KR102325876B1 - 신경에 대한 효능 및 독성평가를 위한 생체모방 신경칩 및 이의 용도 - Google Patents

신경에 대한 효능 및 독성평가를 위한 생체모방 신경칩 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경조직을 모사하기 위한 성상교세포 공급부와 신경세포 공급부, 및 상기 성상교세포 공급부와 신경세포 공급부에 배양액을 공급하기 위한 배양액 공급부를 포함하는 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩, 상기 생체모방 신경칩을 이용하여 성상교세포를 통해 신경세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법 및 상기 생체모방 신경칩을 이용하여 성상교세포를 통해 신경세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩을 사용하면, 신경조직 연구에 있어서 동물실험의 이종간의 차이에 따른 부정확성을 극복할 수 있고, 성상교세포와 신경세포를 복합적으로 사용하여 생체 내 조건과 유사한 조건에서 약물의 보다 정확한 효능 및 독성을 평가하는 플랫폼으로의 사용이 가능하며, 신경조직 내 미세환경 연구 및 다른 장기칩(organ-on-a-chip)의 연구 등에 응용될 수 있으므로, 약물 유효성 및 독성 등을 효과적으로 분석할 수 있는 휴먼온어칩(human-on-a-chip) 개발에 활용될 수 있을 것이다.

Description

신경에 대한 효능 및 독성평가를 위한 생체모방 신경칩 및 이의 용도{Neuron on a chip for efficacy and toxicity tests to nerves and uses thereof}
본 발명은 신경에 대한 효능 및 독성평가를 위한 생체모방 신경칩 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 신경조직을 모사하기 위한 성상교세포 공급부와 신경세포 공급부, 및 상기 성상교세포 공급부와 신경세포 공급부에 배양액을 공급하기 위한 배양액 공급부를 포함하는 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩, 상기 생체모방 신경칩을 이용하여 성상교세포를 통해 신경세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법 및 상기 생체모방 신경칩을 이용하여 성상교세포를 통해 신경세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법에 관한 것이다.
신경계관련 질환을 표적으로 하는 치료요법에 대한 사회적, 임상적 및 경제적 요구가 증가하고 있음에도, 관련된 약물의 개발은 1990년 이래로 둔화되었고 다른 종류의 약물의 임상시험보다 실패할 가능성이 더 높다고 알려져 있다. 독성을 연구하는 방법 중 역학연구를 통한 독성평가가 가장 신뢰성 이 높은 것으로 알려져 있으나 이 방법은 많은 돈과 시간이 필요로 하는 단점이 있다. 따라서 상대적으로 짧은 시간 내 평가하기 위한 방법으로 쥐, 생쥐, 기니피그, 토끼 등과 같은 다양한 종의 동물을 이용한 약물 평가를 하게 되었지만 이 또한 윤리적인 문제에서 자유로울 수 없었으며, 인간과 다른 이온채널의 존재, 약동학적 차이 등 종간 차이(inter-species differences)라는 한계점을 지니고 있어 동물실험 결과가 인간에게 똑같이 적용되지 않는 경우가 많고, 동물실험을 거쳐 임상실험을 통과한다고 하더라도 부작용으로 다시 퇴출되는 경우가 종종 있는 실정이다. 현재 동물실험을 이용한 신약개발에는 10-15년의 오랜 기간과 약 5조원의 고비용이 필요하며, 이러한 비효율성에도 불구하고 여전히 동물실험을 진행하는 이유는 현재로선 마땅히 이를 대체할만한 방법이 없기 때문이다. 따라서 이를 대체할 수 있는 보다 효율적인 독성평가 시스템의 개발이 절실하다
동물실험을 대체하여 생체 외(in-vitro)에서 독성을 보다 정확하게 평가 할 수 있는 기술로써 장기 생체모방칩(Organ on a chip; OOC)이 최근 주목 받고 있다. 이 기술은 특정 장기의 내부 미세환경(microenvironment) 구조를 모방하여 해당 장기를 구성하는 세포를 배양함으로써 그 기능과 특성을 구현할 수 있으며, 단순히 칩 위에서 세포를 배양하는 것이 아니라 산소 및 영양분의 이동과 흡수, 신호전달물질의 이동 등이 마이크로미터 내지 수 밀리미터 단위 내에서 벌어진다는 점에 착안하며, 미세유체기술 및 반도체 미세공정으로부터 발전시킨 소프트 리소그래피(soft-lithography) 공정으로 인체 조직 내 마이크로미터 단위의 미세 환경을 구현하여, 지속적인 관류시스템으로 연결된 마이크로 챔버 내에서 살아있는 세포를 배양하고, 이러한 챔버들을 배열하여 조직 또는 장기 수준의 생리활성을 구현함으로써 기존의 신약개발 및 독성평가 방법을 대체할 수 있는 플랫폼으로 기대되고 있다.
그러나, 장기 생체모방칩 분야는 초기 연구분야임에 따라 선행된 연구들에서 실제 생체 내(in-vivo) 에서의 기전을 정확하게 반영하지 못하는 등 극복해야할 한계점들이 다수 존재한다. 본 발명과 유사하며 팀에서 생체모방 신경칩 개발을 위해 참고하였던 연구인 2011년과 2013년에 발표된 Donna J. Webb 교수 연구팀의 선행연구는 PDMS를 이용한 개폐형 미세밸브(microvalve)으로 나누어진 신경세포 챔버와 성상교세포 챔버에 동물 유래 신경세포와 성상교세포를 선택적으로 주입하고 공동배양을 수행한 미세유체 플랫폼에 관한 것이다. 관련연구가 초창기임에 유의적인 연구임에 불구하고, 동물유래 세포를 사용했다는 점과, 상대적으로 복잡한 구동방식의 미세밸브를 이용하여 선택적 주입을 수행하였다는 점, 강한 전단응력(shear stress)에 세포들이 직접적으로 노출되는 챔버 및 채널 디자인 등 아쉬운 점들이 있었다.
또한, 신경계를 타겟으로 하는 약물평가를 위해 선행연구 되었던 신경 생체모방칩들은 주로 혈뇌 장벽(blood-brain barrier, BBB)를 모방하는 방법에 초점을 맞추어 연구를 진행하고 있는데, 예를 들어, 한국공개특허 제10-2019-0044630호에는 내피세포 층과, 신경세포 및 선택적으로 하나 이상의 성상교세포, 주피세포, 희소돌기아교세포 및 미세아교세포로 구성된 뇌 조직 층을 포함하는 혈뇌 장벽의 인 비트로 모델이 개시되어 있다. 그러나, 이러한 모델이 생체 내 BBB 기능 수준까지 모방하는데는 기술적 한계가 존재하며, 뇌장벽 시스템이 손상되지 않은 상황에서도 독성물질이 비특이적 투과성을 가진 세포막 및 뇌장벽의 종류 중 BBB를 제외한 BCSFB와 OBB의 타이트정션(tight junction)에 존재하는 클라우딘-2(claudin-2)를 통과할 가능성이 여전히 있으므로, BBB 연구의 중요성에도 불구하고, 불완전한 뇌장벽 시스템을 모방하기보다는 독성물질이 뇌 조직에 침투 한 후 정확한 상황에 대해 연구를 선행하는 것이 조금 더 현실적인 연구방향이라 여겨지고 있다.
그 밖에 신경계를 생체모방하고자하는 시도는 여럿 있었으며, 예를 들면 미국등록특허 제7403883호에는 인간 척추관 형태의 곡선 통로를 형성하는 모델 본체 및 상기 통로 내에 위치하여 고정할 수 있고, 인간 척수 구조를 시뮬레이팅하기 위한 인공 코드 구조를 포함하는 인간의 척수를 모방한 3차원 인비트로 척수모델이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-0994451호에는 생체 모방 신경세포와 시냅스를 가변부성저항과 트랜스콘덕터로 구현하여 신경 칩 설계에 적합한 펄스 신호 생성 및 신호 전달 특성을 갖도록 한 연산 기능을 갖는 가변부성저항으로 이루어진 생체 모방 신경 세포 회로가 개시되어 있다.
인체 내 생리현상 특히 장기수준에서 발생하는 생리현상은 매우 복잡하고 체계적인 시스템으로 이루어져 있으므로 이 모든 것을 모방하기에는 현재로썬 기술적인 한계가 존재한다. 따라서 핵심적인 생리학적 특성들 몇 가지를 선정하여 여러 측면으로 이를 관찰하고 최종적으로 종합적인 플랫폼을 구현하여 시스템적인 기전을 확인하는 것이 생체 내의 특정 생리현상에 대한 기전을 파악을 위한 좋은 방법으로 평가되고 있는 실정이다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 생체 외에서 신경계와 유사한 수준으로 신경세포를 구현하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 신경조직을 모사하기 위한 성상교세포 공급부와 신경세포 공급부 및 상기 성상교세포 공급부와 신경세포 공급부에 배양액을 공급하기 위한 배양액 공급부를 포함하는 생체모방 신경칩을 이용할 경우, 신경세포 및 성상교세포의 세포 반응 변화를 관찰하여 각 세포에 미치는 약물의 효능과 독성을 용이하게 평가할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 신경조직을 모사하기 위한 성상교세포 공급부와 신경세포 공급부, 및 상기 성상교세포 공급부와 신경세포 공급부에 배양액을 공급하기 위한 배양액 공급부를 포함하는 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 생체모방 신경칩을 이용하여 성상교세포를 통해 신경세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 생체모방 신경칩을 이용하여 성상교세포를 통해 신경세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 장기 생체모방칩 중에서 신경조직의 기능을 모방할 수 있는 신경칩을 개발하고자, 신경조직을 구성하는 성상교세포와 신경세포를 포함하도록 생체모방 신경칩을 구성하였다.
이를 위하여 상기 신경조직의 구조를 신경세포, 상기 신경조직을 감싸는 성상교세포 및 상기 성상교세포에 영양을 공급하는 모세혈관으로 구분하고, 이들을 각각 모방하는 구성요소를 포함하도록 생체모방 신경칩을 개발하였다. 먼저, 신경세포를 모방하는 구성요소는 내부에 보조성분을 이용하여 신경세포가 신경조직의 형태로 고정시킨 신경세포 챔버를 사용하였고; 성상교세포를 모방하는 구성요소는 내부에 보조성분을 이용하여 성상교세포가 성상교조직의 형태로 고정되고, 형태적으로는 상기 신경세포 챔버와 동일한 방향으로 연장되며, 상기 신경세포 챔버의 일부와 연접하도록 구성된 성상교세포 챔버를 사용하였으며; 상기 모세혈관을 모방하는 구성요소는 배양액을 상기 성상교세포 챔버와 신경세포 챔버에 공급할 수 있도록 상기 성상교세포 챔버와 동일한 방향으로 연장시키고, 상기 성상교세포 챔버의 일부와 연접하도록 구성된 배양액 채널을 사용하였다. 또한, 상기 각각의 연접부위를 통해 배양액이 상호 교류할 수 있도록 구성하였다.
뿐만 아니라, 모세혈관과 이를 모사한 배양액 채널의 유사성을 높이기 위하여, 상기 배양액 채널내부 표면에 혈관내피세포를 코팅할 수 있다. 상기 혈관내피세포를 생체 외 조건에서 배양할 경우, 배양용기 바닥에 얇게 퍼져서 부착되어 증식하고, 세포 사이의 공간을 의미하는 내강(lumen)을 형성하는 특징을 나타낸다. 따라서, 상기 배양액 채널 내에 혈관내피세포를 주입하면, 상기 배양액 채널의 내부표면에 얇게 퍼져서 부착되어 증식하게 되고, 자연적으로 혈관내피세포로 감싸여진 내강을 형성하게 되므로, 모세혈관과 유사한 구조를 형성하게 된다.
한편, 상기 각 챔버 및 채널에 기능성분을 공급하기 위한 구성요소를 추가로 구비하였다. 구체적으로, 상기 신경세포 챔버에 기능성분인 신경세포와 보조성분의 혼합물을 공급하기 위하여, 상기 신경세포 챔버의 각 측단에 연통된 신경세포 채널을 구비하고, 상기 구비된 각각의 신경세포 채널의 일 측단에 신경세포 유입구를 구비하였으며, 다른 일 측단에 신경세포 유출구를 구비하였다. 다음으로, 상기 성상교세포 챔버에 기능성분인 성상교세포와 보조성분의 혼합물을 공급하기 위하여, 상기 성상교세포 챔버의 각 측단에 연통된 성상교세포 채널을 구비하고, 상기 구비된 각각의 성상교세포 채널의 일 측단에 성상교세포 유입구를 구비하였으며, 다른 일 측단에 성상교세포 유출구를 구비하였다. 끝으로, 상기 배양액 채널에 기능성분인 배양액을 공급하기 위하여, 상기 배양액 채널의 각 측단에 연통된 배양액 저장챔버를 구비하였다.
상술한 바와 같이 개발된 생체모방 신경칩은 배양액 공급부, 성상교세포 공급부 및 신경세포 공급부를 포함하도록 구성되는데, 상기 배양액 공급부는 배양액 저장챔버 및 배양액 채널을 포함하고; 상기 성상교세포 공급부는 성상교세포 유입구, 성상교세포 유출구, 성상교세포 챔버 및 성상교세포 채널을 포함하며; 상기 신경세포 공급부는 신경세포 유입구, 신경세포 유출구, 신경세포 챔버 및 신경세포 채널을 포함한다.
이처럼 개발된 생체모방 신경칩은 생체 내 신경조직을 구조적으로 모사한 형태를 갖기 때문에, 외부에서 유입된 약물이 성상교세포를 통해 신경세포에 미치는 영향을 생체 내의 신경세포와 유사한 수준으로 사전 검증하는데 사용할 수 있다.
이처럼 신경조직 수준에서 구조적으로 모사하여 약물이 성상교세포를 통해 신경세포에 미치는 영향을 생체 내의 신경조직과 유사한 수준으로 사전 검증할 수 있는 신경칩은 지금까지 개발되지 않았고 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.
상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 신경조직을 모사하기 위한 성상교세포 공급부와 신경세포 공급부 및 상기 성상교세포 공급부와 신경세포 공급부에 배양액을 공급하기 위한 배양액 공급부를 포함하는 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩은
(a) 2개의 배양액 저장챔버; 및, 상기 각 챔버와 연통하는 배양액 채널;을 포함하는 배양액 공급부;
(b) 일 측단에 구비된 성상교세포 유입구; 다른 일 측단에 구비된 성상교세포 유출구; 상기 성상교세포 유입구와 성상교세포 유출구 사이에 구비되고, 상기 배양액 채널과 동일한 방향으로 연장되어 상기 배양액 채널의 일부와 연접하고, 상기 배양액 채널과의 연접부위에 배양액이 상호 교류할 수 있는 1차 믹싱영역을 형성하는 성상교세포 챔버; 및 상기 성상교세포 챔버의 일 측단과 성상교세포 유입구 사이 및 상기 성상교세포 챔버의 다른 일 측단과 성상교세포 유출구 사이에 각각 구비되어 연통된 성상교세포 채널;을 포함하는 성상교세포 공급부; 및
(c) 일 측단에 구비된 신경세포 유입구; 다른 일 측단에 구비된 신경세포 유출구; 상기 신경세포 유입구와 신경세포 유출구 사이에 구비되고, 상기 성상교세포 챔버와 동일한 방향으로 연장되어 상기 성상교세포 챔버의 일부와 연접하고, 상기 성상교세포 챔버의 연접부위에 배양액이 상호 교류할 수 있는 2차 믹싱영역을 형성하는 신경세포 챔버; 및 상기 신경세포 챔버의 일 측단과 신경세포 유입구 사이 및 상기 신경세포 챔버의 다른 일 측단과 신경세포 유출구 사이에 각각 구비되어 연통된 신경세포 채널;을 포함하는 신경세포 공급부로 구성된다.
본 발명에서 제공하는 생체모방 신경칩의 전체적인 구조물의 재질은 성상교세포 및 신경세포의 고정 및 배양을 저해하거나 좋지 않은 영향을 미치지 않는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane), PDMS), 폴리락틱산(polylactic acid, PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리디옥사논(polydioxanone, PDO) 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 광학적으로 투명하고, 내구성이 강하며, 생물 친화적이고, 유연하여, motion-tracking 이라는 광학적 방법을 이용하여 성상교세포 및 신경세포의 상태를 용이하게 분석할 수 있는 PDMS 등이 될 수 있다.
이때, 상기 재질을 이용하여 제조된 생체모방 신경칩은 이에 포함된 신경세포 챔버에 신경세포가 정착되고, 성상교세포 챔버에 성상교세포가 정착되며, 배양액 채널에 배양액을 유입하는 과정을 원활하게 수행하기 위하여, 1차적으로 형태를 형성한 생체모방 신경칩을 대상으로 후처리 공정을 수행할 수 있다. 이때, 1차적으로 형태를 형성한 생체모방 신경칩 전체를 대상으로 후처리 공정을 수행할 수도 있고, 신경세포 챔버, 성상교세포 챔버 및 배양액 채널 부위에 한정하여 후처리 공정을 수행할 수도 있으며, 배양액 채널과 성상교세포 챔버가 연접한 1차 믹싱영역 및 성상교세포 챔버와 신경세포 챔버가 연접한 2차 믹싱영역에 한정하여 후처리 공정을 수행할 수도 있다. 또한, 상기 후처리 공정은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 60 내지 80℃에서 36 내지 60시간 동안 가열처리하여 수행할 수 있고, 다른 예로서, 65 내지 75℃에서 44 내지 52시간 동안 가열처리하여 수행할 수 있으며, 또 다른 예로서, 70℃ 오븐에서 48시간 동안 가열처리하여 수행할 수 있다.
이하에서는, 본 발명의 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩을 구성하는 각 구성부의 구성을 구체적으로 설명하기로 한다:
1. 배양액 공급부
본 발명에서 제공하는 생체모방 신경칩에 포함된 배양액 공급부는 2개의 배양액 저장챔버 및 배양액 채널을 포함한다.
상기 배양액 저장챔버는 1차 및 2차 믹싱영역을 통해 성상교세포 챔버와 신경세포 챔버에 공급하기 위한 배양액을 저장하고, 저장된 배양액을 배양액 채널 및 성상교세포 챔버를 통해 신경세포에 공급하는 역할을 수행한다.
2개의 배양액 저장챔버가 모두 배양액을 공급하는 역할을 수행하기 때문에 상기 배양액이 배양액 채널을 통과하여 성상교세포와 신경세포를 배양 후 성상교세포와 신경세포로부터 분비된 각종 대사산물, 노폐물 등으로 오염된 배양액을 회수하는 역할은 성상교세포 유입구 및 유출구와 신경세포 유입구 및 유출구를 통해 수행하게 된다.
상기 배양액 채널은 2개의 배양액 저장챔버 사이에 배양액이 유통하는 배양액의 메인 유로로서의 역할을 수행하는데, 상기 배양액 채널의 일부가 성상교세포 챔버와 1차 믹싱영역을 형성하고, 상기 형성된 1차 믹싱영역을 통해 성상교세포 및 신경세포에 배양액을 공급하는 역할을 수행한다.
본 발명에 있어서, 상기 배양액 채널은 신경세포에 혈액을 공급하기 위한 모세혈관을 모사한 구성요소로서 해석될 수 있다. 이에 따라, 상기 배양액 채널의 폭은 모세혈관의 기능을 모사할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 50 내지 70㎛의 폭을 가질 수 있고, 다른 예로서, 55 내지 65㎛의 폭을 가질 수 있으며, 또 다른 예로서, 60㎛의 폭을 가질 수 있다.
한편, 상기 모세혈관과 이를 모사한 배양액 채널의 유사성을 높이기 위하여, 상기 배양액 채널내부 표면에 혈관내피세포를 코팅할 수 있다. 예를 들어, 상기 배양액 채널 내에 혈관내피세포를 주입하면, 상기 배양액 채널의 내부표면에 얇게 퍼져서 부착되어 증식하게 되고, 자연적으로 혈관내피세포로 감싸여진 내강을 형성하게 되므로, 모세혈관과 유사한 구조를 형성하게 된다.
예를 들어, 성상교세포와 인접해있는 모세혈관망을 형성해주기 위하여 혈관내피세포주(EA. Hy926)를 칩 내 최외각에 위치하고 있는 배양액 채널에 로딩하여 공동배양을 수행할 수 있다. 이때, 배양액 저장챔버에 파이펫 혹은 주사기펌프를 이용하여 혈관내피세포주를 채널 내부로 주입하도록 하며, 주입이 완료되면 칩을 90도 혹은 180도로 세워서 배양액 채널 전면에 중력에 의해 세포가 수월하게 로딩되게 유도하는 방법을 사용할 수 있다.
2. 성상교세포 공급부
본 발명에서 제공하는 생체모방 신경칩에 포함된 성상교세포 공급부는 성상교세포 유입구, 성상교세포 유출구, 성상교세포 챔버 및 성상교세포 채널을 포함한다.
상기 성상교세포 유입구는 성상교세포 챔버에 공급하기 위한 기능성분인 성상교세포와 보조성분의 혼합물을 유입하는 역할을 수행하는데, 예를 들어, 성상교세포 유입구에 성상교세포와 보조성분의 혼합물이 로딩된 주사기의 노즐이 연결될 수 있는 구조를 갖도록 구성될 수 있다.
본 발명에서 사용된 성상교세포는 생체모방 신경칩의 성상교세포 챔버 내부에 고정되어 생체 내 성상교세포의 기능을 모사할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 줄기세포로부터 분화된 성상교세포가 될 수 있다.
상기 성상교세포 혼합물은 성상교세포와 상기 성상교세포의 유통과 고정을 보조하는 보조성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 생체모방 신경칩은 이에 포함된 성상교세포 챔버내부에 정렬되어 고정된 형태로 존재하는 성상교세포를 포함하게 되는데, 이와 함께 상기 성상교세포 채널 내부에 성상교세포의 주입과 고정을 보조하는 보조성분을 포함할 수 있다. 상기 보조성분은 성상교세포 주변의 미세환경에 존재하는 세포외기질(ECM)로서의 역할을 수행할 수 있는데, 성상교세포의 2차원 혹은 3차원 세포배양에 필수적이며, 배양된 성상교세포의 구조 및 기능이 생체 내의 것과 유사하도록 유지하는 역할을 수행할 수 있다. 상기 보조성분은 성상교세포의 유입과 고정을 보조할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 성상교세포 챔버의 내부표면에 성상교세포를 결합시키는 결합제, 성상교세포 챔버의 내부에서 성상교세포가 3차원구조를 형성하게 하고 형성된 3차원 구조를 고정시키기 위한 지지제 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 성상교세포 채널의 내부표면에 성상교세포를 결합시키는 결합제의 일종인 마트리젤(matrigel)이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 성상교세포 채널의 내부에서 성상교세포가 3차원구조를 형성하게 하고 형성된 3차원 구조를 고정시키기 위한 지지제의 일종인 하이드로젤이 될 수 있고, 또 다른 예로서, 성상교세포 채널의 내부에서 성상교세포가 3차원구조를 형성하게 하고 형성된 3차원 구조를 고정시키기 위한 하이드로젤의 일종인 콜라겐 하이드로젤, 알지네이트 하이드로젤, 젤마(GelMa) 하이드로젤 등이 될 수 있다.
상기 보조성분의 일 양태로서 하이드로젤을 사용할 경우, 상기 성상교세포와 하이드로젤의 혼합물은 성상교세포의 3차원 배양을 보조하고, 추가적으로 상기 성상교세포에 유동성을 부여하여, 상기 성상교세포가 성상교세포 유입구로부터 성상교세포 채널을 통해 성상교세포 챔버로 이동할 수 있게 하며, 상기 혼합물이 성상교세포 챔버로 이동한 후, 이에 포함된 하이드로젤이 경화되면, 상기 경화된 하이드로젤 내에 포함된 성상교세포가 자연스럽게 고정될 수 있는데, 하이드로젤의 내재적인 다공성 특징으로 인하여, 하이드로젤을 통해 외부의 배양액이 성상교세포에 전달될 수 있어, 고정된 성상교세포의 배양을 보조할 수 있다. 이때, 상기 하이드로젤은 다양한 조건에 의해 경화될 수 있는데, 예를 들어, 콜라겐 하이드로젤은 인큐베이터 내에 1시간 이상 두어 온도상승을 유도하여 경화시킬 수 있고, 알지네이트 하이드로젤은 배양액 채널에 배지를 대체하여 CaCl2 용액을 주입하여 경화시킬 수 있으며, 젤마 하이드로젤은 자외선을 조사하여 경화시킬 수 있다.
상기 성상교세포 유출구는 과도하게 공급된 성상교세포 혼합물을 유출하는 역할을 수행할 수 있다. 또한, 상기 배양액 채널에서 1차 믹싱영역을 통해 공급된 배양액, 상기 신경세포 챔버에서 2차 믹싱영역을 통해 공급된 신경세포로부터 분비된 각종 대사산물 또는 노폐물 등의 오염물을 외부로 배출하는 역할을 수행할 수 있다. 이처럼 오염물을 배출하는 역할은 성상교세포 유출구 뿐만 아니라 성상교세포 유입구도 함께 수행할 수 있다. 즉, 성상교세포를 성상교세포 챔버에 유입하는 역할이 종료된 성상교세포 유입구는 배양액 및 오염물을 외부로 배출하는 역할을 수행할 수도 있다. 경우에 따라서는 추가적인 저장용기에 연결될 수 있는 구조를 갖도록 구성될 수 있다.
상기 성상교세포 챔버는 성상교세포 유입구로부터 공급된 성상교세포 혼합물이 저장, 고정 및 배양되는 부위로서, 1차적으로는 고정된 성상교세포를 배양하기 위한 배양용기로서의 역할을 수행하고, 2차적으로는 상기 배양액 채널로부터 유입된 배양액을 신경세포 챔버에 고정된 신경세포에 전달하고, 신경세포로부터 분비된 각종 대사산물, 노폐물 등을 외부로 방출하는 통로로서의 역할을 수행할 수 있다.
상술한 바와 같이, 상기 성상교세포 챔버의 내부에 주입된 성상교세포는 이와 함께 혼합물의 형태로 주입된 보조성분에 의해 성상교세포 챔버의 내부에 고정될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 성상교세포 챔버는 성상교세포 조직을 모사한 구성요소로서 해석될 수 있다. 이에 따라, 상기 성상교세포 챔버의 폭은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 가로 3 내지 5mm x 세로 3 내지 5mm의 크기를 가질 수 있고, 다른 예로서, 가로 3.5 내지 4.5mm x 세로 3.5 내지 4.5mm의 크기를 가질 수 있으며, 또 다른 예로서, 가로 4mm x 세로 4mm의 크기를 가질 수 있다.
상기 성상교세포 채널은 상기 성상교세포 챔버의 일 측단과 성상교세포 유입구 사이 및 상기 성상교세포 챔버의 다른 일 측단과 성상교세포 유출구 사이에 각각 구비되어 연통되는 부위로서, 상기 성상교세포 유입구를 통해 공급된 성상교세포 혼합물을 성상교세포 챔버로 전달하고, 상기 성상교세포 챔버 내에 과잉된 성상교세포 혼합물을 성상교세포 유출구로 전달하는 역할을 수행한다. 아울러, 상기 배양액 채널로부터 유입된 배양액의 과잉분 및 신경세포로부터 분비된 각종 대사산물, 노폐물 등을 외부로 방출하기 위한 중간통로로서의 역할을 수행할 수 있다.
상기 성상교세포 혼합물을 성상교세포 챔버로 이동시킨된 후, 이에 포함된 성상교세포를 배양하면, 상기 배양된 성상교세포를 통하여, 배양액이 배양액 채널로부터 신경세포 챔버로 전달될 수 있다.
이처럼 배양액이 성상교세포 챔버를 통해 배양액 채널로부터 신경세포 챔버로 전달되기 위하여, 상기 성상교세포 챔버는 배양액 채널과 연접한 부위에 1차 믹싱영역을 형성하고, 신경세포 챔버과 연접한 부위에 2차 믹싱영역을 형성한다. 상기 1차 및 2차 믹싱영역을 통해 신경세포에 배양액을 공급하고, 신경세포 배양에 사용된 배양액을 회수함으로써, 결과적으로는 신경세포 챔버 내에 고정된 신경세포를 배양할 수 있다.
먼저, 상기 1차 믹싱영역은 배양액 채널의 일부, 상기 배양액 채널의 일부와 연접한 성상교세포 챔버의 일부, 상기 각 채널의 연접부에 형성된 부분 차단부재로 구성될 수 있다.
이때, 부분 차단부재는 상호 연접된 배양액 채널의 일부와 성상교세포 챔버의 일부를 완전히 개통하지 않고 부분적으로 개통하는 역할을 수행하는데, 이는 성상교세포의 고정 이전에 성상교세포 챔버 내부에 주입된 성상교세포가 배양액 채널의 내부로 이동하는 것을 방지하면서도, 상기 부분적으로 개통된 부위를 통해, 배양액 채널에 공급된 배양액이 성상교세포 챔버에 고정된 성상교세포로 이동하는 것을 허용하여, 결과적으로는 효과적인 신경세포 배양에 일조한다.
다음으로, 상기 2차 믹싱영역은 성상교세포 챔버의 일부, 상기 성상교세포 챔버의 일부와 연접한 신경세포 챔버의 일부, 상기 각 챔버의 연접부에 형성된 부분 차단부재로 구성될 수 있다.
이때, 부분 차단부재는 기본적으로 1차 믹싱영역에 포함된 부분 차단부재와 형상 및 기능면에서 동등한 것으로 해석될 수 있다. 즉, 상기 2차 믹싱영역에 포함된 부분 차단부재는 상호 연접된 성상교세포 챔버의 일부와 심경세포 챔버의 일부를 완전히 개통하지 않고 부분적으로 개통하는 역할을 수행하는데, 이는 신경세포의 고정 이전에 신경세포 챔버 내부에 주입된 신경세포 혼합물에 포함된 신경세포가 성상교세포 챔버의 내부로 이동하는 것과 성상교세포의 고정 이전에 성상교세포 챔버 내부에 주입된 성상교세포 혼합물에 포함된 성상교세포가 신경세포 챔버의 내부로 이동하는 것을 모두 방지하면서도, 상기 부분적으로 개통된 부위를 통해, 성상교세포 챔버를 통과하여 배양액 채널로부터 공급된 배양액이 신경세포 챔버에 고정된 신경세포로 이동하는 것을 허용하여, 결과적으로는 효과적인 성상교세포 및 신경세포 배양에 일조한다.
상기 부분 차단부재는 상술한 기능성을 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 이격되어 각 채널 및 챔버의 연장방향을 따라서 일렬로 배치된 미세 기둥 구조물이 될 수 있는데, 이는 그의 이격된 영역을 통해, 배양액 채널의 일부영역과 성상교세포 챔버의 일부영역의 사이 및 상기 성상교세포 챔버의 일부영역과 신경세포 챔버의 일부영역의 사이로 배양액의 상호 유통을 허용하는 역할을 수행할 수 있다.
구체적으로, 상기 미세 기둥 구조물은 그의 이격된 영역을 통해, 상호 연접된 배양액 채널의 일부영역과 성상교세포 챔버의 일부영역의 사이 및 상기 성상교세포 챔버의 일부영역과 신경세포 챔버의 일부영역의 사이를 완전히 개통하지 않고 부분적으로 개통하는 역할을 수행하는데, 이를 통해 성상교세포 및 신경세포의 이동을 방지하고, 배양액의 상호 유통을 허용할 수 있다.
이를 위하여, 상기 미세 기둥 구조물의 형태는 상술한 기능성을 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 단면의 형상이 세로로 긴 육각형 형태가 될 수 있는데, 이는 육각형 형태의 미세 기둥 구조물의 배열은 챔버 및 채널들 사이에 병목구조의 이동통로들을 형성하며, 이동통로가 좁아지는 부분의 표면장력을 극대화시켜 유체의 경계를 쉽게 형성할 수 있게 해주며, 세로로 긴 형상은 형성된 유체의 경계간 사이의 거리를 증가 시키며, 이는 배양액 혹은 세포 혼합물을 주입 동안 경계 사이의 간극이 쉽게 붕괴되지 않기 때문에 주입물의 혼합을 안정적으로 예방할 수 있다.
따라서, 배양액 채널에 배양액을 주입할 때, 미세 기둥 구조물에 의해 이동통로가 좁아지는 부분에서 표면장력에 의해 경계가 형성되게끔 유도하고, 성상교세포 챔버에 성상교세포 혼합물을 주입할 때, 미세 기둥 구조물에 의해 이동통로가 좁아지는 부분에서 표면장력에 의해 경계가 형성되게끔 유도하며, 마찬가지로 신경세포 챔버에 신경세포 혼합물을 주입할 때, 미세 기둥 구조물에 의해 이동통로가 좁아지는 부분에서 표면장력에 의해 경계가 형성되게끔 유도함으로써, 상기 미세 기둥 구조물을 중심으로 신경세포 챔버, 성상교세포 챔버 및 배양액 채널 각각의 사이에 빈 간격(gap)이 형성됨에 따라 분리 밸브 혹은 분리막의 존재가 없어도 각각의 분리 주입이 원활하게 수행되게 하기 위함이다.
또한, 상기 미세 기둥 구조물의 크기는 상술한 기능성을 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 가로 30 내지 50㎛ 및 세로 90 내지 110㎛의 크기를 나타낼 수 있고, 다른 예로서, 가로 35 내지 45㎛ 및 세로 95 내지 105㎛의 크기를 나타낼 수 있으며, 또 다른 예로서, 가로 40㎛ 및 세로 100㎛의 크기를 나타낼 수 있다. 이처럼 미세 기둥 구조물의 가로길이와 세로길이를 달리 설정한 이유는 가로길이를 세로길이보다 짧게 하여, 배양액의 흐름을 방해하지 않고 배양액이 배양액 채널로부터 성상교세포 챔버를 지나 신경세포 챔버로 유입되도록 하고, 세로길이는 상기 언급한 거와 같이 유도된 경계 형성부위의 거리를 충분히 하여 신경세포 챔버와 성상교세포 챔버 사이 및 성상교세포 챔버와 배양액 채널 사이에 각각 빈 간격(gap)이 재현성있게 형성되도록 유도하기 위한 것이다.
본 발명의 용어 "가로"는 성상교세포 챔버의 바닥에서 수직으로 세워진 미세기둥의 면 중에서, 배양액 채널, 성상교세포 챔버 및 신경세포 챔버의 연장방향과 평행한 방향의 면을 의미한다.
본 발명의 용어 "세로"는 성상교세포 챔버의 바닥에서 수직으로 세워진 미세기둥의 면 중에서, 배양액 채널, 성상교세포 챔버 및 신경세포 챔버의 연장방향과 수직인 방향의 면을 의미한다.
아울러, 상기 각 미세 기둥 구조물간의 이격 길이는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 20 내지 40㎛의 길이를 나타낼 수 있고, 다른 예로서, 25 내지 35㎛의 길이를 나타낼 수 있으며, 또 다른 예로서, 30㎛의 길이를 나타낼 수 있다.
3. 신경세포 공급부
본 발명에서 제공하는 생체모방 신경칩에 포함된 신경세포 공급부는 신경세포 유입구, 신경세포 유출구, 신경세포 챔버 및 신경세포 채널을 포함한다.
상기 신경세포 유입구는 신경세포 챔버에 공급하기 위한 기능성분인 신경세포와 보조성분의 혼합물을 유입하는 역할을 수행하는데, 예를 들어, 신경세포 유입구에 신경세포와 보조성분의 혼합물이 로딩된 주사기의 노즐이 연결될 수 있는 구조를 갖도록 구성될 수 있다.
본 발명에서 사용된 신경세포는 생체모방 신경칩의 신경세포 챔버 내부에 고정되어 생체 내 신경세포의 기능을 모사할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 줄기세포로부터 분화된 신경세포가 될 수 있다.
앞서 "2. 성상교세포 공급부"에서 설명한 바와 유사하게, 상기 신경세포 혼합물 역시 신경세포와 상기 신경세포의 유통과 고정을 보조하는 보조성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 생체모방 신경칩은 이에 포함된 신경세포 챔버내부에 정렬되어 고정된 형태로 존재하는 신경세포를 포함하게 되는데, 이와 함께 상기 신경세포 챔버 내부에 신경세포의 주입과 고정을 보조하는 보조성분을 포함할 수 있다. 상기 보조성분의 기능 및 구성은 앞서 "2. 성상교세포 공급부" 항목에서 설명한 바와 동일하다.
상기 보조성분의 일 양태로서 하이드로젤을 사용할 경우, 상기 신경세포와 하이드로젤의 혼합물은 신경세포의 3차원 배양을 보조하고, 추가적으로 상기 신경세포에 유동성을 부여하여, 상기 신경세포가 신경세포 유입구로부터 신경세포 채널을 통해 신경세포 챔버로 이동할 수 있게 하며, 상기 혼합물이 신경세포 챔버로 이동한 후, 이에 포함된 하이드로젤이 경화되면, 상기 경화된 하이드로젤 내에 포함된 신경세포가 자연스럽게 고정될 수 있는데, 하이드로젤의 내재적인 다공성 특징으로 인하여, 하이드로젤을 통해 외부의 배양액이 신경세포에 전달될 수 있어, 고정된 신경세포의 배양을 보조할 수 있다. 이때, 상기 하이드로젤의 경화조건은 앞서 "2. 성상교세포 공급부" 항목에서 설명한 바와 동일하다.
상기 신경세포 챔버는 상술한 바와 같이, 신경세포 유입구를 통해 공급된 신경세포 혼합물이 저장, 고정 및 배양될 뿐만 아니라, 고정된 신경세포를 배양하기 위한 배양용기로서의 역할을 수행할 수 있다.
상술한 바와 같이, 상기 신경세포 챔버의 내부에 주입된 신경세포는 이와 함께 혼합물의 형태로 주입된 보조성분에 의해 신경세포 챔버의 내부에 고정될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신경세포 챔버는 신경조직의 가장 기본적인 단위인 신경세포를 모사한 형태인 것으로 해석될 수 있다. 이에 따라, 상기 신경세포 채널의 폭은 신경세포의 고정 및 배양을 수행할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 가로 2.5 내지 4.5mm x 세로 0.5 내지 1.5mm의 크기를 가질 수 있고, 다른 예로서, 가로 3 내지 4mm x 세로 0.75 내지 1.25mm의 크기를 가질 수 있으며, 또 다른 예로서, 가로 3.5mm x 세로 1mm의 크기를 가질 수 있다.
상기 신경세포 채널은 상기 신경세포 챔버의 일 측단과 신경세포 유입구 사이 및 상기 신경세포 챔버의 다른 일 측단과 신경세포 유출구 사이에 각각 구비되어 연통되는 부위로서, 상기 신경세포 유입구를 통해 공급된 신경세포 혼합물을 신경세포 챔버로 전달하고, 상기 신경세포 챔버 내에 과잉된 신경세포 혼합물을 신경세포 유출구로 전달하는 역할을 수행한다. 아울러, 상기 배양액 채널로부터 유입된 배양액의 과잉분 및 신경세포로부터 분비된 각종 대사산물, 노폐물 등을 외부로 방출하기 위한 중간통로로서의 역할을 수행할 수 있다.
상기 신경세포 유출구는 신경세포 챔버에 고정된 신경세포를 배양하면서 상기 신경세포로부터 생성된 대사산물 또는 노폐물 등의 오염물을 외부로 배출하는 역할을 수행할 수 있다. 이처럼 오염물을 배출하는 역할은 신경세포 유출구 뿐만 아니라 신경세포 유입구도 함께 수행할 수 있다. 즉, 신경세포를 신경세포 채널을 통해 신경세포 챔버에 유입하는 역할이 종료된 신경세포 유입구는 신경세포 챔버에 고정된 신경세포를 배양하면서 생성되는 오염물을 외부로 배출하는 역할을 수행할 수도 있다.
상기 신경세포 유출구의 형상은, 신경세포 챔버에 고정된 신경세포로부터 분비된 각종 대사산물, 노폐물 등의 오염물을 외부로 배출하는 역할을 수행할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 다만, 상기 오염물로 인한 신경세포 주변환경의 오염을 방지하기 위하여 튜브 또는 주사기의 노즐이 결합될 수 있는 형태로 구성될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩은 적어도 하나의 배양액 공급부, 하나의 성상교세포 공급부 및 하나의 신경세포 공급부를 기본적으로 포함하지만, 상기 생체모방 신경칩을 사용하는 목적에 따라, 다수의 배양액 공급부, 성상교세포 공급부 및 신경세포 공급부를 포함할 수도 있다.
예를 들어, 복수개의 배양액 공급부와 하나의 성상교세포 공급부 및 하나의 신경세포 공급부를 포함하거나, 복수개의 성상교세포 공급부와 하나의 배양액 공급부 및 하나의 신경세포 공급부를 포함하거나, 복수개의 신경세포 공급부와 하나의 배양액 공급부 및 하나의 성상교세포 공급부를 포함하거나, 복수개의 배양액 공급부 및 복수개의 성상교세포 공급부와 하나의 신경세포 공급부를 포함하거나, 복수개의 배양액 공급부 및 복수개의 신경세포 공급부와 하나의 성상교세포 공급부를 포함하거나, 복수개의 성상교세포 공급부 및 복수개의 신경세포 공급부와 하나의 배양액 공급부를 포함하거나, 복수개의 배양액 공급부, 복수개의 성상교세포 공급부 및 복수개의 신경세포 공급부를 포함할 수 있다.
특히, 복수개의 배양액 공급부, 성상교세포 공급부 및 신경세포 공급부를 포함하는 경우, 다수의 1차 및 2차 믹싱영역이 형성될 수 있는데, 이때, 각 채널간의 간섭을 배제하기 위하여, 생체모방 신경칩을 3차원적으로 구성하여 복수개의 동일한 채널이 인접하지 않도록 구성되거나 또는 인접하더라도 상호 완전 격리되도록 구성함이 바람직하다.
이하, 본 발명의 도 1 내지 도 5를 참조하여, 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩의 구조를 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명에서 제공하는 생체모방 신경칩(1)은 슬라이드 글라스(2)위에 구비된 구조물의 형태로서, 신경세포 유입구(6), 신경세포 유출구(7), 신경세포 채널(11) 및 신경세포 챔버(12)로 구성된 신경세포 공급부를 중심으로, 성상교세포 유입구(4), 성상교세포 유출구(5), 성상교세포 채널(9) 및 성상교세포 챔버(10)로 구성된 두 세트의 성상교세포 공급부가 상단과 하단에 각각 구비되고, 상기 성상교세포 공급부의 상단과 하단에 배양액 저장챔버(3) 및 배양액 채널(8)로 구성된 두 세트의 배양액 공급부가 각각 구비된 형태이다.
상기 성상교세포 챔버(10)의 일부는 배양액 채널(8)의 일부와 1차 믹싱영역을 형성하고, 신경세포 챔버(12)의 일부와 2차 믹싱영역을 형성하는데, 상기 각 믹싱영역은 이격되어 각 채널의 연장방향을 따라서 일렬로 배치된 미세 기둥 구조물(13)에 의해 각각 구별된다.
본 발명의 다른 실시양태는 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩을 이용하여, 신경세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 신경세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법은 (a) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩에 포함된 성상교세포 챔버에 포함된 성상교세포와 신경세포 챔버에 포함된 신경세포를 배양하는 단계; (b) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩에 포함된 배양액 저장챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및, (c) 상기 배양된 성상교세포 및 신경세포의 변화를 평가하는 단계를 포함한다.
먼저, 상기 성상교세포를 배양하게 되면, 별 형상의 기본적인 형태를 형성하게 되는데, 이러한 세포의 형태가 변화되는지의 여부를 측정하여, 상기 약물이 성상교세포에 미치는 효과를 평가할 수 있다. 예를 들어, 약물의 투여 후, 성상교세포의 형태가 별 형상을 유지하면, 상기 약물은 생체 내에서 성상교세포에 악영향을 나타내지 않는 제제로서 사용될 수 있는 것으로 평가할 수 있다. 이에 반하여, 약물을 투여한 후, 성상교세포가 별 형상을 유지하지 못하고 세포가 응집되면, 상기 약물은 생체 내에서 성상교세포의 퇴화를 유도하는 제제로서의 역할을 수행할 것으로 평가할 수 있다.
다음으로, 상기 신경세포를 배양하게 되면, 온전한 신경세포체 및 신경돌기를 형성하고, 이로 인하여 신경돌기망을 구성하게 되는데, 이처럼 구성된 신경돌기망은 신경세포의 주요기능에 필수적인 구성요소이기 때문에, 상기 신경돌기 및 신경돌기망의 수준을 측정하여, 상기 약물이 신경세포에 미치는 효과를 평가할 수 있다. 예를 들어, 약물의 투여 후, 신경돌기의 수준이 증가되면, 상기 약물은 생체 내에서 신경의 형성을 촉진시키는 제제로서의 역할을 수행할 것으로 평가할 수 있다. 이에 반하여, 약물을 투여한 후, 신경돌기의 수준이 감소되면, 상기 약물은 생체 내에서 신경의 퇴화를 유도하는 제제로서의 역할을 수행할 것으로 평가할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩을 이용하여, 신경세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 신경세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법은 (a) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩에 포함된 성상교세포 챔버에 포함된 성상교세포와 신경세포 챔버에 포함된 신경세포를 배양하는 단계; (b) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩에 포함된 배양액 저장챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및, (c) 상기 배양된 성상교세포 및 신경세포의 손상여부를 평가하는 단계를 포함한다.
상술한 바와 같이, 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩을 이용하면, 성상교세포 및 신경세포를 통해 상기 공급된 약물이 성상교세포 및 신경세포에 독성을 나타내는지의 여부를 평가할 수 있다.
즉, 상기 생체모방 신경칩에 포함된 배양액 저장챔버에 약물을 투여하면, 상기 약물이 배양액과 함께 성상교세포에 공급된 후, 성상교세포에 의해 변형된 산물을 생성할 수 있고, 이처럼 변형된 산물이 신경세포에 처리되면, 이로 인하여 상기 약물이 아닌 약물이 성상교세포에서 변형된 산물이 신경세포를 지속적으로 또는 급격히 손상시키는 증상을 나타내는지를 확인할 수 있으므로, 보다 생체 내 환경과 유사한 환경에서 약물이 신경세포에 미치는 독성을 평가할 수 있다.
이러한 독성의 평가는 상술한 바와 같이 성상교세포의 형태 또는 신경돌기의 수준을 이용하여 수행될 수 있다. 즉, 약물을 투여한 후, 성상교세포가 별 형상을 유지하지 못하고 세포가 응집되거나, 또는 신경돌기의 수준이 감소되면, 상기 약물은 생체 내에서 성상교세포 및 신경세포에 독성을 나타내는 제제인 것으로 평가할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩을 사용하면, 신경조직 연구에 있어서 동물실험의 이종간의 차이에 따른 부정확성을 극복할 수 있고, 성상교세포와 신경세포를 복합적으로 사용하여 생체 내 조건과 유사한 조건에서 약물의 보다 정확한 효능 및 독성을 평가하는 플랫폼으로의 사용이 가능하며, 신경조직 내 미세환경 연구 및 다른 장기칩(organ-on-a-chip)의 연구 등에 응용될 수 있으므로, 약물 유효성 및 독성 등을 효과적으로 분석할 수 있는 휴먼온어칩(human-on-a-chip) 개발에 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 생체모방 신경칩의 입체도 및 칩 내 구성요소가 포함된 전체 모식도이다.
도 2는 본 발명의 생체모방 신경칩의 입체도이다.
도 3은 본 발명의 생체모방 신경칩의 미세유체소자 부분의 평면도이다.
도 4는 본 발명의 생체모방 신경칩 내 미세유체소자 부분의 신경세포 챔버와 채널, 성상교세포 챔버와 채널 및 배양액 채널을 확대한 모식도이다.
도 5는 본 발명의 생체모방 신경칩 내 미세유체소자 부분의 미세 기둥구조를 확대한 모식도이다.
도 6는 본 발명의 생체모방 신경칩의 실제 사진과 칩 내 각 챔버 및 채널 내로 식용색소를 주입함으로써 선택적인 분리 주입이 가능한지 확인한 현미경사진이다.
도 7a는 본 발명의 생체모방 신경칩 내 신경세포 및 성상교세포의 공동배양이 가능한지와 해당 세포의 선택적인 분리 주입 구현이 가능한지를 확인한 현미경 사진이다.
도 7b는 세포별 특이마커로 사용되는 항체들을 이용한 면역염색법을 통해 본 발명의 생체모방 신경칩 내에서 신경세포 및 성상교세포가 건강한 상태로 공동배양되는지 확인한 공초점 현미경 사진이다.
도 8a는 본 발명의 생체모방 신경칩 내에 신경세포만을 단독으로 3일 동안 배양하고 신경독성을 유발하는 물질인 MeHg를 5μM의 농도로 처리한 후 3시간 동안 1시간 간격으로 신경세포의 생존율 및 형태 변화를 관찰하기 위해 Calcein-AM으로 염색하여 관찰한 공초점 현미경사진이다.
도 8b는 본 발명의 생체모방 신경칩 내에 신경세포만을 단독으로 3일 동안 배양하고 신경독성을 유발하는 물질인 MeHg를 1, 5, 10μM의 농도로 처리하고 3시간 후 농도별 신경세포의 생존율 및 형태 변화를 관찰하기 위해 Calcein-AM으로 염색하여 관찰한 공초점 현미경사진이다.
도 8c는 본 발명의 생체모방 신경칩 내에 신경세포만을 단독으로 3일 동안 배양하고 신경독성을 유발하는 물질인 MeHg를 1, 5, 10μM의 농도로 처리하고 3시간 후 농도별 신경세포의 정체성 확인 및 형태와 내부 단백질 발현 변화를 관찰하기 위해 신경세포 특이적 마커들인 Tuj1과 MAP2로 염색하여 관찰한 공초점 현미경사진이다.
도 9a는 본 발명의 생체모방 신경칩 내에 성상교세포를 3일 동안 배양하고 신경독성을 유발하는 물질인 MeHg를 5μM의 농도로 처리한 후 3시간 동안 1시간 간격으로 성상교세포의 생존율 및 형태 변화를 관찰하기 위해 Calcein-AM으로 염색하여 관찰한 공초점 현미경사진이다.
도 9b는 본 발명의 생체모방 신경칩 내에 성상교세포를 3일 동안 배양하고 신경독성을 유발하는 물질인 MeHg를 1, 5, 10μM의 농도로 처리하고 3시간 후 농도별 성상교세포의 생존율 및 형태 변화를 관찰하기 위해 Calcein-AM으로 염색하여 관찰한 공초점 현미경사진이다.
도 9c는 본 발명의 생체모방 신경칩 내에 성상교세포를 3일 동안 배양하고 신경독성을 유발하는 물질인 MeHg를 1, 5, 10μM의 농도로 처리하고 3시간 후 농도별 성상교세포의 정체성 확인 및 형태와 내부 단백질 발현 변화를 관찰하기 위해 성상교세포 특이적 마커들인 GFAP과 S100B로 염색하여 관찰한 공초점 현미경사진이다.
도 10a는 본 발명의 생체모방 신경칩 내에 3일 동안 신경세포만 단독으로 배양한 조건과 성상교세포와 함께 공동배양한 조건 하에서 신경독성을 유발하는 물질인 MeHg를 10μM의 농도로 처리한 후 3시간 동안 1시간 간격으로 신경세포의 생존율과 형태 변화를 통해 성상교세포에 의한 신경세포 보호기능을 확인하기 위해 Calcein-AM으로 염색하여 관찰한 공초점 현미경사진이다.
도 10b는 본 발명의 생체모방 신경칩 내에 3일 동안 신경세포만 단독으로 배양한 조건과 성상교세포와 함께 공동배양한 조건 하에서 신경독성을 유발하는 물질인 MeHg를 1, 5, 10μM의 농도로 처리하고 3시간 후 농도별 신경세포의 생존율 및 형태 변화를 통해 성상교세포에 의한 신경세포 보호기능을 확인하기 위해Calcein-AM으로 염색하여 관찰한 공초점 현미경사진이다.
도 10c는 본 발명의 생체모방 신경칩 내에 3일 동안 신경세포만 단독으로 배양한 조건과 성상교세포와 함께 공동배양한 조건 하에서 신경독성을 유발하는 물질인 MeHg를 1, 5, 10μM의 농도로 처리하고 3시간 후 농도별 신경세포의 정체성 확인 및 형태와 내부 단백질 발현 변화를 통해 성상교세포에 의한 신경세포 보호기능을 확인하기 위해 신경세포 특이적 마커인 MAP2로 염색하여 관찰한 공초점 현미경사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인간 줄기세포 기반 신경세포 및 성상교세포의 확보
인간 줄기세포(hPSCs)로부터 분화된 신경세포는 NEXEL 사의 신경세포 (Neurosight-S)를 통해 확보하였다. Stock을 해동(thawing)하여 바로 칩 내 주입을 하였으며, 주입에 적절한 농도인 15 x 104개/6㎕로 준비하고 이를 본 발명의 신경칩에 포함된 신경세포 유입구에 로딩하여 신경세포 채널을 지나 신경세포 챔버에 주입하였다. 이 때, 신경세포 챔버의 바닥은 칩 내 안정적인 부착을 위해 평소보다 3배가량 더 농축하여 제작한 Matrigel로 코팅하였으며, Supplement(100X)를 보충한 Neurosight-S 배지로 신경돌기망이 형성될 수 있는 3일 동안 배양하였다.
인간 줄기세포(hPSCs)로부터 분화된 성상교세포의 경우 직접 분화하여 확보하였다. 인간 줄기세포(hPSCs)를 Matrigel이 코팅된 배양 접시(culture dish)에서 TeSr-E8배지를 이용하여 배양과 계대를 통해 유지하였으며, 신경세포로의 분화를 하기 위해 우선적으로 신경전구세포(neural progenitor cells, NPCs)를 만들었다. Collagen IV를 이용하여 줄기세포 콜로니를 띄어낸 뒤, 20% knock out serum replacement, 1% nonessential amino acids, 55μM β-mercaptoethanol, 10μM SB431542, 5μM DMH1이 포함된 DMEM/F12 배지로 embryoid bodies(EBs)를 형성한 뒤, 이를 다시 Matrigel이 코팅된 배양 접시에 붙이고 1% N2 supplement, 2.5㎕/㎖ insulin, 20ng/㎖ basic fibroblast growth factor가 포함된 DMEM/F12 배지로 neural rosettes을 형성했다. 이 rosettes의 가운데만을 가늘게 뺀 파스츄어 파이펫으로 떼어낸 뒤 1% N2 supplement, 20ng/㎖ basic fibroblast growth factor, 20ng/㎖ epidermal growth factor가 포함된 DMEM/F12 배지로 배양함으로써 NPCs를 확보하였다. 확보된 NPCs를 다시 Matrigel이 코팅된 배양 접시에 2.8 x 103개/cm의 밀도로 붙이고 1% N2 supplement, 2% vitamin A-removed B27 supplement, 10ng/㎖ bone morphogenetic protein-4, 10ng/㎖ ciliary neurotrophic factor, 10ng/㎖ leukemia inhibitory factor를 포함한 DMEM/F12 배지로 배양함으로써 최종적으로 분화된 성상교세포를 확보하였다.
이렇게 확보된 성상교세포는 주입에 적절한 농도인 15 x 104개/60㎕로 준비하고 30㎕씩을 본 발명의 신경칩에 포함된 성상교세포 유입구에 로딩하여 성상교세포 채널을 지나 두 개의 각 성상교세포 챔버에 주사기 펌프를 이용하여 주입하였다. 마찬가지로, 성상교세포 챔버의 바닥은 칩 내 안정적인 부착을 위해 평소보다 3배가량 농축하여 제작한 Matrigel로 코팅하였으며, Neurosight-S 배지를 이용하여 3일 동안 신경세포와 함께 공동배양을 수행하였고, 이와 같은 배지로 성상교세포를 배양하였을 때 이상이 없음을 확인하였다. 모든 세포는 37℃ 및 5% CO2에서 가습한 인큐베이터에 보관하였다.
실시예 2: 생체모방 신경칩의 제작
생체모방 신경칩은 PDMS(polydimethylsiloxane)탄성중합체와 슬라이드글라스(slide glass)를 이용하여 제작하였다. PDMS는 광학적으로 투명하며 매우 내구성이 강한 중합체로, 생물 친화적이기 때문에 세포에 해를 가하지 않고, 투명하고 유연한 재질이기 때문에 광학적 방법을 이용하여 손쉽게 독성물질에 대한 신경세포 및 성상교세포의 상태를 분석가능하다는 장점이 있다.
생체모방 신경칩의 도면은 칩 내부에 생체 내 신경세포와 인접한 미세환경을 구현하기 위해, 하기와 같은 신경계의 5가지 생리학적 특징들을 고려하여 AutoCAD 프로그램을 통해 설계되었다: 1) 신경계는 신경세포 및 신경교세포 2가지 유형의 세포들로 구성된다; 2) 인간 뇌에서의 신경교세포와 신경세포의 비율(GNR)은 약 1:1이다; 3) 물질대사적 측면에서의 신경세포-성상교세포간의 상호작용으로써 영양소가 혈관으로부터 성상교세포를 통해 신경세포로 전달된다; 4) 신경세포는 인간 뇌 내부 세포 간 소통로로서 역할을 하는 뇌간질액(ISF)의 흐름 아래에 항상 노출된다; 5) 신경세포는 MeHg 독성으로부터 성상교세포에 의해 보호된다.
75㎛ 높이의 주형(mold)를 생성하기 위한 필름 마스크(film mask)를 제작 하고, 이를 이용하여 포토레지스트(photoresist; PR)인 감광액 SU-8(MICROCHEM)과 광식각(photolithography)기법을 사용하여 주형(mold)을 제작하여, 칩 내 미세구조가 구현된 PDMS 기반 미세유체소자를 제작하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다:
실리콘 웨이퍼(wafer) 위에 감광액을 약 1.5㎖ 가량 떨어뜨린 후 스핀 코터 (spin coater)를 이용하여 75㎛ 두께로 고르게 도포(PR coating)한 다음, 80℃로 가열된 핫 플레이트(hot plate) 위에 웨이퍼를 올려 약 10분 가량 소프트 베이킹(soft baking)을 수행함으로써 습기를 제거하고 웨이퍼 위의 감광액이 표면에 단단하게 부착될 수 있게 하여, 감광액 현상(PR developing) 시 자외선에 노출된 부분이 떨어져 나가지 않도록 방지하였다. 감광액이 도포된 웨이퍼 위에 필름 마스크를 정렬한 뒤 그 위에 자외선 노광 마스크 얼라이너(UV exposable mask aligner)를 이용하여 자외선을 조사하였는데, 이처럼 자외선 노광(UV exposure)을 받은 네거티브 포토레지스트는 자외선이 노출된 부분이 더욱 단단해짐을 확인하였다.
이후, 감광액 현상액(PR developer; SU-8 developer, MICROCHEM)에 약 1분 30초 동안 담가 감광액을 현상(PR developing)하여 자외선에 노출되지 않은 부분을 선택적으로 제거하였다. 마지막으로 탈이온수(Deionized water; DI water)로 웨이퍼를 세척하고 질소로 건조시킨 뒤, 웨이퍼를 약 10분 동안 80℃에 두어 노광 후 베이킹(post exposure baking) 과정을 수행하여 미세구조가 패터닝된 최종 주형(mold)를 수득하였다.
상기 감광액 패터닝(PR patterning)이 완료된 주형(mold) 위에 PDMS 실리콘계 엘라스토머(silicone base elastomer)와 경화제(curing agent, SYLGARD 184 silicone elastomer kit, Dow Corning)의 비율을 10:1로 섞어 SU-8 주형 위에 부은 뒤 80℃에서 overnight으로 열처리를 가해 굳혔다. 이를 주형으로부터 분리해낸 후, PDMS를 칩의 크기에 따라 자른 뒤 원통형 1.5mm 및 6mm 직경의 생검 펀치(biopsy punch)를 이용하여 신경세포 유입구 및 유출구, 성상교세포 유입구 및 유출구와 배양액 저장챔버를 각각의 크기에 맞게 펀치아웃(punch out)하였다.
상기 제작된 미세유체소자는 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol)이 담겨있는 초음파 발생 장치(sonicator)에 PDMS 기반 미세유체소자를 담가 60초간 초음파 처리(sonication)를 수행하여 세척한 후 질소 에어건(air-gun)으로 완벽하게 증발시켰다. 세척이 완료된 PDMS기반 미세유체소자와 슬라이드글라스는 70℃ 드라이 오븐(dry oven) 내에서 5분 동안 건조시킨 뒤 3시간 동안 자외선에 노출시켜 멸균시켰다. 최종적으로, PDMS 기반 미세유체소자와 슬라이드 글라스를 플라즈마 처리기(plasma processing system, CUTE, FEMTO Science)에 넣고 산소 플라즈마 처리(oxygen plasma treatment)를 통해 접착시켜 생체모방 신경칩을 제작하였다.
접착된 생체모방 신경칩은 35mm 페트리 디쉬(petri dish)에 넣고, 플라즈마 처리에 의한 접착력을 단단하게 하기 위해 80℃로 가열된 핫플레이트(hot plate) 위에서 15분 동안 열을 가한 후 추후 분리 주입을 위한 후처리 공정을 70℃ 오븐에서 48시간 동안 수행하였다. 이 같은 후처리 공정은 원하는 채널에 해당 구성요소를 선택적으로 주입하기 위하여 수행하였다.
상기와 같이 제작된 생체모방 신경칩의 크기는 가로 3.5cm, 세로 1.9cm 이며 칩 내 모든 미세구조의 높이는 75㎛로 설정하였다.
도 1에서 보듯이, 신경칩의 주요 내부 미세구조는 중앙에 위치하는 신경세포 챔버, 이와 인접하는 2개의 성상교세포 챔버, 가장 바깥쪽에 위치하는 2개의 배양액 채널 및 각 챔버들과 채널들의 사이공간에 위치하는 4줄의 미세 기둥(micro-post) 구조 배열로 구성되었다. 이러한 배치를 함으로써, 생체 내 미세환경에서 영양소가 혈관에서 성상교세포들을 통해 신경세포들로 전달되는 것과 마찬가지로, 측면에 위치하는 배양액 채널들로부터 성상교세포 챔버들을 통과하고, 최종적으로, 신경세포 챔버에 도달하는 배양액 흐름을 고려하였다.
실제 준비된 세포의 크기는 성상교세포가 신경세포보다 크기 때문에 여러 번의 배양실험을 통해 신경세포 챔버의 면적과 2개의 성상교세포 챔버의 총 면적의 비율을 세포 크기에 비례하여 생체 내 신경세포와 신경교세포의 비율과 유사한 1:1의 비율로 주입될 수 있게 신경세포 챔버는 가로 3.5mm x 세로 1mm로 설정하였고, 각각의 성상교세포 챔버는 가로 4mm x 세로 4mm로 설정하였다.
또한, 기존 선행연구들처럼 각 세포들을 주입하기 위한 채널을 통해 직접적으로 배양액을 주입할 때 세포 챔버 내에 발생할 수 있는 고속의 배양액 흐름에 의한 전단응력(shear stress)을 최소화하면서 생체 내 뇌간질액(ISF)의 흐름과 유사하게 저속으로 배양액이 흐르는 환경을 구현할 수 있게, 배양액 저장 챔버로부터 배양액의 장거리 이동을 유도할 수 있는 긴 배양액 채널을 최외각에 배치하였고, 생체 내 혈관과 유사한 크기로 설정하고자 배양액 채널의 폭은 60㎛으로 설정하였다.
특정 세포를 칩 내 원하는 공간에 선택적으로 주입하기 위해서는 일반적으로 다른 공간과 물리적으로 분리할 수 있는 미세 밸브가 필요하다. 그러나 대부분의 미세 밸브는 번거로운 작동법 및 외부 구동력을 필요로 하며, 기존 선행연구를 통해 알려진 미세 기둥 구조만으로는 서로 인접해 있는 챔버들에 재현성있게 분리 주입하기는 매우 어렵다.
따라서, 본 발명에서는 도 5처럼 가로 40㎛ x 세로 100㎛의 세로로 긴 육각형 형태의 미세 기둥 구조를 챔버와 채널들 사이에 4개의 배열로 구성하였고, 각각의 미세 기둥은 30㎛씩 이격되어 배치하였다.
세로로 긴 육각형 형태로 미세 기둥 구조를 디자인한 이유는 첫째 육각형 형태의 미세 기둥의 배열은 챔버 및 채널들 사이에 병목구조의 이동통로들을 형성하며 이는 이동통로가 좁아지는 부분의 표면장력을 극대화시켜 유체의 경계를 쉽게 형성하게 할 것으로 기대되었다. 둘째 세로로 긴 형상은 형성된 유체의 경계간 사이의 거리를 증가 시키며, 이는 세포 주입 동안 경계 사이의 간극이 쉽게 붕괴되지 않기 때문에 유체 혼합을 안정적으로 예방할 수 있을 것으로 기대되었다.
도 6에서 볼 수 있듯이, 주사기 펌프를 사용하여 식용색소를 각 챔버 및 채널에 주입하여 미세 밸브 혹은 분리막의 존재가 없어도 서로 인접해 있는 신경세포 챔버, 성상교세포 챔버, 배양액 채널 내로 유체의 혼합없이 주입 될 수 있는지를 확인하였으며, 챔버 및 채널들 사이의 미세 기둥 구조에 의해 빈 간격(gap)이 잘 형성되었음을 확인하였다.
신경세포와 성상교세포를 주입하기 위한 각 유입구(inlet)와 유출구(outlet)의 지름은 1.5mm 이며, 배양액 저장챔버의 지름은 6mm으로 설정하였다.
실시예 3: 생체모방 신경칩 내 구성요소들을 이용한 생체유사환경 구축 방법
먼저, 상기에서 언급하였듯이, 칩 내 세포의 안정적인 부착을 위해 평소보다 3배가량 더 농축하여 준비한 Matrigel을 담지한 주사기의 노즐을 성상교세포 챔버 및 채널과 연결된 성상교세포 유입구에 연결한 뒤, 주사기 펌프(syringe pump, NE-1000, NEWERA)를 이용하여 분리 주입하였다. 이어서 마찬가지로 Matrigel을 담지한 주사기의 노즐을 신경세포 챔버 및 채널과 연결된 신경세포 유입구에 연결한 뒤 주사기 펌프를 이용하여 분리 주입하고 미세 기둥 구조로 인해 형성되는 병목구조의 좁아지는 부분에 Matrigel이 경계를 이루는 것을 확인함으로써 성공적인 분리 주입이 이루어졌음을 확인하였다. 이후 약 1시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 가습한 인큐베이터에서 코팅을 수행하고, 코팅이 완료된 시점에서 dPBS를 이용하여 신경세포 챔버와 성상교세포 챔버를 세척하였다.
세포주입은 반대로 인간 줄기세포 유래 신경세포(Neurosight-S)를 우선적으로 주입하며, 주입에 적절한 농도인 15 x 104개/6㎕로 준비하고 신경세포 유입구에 로딩하여 신경세포 챔버에 주입하며, 인간 줄기세포 유래 성상교세포는 주입에 적절한 농도인 15 x 104개/60㎕로 준비하고 30㎕씩을 담지한 주사기 노즐을 성상교세포 유입구에 연결하고 두 개의 각 성상교세포 챔버에 주사기 펌프를 이용하여 주입하였다.
이후 2개의 배양액 저장챔버에 배지를 100㎕을 로딩하고 파이펫을 이용하여 각 양쪽에 위치한 배양액 채널 내부에 배양액을 채운 뒤 나머지 2개의 배양액 저장챔버에 배지를 100㎕을 로딩하여 배양액 저장챔버 간에 배양액의 흐름이 연결되도록 하였다. 이때, 미세 기둥 구조로 인해 형성되는 병목구조의 좁아지는 부분에 배양액이 경계를 이루는 것을 확인하였다. 신경칩에 분리 주입 시 형성된 간격(gap)은 일시적으로 형성되었다가 세포의 분리 주입이 완료되면 자연스럽게 사라지며, 칩 내부에 모든 간격이 사라지게 되면 37℃ 및 5% CO2에서 가습한 인큐베이터에서 배양하였다.
배양액은 매일 신선한 배양액으로 교체하여 지속적인 배지흐름과 신선한 영양분을 제공하였고, 배양액 교체 시 신경세포 유입구 및 유출구, 성상교세포 유입구 및 유출구로 배출된 배양액을 제거함으로써 노폐물을 제거하면서 배양하였다.
도 7a에서 볼 수 있듯이, 칩 내 신경세포는 부착함과 동시에 신경돌기(neurites)를 생성하여 배양 3일쯤에 완전한 신경돌기망을 형성하며, 성상교세포의 경우도 부착과 동시에 종말단추(end feet)를 생성하고 자연스러운 세포이동을 통해 성상교세포 챔버의 모든 곳으로 균일하게 퍼져서 배양됨을 확인하였다.
이에 따라, 독성평가를 수행하기 전 최적 배양기간을 3일로 설정하였으며, 상기에서 언급한 세포의 분리 주입을 통해 미세 기둥 구조를 기준으로 해당 챔버에 해당 세포들만이 배양되는 것을 확인할 수 있었다.
추가적으로 도 7b에서 확인할 수 있다시피 면역염색법을 통해 신경세포는 선택마커인 Tuj1와 성숙마커인 MAP2를 표지하였고, 성상교세포는 선택마커인 GFAP와 성숙마커인 S100B를 표지하여 신경세포 챔버에 건강한 상태의 신경세포가 배양되었고 성상교세포 챔버에 건강한 상태의 성상교세포가 배양되었음을 확인하였다.
실시예 4: 생체모방 신경칩을 이용한 약물 독성평가 실험
본 발명에서 주목한 신경계의 생리학적 특성과 유사한 생체 내 환경이 구축된 생체모방 신경칩을 이용하여 신경 독성평가가 가능한지를 평가하고자 하였다. 우선 Brain barrier 구조와 상관없이 이를 통과하며 신경독성을 가지고 있다고 알려져 있는 대표적인 환경독성물질인 methylmercury chloride(MeHg)를 처리한 독성물질로 선정하였으며, 신경세포만 배양한 칩과 신경세포와 성상교세포를 공동배양한 칩에 MeHg를 다양한 농도(0, 1, 5, 10μM)로 3시간 동안 처리한 후 MeHg 시간 및 농도에 따른 세포 반응변화를 실시간 세포 이미징(live cell imaging) 기법과 면역염색법(immunocytochemistry)으로 확인함으로써 신경 독성평가를 수행하고 이를 통해 생체모방 신경칩의 약물 독성평가 플랫폼으로써의 기능성을 평가하였다(도 8 내지 10).
도 8a에서 보듯이, 생체모방 신경칩을 이용하여 MeHg의 독성으로 인한 시간에 따른 신경세포의 반응을 확인하기 위해 신경세포만 배양한 조건에서 5μM MeHg를 처리하고, 살아있는 세포만은 염색할 수 있는 마커인 Calcein-AM을 통해 세포 생존율을 실시간으로 평가하였다. 대조군에서 대부분의 신경세포는 온전한 세포체 및 신경돌기을 가지면서 신경돌기망을 형성됨을 확인하였다. 5μM MeHg를 처리한 후, 신경돌기는 MeHg 처리 후 2시간까지는 유의한 변화없이 조금씩만 떨어졌지는 상태를 유지하다가, 마지막 3시간 처리 후에는 급격히 신경돌기가 거의 사라져서 단편화된 조각만을 남기고 세포체 형태로만 남게 되었다. 이는 MeHg에 노출되는 시간만큼 신경독성에 의해 신경세포의 생존율이 떨어진다는 것을 알게 된 결과였다.
도 8b에서 보듯이, 성상교세포없이 동일한 배양 조건 하에서, 이번에는 신경칩을 이용하여 MeHg의 농도 차이에 따른 신경독성 수준을 확인하였다. MeHg 처리 농도는 1, 5 및 10 μM로 설정하였고 마찬가지로 신경세포의 생존율은 Calcein-AM을 통해 실시간으로 확인하였다. 1μM의 가장 낮은 농도에서는 MeHg 처리 3시간 후 몇몇 신경돌기가 온전하게 MeHg의 신경독성을 견디고 형태를 유지하고 있음을 확인했으며, 5μM 농도를 처리하고 3시간 후에는 신경세포의 신경돌기는 사라지고 세포체만이 남은 형태를 관찰하였고, 10μM 농도를 처리하고 3시간 후 남아있던 세포체의 형광신호마저 매우 감소한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 농도에 비례하여 신경독성의 수준이 달라지고 이에 따라 신경세포 생존력도 변화한다는 것을 확인한 결과라 할 수 있었다.
세포의 형태학적 특성으로 인해 어느 종류의 세포인지를 구별 할 수 있지만, Calcein-AM은 세포 유형에 관계없이 살아있는 세포를 모두 타겟으로 하기 때문에 세포의 종류를 명확하게 식별할 수 없다는 문제점이 있어, 본 발명자들은 신경세포만을 타겟으로 하는 Tuj1 및 MAP2 항체를 사용하여 면역염색법을 통해 MeHg에 의한 신경세포의 손상이 동일하게 발생하는지 재확인하였다(도 8c).
도 8c에서 보듯이, 1, 5, 10 μM의 농도로 MeHg를 처리하고 처리 3시간 후 면역염색하여 확인한 결과, Calcein-AM으로 확인한 결과와 마찬가지로 농도가 증가함에 따라 세포의 손상이 심해지는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 신경칩을 이용하여 MeHg 독성에 의한 신경세포의 변화들을 재현성있게 관찰할 수 있음을 증명하는 결과라고 분석되었다.
반면, 신경세포에 대한 MeHg의 독성을 관찰하였으니, 이번에는 MeHg의 독성에 의해 성상교세포의 변화를 동일한 방식으로 관찰하고자 하였다(도 9a 및 9b).
도 9a 및 9b에서 보듯이, 생체모방 신경칩을 이용하여 MeHg의 독성으로 인한 시간 및 농도변화에 따른 성상교세포의 반응을 확인하기 위해 성상교세포를 배양한 조건에서MeHg를 처리하고, Calcein-AM을 통해 세포 생존율을 실시간으로 평가한 결과, 성상교세포는 시간이 지남에 따라 세포의 응집에 따른 형태학적 변화가 관찰되긴 했지만 세포 생존력의 감소는 관찰되지 않았다. 또한, 농도에 관계없이 세포 응집에 의한 형태 변화의 정도에도 유의한 차이가 없음을 관찰하였다.
한편, 뇌척수액(CSF)에서 뇌손상과 S100B 수준 사이의 상관관계를 입증한 여러 보고서가 있으며, 그 중에 MeHg에 노출된 신생아 단계의 쥐의 CSF에서 S100B 증가가 관찰되었고 이러한 S100B 증가가 CNS 손상과 관련이 있다는 주장을 바탕으로, 성상교세포로서의 식별과 동시에 MeHg를 감지하였을 때의 성상교세포의 반응을 확인하기 위해 금속에 의한 신경독성으로 인한 뇌손상 마커로 사용되는 GFAP 및 S100B를 이용하여 면역염색법을 수행하였다(도 9c).
도 9c에서 보듯이, 성상교세포의 생존율은 이전과 같이 변하지 않았으며, 세포 응집에 의한 형태적 변화도 재확인되었다. 가장 흥미로운 결과는 GFAP의 발현 수준이 S100B의 발현 수준에 반비례한다는 것인데, 다시 말하면, 생체 내 조건과 유사하게 MeHg의 농도가 증가함에 따라 S100B 신호가 증가하였고, 반면, GFAP 신호는 감소함을 확인하였다. GFAP 양성 성상교세포의 대부분은 별 모양과 같은 기본 형태를 가지며, 대조적으로 S100B 양성 세포의 대부분은 세포 응집 현상에 의해 endfeet이 사라져 뭉개진 형태를 보였다. 이 모든 결과는 본 발명의 신경칩이 생체 내 단백질 발현 패턴과 같은 특정세포의 반응을 재현할 수 있는 다목적 플랫폼임을 강력히 주장할 수 있는 근거라고 분석되었다.
최종적으로, 생체모방 신경칩 내부에서 성상교세포의 존재유무에 따라 MeHg의 신경독성으로부터 신경보호기능을 나타내는지 확인하고자 하였다. 따라서 신경세포를 단독으로 배양하고, 신경세포와 성상교세포를 공동배양하는 2가지 조건에 MeHg를 처리하고 Calcein-AM을 통해 시간 및 농도변화에 따른 세포 생존력을 실시간으로 평가하였다(도 10a 내지 10c).
도 10a에서 보듯이, 시간에 따른 변화는 가장 확실한 결과비교를 하기 위해 10μM의 농도를 처리한 뒤 실시간 변화를 비교하였고 신경세포만 단독배양하였을 때 MeHg 처리 2시간 후에 대부분의 Calcein-AM 신호가 급격하게 줄어들기 시작하였으며, 반면에 성상교세포가 공동배양 된 경우 처리 3시간 후까지 일부 사라지는 몇가닥의 신경돌기를 제외하고는 현저한 변화가 발견되지 않았다.
또한, 도 10b 및 10c에서 보듯이, 농도변화에 따른 반응을 비교하였을 때도 신경세포만 단독으로 배양한 결과와 비교하여 성상교세포가 존재하는 조건에서는 농도와 관계없이 Calcein-AM 신화와 MAP2 신호가 어떠한 감소도 없이 유지됨을 확인할 수 있었다. 따라서 MeHg 독성에 대한 성상교세포 매개 신경보호기작은 신경칩을 통해 충분히 연구가 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, 본 발명에서 제공하는 생체모방 신경칩은 신경 독성평가를 수행함에 있어서 신뢰할만한 결과를 도출할 수 있는 시스템이라고 평가할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
1 : PDMS 기반 미세유체 소자
2 : 슬라이드 글라스
3 : 배양액 저장챔버
4 : 성상교세포 유입구
5 : 성상교세포 유출구
6 : 신경세포 유입구
7 : 신경세포 유출구
8 : 배양액 채널
9 : 성상교세포 채널
10 : 성상교세포 챔버
11 : 신경세포 채널
12 : 신경세포 챔버
13 : 미세 기둥 구조물

Claims (16)

  1. (a) 2개의 배양액 저장챔버; 및, 상기 각 챔버와 연통하는 배양액 채널;을 포함하는 배양액 공급부;
    (b) 일 측단에 구비된 성상교세포 유입구; 다른 일 측단에 구비된 성상교세포 유출구; 상기 성상교세포 유입구와 성상교세포 유출구 사이에 구비되고, 상기 배양액 채널과 동일한 방향으로 연장되어 상기 배양액 채널의 일부와 연접하고, 상기 배양액 채널과의 연접부위에 배양액이 상호 교류할 수 있는 1차 믹싱영역을 형성하는 성상교세포 챔버; 및 상기 성상교세포 챔버의 일 측단과 성상교세포 유입구 사이 및 상기 성상교세포 챔버의 다른 일 측단과 성상교세포 유출구 사이에 각각 구비되어 연통된 성상교세포 채널;을 포함하는 성상교세포 공급부; 및
    (c) 일 측단에 구비된 신경세포 유입구; 다른 일 측단에 구비된 신경세포 유출구; 상기 신경세포 유입구와 신경세포 유출구 사이에 구비되고, 상기 성상교세포 챔버와 동일한 방향으로 연장되어 상기 성상교세포 챔버의 일부와 연접하고, 상기 성상교세포 챔버의 연접부위에 배양액이 상호 교류할 수 있는 2차 믹싱영역을 형성하는 신경세포 챔버; 및 상기 신경세포 챔버의 일 측단과 신경세포 유입구 사이 및 상기 신경세포 챔버의 다른 일 측단과 신경세포 유출구 사이에 각각 구비되어 연통된 신경세포 채널;을 포함하는 신경세포 공급부로 구성된, 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩으로서,
    상기 1차 믹싱영역은 배양액 채널의 일부, 상기 배양액 채널의 일부와 연접한 성상교세포 챔버의 일부, 상기 연접부에 형성된 부분 차단부재로 구성되며,
    상기 2차 믹싱영역은 성상교세포 챔버의 일부, 상기 성상교세포 챔버의 일부와 연접한 신경세포 챔버의 일부, 상기 연접부에 형성된 부분 차단부재로 구성되고,
    상기 부분 차단부재는, 이격되어 각 채널 및 챔버의 연장방향을 따라서 일렬로 배치된 미세 기둥 구조물이며,
    상기 미세 기둥 구조물은 단면이 가로보다 세로가 긴 육각형 형태로서 챔버 및 채널들 사이에 병목구조의 이동통로를 형성하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 배양액 저장챔버는 1차 및 2차 믹싱영역을 통해 성상교세포 챔버와 신경세포 챔버에 공급하기 위한 배양액을 저장하고, 저장된 배양액을 배양액 채널 및 성상교세포 챔버를 통해 신경세포에 공급하는 역할을 수행하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 배양액 채널은 2개의 배양액 저장챔버 사이에 배양액이 유통하는 배양액의 메인 유로로서의 역할을 수행하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 배양액 채널은 내부 표면에 혈관내피세포가 코팅된 형태인 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 성상교세포 챔버는 성상교세포 유입구로부터 공급된 성상교세포와 보조성분의 혼합물이 저장, 고정 및 배양되는 부위이고, 고정된 성상교세포를 배양하기 위한 배양용기로서의 역할을 수행하며, 상기 배양액 채널로부터 유입된 배양액을 신경세포 챔버에 고정된 신경세포에 전달하고, 신경세포로부터 분비된 각종 대사산물, 노폐물 등을 외부로 방출하는 통로로서의 역할을 수행하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 신경세포 챔버는 신경세포 유입구를 통해 공급된 신경세포와 보조성분의 혼합물이 저장, 고정 및 배양되는 부위이고, 고정된 신경세포를 배양하기 위한 배양용기로서의 역할을 수행하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 보조성분은 마트리젤, 콜라겐 하이드로젤, 알지네이트 하이드로젤 또는 젤마(GelMa) 하이드로젤인 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서,
    상기 미세 기둥 구조물은, 그의 이격된 영역을 통해, 배양액 채널의 일부영역과 상기 배양액 채널의 일부와 연접한 성상교세포 챔버의 일부영역 사이 및 성상교세포 챔버의 일부영역과 상기 성상교세포 챔버의 일부와 연접한 신경세포 챔버의 일부영역 사이로 배양액의 상호 교류를 허용하는 역할을 수행하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩.
  12. (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩에 포함된 성상교세포 챔버에 포함된 성상교세포와 신경세포 챔버에 포함된 신경세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩에 포함된 배양액 저장챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및,
    (c) 상기 배양된 성상교세포 및 신경세포의 변화를 평가하는 단계를 포함하는, 신경세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서, 신경세포에서 형성된 신경돌기의 수준이 증가되면, 상기 약물은 생체 내에서 신경의 형성을 촉진시키는 제제인 것으로 평가하는 것인, 신경세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법.
  14. (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩에 포함된 성상교세포 챔버에 포함된 성상교세포와 신경세포 챔버에 포함된 신경세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 생체모방 신경칩에 포함된 배양액 저장챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및,
    (c) 상기 배양된 성상교세포 및 신경세포의 손상여부를 평가하는 단계를 포함하는, 신경세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서, 신경세포에서 형성된 신경돌기의 수준이 감소되면, 상기 약물은 생체 내에서 신경에 독성을 나타내는 제제인 것으로 평가하는 것인, 신경세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서, 성상교세포가 별 형상을 유지하지 못하고 세포가 응집되면, 상기 약물은 생체 내에서 신경에 독성을 나타내는 제제인 것으로 평가하는 것인, 신경세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법.
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