側端が外部に通じ、且つ他方側端が第１閉鎖エリアＳ１に通じており、第２流路２２３は、一方側端が外部に通じ、且つ他方側端が第２閉鎖エリアＳ２に通じている。

Description

細胞培養容器

　本開示は、細胞を培養するための細胞培養容器に関し、特に、自動的に一定の低速度で常時培養液を供給し、同時に同量の培養液を排出する灌流培養に用いる細胞培養容器に関する。

　細胞の培養に際しては、例えばディッシュ（シャーレ）、ウェルプレート、フラスコなどの培養容器が広く用いられている。ディッシュやウェルプレートは蓋があっても載せるだけで隙間があり、密閉できなかった。フラスコの場合は密閉可能だが、これら従来の培養容器はいずれも培養液の交換等の作業に蓋の開閉が必要であった。そのため、これらの培養容器は、研究を目的にした細胞培養用途には汎用性が高いが、医療を目的にした細胞培養用途には、コンタミネーションのリスク、専門技術を持つ人材やコストの問題、培養細胞の品質均一化が難しいという問題があった。

　昨今、これらの問題を解決するべく様々な自動培養装置が開発されている（例えば、特許文献１を参照）。自動培養装置に用いられる培養容器において、例えば一対のポートが設けられている。これらポートは、例えば培養容器の蓋に設けられ、それぞれ蓋から下方に延びて培養容器の内部に配置される。細胞培養を行う際には、一方のポートを通じて新しい培養液が培養容器に供給され、かつ他方のポートを通じて培養容器内部の培養液が外部に排出される。一方のポートから培養液を供給し他方のポートから排出をするには、それぞれのポートに適したポンプを接続すればよく、その場合容器内に培養液と気体の層があっても液は流れる。しかしながら、一方のポートから供給する培養液と他方のポートから排出する培養液の量が正確に一致しなければ、培養が長期間に及んだ場合には容器内の液が枯渇または溢れることになり、これを回避するために水位センサーなどを用いた場合には装置が大掛かりになる。

　このような不都合を回避するために、１つの容器に対してポンプを１つにした上で、一方のポートから陽圧で培養液を供給し他方のポートからオーバーフローさせて排出するか、片側のポートから培養液を陰圧で排出しもう一方のポートから培養液を引き込むシンプルな方法が有効になる。容器内の培養エリアに培養液を満液化させ、自動的に一定の低速度で常時培養液を供給し、同時に同量の培養液を排出する灌流培養である。この灌流培養においては、スムーズな液流を実現するために、閉鎖系であることと、培養容器の培養エリアに気体の層や気泡を作らないことが重要となるが、閉鎖系の培養容器内部を培養液で満たそうとしても、容器内部に少量の空気（気泡）が残存する場合がある。例えばポートが蓋から下方に延びて容器内部に配置されていると、容器内部に残存する空気を外部に排出することができなかった。さらに、灌流培養の課題として、対象の細胞が容器の底面を足場にして増殖する接着細胞であれば問題ないが、浮遊系の細胞であった場合に当該排出液ととともに流失するおそれがあった。

特開２０１７－７９６３３号公報

　本開示は、このような事情のもとで考え出されたものであって、閉鎖系で灌流培養を行う場合の不都合を改善するのに適した細胞培養容器を提供することを主たる課題とする。

　上記の課題を解決するため、本開示では、次の技術的手段を採用した。

　本開示によって提供される細胞培養容器は、第１方向の一方側端に開口を有し、且つ前記第１方向の他方側端を塞ぐ容器底部を有する有底筒状の容器体と、前記開口を塞いで前記容器体の内側空間を密閉する閉塞体と、を備え、前記閉塞体は、外部と前記容器体の内側空間とを隔てる第１天井部と、前記第１天井部に対して前記第１方向の他方側に配置され、液体が通過可能な膜フィルターと、を有し、前記膜フィルターと前記容器底部とに挟まれた第１閉鎖エリア、および前記第１天井部と前記膜フィルターとに挟まれた第２閉鎖エリアが形成されており、前記閉塞体は、少なくとも１つずつの第１流路および第２流路を有し、前記第１流路は、一方側端が外部に通じ、且つ他方側端が前記第１閉鎖エリアに通じており、前記第２流路は、一方側端が外部に通じ、且つ他方側端が前記第２閉鎖エリアに通じている。

　好ましい実施の形態においては、前記第１天井部には、前記第１方向の一方側に凹む天井凹部が形成されており、前記天井凹部は、前記第２流路につながっている。

　好ましい実施の形態においては、前記閉塞体は、外部と前記容器体の内側空間とを隔てる第２天井部と、前記第２天井部から前記第１方向の他方側に離間して配置され、ガス透過性を有するガス透過膜と、を有し、前記第２天井部と前記ガス透過膜とに挟まれた第３閉鎖エリアが形成され、且つ前記ガス透過膜は、前記第１閉鎖エリアと前記第３閉鎖エリアを区画しており、前記閉塞体は、複数の第３流路を有し、前記第３流路は、一方側端が外部に通じ、且つ他方側端が前記第３閉鎖エリアに通じている。

　好ましい実施の形態においては、前記容器体は、前記第１方向に延び、且つ前記開口を有する第１筒状部を含み、前記容器体および前記閉塞体の間に介在する環状のシール部材と、環状の頂板部、および前記頂板部の外周縁から前記第１方向の他方側に延び、且つ前記第１筒状部に外嵌される第２筒状部、を有する外蓋と、をさらに備え、前記容器体および前記外蓋の少なくともいずれか一方には、前記閉塞体に前記頂板部が当接する状態で前記第１筒状部と前記第２筒状部との相対移動を阻止する係止手段が設けられている。

　好ましい実施の形態においては、前記容器底部は、前記第１方向の一方側を向く第１底面を有し、前記第１底面には、複数の凹部が設けられており、前記複数の凹部は、前記第１底面の面内方向に沿って稠密に配列されている。

　本開示のその他の特徴および利点は、添付図面を参照して以下に行う詳細な説明によって、より明らかとなろう。

本開示の第１実施形態に係る細胞培養容器を示す斜視図である。 図１に示す細胞培養容器の平面図である。 図２のＩＩＩ－ＩＩＩ線に沿う断面図である。 図２のＩＶ－ＩＶ線に沿う断面図である。 図２のＶ－Ｖ線に沿う断面図である。 本開示の第１実施形態に係る細胞培養容器の使用状態を示す、図３と同様の断面図である。 本開示の第１実施形態に係る細胞培養容器の使用状態を示す、図３と同様の断面図である。 第１実施形態の変形例に係る細胞培養容器を示す、図３と同様の断面図である。 容器底部の第１底面に形成された複数の凹部の配列状態を示し、第１方向に見た図である。

　以下、本開示の好ましい実施の形態を図面を参照しつつ具体的に説明する。

　本開示における「第１」、「第２」、「第３」等の用語は、単にラベルとして用いたものであり、必ずしもそれらの対象物に順列を付することを意図していない。

＜第１実施形態＞
　図１～図５は、本開示の第１実施形態に係る細胞培養容器を示している。本実施形態の細胞培養容器Ａ１は、容器体１、閉塞体２、シール部材３および外蓋４を備えている。図１は、細胞培養容器Ａ１の斜視図である。図２は、細胞培養容器Ａ１の平面図である。図３は、図２のＩＩＩ－ＩＩＩ線に沿う断面図である。図４は、図２のＩＶ－ＩＶ線に沿う断面図である。図５は、図２のＶ－Ｖ線に沿う断面図である。

　図３～図５に示すように、本実施形態において、容器体１は、第１筒状部１１、連絡部１２、円筒部１３および容器底部１４を備える。第１筒状部１１は、上下方向（第１方向ｘ）に延びている。容器体１は、第１筒状部１１の第１方向ｘの一方側端（以下、適宜「第１方向一方側ｘ１端」という。）である上端１１２に開口１１０を有する容器状とされている。第１筒状部１１は、概略円筒状とされており、第１筒状部１１の外周面には、雄ネジ１１１が形成されている。連絡部１２は、第１筒状部１１の第１方向ｘの他方側端（以下、適宜「第１方向他方側ｘ２端」という。）につながり、径方向内側に突出する環状部分である。円筒部１３は、連絡部１２の径方向内側につながり、第１方向ｘに延びている。

　円筒部１３の第１方向一方側ｘ１端は、第１筒状部１１の第１方向一方側ｘ１端よりも第１方向他方側ｘ２に位置し、円筒部１３の第１方向他方側ｘ２端は、第１筒状部１１の第１方向他方側ｘ２端よりも第１方向他方側ｘ２に位置する。連絡部１２の第１方向一方側ｘ１を向く面は、凹溝１２１の一部を構成している。当該凹溝１２１は、連絡部１２の第１方向一方側ｘ１を向く面と、これにつながる第１筒状部１１の内周面および円筒部１３の外周面とにより構成された環状溝であり、シール部材３を配置するための部位である。

　容器底部１４は、円筒部１３の下端（第１方向他方側ｘ２端）につながり、円筒部１３の内側を塞いでいる。本実施形態において、円筒部１３の下端の適所には、延出片１３１が設けられている。延出片１３１は、円筒部１３につながって径方向外方に延びる部分である。

　容器体１は、例えば半透明または透明のプラスチック材料により形成されている。当該プラスチック材料としては、例えばポリスチレンのほか、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマーなどの、好適には透明性を有する材料が用いられるが、これらに限定されない。

　なお、容器底部１４は、平板状であり、第１底面１４ａを有する。第１底面１４ａは、第１方向一方側ｘ１を向いており、細胞を培養するための平坦な細胞培養面である。この細胞培養面（容器底部１４の第１底面１４ａ）には、必要に応じて細胞接着性を向上させるための表面処理が適宜施される。当該表面処理としては、例えばコロナ放電処理、プラズマ処理などの親水化処理を挙げることができる。

　閉塞体２は、容器体１の開口１１０を閉塞し、容器体１の内側空間を密閉するためのものである。図３～図５に示すように、閉塞体２は、第１環状板部２１、フィルター押え２２、膜フィルター２３、膨出部２４およびガス透過膜２５を含んで構成される。

　第１環状板部２１は、第１方向ｘに見て環状をなしており、本実施形態では略円環状の板状部分を含んで構成される。第１環状板部２１は、第１流路２１１、排出用円筒部２１２および内側係止部２１３を有する。排出用円筒部２１２は、第１方向一方側ｘ１に延びる円筒状であり、フィルター押え２２を配置するための部位である。内側係止部２１３は、排出用円筒部２１２の下端（第１方向他方側ｘ２端）から径方向内側に突出する環状突部である。第１流路２１１については後述する。

　フィルター押え２２は、膜フィルター２３を挟む部材であり、排出用円筒部２１２に嵌入されている。フィルター押え２２は、円筒部２２１、天井凹部２２２および第２流路２２３を有する。円筒部２２１は、排出用円筒部２１２の内側に嵌っている。天井凹部２２２は、円筒部２２１につながり、円筒部２２１の内側を塞いでいる。天井凹部２２２は、第１方向一方側ｘ１に凹んでいる。第１環状板部２１およびフィルター押え２２（円筒部２２１）は、膜フィルター２３を第１方向ｘの両側から挟んでいる。詳細な図示説明は省略するが、円筒部２２１と排出用円筒部２１２との間には、Ｏリングが介在している。これにより、第１環状板部２１とフィルター押え２２との嵌合部は密閉されており、フィルター押え２２（天井凹部２２２）よりも第１方向他方側ｘ２の空間は、外部と隔てられている。第２流路２２３については後述する。

　膜フィルター２３は、液体が通過可能な液通過性の膜体である。膜フィルター２３は、例えば培養液などの液体が通過可能である。また、空気などの気体も膜フィルター２３を通過可能である。その一方、培養細胞などの液体以外の内容物は、膜フィルター２３を通過することができずに捕捉される。膜フィルター２３は、フィルター押え２２に対して第１方向他方側ｘ２に配置されている。この膜フィルター２３が設けられることで、細胞培養容器Ａ１の内部においては、互いに区画された第１閉鎖エリアＳ１および第２閉鎖エリアＳ２が形成される。第１閉鎖エリアＳ１は、膜フィルター２３と容器底部１４とに挟まれている。第２閉鎖エリアＳ２は、フィルター押え２２と膜フィルター２３とに挟まれている。膜フィルター２３の構成材料は特に限定されず、例えばＰＥＴ（ポリエステル）、あるいはＰＣ（ポリカーボネート）製の親水化フィルターなどが挙げられる。なお、上記のフィルター押え２２は、「第１天井部」の一例に相当する。

　膨出部２４は、第１環状板部２１の内周縁につながっている。膨出部２４は、第１方向ｘに見て第１環状板部２１の内側を塞いでいる。また、膨出部２４は、第１環状板部２１に対して第１方向一方側ｘ１に張り出している。膨出部２４は、複数の第３流路２４１を有する。第３流路２４１については後述する。

　ガス透過膜２５は、ガス透過性を有する薄状膜である。その一方、ガス透過膜２５は、液体は通過することができず、液非透過性である。ガス透過膜２５は、第１環状板部２１に取り付けられている。具体的には、ガス透過膜２５は、第１環状板部２１の下面（第１方向他方側ｘ２を向く面）に例えば接着等の適宜手段により密着状態で固定される。このガス透過膜２５が設けられることで、細胞培養容器Ａ１の内部においては、第１閉鎖エリアＳ１と区画された第３閉鎖エリアＳ３が形成される。第３閉鎖エリアＳ３は、膨出部２４とガス透過膜２５とに挟まれている。第１閉鎖エリアＳ１は、ガス透過膜２５と容器底部１４とに挟まれている。ガス透過膜２５の構成材料は特に限定されず、例えばＰＥＴ（ポリエステル）、あるいはＰＣ（ポリカーボネート）製の疎水性フィルターなどが挙げられる。なお、上記の膨出部２４は、「第２天井部」の一例に相当する。

　シール部材３は、容器体１および閉塞体２の間に介在し、容器体１の内側空間を外部と遮断するものである。シール部材３は、環状をなしており、第１方向ｘにおいて容器体１の円筒部１３と閉塞体２の第１環状板部２１との間に挟まれている。また、シール部材３の一部は、凹溝１２１に配置される。

　シール部材３は、可撓性、弾力性を有する軟質素材からなる。シール部材３を構成する素材としては、例えば、シリコーンゴム、エラストマー樹脂などが挙げられる。詳細は後述するが、シール部材３と内容物（例えば培養液）との接触を考慮すると、シール部材３の素材としては、細胞毒性が無く、かつ生体適合性を有する医療用シリコーンゴムがより好ましい。また、シール部材３の硬さについては、例えばゴム硬度が２０度～４０度程度であるのが好ましい。

　外蓋４は、頂板部４１および第２筒状部４２を有する。頂板部４１は、概略円環状とされており、シール部材３を第１環状板部２１（閉塞体２）と円筒部１３（容器体１）との間に挟み付ける部分である。頂板部４１の径方向内側には、貫通孔４１１が形成されている。貫通孔４１１は、頂板部４１の厚さ方向（第１方向ｘ）に見て当該頂板部４１に囲まれている。

　第２筒状部４２は、頂板部４１の外周縁から当該頂板部４１の厚さ方向（図中上下方向である第１方向ｘ）に延びており、概略円筒状とされている。第２筒状部４２の内周面には、雌ネジ４２１が形成されており、当該雌ネジ４２１は、容器体１（第１筒状部１１）の雄ネジ１１１に螺合可能である。

　外蓋４は、例えば不透明、半透明または透明のプラスチック材料により形成されている。当該プラスチック材料としては、例えばポリエチレン、ポリプロピレンのほか、ポリスチレン、ポリカーボネートなどが用いられるが、これらに限定されない。

　第１流路２１１、第２流路２２３および複数の第３流路２４１は、外部と細胞培養容器Ａ１の内部空間とに通じる筒状の連通路である。図３に示すように、第１流路２１１は、一方側端（第１方向一方側ｘ１端）が外部に通じ、他方側端（第１方向他方側ｘ２端）が第１閉鎖エリアＳ１に通じる。第２流路２２３は、一方側端（第１方向一方側ｘ１端）が外部に通じ、他方側端（第１方向他方側ｘ２端）が第２閉鎖エリアＳ２に通じる。第２閉鎖エリアＳ２を規定するフィルター押え２２の天井凹部２２２は、第２流路２２３につながっている。図５に示すように、複数の第３流路２４１は、各々、一方側端（第１方向一方側ｘ１端）が外部に通じ、他方側端（第１方向他方側ｘ２端）が第３閉鎖エリアＳ３に通じる。

　次に、細胞培養容器Ａ１の使用方法および作用について、図６、図７を参照しつつ説明する。

　細胞培養容器Ａ１は、容器内に培養液を供給し、同時に同量の培養液を容器外に排出する灌流培養に使用される。なお、細胞培養容器Ａ１に収容される培養細胞や培養液については、特に限定されるものではない。

　細胞培養容器Ａ１を用いた細胞培養では、あらかじめ、容器体１、閉塞体２、シール部材３および外蓋４をアセンブリしておく。次に、第１流路２１１および第２流路２２３を介して細胞培養容器Ａ１に培養液の供給および空気の排出を行い、容器体１の内側空間（第１閉鎖エリアＳ１）を培養液で満たす。ここで、図６に示すように第１流路２１１および第２流路２２３には、それぞれチューブ８が接続される。第１流路２１１の一方側端（第１方向一方側ｘ１端）には、チューブ８を介して灌流用ポンプ（図示略）が接続され、第２流路２２３の一方側端（第１方向一方側ｘ１端）には、チューブ８を介して排液用容器（図示略）が接続される。なお、第１閉鎖エリアＳ１を培養液で満たす前に、培養液とともに培養細胞を第１閉鎖エリアＳ１に供給する。

　第１流路２１１の他方側端（第１方向他方側ｘ２端）は、第１閉鎖エリアＳ１に通じている。これにより、第１閉鎖エリアＳ１は、第１流路２１１を介して供給される培養液で満たされる。また、第１流路２１１を介して供給される培養細胞も第１流路２１１に流れ込む。第１閉鎖エリアＳ１にある空気は、気体が通過可能な膜フィルター２３を通過し、第２閉鎖エリアＳ２を経て第２流路２２３から外部に排出される。灌流培養を行う際には、第１流路２１１を通じて新しい培養液Ｃが第１閉鎖エリアＳ１に供給される。第１閉鎖エリアＳ１にある培養液Ｃは、膜フィルター２３を通過して第２閉鎖エリアＳ２に流れ込む。そして、第２閉鎖エリアＳ２にある培養液Ｃは、第２流路２２３を通じて外部に排出される。灌流培養工程においては、細胞培養容器Ａ１内（第１閉鎖エリアＳ１および第２閉鎖エリアＳ２）の培養液Ｃを僅かずつ入れ替え続ける。

　細胞培養容器Ａ１において、閉塞体２は、膜フィルター２３を有する。この膜フィルター２３は、細胞培養容器Ａ１の内部を第１閉鎖エリアＳ１および第２閉鎖エリアＳ２に区画している。上述のように、第１流路２１１から細胞培養容器Ａ１内（第１閉鎖エリアＳ１）に供給される培養液Ｃは、膜フィルター２３を通過し、第２閉鎖エリアＳ２、第２流路２２３を経て外部に排出される。一方、灌流スピードは極めてゆっくりしたものなので、培養細胞が自重に逆らい浮遊して天井凹部２２２側に設けられた膜フィルター２３に吸い寄せられることは殆どない。培養液Ｃ中にある培養細胞は、万一膜フィルター２３に到達した場合でも膜フィルター２３を通過することができない。これにより、第１閉鎖エリアＳ１において培養細胞が培養液Ｃ中に浮遊しても、培養液Ｃ中の培養細胞が第２流路２２３から不当に排出されることは防止される。

　細胞培養容器Ａ１の第１閉鎖エリアＳ１に少量の空気が残存する場合がある。膜フィルター２３の上側（第１方向一方側ｘ１）に位置する第２閉鎖エリアＳ２を形成するフィルター押え２２には、第１方向一方側ｘ１に凹む天井凹部２２２が形成されており、当該天井凹部２２２は第２流路２２３につながっている。このような構成によれば、第２流路２２３が上位に位置するように細胞培養容器Ａ１を傾けると、第１閉鎖エリアＳ１内の気泡は、膜フィルター２３を通過して第２閉鎖エリアＳ２に移動する。この状態で灌流用ポンプを作動させることにより、第２閉鎖エリアＳ２に残存する気泡は天井凹部２２２を通じて第２流路２２３内に移動し、細胞培養容器Ａ１の外部に排出することができる。

　閉塞体２は、膨出部２４およびガス透過膜２５を含む。細胞培養容器Ａ１においては、膨出部２４とガス透過膜２５とに挟まれた第３閉鎖エリアＳ３が形成されており、ガス透過膜２５は、第１閉鎖エリアＳ１と第３閉鎖エリアＳ３を区画している。膨出部２４（閉塞体２）は、複数の第３流路２４１を有する。各第３流路２４１は、一方側端（第１方向一方側ｘ１端）が外部に通じ、他方側端（第１方向他方側ｘ２端）が第３閉鎖エリアＳ３に通じる。このような構成によれば、必要に応じて、複数の第３流路２４１１を通じて所定のガスを膨出部２４に供給し、且つ排出することで、第３閉鎖エリアＳ３を所定のガス雰囲気に維持することができる。そして、第１閉鎖エリアＳ１の内容物（培養液Ｃおよび培養細胞）については、ガス透過膜２５を介して第３閉鎖エリアＳ３との通気状態が維持され、第３閉鎖エリアＳ３のガスを取り込むことが可能である。さらに、第３流路２４１に供給するガス種を変更することで、第３閉鎖エリアＳ３のガス雰囲気を、容易、且つ迅速に変更することができる。例えばＣＯ₂インキュベータ等を用いて所定のガス雰囲気状態を作る場合と比べて、簡単な構成で所望のガス雰囲気の通気を行うことが可能である。

　細胞培養容器Ａ１は、容器体１および閉塞体２の他に、シール部材３および外蓋４を備えている。シール部材３は、容器体１と閉塞体２との間に介在している。容器体１の第１筒状部１１に外嵌される外蓋４の第２筒状部４２には、雌ネジ４２１が形成されている。当該雌ネジ４２１を容器体１（第１筒状部１１）の雄ネジ１１１に締め込むことで、シール部材３が容器体１における円筒部１３の上端と閉塞体２の第１環状板部２１とによって挟まれて、アセンブリ状態が維持される。これにより、容器体１に収容された内容物（培養細胞や培養液Ｃ）は液封されている。したがって、灌流培養工程において細胞培養容器Ａ１の閉鎖状態を維持したまま培養液灌流作業を行うことができ、コンタミネーションのリスクを回避することができる。その結果、細胞培養容器Ａ１によれば、培養液Ｃの状態を良好に保って、細胞の品質確保を実現することができる。なお、容器体１（第１筒状部１１）の雄ネジ１１１および外蓋４（第２筒状部４２）の雌ネジ４２１は、「係止手段」の一例に相当する。

　＜第１実施形態の変形例＞
　図８および図９は、第１実施形態の変形例に係る細胞培養容器を示している。図８は、上記実施形態において示した図３と同様の断面図である。なお、図８以降の図面において、上記実施形態の細胞培養容器Ａ１と同一または類似の要素には、上記実施形態と同一の符号を付しており、適宜説明を省略する。

　本変化例の細胞培養容器Ａ１１において、容器体１（容器底部１４）の第１底面１４ａには、複数の凹部１４１が形成されている。図９に示すように、複数の凹部１４１は、第１底面１４ａの面内方向に沿って稠密に配列されている。複数の凹部１４１は、培養細胞が三次元的に凝集し、スフェロイドが形成されやすくするための凹みである。

　本変形例の細胞培養容器Ａ１１において、閉塞体２は、膜フィルター２３を有する。この膜フィルター２３は、細胞培養容器Ａ１１の内部を第１閉鎖エリアＳ１および第２閉鎖エリアＳ２に区画している。第１流路２１１から細胞培養容器Ａ１１内（第１閉鎖エリアＳ１）に供給される培養液Ｃは、膜フィルター２３を通過し、第２閉鎖エリアＳ２、第１流路２１１を経て外部に排出される。一方、灌流スピードは極めてゆっくりしたものなので、培養細胞が自重に逆らい浮遊して天井凹部２２２側に設けられた膜フィルター２３に吸い寄せられることは殆どない。培養液Ｃ中にある培養細胞は、万一膜フィルター２３に到達した場合でも膜フィルター２３を通過することができない。これにより、第１閉鎖エリアＳ１において培養細胞が培養液Ｃ中に浮遊しても、培養液Ｃ中の培養細胞が第２流路２２３から不当に排出されることは防止される。

　本変形例では、容器体１（容器底部１４）の第１底面１４ａには複数の凹部１４１が設けられている。複数の凹部１４１を含む容器底部１４（第１底面１４ａ）には、スフェロイド形成に有利に働く細胞非接着コートを施してもよい。このような構成にすれば、細胞が三次元的に凝集し、スフェロイドが形成されやすい。本開示によれば、灌流の液中に気泡が残存しにくく、灌流スピードは極めてゆっくりしたものなのでスフェロイドが凹部１４１から不当に浮き上がりにくく、また、天井凹部２２２側に設けられた膜フィルター２３によってスフェロイドが排出されることもない。なお、形成されたスフェロイドを閉鎖的に回収する場合、第１流路２１１側から吸引することでスフェロイドの回収が可能である。その他にも、本変化例の細胞培養容器Ａ１１において、上記実施形態の細胞培養容器Ａ１と同様の作用効果を奏する。

　以上、本開示の具体的な実施形態を説明したが、本開示に係る細胞培養容器は、上記実施形態に限定されるものではない。本開示に係る細胞培養容器の各部の具体的な構成は、種々に設計変更自在である。

　Ａ１，Ａ１１，Ａ２：細胞培養容器、１：容器体、１１：第１筒状部、１１０：開口、１１１：雄ネジ（係止手段）、１１２：上端（第１筒状部の第１方向一方側端）、１２：連絡部、１２１：凹溝、１３：円筒部、１３１：延出片、１４：容器底部、１４ａ：第１底面、１４１：凹部、２：閉塞体、２１：第１環状板部、２１１：第１流路、２１２：排出用円筒部、２１３：内側係止部、２２：フィルター押え（第１天井部）、２２１：円筒部、２２２：天井凹部、２２３：第２流路、２３：膜フィルター、２４：膨出部（第２天井部）、２４１：第３流路、２５：ガス透過膜、３：シール部材、４：外蓋、４１：頂板部、４１１：貫通孔、４２：第２筒状部、４２１：雌ネジ（係止手段）、８：チューブ、Ｃ：培養液、Ｓ１：第１閉鎖エリア、Ｓ２：第２閉鎖エリア、Ｓ３：第３閉鎖エリア、ｘ：第１方向、ｘ１：第１方向一方側、ｘ２：第１方向他方側

Claims (5)

1. 　第１方向の一方側端に開口を有し、且つ前記第１方向の他方側端を塞ぐ容器底部を有する有底筒状の容器体と、
   　前記開口を塞いで前記容器体の内側空間を密閉する閉塞体と、を備え、
   　前記閉塞体は、外部と前記容器体の内側空間とを隔てる第１天井部と、前記第１天井部に対して前記第１方向の他方側に配置され、液体が通過可能な膜フィルターと、を有し、
   　前記膜フィルターと前記容器底部とに挟まれた第１閉鎖エリア、および前記第１天井部と前記膜フィルターとに挟まれた第２閉鎖エリアが形成されており、
   　前記閉塞体は、少なくとも１つずつの第１流路および第２流路を有し、
   　前記第１流路は、一方側端が外部に通じ、且つ他方側端が前記第１閉鎖エリアに通じており、
   　前記第２流路は、一方側端が外部に通じ、且つ他方側端が前記第２閉鎖エリアに通じている、細胞培養容器。
2. 　前記第１天井部には、前記第１方向の一方側に凹む天井凹部が形成されており、
   　前記天井凹部は、前記第２流路につながっている、請求項１に記載の細胞培養容器。
3. 　前記閉塞体は、外部と前記容器体の内側空間とを隔てる第２天井部と、前記第２天井部から前記第１方向の他方側に離間して配置され、ガス透過性を有するガス透過膜と、を有し、
   　前記第２天井部と前記ガス透過膜とに挟まれた第３閉鎖エリアが形成され、且つ前記ガス透過膜は、前記第１閉鎖エリアと前記第３閉鎖エリアを区画しており、
   　前記閉塞体は、複数の第３流路を有し、
   　前記第３流路は、一方側端が外部に通じ、且つ他方側端が前記第３閉鎖エリアに通じている、請求項１または２に記載の細胞培養容器。
4. 　前記容器体は、前記第１方向に延び、且つ前記開口を有する第１筒状部を含み、
   　前記容器体および前記閉塞体の間に介在する環状のシール部材と、
   　環状の頂板部、および前記頂板部の外周縁から前記第１方向の他方側に延び、且つ前記第１筒状部に外嵌される第２筒状部、を有する外蓋と、をさらに備え、
   　前記容器体および前記外蓋の少なくともいずれか一方には、前記閉塞体に前記頂板部が当接する状態で前記第１筒状部と前記第２筒状部との相対移動を阻止する係止手段が設けられている、請求項１ないし３のいずれかに記載の細胞培養容器。
5. 　前記容器底部は、前記第１方向の一方側を向く第１底面を有し、
   　前記第１底面には、複数の凹部が設けられており、
   　前記複数の凹部は、前記第１底面の面内方向に沿って稠密に配列されている、請求項１ないし４のいずれかに記載の細胞培養容器。

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