JPH04183388A - 細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は多孔質膜を用いた細胞培養方法に関する。

［従来の技術］ 近年モノクロナール抗体、インターフェロン、インター
ロイキン、ＴＰＡ等の生体由来の生理活性物質の医学、
産業分野での有用性が明らかとなってきている。それに
伴い、これらの有用物質を大量かつ安価に生産するため
の高密度細胞培養方法の必要性が増加している。

特にＫＮＡＺＥＫらによる中空糸膜面に細胞を付着させ
、中空糸の中空部に培地を循環させることによって、中
空糸膜面を介して細胞に栄養物を供給する方法（特開昭
４９−４１５７９号公報）は効率的に細胞を培養する方
法として注目されている。

この中空糸法の利点は、限られた空間内に大きな表面積
を確保することにより、付着性細胞に対して広い付着面
を供給できること、及び、中空糸膜の膜方向に開いた微
小な孔を通して、細胞の生存、増殖に必要な各種栄養物
、酸素などの供給や細胞の代謝により生成した老廃物の
除去を、拡散または中空糸膜内外に与えた圧力差により
生じる液体の流れに同伴して極めて容易に行えることに
ある。その結果、細胞の高密度培養が可能となリ、生産
物の濃度、生産性を高めることができる。

従来より、中空糸性細胞培養に、セルロースアセテート
製中空糸膜（特公昭５４−６６３４号公報）、ポリスル
ホン製中空糸膜（特開昭６２−１３０６７８号公報）な
どを使用した例がみられる。

また、強度特性に優れ、取扱も容易であるという点から
ポリエチレン、ポリプロピレンなとのポリオレフィンか
らなる多孔質膜を用いる方法（特開昭６３−１７６８５
号公報）が提案されている。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、従来の多孔質膜を用いる細胞培養法に利
用されてきた多孔質膜では、細胞の付着性、増殖性、生
存性等において必ずしも充分でない場合が多く、これら
の点に関する改良が望まれていた。

例えば、ポリスルホン中空糸膜は、セルロース系中空糸
膜に比較して細胞の付着性、増殖性および伸展性におい
て優れた特性を有しているが、現在一般に広く使用され
ているポリスチレン性デイツシュに較べると、細胞の付
着性、増殖性、生存性において満足のいくものではない
。

また、本発明者らの研究によれば、ポリオレフィン系多
孔質膜においても、細胞の付着性や増殖性等において必
ずしも充分でないことが明らかとなった。

本発明の目的は、ポリエチレン多孔質膜、ポリプロピレ
ン多孔質膜等のポリオレフィン系多孔質膜の利点を損な
うことな（、良好な細胞の増殖性、生存性、付着性細胞
を用いた場合の多孔質膜への細胞の付着性などが得られ
る高密度培養に好適な細胞培養方法を提供することにあ
る。

〔課題を解決するための手段１ 本発明の細胞培養法は、他の領域と多孔質膜により仕切
られた培養領域中で細胞を培養する方法において、前記
多孔質膜が、ポリオレフィン系多孔質膜の少なくとも一
部の表面にポリウレタンを保持させてなるものであるこ
とを特徴とする。

本発明に用いるポリオレフィン系多孔質膜としては、例
えばポリエチレン、ポリプロピレン及びポリ４−メチル
ペンテン−１などのポリオレフィンからなる、あるいは
これらポリオレフィンを主成分とする素材からなる多孔
質膜を挙げることができる。なお、このポリオレフィン
系多孔質膜は、その膜表面（外表面及び細孔内表面を含
む）の少なくとも一部が、例えば特開昭６２−９６４４
０号公報などに開示された方法に従って架橋重合された
ものであっても良い。

本発明で用いられる多孔質膜の孔径は、例えば培地、酸
素等の気体、生産物、排泄物等の移動させるべき物質の
充分な膜を介しての移動量が得られ、かつ細胞が漏れな
い程度の大きさであればよく、培養形態に応じて適宜選
択される。また、孔の形状は特に限定されない。

多孔質膜の孔径としては、例えば、分画粒子径が０．０
１〜５μｍ程度であることが好ましく、０．１〜４μｍ
程度であることがより好ましい。

多孔質膜が延伸法により多孔質化されたものである場合
は、この分画粒子径は節部とミクロフィブリルとでかこ
まれてなる細孔のフィブリル間のスリット径の平均値で
示される。

さらに、空孔率は、同様に培地等の充分な流れが得られ
、実用上充分な強度が保てる範囲でよく、具体的には１
０〜９０％であればよく、４０〜８０％であることが好
ましい。膜厚は同様に実用上充分な強度が保てる範囲で
よいが、およそ２０〜２００ｉＬｍ程度であることが好
ましい。

本発明に用いるポリ多孔質膜としては、中空糸状（中空
糸膜）、平膜、管状膜などの任意の形態のものを用いる
ことができる。

特に、延伸法により製造した中空糸膜は、中空糸膜の膜
面にミクロフィブリルと節部とによって形成されるスリ
ット状の微小空間（細孔）が３次元的に相互に連通した
細孔構造が形成されているため、空孔率が高く、これを
用いて付着性細胞の培養を行った場合においては、表面
に付着した細胞に対し、連通した細孔構造部を通して、
実質的に充分に均一に栄養物や酸素などを供給したり、
細胞生産物、代謝産物などを容易に除去でき、かつ、目
詰まりによる性能低下が少ないという点から好ましい。

なお、その製造は特公昭５６−５２１２３号公報、特開
昭５７−４２９１９号公報などに記載された方法に従っ
て行なうことができる。

なお、延伸法により製造したポリオレフィン系の中空糸
膜は、その組成にもよるが、一般的に比較的高い熱収縮
性を有し、両端を固定した状態で蒸気殺菌などの高温条
件下におくと熱収縮による切断を起すことがあるので、
そのような場合には予め加熱処理によって予め熱収縮さ
せたものを用いると良い、この加熱処理には、例えば特
開平ｌ−９９６１０号公報などに記載された方法等のよ
うな加圧熱水中で３０〜８０％の熱収縮を生じさせる条
件での処理が利用できる。

本発明においてポリオレフィン系中空糸膜の少なくとも
一部の表面に保持されるポリウレタンとしては種々のポ
リウレタンが利用でき、例えば、ポリエステルやポリエ
ーテルなどのポリヒドロキシ化合物に、ポリイソシアネ
ート化合物を反応させて得られるポリウレタン等を挙げ
ることができる。

ポリイソシアネート化合物と反応させるポリエステルと
しては、例えばヒマシ油に代表されるレジノール酸グリ
セライドなどのグリセリンカルボン酸エステル等のエス
テル類や、フタル酸、アジピン酸、二重化リルイン酸な
どの有機酸とエチレン、プロピレンからなるグリコール
やトリオールからなるポリエステルなどを挙げることが
できる。

ポリイソシアネート化合物と反応させるポリエーテルと
しては、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレ
ングリコール、グリセリン、トリメチロールプロパン、
ペンタエリスリトール、ソルビトール、ショ糖等の多価
アルコール類：エチレンジアミン、エタノールアミン、
芳香族ポリアミン等のアミン類に酸化エチレンをポリオ
キシエチレン状に付加させて得られるポリエーテルなど
を挙げることができる。

ポリイソシアネート化合物としては、芳香族系、脂肪族
系、ポリエーテル系等の種々のポリイソシアネート化合
物を用いることができ、例えばトリレンジイソシアネー
ト、４．４−ジフェニルメタンイソシアネート、ジフェ
ニルジイソシアネート、ナフタレンジイソシアネート、
キシレンジイソシアネート、ブタンジイソシアネート等
を挙げることができる。

ポリウレタンをポリオレフィン系多孔質膜の少なくとも
一部の表面に保持させる方法としては、種々の方法が利
用できるが、例えば、イソシアネート化合物とポリオー
ルを反応させて得たプレポリマーをポリエステル系硬化
剤とともに溶剤に溶解し、得られた溶液に多孔質膜を浸
漬させた後、溶剤を蒸発させる方法等を挙げることがで
きる。

このプレポリマーは、種々の方法で得られるが、例えば
、ポリオールに若干の水を添加し３５〜４０℃で加熱後
、イソシアネート化合物な加え、発熱反応させ、さらに
加熱して反応させた後、若干のイソシアネートをさらに
添加して得ることができる。また、ジフェニルメタンジ
イソシアネート系ポリウレタンプレポリマー（商品名：
コロネート　Ｃ−４４０３、日本ウレタン製）などの市
販品も利用できる。

ポリエステル系硬化剤としては、種々のポリエステルを
用いることができるが、末端基がヒドロキシル化合物を
多く有するヒドロキシポリエステルやヒマシ油もしくは
ヒマシ油誘導体などが用いられる。例えば、ポリエステ
ル系ヒマシ油誘導体（商品名：ニラポラン　４２３３、
日本ウレタン製）などを利用することができる。

多孔質膜の浸漬用溶液を調製するための溶剤としては、
クロロホルム、ＭＥＫ、ジメチルホルムアミド等を用い
ることができる。

浸漬用溶液中でのプレポリマーの濃度は、多孔質膜の種
類、保持させるポリウレタンの量等に応じて、また硬化
剤の量は配合するポリウレタンの量に応じて選択するこ
とができるが、均一に多孔質膜に浸漬する目的から５０
％以下の濃度が好ましい。

なお、本発明においてポリウレタンが保持される多孔質
膜の少なくとも一部の表面とは、細孔内表面および外表
面を含む膜表面の一部あるいは全部をいう。

すなわち、実質的にポリウレタンが保持されていればよ
く、必ずしも全ての表面にポリウレタンが保持されてい
る必要はない。また、ポリウレタンは少なくとも細胞が
付着する側の外表面に保持されていればよい。表面に保
持されるポリウレタンの量は多孔質膜の空孔率や細孔径
にも依存するが、多孔質膜の重量に対しておよそ１〜１
５０重量％、好ましくは５〜１２０％である。

また、「保持されてなる」とは保存中や使用中に容易に
脱離しない程度に膜表面に結合ないしは密着されている
ことをいう。

本発明で用いるポリオレフィン系多孔質膜においては、
ポリウレタンがその表面の少なくとも一部に保持されて
いることによって、細胞の増殖性、生存性、付着細胞を
用いた際の細胞の付着性及び伸展性などが向上したもの
となる。

なお、細胞の基材表面への付着性については、基材表面
の物理的な表面構造の他に、表面の親水性や疎水性の程
度及びそれらの分布状態等が複雑に関与しているといわ
れており、ポリウレタンをポリオレフィン系多孔質膜の
膜表面の少なくとも一部に保持させることにより、親水
性部分の割合が増加して細胞の付着性が向上し、その結
果細胞の増殖性、伸展性等が改善されるものと考えられ
る。

本発明の具体的態様は、培、養する細胞の種類、多孔質
膜を介して移動させる物質の種類などに応じて適宜選択
される。

本発明によれば、例えばアフリカミドリザル腎細胞（Ｖ
ｅｒｏ細胞）、上皮細胞（９４０Ｃ３）、マウス繊維芽
細胞（３Ｔ３）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｃ
Ｈ○）、チャイニーズハムスター肺繊維芽細胞（Ｖ−７
９）、子宮頚部癌細胞（Ｈｅｌａ）、ヒト胎児肺由来正
常２倍体細胞（ＷＩ−３８）などの付着性細胞や、例え
ばリンパ球細胞、骨髄腫細胞、白血球細胞など、および
、これらと他の細胞との細胞融合によって得られる雑種
細胞（ハイブリトーマ）等の浮遊性細胞などの種々の細
胞の効率よい培養を行なうことができる。

なお、本発明で用いる多孔質膜においては、付着性細胞
を用いた場合に良好な細胞の付着性及び伸展性が得られ
、効率良い培養を行うことができる。

本発明に用いる培地は、培養する細胞に応じて適宜選択
すればよく、例えば、無機塩類、アミノ酸類、糖類、脂
肪酸類、ビタミン類、補酵素類、核酸塩基類、ホルモン
類、アルブミン、トランスフェリン、その他の種々の細
胞の成長因子、血清中の成分などから選択した必要成分
の水溶液などが用いられる。

本発明の方法の具体的な態様としては、例えば以下のも
のを挙げることができる。

１）第１図に示すように、細胞添加口３を有する培養領
域６と培地人口４および出口５を有する領域７とを多孔
質膜２で仕切った培養器を用意し、領域６．７中に液体
培地を満たした状態で、細胞添加口３から必要数の細胞
を添加し、培養領域６中の培地の温度を所定の温度に調
節して培養を行なう。その際、培地人口４から培地を流
入させ、また培地出口５から培養液を流出させて、領域
７内を流通させる。なお、培地出口５から流出した培地
は培地人口４にもどして、領域７内を循環するようにし
てもよい。培地中の細胞の成育、維持に必要な栄養物や
酸素などの物質は領域７内から多孔質膜２を介して領域
６内に供給され、細胞の増殖に利用される。また、領域
６中に細胞の増殖にともなって生じた生産物、老廃物な
どが膜壁を通して領域７中に排出され、効率よい培養を
行なうことができる。

２）第２図に示すように、細胞添加口３および培地出口
５を有する培養領域６と培地人口４を有する領域を多孔
質膜２で仕切った培養器を用意し、領域６．７に液体培
地を満たした状態で、細胞添加口３から細胞の必要数を
添加し、培養領域中の培地の温度を所定の温度に調節し
て培養を行なう。その際、培地人口４から培地を領域７
に流入させ、培地出口５から流出させる。培地出口５に
は、必要に応じて細胞の流出を除くためのフィルターな
どを設けてもよい。また、培地出口５から流した培地は
、培地人口４へ返送して培養器１内を循環するようにし
てもよい。

多孔質膜として中空糸膜を用いる場合には、例えば中空
糸膜の中空部と連通ずる領域と、中空糸膜外表面と接す
る領域とを形成し、これら２つの領域を第１図および第
２図に示した領域６．７として利用する。

中空糸膜な用い、中空糸膜外表面に接する領域を培養領
域として利用する場合の一例を以下に示す。

第３図は側部導管１２．１３と連通し、中空糸膜９の外
表面と接する領域と、中空糸膜９の中空部と連通し、端
部導管１０．１１と接続された領域とが液密に仕切られ
た構成を有する培養器の断面図である。

この培養器の中空糸の中空部につながる領域に連通した
端部導管１０．１１は栄養物や酸素の供給、老廃物の除
去用に用い得るものである。

また、側部導管１２．１３は培養開始時の細胞の導入口
として利用できるものであり、培養が長時間行なわれて
細胞濃度が高まった時はここから老廃物や死亡した細胞
を含有する培地を抜くことができる。

第４図は、第３図に示した細胞培養器を組み込んだ細胞
培養装置であり、培地貯槽１６より細胞培養器８へ培地
をポンプ１５により循環させる回路を形成したものであ
る。

以上、多孔質膜により仕切られた２つの領域を利用する
場合について述べたが、培養領域と多孔質膜で仕切られ
る領域の２以上を設け、培地成分や酸素などの気体等を
分割して供給したり、培養液の供給を行なう領域と、生
産物や老廃物を除去するための領域とを分割してもよい
。

また、培養領域も２以上設けてもよい。

［実施例］ 以下、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこ
れらの実施例で限定されるものではない。

なお、実施例においては多孔質膜としていずれも延伸法
によって得られるミクロフィブリルと節部とで形成され
るスリット状の空間（空孔）が３次元的に連通した多孔
質膜を用い、該多孔質膜の孔径は該スリット状空間の幅
の平均値と長さの平均値とで表現した。

実施例１ ポリエチレン多孔質中空糸膜（スリット状細孔の幅０．
８μｍ、長さ２．２μｍ、空孔率７０％、膜厚５５μｍ
、内径２７０μｍ）を１２１℃、１．２ｋｇ／ｃｍ２の
加圧熱水中に５時間放置して５２％の熱収縮を起させた
。

この熱収縮処理した中空糸膜を、ジフェニルメタンジイ
ソシアネート系ポリウレタンプレポリマーであるコロネ
ート　Ｃ−４４０３（商品名、日本ポリウレタン製）及
びポリエステル系とマシ油誘導体であるニラポラン　４
２２３　（商品名、日本ポリウレタン製）をそれぞれ５
％づつ含むクロロホルム溶液に１０分間浸漬した後、室
温下で１昼夜風乾してクロロホルムを揮散させて、ポリ
エチレン多孔質中空糸膜の表面にポリウレタンを保持さ
せた。このようにして得られた多孔質中空糸膜は、ポリ
ウレタンが中空糸膜重量に対して１０％保持されていた
。

この多孔質中空糸１５０本を集束してポリカーホネート
製円筒容器（内径８ｍｍＸ有効長１５０ｍｍ）に充填し
、各中空糸膜の両端部の開口状態を保持するように、ウ
レタン樹脂で両端を固定して、第３図に示すような細胞
培養器８を作成した。

この細胞培養器を７０％エタノール水溶液で湿潤化し、
蒸留水により充分に洗浄後、シリコンチューブを用いて
第４図に示すような細胞培養器　′置回路を組み立てた
。

この培地貯槽１６に、炭酸水素ナトリウム及びＬ−グル
タミンを除く他の所定のイーグルＭＥＭ培地成分を含む
溶液（日水製薬製）を８５０ｍβ入れ、培養装置回路内
にチューブポンプ１５により培地を充填後、オートクレ
ーブにより１２１０Ｃ１３０分の殺菌処理を行った。

殺菌処理終了後、牛胎児血清溶液の１００ｍＪ２と、Ｌ
−グルタミン０．２６ｇを水２５ｍρに溶解して濾過滅
菌した水溶液と、炭酸水素ナトｌ）ラム２ｇを水２５ｍ
βに溶解して濾過滅菌した水溶液とをクリーンベンチ内
で培地貯槽１６内に添加して混合後、再びチューブポン
プ１５により培地を培養装置回路内に循環させた。

次に、細胞培養装置８の中空糸膜の外表面と接する領域
に、Ｈｅ１ａ細胞（５Ｘ１０’個）を第３図の側部導管
１２．１３から添加し、密閉後培養を開始した。

培養は、培養器全体を回転させることなどにより培養器
内に細胞を均一に分散させた後、装置全体を３７℃、Ｃ
Ｏ２インキュベーター内に設置して行った。

ポンプ１５により培地を６０　ｍ　１２　／　ｈ　ｒで
循環させながら２４時間培養後、培地の流速を１２０ｍ
　Ｂ、　／　ｈ　ｒに上げ更に２日間培養を行った。

その後、培地貯槽１６内の培地を新しい培地と交換後、
流速を２４０ｍβ／　ｈ　ｒにさらに上げて３日間培養
を続けた。

このようにして培養開始後６日後に培養を停止し、トリ
プシン０．２５％及びＥＤＴＡｏ、０２％を含むＰＢＳ
　（−）で培養器内から細胞を回収し、細胞数を測定し
、さらにトリパンブルー染色を行ない、細胞生存率を求
め生細胞数を算出した結果、培養器内の生細胞数は２．
　　Ｉ　Ｘ　１０８個であった。

比較例１ ポリウレタンを保持させていない以外は実施例１で用い
たのと同様のポリエチレン製中空糸膜を用いて実施例１
と同様の細胞培養器を作製し、同様の操作によってＨｅ
１ａ細胞の培養を行い、培養終了後の培養器内の生細胞
数を求めたところ、９．８Ｘ１’０’個であった。

実施例２ 実施例１と同様の操作により第４図に示す培養装置回路
を作製し、系内をＰＢＳ　（−）で満たした状態で、オ
ートクレーブにより１２１℃、３０分間の殺菌処理を行
った。

次に、クリーンベンチ内でＰＢＳ　（−）を系内から抜
き取り、その代わりに牛胎児血清（１０％）を含有した
Ｈａｍｓ　　Ｆ１２培地（商品名、日水製薬製）ｌβを
培地貯槽１６に入れ、１０分間チューブポンプ１５によ
って系内な循環させた。

その状態で、細胞培養装置８の中空糸の外表面と接する
領域にＣＨＯ−Ｋｌ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−６１，５Ｘ
　１０’個）を第３図の側部導管１２．１３から添加し
、密閉後培養を開始した。

以後実施例１と同様の条件で６日間の培養を行った後、
同様にして培養終了後の培養器内の生細胞数を求めたと
ころ、２．３Ｘ１０”個であった。

［発明の効果］ 以上述べたように本発明の細胞培養方法で用いる多孔質
膜は、ポリオレフィン系多孔質膜を基材とするものであ
るので強度特性に優れ膜の取扱が容易であり、しかもそ
の表面上にポリウレタンを保持させであるので、良好な
細胞の増殖性、生存性、付着性細胞を用いた際の付着性
及び伸展性が得られる。その結果、本発明の細胞培養方
法によれば良好な高密度細胞培養が行なえる。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は本発明に用い得る細胞培養器の一例を
示す模式断面図であり、第４図は細胞培養器を用いた細
胞培養装置の一例を示す図である。 ｌ、８：細胞培養器　　２：多孔質膜（平膜）３：細胞
添加口　　　　４：培地入口 ５：培地出口　　　　　６：培養領域 ７：領域　　　　　　　９：多孔質中空糸膜１０．１１
：端部導管 １２．１３：側部導管 １４・シリコンチューブ １５：チューブポンプ １６：培地貯槽 １７．１８：フィルター 特許出願人　三菱レイヨン株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）他の領域と多孔質膜により仕切られた培養領域中で
   細胞を培養する方法において、前記多孔質膜が、ポリオ
   レフィン系多孔質膜の少なくとも一部の表面にポリウレ
   タンを保持させてなるものであることを特徴とする細胞
   培養方法。 ２）多孔質膜が中空糸形状を有する請求項１に記載の細
   胞培養方法。 ３）ポリオレフィン系多孔質膜が、ポリエチレン系中空
   糸膜またはポリプロピレン系中空糸膜である請求項１ま
   たは２に記載の細胞培養方法。