JP7023277B2 - 生体内環境に近い培養容器およびそれを備える培養ディッシュ - Google Patents
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Description
(2)本発明の別の実施形態は、さらに、部屋が一方を開口させた凹部であり、凹部の側壁の上方から下方に向かう任意の位置に至る開口部から隣の凹部の開口部に通じるスリットを備える生体内環境に近い培養容器であっても良い。
(3)本発明の別の実施形態は、また、スリットが凹部の高さの50%以下の長さの生体内環境に近い培養容器であっても良い。
(4)本発明の別の実施形態は、また、部屋の容積が10~50nLの範囲にある生体内環境に近い培養容器であっても良い。
(5)本発明の別の実施形態は、また、培養容器内に培養液を供給するためのリザーブタンクと、部屋を通過して排出される培養液を貯める廃棄タンクと、をさらに備える生体内環境に近い培養容器であっても良い。
(6)本発明の一実施形態は、前述のいずれかの生体内環境に近い培養容器を備える培養ディッシュであって、培養容器と、培養容器内に培養液を供給するためのリザーブタンクと、培養容器から排出される培養液を貯める廃棄タンクとを備え、リザーブタンクの内部の培養液がリザーブタンクから培養容器を経て廃棄タンクに至るように、リザーブタンクと培養容器と廃棄タンクとを高低差をつけて配置している生体内環境に近い培養ディッシュである。
(7)本発明の別の実施形態は、さらに、リザーブタンクと培養容器との間に、リザーブタンク内の培養液を重力に抗して培養容器へと供給可能な膜を備える生体内環境に近い培養ディッシュであっても良い。
4 凹部(部屋の一形態)
5 スリット(空間の一形態)
8 受精卵(細胞または胚の一例)
10 培養液
20,20a 培養ディッシュ
24 リザーブタンク
25 廃棄タンク
45 膜
<第一実施形態>
図1は、本発明の第一実施形態に係る培養容器の平面図を示す。図2は、図1の培養容器のA-A線断面図とその一部Cの拡大断面図(2A)、および該培養容器のB-B線断面図(2B)をそれぞれ示す。図3は、図2の培養容器に受精卵を入れた状態の断面図とその一部Cの拡大断面図(3A)、および複数の凹部を培養液が流れる状況の該一部Cの拡大断面図(3B)をそれぞれ示す。
図4は、本発明の第二実施形態に係る培養容器の図2(2A)と同様の断面図とその一部Cの拡大断面図を示す。
図6は、本発明の第三実施形態に係る培養容器の平面図(6A)および同培養器を用いて培養している状況を該平面図のA-A線断面にて表した縦断面図(6B)をそれぞれ示す。
<第一実施形態>
図7は、本発明の第一実施形態に係る培養ディッシュの簡略分解斜視図を示す。図8は、図7の培養ディッシュの縦方向断面図(8A)、および培養中の同断面図と一部Gの拡大断面図(8B)をそれぞれ示す。
図9は、本発明の第二実施形態に係る培養ディッシュの図8(8A)と同様の断面図(9A)および供給管の拡大断面図(9B)をそれぞれ示す。
培養容器1,1a,1b,15および培養ディッシュ20,20a(適宜、「培養容器1等」という。)は、リザーブタンク24、供給管29および排出管28等の接続若しくは配置部材を除いた形態にて、金型成形、フォトリソグラフィと転写の組み合わせ、あるいは3Dプリントによって製造可能である。金型成形を行う場合、金型内に、未硬化状態の硬化性樹脂組成物若しくは硬化性ゴム組成物を供給して、加熱(加圧を伴う場合あり)、紫外線照射等により上記組成物を金型内で硬化させるのが好ましい。この際、凹部4およびスリット5を、成形時に形成しても良く、あるいは成形後にレーザ加工若しくは機械加工によって形成しても良い。
上方に開口する形態の凹部4は、細胞または胚を個別に収容可能な部屋の一例にすぎず、底部あるいは側壁に孔を有する部屋でも良い。スリット5は、凹部4の側壁方向から見て長方形の形状を有するが、楕円形等の他の形状であっても良い。スリット5における凹部4の深さ方向の長さは、凹部4の開口面から凹部の深さの50%、40%、30%、20%あるいは10%までの長さであっても良い。また、スリット5における凹部4の深さ方向の長さは、凹部4の開口面から凹部の深さの60%、70%、80%、90%あるいは100%までの長さであっても良い。リザーブタンク24は、培養容器1等の内部に固着されていても良い。廃棄タンク25は、培養容器1等から着脱自在な部材でも良い。
シャーレ型の培養容器を作製するための金型(凹金型と凸金型)を用意した。凸金型には、転写面に、縦5列×横5列の合計25個の凸部(直径:300μm、高さ:250μm、凸部間隔:100μm)、凸部同士を接続する板状部(幅:20μm、高さ:125μm)および突出領域(高さ1.5mm、突出面:18mm×10mm)を備えるものを用いた。金型内に、未硬化の樹脂原料(ポリスチレン)を加熱・加圧供給し、硬化後、金型を開き、内表面に、縦5列×横5列の合計25個の凹部(開口直径:300μm、深さ:250μm、凹部間隔:100μm)、スリット(幅:20μm、深さ:125μm)および廃棄タンク(深さ1.5mm、開口部:18mm×10mm)を備えるシャーレ型の培養容器(直径:36mm、高さ:11mm)を得た。この培養容器を、「Vivo dish+50%slit」と称する。また、培養容器として、上記の「Vivo dish+50%slit」以外に、25個の凹部を独立して形成したスリットの無い培養容器(「Vivo dish slitなし」と称する)と、スリットの深さを凹部の深さと同じ250μmとした培養容器(「Vivo dish+100%slit」と称する)とを、凸金型の形状を変えて、上記と同様の金型成形にて作製した。
上述の工程で作製された培養容器、後述のリザーブタンクをはじめとする部材は、予め、電子線あるいはγ線滅菌した。受精卵の導入前に、培養容器をKSOM(Lawitts JA, Biggers JD. Culture of preimplantation embryos. Methods Enzymol. 1993 ; 225 : 153―64.)で洗浄した。その後、37℃、酸素濃度5%、二酸化炭素濃度5%のインキュベータ内で、ガス平衡した。
(実験I):培養液循環の条件下における培養容器の形態が及ぼす効果
-実験例(1)- 培養容器「Vivo dish+50%slit」の凹部に培養液を供した後、受精卵を凹部内に入れた。その後、リザーブタンクから10nL/minの供給速度で培養液を培養容器の凹部およびスリットに向けて供給し、廃棄タンクに至る循環供給を実行した。培養開始の24時間後から、24時間毎に、96時間後までの受精卵の胚盤胞への発生を観察・記録した。培養開始時の受精卵(マウス2細胞期受精卵)の数に対する、胚盤胞へと発生した受精卵の数の割合を発生率(%)として求めた。また、得られたマウス胚盤胞を構成する総細胞数と、胚盤胞中の内部細胞塊の細胞数(ICM細胞数)とを二重蛍光染色法により計測した。また、脱出胚盤胞(透明帯(受精卵を覆っているカプセル)から脱出した状態の胚盤胞)についても同様の計測を行った。さらに、受胚雌妊娠率(%)および産仔生産率(%)も求めた。
-実験例(4)- 培養容器「Vivo dish+50%slit」の凹部に培養液を供した後、受精卵を凹部内に入れた。実験Iと同様に、発生率(%)、各種細胞数、受胚雌妊娠率(%)および産仔生産率(%)を求めた。
Claims (6)
- 細胞または胚を培養するための培養容器であって、
前記細胞または前記胚を個別に収容可能な部屋を複数個備え、
2以上の前記部屋同士が、培養液を通過させる一方で前記細胞または前記胚を通過させない大きさの空間を介して接続しており、
前記部屋は、
一方を開口させた凹部であり、
前記凹部の側壁の上方から下方に向かう任意の位置に至る開口部から隣の前記凹部の前記開口部に通じるスリットを備える生体内環境に近い培養容器。 - 前記スリットは、前記凹部の高さの50%以下の長さである請求項1に記載の生体内環境に近い培養容器。
- 前記部屋の容積は10~50nLの範囲にある請求項1または請求項2に記載の生体内環境に近い培養容器。
- 前記培養容器内に培養液を供給するためのリザーブタンクと、
前記部屋を通過して排出される培養液を貯める廃棄タンクと、
をさらに備える請求項1から請求項3のいずれか1項に記載の生体内環境に近い培養容器。 - 請求項1から請求項3のいずれか1項に記載の生体内環境に近い培養容器を備える培養ディッシュであって、
前記培養容器と、
前記培養容器内に培養液を供給するためのリザーブタンクと、
前記培養容器から排出される培養液を貯める廃棄タンクと、
を備え、
前記リザーブタンクの内部の前記培養液が前記リザーブタンクから前記培養容器を経て前記廃棄タンクに至るように、前記リザーブタンクと前記培養容器と前記廃棄タンクとを高低差をつけて配置している生体内環境に近い培養ディッシュ。 - 前記リザーブタンクと前記培養容器との間に、前記リザーブタンク内の前記培養液を重力に抗して前記培養容器へと供給可能な膜を備える請求項5に記載の生体内環境に近い培養ディッシュ。
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