JP6712073B2

JP6712073B2 - シャーレ型細胞培養容器

Info

Publication number: JP6712073B2
Application number: JP2015167060A
Authority: JP
Inventors: 山口　和夫; 和夫山口; 倫子伊藤; 翔太山本; 中西　淳; 淳中西; 山本　浩司; 浩司山本
Original assignee: NIIGATA CO., LTD.; Kanagawa University; National Institute for Materials Science
Current assignee: NIIGATA CO., LTD.; Kanagawa University; National Institute for Materials Science
Priority date: 2015-08-26
Filing date: 2015-08-26
Publication date: 2020-06-17
Anticipated expiration: 2035-08-26
Also published as: JP2017042094A

Description

本発明は、シャーレ型細胞培養容器に関する。

培養基板上の指定した位置に細胞を付着させて培養する細胞パターニングを行う技術は、生体組織を模倣した組織化細胞培養が可能である。そのため、細胞パターニングは、基礎研究のみならず、実験動物に代わる薬剤スクリーニング系や細胞シート等の移植用組織・臓器の開発等、様々な研究・開発に有用である。

この細胞パターニングに利用可能な細胞容器が近年開発されており、例えば、非特許文献１に記載された、フィルム製のシャーレ型細胞培養容器も、細胞パターニングに利用可能である。

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｓｕｎａｍｉ−ｇｌａｓｓ．ｃｏ．ｊｐ／ｌｉｆｅ／ｂｉｏ／ｄａｔａ２５．ｈｔｍｌ

しかしながら、非特許文献１に記載されたシャーレ型細胞培養容器は、エタノール等の有機溶媒により殺菌することにより、接着剤の部分が溶出して接着力が弱くなるばかりでなく、その接着剤が細胞培養に悪影響を及ぼし、細胞の接着性を制御できずに所望の細胞パターニングを得られない場合がある。

他方、細胞パターニングの中には、光等の外部刺激に応じて細胞付着性が変化する、いわゆる「動的パターニング」というものが知られている。この動的パターニングは、刺激位置を変えながら随時細胞を添加することで、複数種の細胞を位置選択的に配置できるものであり、つまり細胞付着を任意のタイミングで操作可能であるため、例えば、細胞の運動性の評価等、通常の細胞パターニングとは異なる研究・開発に利用可能である。動的パターニングのうち、光により培養基板の細胞付着性を変化させるためには、光分解性基を細胞基板の表面に結合させることが必要となる。

しかしながら、非特許文献１に記載されたシャーレ型細胞培養容器は、培養基板の外周が容器の底面に光硬化性接着剤により直接接着されている。このように、光硬化性接着剤を用いて培養基板を接着した場合、光硬化のための光照射によって上述の光分解性基が分解してしまうことから、非特許文献１に記載されたような光硬化性接着剤を利用したシャーレ型細胞培養容器は、光応答性の動的パターニングには利用できない。

本発明は以上の実情に鑑みてなされたものであり、培養基板の底面への接着に接着剤を利用する必要がなく、有機溶媒により殺菌を行っても培養基板の培養容器への接着力が損なわれにくく、更に、有機溶媒による殺菌による細胞培養への影響が低減された、光応答性の動的パターニングに適したシャーレ型細胞培養容器を提供することを目的とする。

本発明者らは、シャーレ型細胞培養容器の底面部に形成された穴部に細胞基板を嵌合し、底面部の裏側から固定することで、有機溶媒により殺菌を行っても培養基板の培養容器への接着力が損なわれにくく、有機溶媒での殺菌による細胞培養への影響が低減されることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。

（１）底面部と側壁部とを備えるシャーレ型細胞培養容器であって、
前記底面部に、該底面部の厚さ方向に貫通した穴部が形成され、
光分解性基が表面に結合された培養基板が、前記穴部に前記表面が容器の内側方向を向くように配置された状態で嵌合された、シャーレ型細胞培養容器。

（２）前記培養基板が容器の外側方向からフィルムにより前記底面部に固定された、（１）に記載の細胞培養容器。

（３）前記光分解性基が、シランカップリング剤である、（１）又は（２）に記載の細胞培養容器。

本発明によれば、培養基板の底面への接着に接着剤を利用する必要がなく、有機溶媒により殺菌を行っても培養基板の培養容器への接着力が損なわれにくく、更に、有機溶媒での殺菌による細胞培養への影響が低減された、光応答性の動的パターニングに適したシャーレ型細胞培養容器を提供することができる。

本発明の一実施形態に係るシャーレ型細胞培養容器の断面図を示す図である。従来品のシャーレ型細胞培養容器の断面図を示す図である。光分解性基が表面に結合された培養基板（カバーガラス）のみを用いて細胞培養を行った際の細胞パターニングを観察した画像を示す図である。本発明の一実施形態に係るシャーレ型細胞培養容器を用いて細胞培養を行った際の細胞パターニングを観察した画像を示す図である。

以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されない。

＜シャーレ型細胞培養容器＞
本発明のシャーレ型細胞培養容器は、底面部と側壁部とを備えるシャーレ型細胞培養容器であって、底面部に、該底面部の厚さ方向に貫通した穴部が形成され、光分解性基が表面に結合された培養基板が、穴部に表面が容器の内側方向を向くように配置された状態で嵌合されたものである。以下、図１を参照しながら、本発明の好ましい一実施形態であるシャーレ型細胞培養容器１について説明する。

本発明のシャーレ型細胞培養容器１は、図１に示すように、底面部１１と側壁部１２とを備え、底面部１１に形成された穴部１１１に、培養基板１３が嵌合される。該培養基板１３は、フィルム１４により底面部１１に固定される。また、図１には示さないが、蓋部を更に備える。

（底面部１１）
底面部１１は、図１に示すように、該底面部１１の厚さ方向に貫通した穴部１１１が形成されている。該穴部１１１は、後述する培養基板１３が嵌合可能に構成され、円形状に形成される。また、底面部１１は、円形平面状に構成される。

底面部１１の直径は、特に限定されず、例えば、φ１０〜１５０ｍｍのものを用いることができる。穴部１１１の直径は、培養基板１３が嵌合可能に構成されれば、特に限定されないが、例えば、φ５〜５０ｍｍのものを用いることができる。また、底面部１１の厚さは特に限定されず、例えば、０．１〜２．０ｍｍであってもよい。

底面部１１の材質は、特に限定されず、ガラスにより構成してもよく、樹脂（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリカーボネート）により構成してもよい。

（側壁部１２）
側壁部１２は、底面部１１の外周に設けられる。側壁部１２の材質は、特に限定されず、底面部１１と同様の材質を用いることができる。側壁部１２は、蓋部により覆うことが可能となるように構成される。また、側壁部１２の厚さは、特に限定されず、例えば、０．１〜２．０ｍｍであってもよい。また、側壁部１２の高さは、例えば、５．０〜３０ｍｍであってもよい。

（培養基板１３）
培養基板１３は、表面に光分解性基が結合される。また、培養基板１３は、穴部１１１に培養基板１３の表面が容器の内側方向を向くように配置された状態で嵌合される。培養基板１３は、細胞を培養する場となる部分である。

培養基板１３は穴部１１１に嵌合可能に構成されるものであり、本実施形態においては、穴部１１１の円形形状に合わせて円形平面状に構成される。

培養基板１３は、表面に光分解性基が結合可能な基を有する素材であり、通常、光透過性の素材が用いられるが、例えば、ガラス、石英ガラス、シリコン、ダイアモンド、金等が挙げられる。

「光分解性基」とは、紫外線等の高エネルギーの光の照射により、分解する基を意味し、従来の公知の光分解性基を使用可能であるが、光分解性のシランカップリング剤であることが好ましい。

光分解性基は、特に限定されず、例えば、以下の一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表される基が挙げられる。

Ｒ^１は、単結合又は炭素数１〜２０の直鎖又は分鎖のアルキル基もしくはアルコキシ基（酸素原子は、培養基板側又はその逆側のいずれに位置してもよい。）であり、Ｒ_２は、細胞付着抑制基である。

光分解性基は、上記一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）のように、細胞培養の動的パターニングを行うために、細胞付着抑制基を置換基として有するものであることが好ましい。細胞付着抑制基とは、細胞の付着（又は接着）を抑制（又は阻害）する官能基を意味し、代表的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）を置換基として有する炭化水素基又はアミノ基が挙げられる。細胞付着抑制基は、好ましくは、以下の一般式（Ｖ）で表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を置換基として有する炭化水素基又はアミノ基である。炭化水素基としては、炭素数１〜２０の直鎖又は分鎖のアルキル基が挙げられる。アミノ基は、第１級アミノ基、第２級アミノ基が挙げられる。

（式中、ｍは３〜１２００の整数であり、Ｒ^３は、水素原子又はメチル基である。）

培養基板１３の表面を構成する基としては、培養基板１３の素材がガラスの場合は、以下の一般式（ＶＩ）で表される結合ができるシランカップリング剤が好ましく用いられる。また、培養基板１３の素材が金の場合は、以下の一般式（ＶＩＩ）で表される結合ができるチオールまたはジスルフィドが好ましく用いられる。

培養基板１３の表面への光分解性基の結合は、従来の公知の方法に行うことができ、例えば、特許５１６７７３８号に記載された方法を用いることができる。

（フィルム１４）
フィルム１４は、培養基板１３を容器の外側方向から底面部１１に固定させる。フィルム１４の形状は、上記固定を可能に構成されるよう、従来の公知のフィルムを用いることができる。本実施形態においては、図１に示すように、フィルム１４は、底面部１１における穴部１１１と培養基板１３との両方に接することで貼着され、培養基板１３の中央部と重ならないように貫通した環状（リング状）の形状で構成されている。このようにフィルム１４を環状の形状とすることで、細胞培養時に、培養基板１３に付着した細胞を観察しやすくなる。フィルム１４の大きさは、穴部１１１の大きさに合わせて適宜選択されるが、例えば、外径φ１０〜６０ｍｍ、内径φ１〜４５ｍｍであってもよい。

フィルム１４は、従来の公知の貼着可能なものであれば、特に限定されず、例えば、理化学実験用のマイクロプレート用シール等を用いることができる。また、フィルム１４の貼着に用いられる粘着剤層を構成する粘着剤は、従来の公知の粘着剤を用いることができ、例えば、ゴム系粘着剤、アクリル系粘着剤、シリコーン系粘着剤、エチレン−酢酸ビニル共重合体系粘着剤、ポリビニルエーテル系粘着剤、ポリウレタン系粘着剤等を１種又は２種以上用いることができる。また、細胞培養時に、培養基板１３に付着した細胞を観察しやすくなることから、透明な素材を用いることが好ましい。

（蓋部）
蓋部は、図１には示さないが、側壁部１２の外側を覆うように構成され、従来の公知のシャーレに用いられる蓋を、底面部１１の直径や側壁部１２の高さ等に合わせて適宜選択できる。また、蓋部の素材は、底面部１１や側壁部１２と同様の素材を用いることができる。

（シャーレ型細胞培養容器１の作製方法）
本発明のシャーレ型細胞培養容器１は、例えば、底面部１１に、切削にて穴部１１１を設け、環状にくりぬいたフィルム１４に培養基板１３を接着し、次いで、穴部１１１に培養基板１３が嵌合するように底面部１１を被せ、フィルム１４を抑えて固定することで、作製することができる。

（効果）
ここで、従来の接着剤を用いた型細胞培養容器１Ａを、図２に示す。図２に示すように、接着剤１５が、培養基板１３上にあるため、有機溶媒により殺菌を行った場合、接着剤１５が溶出しやすい。そのため、接着力が弱くなり、更に、溶出した有機溶媒が細胞培養を阻害するおそれがある。

これに対し、シャーレ型細胞培養容器１は、底面部１１に、該底面部１１の厚さ方向に貫通した穴部１１１が形成され、光分解性基が表面に結合された培養基板１３が、穴部１１１に培養基板１３の表面が容器の内側方向を向くように配置された状態で嵌合されるように構成した。これにより、シャーレ型細胞培養容器１は、培養基板１３の底面部１１への接着に接着剤を利用する必要がなく、培養基板１３を固定できるため、有機溶媒により殺菌を行っても培養基板１３の培養容器への接着力が損ないにくい。また、有機溶媒による殺菌を行っても、接着剤を使用してないことから、溶出した接着剤による細胞培養への影響を低減することができる。また、仮に、接着剤を使用したとしても、培養基板１３の表面に接着剤を塗布せずに固定が可能であり（例えば、穴部１１１と培養基板１３との間に接着剤を塗布すればよいため）、接着剤が培養した細胞に接しにくいため、接着剤による細胞培養への影響を低減することができる。以上で述べた理由により、シャーレ型細胞培養容器１は、光照射による動的パターニングに好適に使用することができる。

また、シャーレ型細胞培養容器１において、培養基板１３が容器の外側方向からフィルムにより底面部１１に固定されるように構成した。これにより、接着剤を用いずとも、より強固に培養基板１３を底面部１１に固定可能となる。

（変形例）
シャーレ型細胞培養容器は、上述したシャーレ型細胞培養容器１に限定されず、必要に応じて適宜変更することができる。

シャーレ型細胞培養容器１においては、底面部１１、培養基板１３は円形平面状に構成したが、これに限定されず、適宜形状を変更でき、例えば、凸状や凹状であってもよく、球状であってもよい。また、培養基板１３は、穴部１１１の形状に合わせればどのような形状であってもよく、例えば、穴部１１１が四角形状であった場合、培養基板１３も四角形状に構成できる。

シャーレ型細胞培養容器１においては、フィルム１４を環状に構成したが、環状でなくてもよく、貫通部のない円形状、四角形状等であってもよい。

＜培養基板への光分解性基の結合＞
（表面修飾）
まず、培養基板として用いるカバーガラス（松浪硝子工業株式会社製、Ｎｏ．１、丸型φ１５ｍｍ）に、ＵＶ−Ｏ_３クリーナーにてＵＶを１時間ずつ両面にそれぞれ照射し、前処理を行った。次いで、５００ｍＬセパラブルフラスコに以下の式（１）で表されるシランカップリング剤の０．３ｍＭ乾燥トルエン溶液１４０ｍＬを調製し、これに酢酸０．４ｍＬ（５０ｍＭ）を添加し、磁製染色器（池本理化工業株式会社製）に立掛けた上述の前処理済みのカバーガラスを入れ、窒素雰囲気下で、アルミ箔で遮光して室温で２４時間静置して、表面修飾を行った。その後、カバーガラスをエタノールで洗浄し、窒素気流で乾燥した。この際のカバーガラスの水の接触角は６８°であった。この表面修飾の反応スキームを以下に示す。

（化学修飾）
５００ｍＬセパラブルフラスコにＰＥＧ_１２Ｋ−ＮＨ_２（日油株式会社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥＰＡ−１２Ｔ）の０．５ｍＭアセトニトリル溶液１４０ｍＬを調製し、トリエチルアミン０．０１ｍＬ（０．５ｍＭ）を添加し、磁製染色器（池本理化工業株式会社製）に立掛けてあった表面修飾済みカバーガラスを入れ、窒素雰囲気下、アルミ箔で遮光して室温で２０時間静置して、光分解性基に細胞付着抑制基による化学修飾を行った。その後、カバーガラスをエタノールで洗浄し、窒素気流で乾燥した。この際のカバーガラスの水の接触角は３６°であった。この化学修飾の反応スキームを以下に示す。

＜シャーレ型細胞培養容器の作製＞
ポリスチレン製のシャーレ（φ３５ｍｍ）の底面部に、切削にてφ１５ｍｍの貫通穴を設けた。機械加工後ハンドナイフにて両端にＣ面加工を施し、エアーにて異物を除去した。他方、培養基板の固定のためのフィルムとして用いられるマイクロプレートシール（カジックス株式会社製、製品名：タイタースティック、型番：ＨＣ、材質：ＰＥＴ）を外径φ２２ｍｍ、内径φ１２ｍｍのドーナツ形状にくり抜いた。上記のマイクロプレートシールの剥離紙をはがし、粘着面を上にして置き、マイクロプレートシールの中央に上記の修飾済みのカバーガラス（φ１５ｍｍ）を接着した。次いで、シャーレの底面部に形成された穴部に、カバーガラスが嵌合するように上記シャーレをカバーガラスに被せ、マイクロプレートシールを抑えて固定した。

＜細胞培養試験＞
作製したシャーレ型細胞培養容器を、滅菌蒸留水で洗浄後、ＰＢＳ２ｍＬを添加した。蛍光顕微鏡にてフォトマスクを介して光照射し（１０Ｊ）、パターンを形成した。光照射による反応スキームを以下に示す。

パターン形成後のシャーレ型細胞培養容器をＰＢＳで洗浄し、次いで血清培地で洗浄した。その後、シャーレ型細胞培養容器に血清培地２ｍＬを添加し、ＨｅＬａ細胞を４×１０^５ｃｅｌｌｓ播種し、インキュベーションした。インキュベーションを開始してから数時間後、血清培地で軽く洗浄し、インキュベーションを続け、逐次観察した。

また、上記の修飾と同様の修飾を行ったカバーガラスのみを用いて、同様の細胞培養試験を行った。

その結果を、図３、図４に示す。図３は、カバーガラスのみを用いて細胞培養を行った際の細胞パターニングを観察した画像を示す図である。図４は、上述の作製したシャーレ型細胞培養容器を用いて細胞培養を行った際の細胞パターニングを観察した画像を示す図である。図３のうち、（ａ）は、培養開始から２時間経過後、（ｂ）は、培養開始から１日経過後、（ｃ）は、培養開始から４日経過後、（ｄ）は、培養開始から７日経過後において、それぞれ顕微鏡で観察した画像である。図４のうち、（ａ）は、培養開始から４時間経過後、（ｂ）は、培養開始から１日経過後、（ｃ）は、培養開始から４日経過後、（ｄ）は、培養開始から７日経過後において、それぞれ顕微鏡で観察した画像である。

図３に示すように、カバーガラスのみで細胞パターニングを行った際に、問題なく明確な細胞パターンが観測され、パターンは７日間維持された。他方、図４に示すように、シャーレ型細胞培養容器を用いて細胞パターニングを行った際も、カバーガラスのみの場合と同様に、明確な細胞パターンが観測され、パターンは７日間維持されたことがわかった。

１シャーレ型細胞培養容器
１Ａシャーレ型細胞培養容器
１１底面部
１１１穴部
１２側壁部
１３培養基板
１４フィルム
１５接着剤

Claims

底面部と側壁部とを備えるシャーレ型細胞培養容器であって、
前記底面部に、該底面部の厚さ方向に貫通した穴部が形成され、
光分解性基が表面に結合された培養基板が、前記穴部に前記表面が容器の内側方向を向くように配置された状態で嵌合され、
前記穴部の径は、前記培養基板の表面の径と同径であり、かつ、前記底面部の径よりも小さく、
前記培養基板が容器の外側方向からフィルムにより前記底面部に固定された、
シャーレ型細胞培養容器。
前記光分解性基が、シランカップリング剤である、請求項１に記載の細胞培養容器。