JP6839599B2 - 観察装置 - Google Patents

Description

本発明は、観察装置に関し、特に培養環境および透過性試験を観察するための観察装置に関する。

従来から、培養環境を観察するための観察装置や透過性試験を観察する観察装置に関する技術が知られている。例えば、特許文献１は、培養環境の維持に適した培養容器、培養観察装置及び培養観察方法を開示する。この培養容器は、第１の透明部材と、第２の透明部材と、筐体部材と、封止部材とを具備する。第１の透明部材は、設定温度に維持することが可能である。第２の透明部材は、第１の透明部材に対向する。筐体部材は、第１の透明部材及び第２の透明部材が接合され、第１の透明部材及び第２の透明部材と共にウェルプレートを収容可能な培養空間を形成する。封止部材は、第１の透明部材と筐体部材の間で、培養空間に注入される液体を封止する。

また、特許文献２は、培養液の交換時に浮遊細胞が除去されることを防止し、かつ培養容器から浮遊細胞を取り出すことなく浮遊細胞の観察を可能とする浮遊細胞の培養方法を開示する。この培養方法は、一対の透過プレートをスペーサを挟んで対向配置することにより、それらの透過プレート間に扁平なチャンバが形成され、チャンバの周囲には、チャンバに培養液を導入する案内管及びチャンバから培養液を排出する案内管が設けられ、先端がチャンバ内に突出するようにして案内管に挿入可能な第２ニードルを備えたセルを利用した浮遊細胞の培養方法である。そして、この培養方法は、浮遊細胞を含んだ培養液をチャンバ内に導入しつつ培養液を排出させ、浮遊細胞をチャンバ内に補足する捕捉工程と、培養液をチャンバ内に導入しつつ、培養液を逐次排出することにより、チャンバ内の培養液を交換する培養液交換工程とを備える。

また、特許文献３は、試料数に応じてセル数を可変することができる透過性試験装置を開示する。この透過性試験装置は、透過膜が内部に収容され、その内部が透過膜によって上部空間と下部空間に分けられ、更に上部空間にドナー液が収容されると共に、下部空間にレシーバ液が収容されたセルユニットと、予め設定された複数個のセルユニットを、着脱自在に保持するように構成されたセルベースと、を備える。この透過性試験装置は、セルベースに対して、予め設定された個数範囲内の任意の個数のセルユニットを装着できる。

特開２０１４−０６４５０７号公報 特開２０１１−１３５８２６号公報 特開２０１５−２１９１１４号公報

しかし、従来の観察装置では、顕微鏡の対物レンズを観察装置に近接させて観察する場合、対物レンズがカバーガラスに相当する部材に接触し少しでも押圧すると、当該部材が破損してしまうという問題があった。また、従来の観察装置は、培養環境の観察と透過性試験の観察の両方を観察できる装置はなく、それぞれの観察装置は、単機能であった。
そこで、本発明は、対物レンズがカバーガラスに相当する部材に接触し多少押圧しても、当該部材が破損することがない観察装置を提供する。さらに、本発明は、培養環境の観察だけでなく、透過性試験のリアルタイムな観察にも使用することができる観察装置を提供する。

上記課題を解決するために、貫通孔と、貫通孔の両端に貫通孔の径より大きい径を有する支持部とを備えるプレートと、少なくとも一方の支持部に周縁部を支持され、中央部に透過孔を有する可撓性のある接続部材と、接続部材の透過孔の周囲で外縁を接着された透過部材と、プレートの表面から支持部が窪むことで形成される段部と、を備え、段部の高さは、支持部からの接続部材と透過部材の一方または両方の高さより高い観察装置が提供される。
これによれば、段部により窪んだ部分に透過部材が備えられると共に、透過部材は可撓性のある接続部材によりプレートに取り付けられることで、仮に対物レンズが透過部材を押圧しても透過部材が破損することを防止する観察装置を提供することができる。

さらに、透過部材の径は、貫通孔の径以下であることを特徴としてもよい。
これによれば、透過部材の径が貫通孔の径以下であることで、対物レンズに対して接続部材の裏側に透過部材を備えることができ、対物レンズが透過部材に直接接触することがなくなり、透過部材が破損することを防止することができる。また、透過部材を接続部材の表側に備える場合でも、透過部材の径が貫通孔の径以下であることで、接続部材の可撓性を利用し、透過部材が破損することを防止することができる。

さらに、接続部材は、透過部材の外縁の両面と接着していることを特徴としてもよい。
これによれば、接続部材が透過部材の外縁の両面と接着していることで、対物レンズが接続部材や透過部材を強く押圧しても、透過部材が接続部材から脱落することを防止することができる。

さらに、支持部は、貫通孔の両端で接続部材を支持し、貫通孔の内側面と接続部材および／または透過部材とで形成されるチャンバに液体を導入する導入路と該液体を排出する排出路が設けられたことを特徴としてもよい。
これによれば、倒立顕微鏡または正立顕微鏡のいずれであっても、透過部材が破損することを防止して培養環境の観察を行うことができる観察装置を提供することができる。

さらに、接続部材を支持していない支持部において、支持部に亘って配置された観察対象の膜を介して配置される封止部材と、封止部材を支持部に押さえつける押圧部材と、を備えることを特徴としてもよい。
これによれば、倒立顕微鏡を使用し、透過部材が破損することを防止して透過性試験の観察を行うことができる観察装置を提供することができる。

さらに、封止部材の外径は、支持部の外径と一致し、封止部材の内径は、支持部の内径と一致することを特徴としてもよい。
これによれば、正確な透過性試験を行うことができる。

本発明によれば、対物レンズがカバーガラスに相当する部材に接触し多少押圧しても、当該部材が破損することがない観察装置を提供することができる。さらに、本発明によれば、培養環境の観察だけでなく、透過性試験のリアルタイムな観察にも使用することができる観察装置を提供することができる。

本発明に係る第一実施例の観察装置の、（Ａ）プレートの平面図、（Ｂ）Ａ−Ａ断面におけるプレートの断面図、（Ｃ）接続部材と透過部材の平面図、（Ｄ）Ｂ−Ｂ断面における接続部材と透過部材の断面図。 本発明に係る第一実施例の観察装置の、（Ａ）平面図、（Ｂ）Ｃ−Ｃ断面における断面図。 本発明に係る第一実施例の変形例の観察装置の、（Ａ）接続部材と透過部材の平面図、（Ｂ）Ｄ−Ｄ断面における接続部材と透過部材の断面図、（Ｃ）断面図。 本発明に係る第二実施例の観察装置の、（Ａ）プレートの平面図、（Ｂ）Ｅ−Ｅ断面における断面図、（Ｃ）平面図。 本発明に係る第二実施例の観察装置における倒立顕微鏡の対物レンズが接近した場合の説明図。 本発明に係る第二実施例の変形例の観察装置の、（Ａ）プレートの平面図、（Ｂ）Ｆ−Ｆ断面における断面図、（Ｃ）平面図。

本発明に係る観察装置は、培養環境中の浮遊細胞の観察と透過性試験の観察の両方に用いることのできる装置である。培養環境中の浮遊細胞の観察に用いることができる装置とは、培養溶液中を浮遊する生きている細胞の培養に適した環境を維持し、培養容器から観察対象の浮遊細胞を取り出すことなく浮遊細胞を顕微鏡下で観察することを可能とする装置である。また、透過性試験の観察に用いることのできる装置とは、透過性試験において、試料が透過膜を透過、拡散する状態を顕微鏡下で観察することを可能とする装置である。なお、透過性試験とは、皮膚等の透過膜を上側容器と下側容器の間に挟んで、上側容器に測定対象物質である薬剤等の試料を、下側容器にレセプター液を供給し、所定時間後にレセプター液の試料の濃度を測定することにより拡散速度を測定する試験である。

以下に、図面を参照し、各実施例について説明する。
＜第一実施例＞
図１および図２を参照し、本実施例における観察装置１００を説明する。観察装置１００は、平板状のプレート１０と、プレート１０に取り付けられる２つの接続部材２０と、それぞれの接続部材２０に接続される透過部材３０とを備える。プレート１０は、顕微鏡のステージに取り付けし易い平板状の形態を有し、培養環境を含むことのできるチャンバを内部に備えることのできる厚みを適宜有する。

プレート１０は、図１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、貫通孔１１と、貫通孔１１の両端ＢＴに貫通孔１１の径Ｒ１より大きい径を有する支持部１２と、プレート１０の表面１４から支持部１２が窪むことで形成される段部１３と、を備える。貫通孔１１は、プレート１０の最も面積の大きい２つの表面１４の間を貫通する孔である。貫通孔１１は、本実施例では平面視直径Ｒ１の円形であるが、これに限定されず辺の長さがＲ１の矩形であってもよい。

支持部１２は、貫通孔１１の表面１４付近である両端ＢＴに、貫通孔１１の径Ｒ１より大きい径を有して、平面視環状に表面１４から窪んだ部分に形成される。支持部１２が窪んでいる奥行長さはＨ１である。すなわち、プレート１０の表面１４から支持部１２が窪むことで段部１３が形成され、その段部１３の高さはＨ１である。支持部１２の平面視における幅は、すなわち支持部１２が貫通孔１１の直径Ｒ１からどの程度大きいかは、接続部材２０との接続強度との関係で適宜定められる。プレート１０の素材は、特に限定されず、金属、ガラス、硬質の合成樹脂などでよい。

接続部材２０は、図１（Ｃ）に示すように、中央部に透過孔２２を有する環状の周縁部２１から構成され、耐水性、耐薬品性、可撓性などを有する部材であり、合成樹脂などの高分子成分などを薄い膜状（フィルム状）に成型したものから作製される。接続部材２０は、周縁部２１を、より具体的には周縁部２１の外縁部を支持部１２に支持されると共に、接着テープなどで支持部１２に接着されて接続される。なお、接着テープは、接続部材２０は可撓性を有するので、接着境界において破壊され難くするために接着された後でもある程度柔軟性のあるものが好ましい。

透過部材３０は、図１（Ｄ）に示すように、一定厚さの平面視円形の平板状であり、接続部材２０の透過孔２２の直径より大きい直径で形成されて、透過孔２２の周囲の周縁部２１と、その外縁３１を接着される。透過部材３０は、浮遊細胞の観察時に使用される波長域を通過させる材料で作製される。例えば、透過部材３０は、ラマン分光法による観察に用いられる場合には観察時に使用される波長域を透過すると共に、透過部材３０から蛍光やラマン散乱光が発生しないことが必要である。このため、透過部材３０は、石英にて構成されることが好ましい。また、透過部材３０は、可視光による観察に用いられる場合には可視域において透過性を有するガラスで構成されることが好ましい。浮遊細胞に適した材質を選択すればよい。一般的には、透過部材３０の板厚は、０．１２〜０．１７ｍｍである。

観察装置１００は、図１（Ｃ）および（Ｄ）に示すように、まず透過部材３０の外縁３１を接続部材２０の周縁部２１の内縁に接着剤等で接着して接続され、図２に示すように、透過部材３０と一体化した接続部材２０の周縁部２１の外縁部を、プレート１０の二か所の支持部１２に接着して接続されて、構成される。透過部材３０の直径は、貫通孔１１の直径Ｒ１より小さいがほぼ同程度直径を有しているので、支持部１２より内側（プレート１０の中心側）に位置するように配置される。側面をプレート１０の貫通孔１１の内側面、上面と下面を透過部材３０で構成された円筒状の密閉された空間は、培養液で満たされる培養環境を含むことのできるチャンバＣを構成する。

段部１３の高さＨ１は、支持部１２からの接続部材２０の周縁部２１の高さよりも高い。換言すれば、段部１３の高さＨ１の長さは、支持部１２からの周縁部２１の厚みの長さよりも長く、周縁部２１はプレート１０の表面１４より奥まったところに配置される。観察装置１００のチャンバＣ内の培養環境中の浮遊細胞を顕微鏡で観察する際、顕微鏡の対物レンズをプレート１０の表面１４に近接させる。その際、顕微鏡の操作によっては、対物レンズがプレート１０の表面１４に接触してしまうことがある。従来技術の観察装置では、カバーガラスに相当する透過部材に直接対物レンズが接触してしまうために透過部材が破損してしまうことがあったが、本発明に係る観察装置１００では、透過部材３０および接続部材２０の周縁部２１は、段部１３により表面１４から奥まって窪んだ部分に備えられるので、対物レンズが接触することはない。また、仮に透過部材３０に直接接触してしまうような直径の小さい対物レンズである場合であっても、透過部材３０は可撓性のある接続部材２０によりプレート１０に取り付けられることで、対物レンズが透過部材３０を押圧しても接続部材２０が撓むことで押圧された圧力を吸収し、透過部材３０が破損することを防止することができる。

また、本実施例のように、透過部材３０の直径が貫通孔１１の直径Ｒ１以下である場合、対物レンズに対して接続部材２０の裏側（プレート１０の中心側）に透過部材３０を備えることができるので、対物レンズが透過部材３０に直接接触する可能性が少なくなり、透過部材３０が破損することを防止することができる。また、透過部材３０を接続部材２０の表側に備える場合でも、透過部材３０の径が貫通孔１１の径以下であることで、接続部材２０が撓むことで押圧された圧力を吸収し、透過部材３０が破損することを防止することができる。なお、透過部材が接続部材２０の表側（プレート１０の表面側）に備えられる場合、段部１３の高さＨ１は、支持部１２からの接続部材２０の高さおよび透過部材３０の高さの和より高いことが好ましい。透過部材３０が表側にあっても、段部１３により表面１４から奥まって窪んだ部分に備えられるので、対物レンズが接触することを防止することができる。

上述したように、本実施例の観察装置１００における支持部１２は、貫通孔１１の両端ＢＴで接続部材２０を支持して備えている。そして、観察装置１００は、図１（Ｂ）および図２（Ｂ）に示すように、貫通孔１１の内側面と接続部材２０や透過部材３０とで形成されるチャンバＣに培養液等の液体を導入する導入路１５とその液体を排出する排出路１６を備える。このような観察装置１００においては、プレート１０の上面側（図視上側）と下面側（図視下側）の両方に透過部材３０を備えるので、倒立顕微鏡または正立顕微鏡のいずれであっても、透過部材３０が破損することを防止して培養環境の観察を行うことができる。

なお、図１および図２において押圧部材取付穴１７を示すが、本実施例の使用方法である培養環境を観察する場合には、押圧部材取付穴１７は使用されない。

＜第一実施例の変形例＞
図３を参照し、本実施例の変形例における観察装置１００’を説明する。なお、重複記載を避けるために、同じ構成要素には同じ符号を付し、説明を省略する。観察装置１００’は、プレート１０と、プレート１０に取り付けられる２つの接続部材２０’と、それぞれの接続部材２０’に接続される透過部材３０とを備える。接続部材２０’は、透過部材３０の外縁３１の両面と接着している。

より具体的には、接続部材２０’は、周縁部２１’から突出して透過部材３０の外縁３１を挟み込むための挟持部２３’を備える。挟持部２３’は、周縁部２１と同様、耐水性、耐薬品性、可撓性などを有する同じ部材で作製されることが好ましい。このように、接続部材２０’が透過部材３０の外縁３１の両面と接着していることで、対物レンズが接続部材２０’や透過部材３０を強く押圧しても、透過部材３０が接続部材２０’から脱落することを防止することができるし、また、チャンバＣからの液漏れも生じ難い。

＜第二実施例＞
図４を参照し、本実施例における観察装置１００Ａを説明する。なお、重複記載を避けるために、同じ構成要素には同じ符号を付し、説明を省略する。観察装置１００Ａは、平板状のプレート１０と、プレート１０の貫通孔１１の図示下側の端に取り付けられる１つの接続部材２０と、接続部材２０に接続される透過部材３０と、接続部材２０を支持していない図示上側の支持部１２において、支持部１２および貫通孔１１に亘って配置された観察対象の透過膜ＭＢを介して配置される封止部材４０と、を備える。なお、透過膜ＭＢは、透過性試験に使用され観察対象となる皮膚などの膜である。透過膜ＭＢは、貫通孔１１より直径の大きい支持部１２に全体に亘って配置され、貫通孔１１を上面から塞ぐように配置される。

封止部材４０は、透過膜ＭＢを介して支持部１２に配置され、透過膜ＭＢを支持部１２に押さえつけて固定する。封止部材４０は、円筒の側面の形状を有し、円筒の内側面に薬剤等の試料を貯える。すなわち、封止部材４０は、円筒形の底面となる透過膜ＭＢと、円筒の内側面で形成される空間（上側容器）に薬剤等の試料を貯え、その状態で下方から倒立顕微鏡で透過部材３０を介して透過膜ＭＢの下面やチャンバＣ（下側容器）内のレセプター液を観察することにより透過性試験を観察することができる。

封止部材４０の円筒形側面の肉厚は、支持部１２の径方向の幅に等しいことが好ましい。すなわち、封止部材４０の外径は、支持部１２の外径と一致し、封止部材４０の内径は、支持部１２の内径と一致することが好ましい。封止部材４０の外径が支持部１２の外径と一致しない場合、封止部材４０は、支持部１２の径の中でずれてしまうことがあり、しっかりと透過膜ＭＢを固定することができず正確な透過性試験を行うことができない。また、透過膜ＭＢの上面において透過部分を画定する封止部材４０の内径と、透過膜ＭＢの下面において透過部分を画定する支持部１２の内径が一致しない場合、透過膜ＭＢにおける透過経路が一律ではなくなるため、正確な透過性試験を行うことができなくなる。したがって、封止部材４０の外径は、支持部１２の外径と一致し、封止部材４０の内径は、支持部１２の内径と一致することで、正確な透過性試験を行うことが可能となる。

図５に示すように、封止部材４０の内部に貯えられた薬剤等の試料が透過膜ＭＢを透過し、チャンバＣ内のレセプター液に拡散する様子を、下方の透過部材３０を介して倒立顕微鏡ＭＣで観察することができる。本実施例の観察装置１００Ａにおいても、透過部材３０は、表面１４から窪んだ位置に配置されるので、倒立顕微鏡ＭＣが直接透過部材３０に接触する可能性が少なくなり、透過部材３０を破損することを防止することができる。したがって、倒立顕微鏡を使用し、透過部材３０が破損することを防止して透過性試験の観察をリアルタイムに行うことができる観察装置１００Ａを提供することができる。

なお、本図に示すように、表面１４から窪んだ位置に配置される透過部材３０および接続部材２０と、近接した倒立顕微鏡ＭＣの対物レンズの間に毛細管現象を利用して液体ＦＤを保持することができる。液体ＦＤは、対物レンズとプレート１０の距離がそれほど大きくなければ表面張力により流れ出ることはない。液体ＦＤの屈折率は、空気の屈折率より大きいので、このように表面１４から窪んだ位置に配置される透過部材３０等と倒立顕微鏡ＭＣの対物レンズの間に液体ＦＤを保持した状態で観察することにより、より高い解像度で観察することが可能となる。

＜第二実施例の変形例＞
図６を参照し、本実施例における観察装置１００Ａ’を説明する。なお、重複記載を避けるために、同じ構成要素には同じ符号を付し、説明を省略する。観察装置１００Ａ’は、平板状のプレート１０と、プレート１０の貫通孔１１の図示下側の端に取り付けられる１つの接続部材２０と、接続部材２０に接続される透過部材３０と、接続部材２０を支持していない図示上側の支持部１２において、支持部１２および貫通孔１１に亘って配置された観察対象の透過膜ＭＢを介して配置される封止部材４０と、封止部材４０を支持部１２に押さえつける押圧部材５０と、押圧部材取付穴１７に差し込まれて押圧部材５０を固定する押圧部材取付棒１８と、を備える。

押圧部材５０は、封止部材４０の内径とほぼ同じ内径を有する開口部５１を、封止部材４０の内径と一致する位置に備える。押圧部材５０のプレート１０側の面で封止部材４０を押圧し、封止部材４０を固定する。第二実施例の観察装置１００Ａでは、封止部材４０の自重により透過膜ＭＢを支持部１２に押さえつけていたが、押圧部材５０で封止部材４０を介して透過膜ＭＢを押さえつけることでより安定させることができる。なお、押圧部材取付穴１７には雌ねじ、押圧部材取付棒１８には雄ねじを有して、ねじで固定することが好ましい。このように、倒立顕微鏡を使用し、透過部材３０が破損することを防止して透過性試験の観察を行うことができる観察装置を提供することができる。

なお、本発明は、例示した実施例に限定するものではなく、特許請求の範囲の各項に記載された内容から逸脱しない範囲の構成による実施が可能である。すなわち、本発明は、主に特定の実施形態に関して特に図示され、かつ説明されているが、本発明の技術的思想および目的の範囲から逸脱することなく、以上述べた実施形態に対し、数量、その他の詳細な構成において、当業者が様々な変形を加えることができるものである。

１００ 観察装置
１０ プレート
１１ 貫通孔
１２ 支持部
１３ 段部
１４ 表面
１５ 導入路
１６ 排出路
１７ 押圧部材取付穴
１８ 押圧部材取付棒
Ｒ１ 貫通孔の直径
ＢＴ 貫通孔の両端
Ｈ１ 段部の高さ
Ｃ チャンバ
２０ 接続部材
２１ 周縁部
２２ 透過孔
２３ 挟持部
３０ 透過部材
３１ 外縁
４０ 封止部材
５０ 押圧部材
５１ 開口部
ＭＢ 膜
ＭＣ 倒立顕微鏡
ＦＤ 液体

Claims (6)

1. 貫通孔と、前記貫通孔の両端に前記貫通孔の径より大きい径を有する支持部とを備えるプレートと、
   少なくとも一方の前記支持部に周縁部を支持され、中央部に透過孔を有する可撓性のある接続部材と、
   前記接続部材の前記透過孔の周囲で外縁を接着された透過部材と、
   前記プレートの表面から前記支持部が窪むことで形成される段部と、
   を備え、
   前記段部の高さは、前記支持部からの前記接続部材と前記透過部材の一方または両方の高さより高い、
   観察装置。
2. 前記透過部材の径は、前記貫通孔の径以下であることを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
3. 前記接続部材は、前記透過部材の外縁の両面と接着していることを特徴とする請求項１または２に記載の観察装置。
4. 前記支持部は、前記貫通孔の両端で前記接続部材を支持し、
   前記貫通孔の内側面と前記接続部材および／または前記透過部材とで形成されるチャンバに液体を導入する導入路と該液体を排出する排出路が設けられたことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の観察装置。
5. 前記接続部材を支持していない支持部において、前記支持部に亘って配置された観察対象の膜を介して配置される封止部材と、
   前記封止部材を前記支持部に押さえつける押圧部材と、
   をさらに備えることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の観察装置。
6. 前記封止部材の外径は、前記支持部の外径と一致し、
   前記封止部材の内径は、前記支持部の内径と一致することを特徴とする請求項５に記載の観察装置。