CN102459559A - 细胞凝集块形成用容器及细胞凝集块的形成方法 - Google Patents

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Abstract

细胞凝集块形成用容器，其表面附近存在由通式：[化学式1]
Figure DEST_PATH_IMAGE001
(式中，R1、R2及R3分别独立为碳原子数1以上6以下的烷基，m为2以上6以下的整数。)表示的基团，以及氨基、羧基和羟基中的至少一种。

Description

细胞凝集块形成用容器及细胞凝集块的形成方法
技术领域
本发明涉及细胞凝集块形成用容器、细胞凝集块的形成方法、细胞凝集块、物质的筛选方法及细胞的功能探索方法。
背景技术
以前，通过培养粘附性细胞(贴壁细胞)及非粘附性细胞(非贴壁细胞)形成细胞凝集块。
专利文献1中公开了以下的方法：通过将包含多能性神经干细胞的组织悬浮于包含至少一种干细胞增殖因子的培养基中、种植于神经干细胞凝集块形成用容器中并进行培养，形成神经干细胞凝集块。此时，神经干细胞凝集块形成用容器在内面具有非水溶性硬化涂层(皮膜層)，其通过以下方式制造：使水溶性树脂覆盖容器内面形成水溶性树脂覆盖层后，使水溶性树脂覆盖层硬化而改性成非水溶性硬化涂层。另外，水溶性树脂可以示例：2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱和其他单体(例如甲基丙烯酸丁酯等)的共聚物。
然而，使用所述神经干细胞凝集块形成用容器，即使对粘附性细胞进行培养，也由于非水溶性硬化涂层阻碍粘附性细胞的粘附而存在粘附性细胞死亡、无法形成粘附性细胞的细胞凝集块的问题。
现有技术文献
专利文献1 : 日本特开2008-220205号公报。
发明内容
本发明的目的是：鉴于上述现有技术所存在的问题，提供可以形成粘附性细胞的细胞凝集块的细胞凝集块形成用容器、及使用该细胞凝集块形成用容器的细胞凝集块的形成方法。另外，本发明的目的是：提供使用该细胞凝集块的形成方法的物质的筛选方法及细胞的功能探索方法。
权利要求1所述的发明是细胞凝集块形成用容器，其特征在于：其表面附近存在由通式：
[化学式1]
Figure 232595DEST_PATH_IMAGE001
(式中，R1、R2及R3分别独立为碳原子数1以上6以下的烷基，m为2以上6以下的整数。)表示的基团，以及氨基、羧基和羟基中的至少一种。
权利要求2所述的发明是根据权利要求1所述的细胞凝集块形成用容器，其特征在于通过以下方式制造：在表面附近存在羧基、氨基及羟基的容器中，使具有对羧基、氨基或羟基有反应性的官能团及由所述通式表示的基团、且分子量为225以上650以下的化合物反应。
权利要求3所述的发明是根据权利要求2所述的细胞凝集块形成用容器，其特征在于：在包含氧气、臭氧及水蒸气中的至少一种和氨气和/或氮气的气氛下对在表面附近存在所述羧基、氨基及羟基的容器进行等离子体处理。
权利要求4所述的发明是根据权利要求1所述的细胞凝集块形成用容器，其特征在于通过以下方式制造：在表面附近存在可以通过水解生成硅烷醇基的官能团、硅烷醇基、衍生自半金属氧化物的羟基及衍生自金属氧化物的羟基中的至少一种的容器中，使第一化合物和第二化合物反应，所述第一化合物具有可以通过水解生成硅烷醇基的官能团及所述通式表示的基团、且分子量为315以上650以下，所述第二化合物具有可以通过水解生成硅烷醇基的官能团，以及氨基、可以通过水解生成羧基的官能团及可以通过水解生成羟基的官能团中的至少一种。
权利要求5所述的发明是根据权利要求1所述的细胞凝集块形成用容器，其特征在于：在表面形成包含树脂的层，所述树脂具有所述通式表示的基团，以及氨基、羧基及羟基中的至少一种。
权利要求6所述的发明是细胞凝集块的形成方法，其特征在于：使用根据权利要求1至5中任一项所述的细胞凝集块形成用容器对体细胞进行培养而形成细胞凝集块。
权利要求7所述的发明是根据权利要求6所述的细胞凝集块的形成方法，其特征在于：所述体细胞为粘附性细胞。
权利要求8所述的发明是物质的筛选方法，其特征在于具有：使用根据权利要求1至5中任一项所述的细胞凝集块形成用容器对体细胞进行培养而形成细胞凝集块的步骤；和使用该细胞凝集块筛选物质的步骤。
权利要求9所述的发明是根据权利要求8所述的物质的筛选方法，其特征在于：所述体细胞为粘附性细胞。
权利要求10所述的发明是细胞的功能探索方法，其特征在于具有：使用根据权利要求1至5中任一项所述的细胞凝集块形成用容器对体细胞进行培养而形成细胞凝集块的步骤；和使用该细胞凝集块探索细胞的功能的步骤。
权利要求11所述的发明是根据权利要求10所述的细胞的功能探索方法，其特征在于：所述体细胞为粘附性细胞。
根据本发明，可以提供能够形成粘附性细胞的细胞凝集块的细胞凝集块形成用容器及使用该细胞凝集块形成用容器的细胞凝集块的形成方法。另外，根据本发明，可以提供使用该细胞凝集块的形成方法的物质的筛选方法及细胞的功能探索方法。
附图说明
图1A是表示使用本发明的细胞凝集块形成用容器形成细胞凝集块的方法的一个例子的图(之一)。
图1B是表示使用本发明的细胞凝集块形成用容器形成细胞凝集块的方法的一个例子的图(之二)。
图2A是表示实施例1的细胞凝集块(培养2天的情况下)的光学显微镜照片。
图2B是表示实施例1的细胞凝集块(培养5天的情况下)的光学显微镜照片。
图3是表示比较例1的培养细胞(培养5天的情况下)的光学显微镜照片。
图4A是表示实施例1的细胞凝集块的碱性磷酸酶活性的评价结果的光学显微镜照片。
图4B是表示比较例1的培养细胞的碱性磷酸酶活性的评价结果的光学显微镜照片。
图5是表示实施例1的细胞凝集块的免疫双重染色的评价结果(之一)的荧光显微镜照片。
图6是表示实施例1的细胞凝集块的免疫双重染色的评价结果(之二)的荧光显微镜照片。
图7是表示实施例1的细胞凝集块的免疫双重染色的评价结果(之三)的荧光显微镜照片。
图8是表示实施例1的细胞凝集块的免疫双重染色的评价结果(之四)的荧光显微镜照片。
图9是表示实施例2的细胞凝集块(培养7天的情况下)的光学显微镜照片。
图10是表示实施例3的细胞凝集块(培养7天的情况下)的光学显微镜照片。
图11是表示比较例2的培养细胞(培养7天的情况下)的光学显微镜照片。
图12是表示实施例2的细胞凝集块的免疫染色的评价结果的照片。
具体实施方式
接着，对用以实施本发明的方案和附图一起进行说明。
本发明的细胞凝集块形成用容器在表面附近存在由通式：
[化学式2]
Figure 792889DEST_PATH_IMAGE002
(式中，R1、R2及R3分别独立为碳原子数1～6的烷基，m为2～6的整数。) 表示的磷酸胆碱类似基团，以及氨基、羧基及羟基中的至少一种。
图1表示使用本发明的细胞凝集块形成用容器形成细胞凝集块的方法的一个例子。如果在细胞凝集块形成用容器D中添加粘附性细胞C及培养基(未图示)，则粘附性细胞C粘附于细胞凝集块形成用容器D的一部分(参照图1A)。认为这是由于粘附性细胞C粘附于细胞凝集块形成用容器D的表面附近存在氨基、羧基及羟基中的至少一种的区域D1。接着，如果对粘附性细胞C进行培养，则粘附性细胞C增殖，自主地形成粘附性细胞C的细胞凝集块C'(参照图1B)。认为这是由于：细胞凝集块形成用容器D的表面附近不存在氨基、羧基或羟基的区域D2抑制粘附性细胞C的粘附，因此在粘附性细胞C上形成增殖的粘附性细胞C。因此，如果使用细胞凝集块形成用容器D对粘附性细胞C进行培养，则可以形成粘附性细胞C的细胞凝集块C'。
本发明的细胞凝集块形成用容器的形式并无特别限定，可以列举：培养皿、多孔板、烧瓶、滚瓶、具有细胞培养过程的装置的单元等。
[本发明的细胞凝集块形成用容器的第一实施方案]
本发明的细胞凝集块形成用容器的第一实施方案通过以下方式制造：在表面附近存在羧基、氨基及羟基的容器中，使具有对羧基、氨基或羟基有反应性的官能团及磷酸胆碱类似基团的表面改性剂反应。此时，表面改性剂的分子量为225～650。由此可以高密度地导入磷酸胆碱类似基团。
在容器的表面附近导入氨基的方法并无特别限定，可以列举：氮气等离子体处理、氨气等离子体处理、使表面处理剂反应的方法、有机硅(silicone)气相处理等。
在氮气等离子体处理中，通过在氮气气氛下产生低温等离子体，在容器的表面附近导入氨基(例如参照Surface and Coatings Technology 116-119(1999)802-807, Colloids and Surfaces A：Physicochem. Eng. Aspects 195(2001)81-95, Macromol. Chem. Phys. 200. 989-996(1999))。具体而言，将容器收纳至反应容器内，利用真空泵使反应容器内达到真空后，导入氮气并进行辉光放电。
在氨气等离子体处理中，通过在氨气气氛下产生低温等离子体，在容器的表面附近导入氨基。具体而言，将容器收纳至反应容器内，利用真空泵使反应容器内达到真空后，导入氨气并进行辉光放电。
构成容器的材料并无特别限定，可列举：聚氯乙烯、丙烯酸类树脂、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚酯、环烯烃树脂、聚碳酸酯、玻璃等。
在使表面处理剂反应的方法中，使用具有氨基的烷氧基硅烷、氯硅烷、硅氮烷等表面处理剂，在表面附近存在可以通过烷氧基甲硅烷基等的水解生成硅烷醇基的官能团、硅烷醇基、衍生自半金属氧化物的羟基及衍生自金属氧化物的羟基中的至少一种的容器的表面附近导入氨基。具体而言，首先，在容器内投入水/2-丙醇混合液，添加3-氨基丙基三甲氧基硅烷后，加热至100℃并反应6小时。接着，冷却至室温后，使用甲醇进行清洗并干燥。
构成容器的材料并无特别限定，可以列举：甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯-甲基丙烯酸甲酯-二乙烯苯共聚物、聚氯乙烯、丙烯酸类树脂、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚酯、环烯烃树脂、聚碳酸酯、二氧化硅、玻璃、氧化铝、滑石、粘土、云母、石棉、二氧化钛、锌白、氧化铁等。
在有机硅气相处理中，使用1,3,5,7-四甲基环四硅氧烷，于容器的表面附近导入氢硅烷基(hydrosilyl)后，使具有氨基的烯烃反应，由此于容器的表面附近导入氨基(例如参照日本特公平1-54379号公报、日本特公平1-54380号公报、日本特公平1-54381号公报)。具体而言，首先，将1,3,5,7-四甲基环四硅氧烷、以及容器投入干燥器中，利用抽气器进行脱气。接着，于80℃反应16小时后，取出容器，于120℃进行干燥。接着，将所得的容器浸渍于乙醇中，添加烯丙基胺后，添加氯铂酸的乙醇溶液，于60℃搅拌2小时。反应结束后，使用乙醇清洗并减压干燥。
构成容器的材料并无特别限定，可列举：苯乙烯-二乙烯苯共聚物、聚氯乙烯、丙烯酸类树脂、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚酯、环烯烃树脂、聚碳酸酯、云母、滑石、高岭土、氧化铝、二氧化钛、氧化锌、氧化铁等。
具有氨基的烯烃并不限定于烯丙基胺，只要是具有乙烯基的胺、具有丙烯酰基的胺等即可。另外，氨基可以由丁氧基羰基、苄氧基羰基等保护。而且，代替具有氨基的烯烃，也可以使用具有环氧基等例如通过与二胺的反应而可以导入氨基的官能团的烯烃。
在容器的表面附近导入羧基和/或羟基的方法并无特别限定，可以列举：氧气等离子体处理、臭氧处理、水蒸气等离子体处理等。
在氧气等离子体处理中，通过在氧气气氛下产生低温等离子体，在容器的表面附近导入羧基及羟基。具体而言，将容器收纳至反应容器内，利用真空泵使反应容器内达到真空后，导入氧气并进行辉光放电。
在臭氧处理中，通过在容器中投入臭氧水溶液，在容器的表面附近导入羧基及羟基。具体而言，在容器中投入40ppm的臭氧水溶液，于室温处理15分钟。
在水蒸气等离子体处理中，通过在水蒸气气氛下产生低温等离子体，在容器的表面附近导入羟基。具体而言，将容器收纳至反应容器内，利用真空泵使反应容器内达到真空后，导入水蒸气并进行辉光放电。
构成容器的材料并无特别限定，可以列举：聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯、聚醚醚酮、环烯烃树脂、聚碳酸酯等。
在容器的表面附近导入羧基的方法并无特别限定，可以列举：使表面处理剂反应的方法、有机硅气相处理等。
在使表面处理剂反应的方法中，使用具有羧基的烷氧基硅烷、氯硅烷、硅氮烷等表面处理剂，在表面附近存在可以通过烷氧基甲硅烷基等的水解生成硅烷醇基的官能团、硅烷醇基、衍生自半金属氧化物的羟基及衍生自金属氧化物的羟基中的至少一种的容器的表面附近导入羧基。具体而言，首先，使三乙氧基甲硅烷基丙基琥珀酸酐溶解于N,N-二甲基甲酰胺，添加蒸馏水和4-二甲基氨基吡啶，于室温搅拌16小时，合成具有羧基的硅烷偶联剂。接着，在容器中投入水/2-丙醇混合液，添加具有羧基的硅烷偶联剂后，加热至100℃并反应6小时。接着，冷却至室温后，使用甲醇清洗并干燥。
构成容器的材料并无特别限定，可以列举：甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯-甲基丙烯酸甲酯-二乙烯苯共聚物、二氧化硅、玻璃、氧化铝、滑石、粘土、云母、石棉、二氧化钛、锌白、氧化铁等。
在有机硅气相处理中，使用1,3,5,7-四甲基环四硅氧烷，在容器的表面附近导入氢硅烷基后，使具有羧基的烯烃反应，由此在容器的表面附近导入羧基(例如参照日本特公平1-54379号公报、日本特公平1-54380号公报、日本特公平1-54381号公报)。具体而言，首先，将加入了1,3,5,7-四甲基环四硅氧烷的容器加入干燥器中，使用抽气器进行脱气。接着，于80℃反应16小时后，取出容器，于120℃干燥。接着，将所得的容器浸渍于乙醇中，添加烯丙基羧酸后，添加氯铂酸的乙醇溶液，于60℃搅拌2小时。反应结束后，使用乙醇清洗并进行减压干燥。
构成容器的材料并无特别限定，可以列举：苯乙烯-二乙烯苯共聚物、云母、滑石、高岭土、氧化铝、二氧化钛、氧化锌、氧化铁等。
具有羧基的烯烃并不限定于烯丙基羧酸，只要是具有乙烯基的羧酸、具有丙烯酰基的羧酸等即可。
在容器的表面附近导入氨基、羧基及羟基的方法并无特别限定，可以列举：在包含氧气及氨气的气氛下进行等离子体处理的方法等。具体而言，将容器收纳至反应容器内，利用真空泵使反应容器内达到真空后，导入氧气及氨气，进行辉光放电，产生低温等离子体。
对羧基有反应性的官能团可以列举氨基、羟基等，从反应性高来看，优选氨基。
对氨基或羟基有反应性的官能团可以列举羧基、醛基等，从反应性高来看，优选羧基。
另外，对于表面改性剂，优选对羧基、氨基或羟基有反应性的官能团通过间隔基与磷酸胆碱类似基团结合。间隔基并无特别限定，可以列举：亚甲基、氧基亚乙基、具有1个以上氨基的亚烷基等。
接着，对具有氨基及磷酸胆碱类似基团的表面改性剂进行说明。
具有氨基及磷酸胆碱类似基团的表面改性剂并无特别限定，可以列举日本特开2006-7203号公报、日本特开2006-7204号公报、日本特开2008-174491号公报所公开的化合物等。
如果存在于容器的表面附近的羧基和表面改性剂所具有的氨基通过一般的反应而缩合，则形成酰胺键。具体而言，在容器中投入N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的溶液，使容器的羧基活性酯化后，添加表面改性剂。
接着，对具有羟基及磷酸胆碱类似基团的表面改性剂进行说明。
具有羟基及磷酸胆碱类似基团的表面改性剂并无特别限定，可以列举L-α-甘油磷酸胆碱等。
如果存在于容器的表面附近的羧基和表面改性剂所具有的羟基通过一般的反应而缩合，则形成酯键。具体而言，使用溴化氰使表面改性剂的羟基活化后，将其投入至容器中。
接着，对具有羧基及磷酸胆碱类似基团的表面改性剂进行说明。
具有羧基及磷酸胆碱类似基团的表面改性剂并无特别限定，可以列举日本特开2006-11381号公报所公开的化合物等。
如果存在于容器的表面附近的氨基和表面改性剂所具有的羧基通过一般的反应而缩合，则形成酰胺键。具体而言，将表面改性剂添加在N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的溶液中，使羧基活性酯化后，将其投入至容器中。
如果存在于容器的表面附近的羟基和表面改性剂所具有的羧基通过一般的反应而缩合，则形成酯键。具体而言，使用溴化氰使表面改性剂的羟基活化后，使其浸渍容器。
接着，对具有醛基及磷酸胆碱类似基团的表面改性剂进行说明。
具有醛基及磷酸胆碱类似基团的表面改性剂并无特别限定，可以列举日本特开2006-11383号公报所公开的化合物等。
如果存在于容器的表面附近的氨基和表面改性剂所具有的醛基通过一般的反应而缩合，则形成亚胺键。具体而言，在容器中投入表面改性剂及甲醇，于室温放置6小时后，于0℃添加氰基三氢硼酸钠，加热搅拌一晩。另外，反应溶剂除了甲醇以外，还可以使用水、乙醇、2-丙醇等质子溶剂，但存在使用甲醇时的导入率高的倾向。
如果存在于容器的表面附近的羟基和表面改性剂所具有的醛基通过一般的反应而加成，则形成缩醛键。具体而言，将容器及表面改性剂于甲醇中、于室温放置6小时后，于0℃添加氰基三氢硼酸钠，加热搅拌一晩。另外，反应溶剂除了甲醇以外，还可使用水、乙醇、2-丙醇等质子溶剂，但存在使用甲醇时的导入率高的倾向。
另外，代替表面附近存在羧基、氨基及羟基的容器，可以使用表面附近存在醛基、和氨基和/或羟基的容器，使具有对醛基有反应性的官能团及磷酸胆碱类似基团的表面改性剂反应。
于容器的表面附近导入醛基的方法并无特别限定，可以列举：使戊二醛和表面附近存在氨基的容器反应的方法等。
对醛基有反应性的官能团可以列举氨基、羟基等，从反应性高来看，优选氨基。
另外，对于表面改性剂，优选对醛基有反应性的官能团通过间隔基与磷酸胆碱类似基团结合。间隔基并无特别限定，可以列举：亚甲基、氧基亚乙基、具有1个以上氨基的亚烷基等。
接着，对具有氨基及磷酸胆碱类似基团的表面改性剂进行说明。
具有氨基及磷酸胆碱类似基团的表面改性剂并无特别限定，可以列举：日本特开2006-7203号公报、日本特开2006-7204号公报、日本特开2008-174491号公报所公开的化合物等。
如果存在于容器的表面附近的醛基和表面改性剂所具有的氨基通过一般的反应而缩合，则形成亚胺键。具体而言，将容器及表面改性剂于甲醇中、于室温放置6小时后，于0℃添加氰基三氢硼酸钠，加热搅拌一晩。另外，反应溶剂除了甲醇以外，还可以使用水、乙醇、2-丙醇等质子溶剂，但存在使用甲醇时的导入率高的倾向。
接着，对具有羟基及磷酸胆碱类似基团的表面改性剂进行说明。
具有羟基及磷酸胆碱类似基团的表面改性剂并无特别限定，可以列举L-α-甘油磷酸胆碱等。
如果存在于容器的表面附近的醛基和表面改性剂所具有的羟基通过一般的反应而加成，则形成缩醛键。具体而言，将容器及表面改性剂于甲醇中、于室温放置6小时后，于0℃添加氰基三氢硼酸钠，加热搅拌一晩。另外，反应溶剂除了甲醇以外还可以使用水、乙醇、2-丙醇等质子溶剂，但存在使用甲醇时的导入率高的倾向。
另外，代替表面附近存在羧基、氨基及羟基的容器，可以使用表面附近存在羧基、和氨基或羟基的容器，使具有对氨基或羟基有反应性的官能团及磷酸胆碱类似基团的表面改性剂反应。
而且，代替表面附近存在羧基、氨基及羟基的容器，可以使用表面附近存在氨基及羟基的容器，使具有对氨基或羟基有反应性的官能团及磷酸胆碱类似基团的表面改性剂反应，使得容器的表面附近残留未反应的氨基和/或羟基。
另外，代替表面附近存在羧基、氨基及羟基的容器，可以使用表面附近存在羧基、氨基或羟基的容器，使具有对羧基、氨基或羟基有反应性的官能团及磷酸胆碱类似基团的表面改性剂反应，使得容器的表面附近残留未反应的羧基、氨基或羟基。
[本发明的细胞凝集块形成用容器的第二实施方案]
本发明的细胞凝集块形成用容器的第二实施方案可以通过以下方式制造：在表面附近存在可以通过水解生成硅烷醇基的官能团、硅烷醇基、衍生自半金属氧化物的羟基及衍生自金属氧化物的羟基中的至少一种的容器中，使第一表面改性剂和第二表面改性剂反应，所述第一表面改性剂具有可以通过水解生成硅烷醇基的官能团及磷酸胆碱类似基团，所述第二表面改性剂具有可以通过水解生成硅烷醇基的官能团，以及氨基、羧基及羟基中的至少一种。此时，第一表面改性剂的分子量为315～650。由此，可以高密度地导入磷酸胆碱类似基团。
在容器的表面附近导入可以通过水解生成硅烷醇基的官能团和/或硅烷醇基的方法可以列举将涂布液涂布于容器上的方法，所述涂布液含有具有可以通过水解生成硅烷醇基的官能团的聚合物(以下称为水解性聚合物)、和烷氧基硅烷。
如果将含有水解性聚合物和烷氧基硅烷的涂布液涂布于容器上，则水解性聚合物和烷氧基硅烷水解，生成硅烷醇基。接着，通过硅烷醇基彼此的脱水缩合，水解性聚合物交联，形成导入了硅烷醇基的交联聚合物层。具体而言，将涂布液涂布于材料后，涂布水、酸或碱，并进行加热。另外，可以在将水、酸或碱涂布于材料后涂布涂布液。而且，可以在涂布液中混合水、酸或碱。此时，由于在涂布液中引起水解，因此优选在涂布时适当制备涂布液。另外，使用水、酸或碱时，可以进行加热，但通常在室温进行充分反应。并且，可以不使用水、酸或碱而利用大气中的水分缓慢地进行反应。
用于水解的酸或碱只要为能够进行水解的酸或碱即可，并无特别限定，可以将二种以上混合使用，也可以作为水溶液使用。
涂布液可以使用使水解性聚合物和烷氧基硅烷溶解或分散于有机溶剂中的涂布液。有机溶剂并无特别限定，可以列举：脂肪族烃，芳香族烃，氯化烃，醚，碳原子数为1～4的1～4价脂肪族醇等醇，乙基溶纤剂、丁基溶纤剂等溶纤剂，二
Figure 564536DEST_PATH_IMAGE003
烷、乙酸甲酯、二甲酰胺等，可以组合应用二种以上。
涂布液中的水解性聚合物的含量通常为0.001～20质量%，优选0.1～5质量%。如果涂布液中的水解性聚合物的含量小于0.001质量%，则通过1次涂布得不到充分的效果，如果涂布液中的水解性聚合物的含量超过20质量%，则涂布性降低。
另外，水解性聚合物相对于烷氧基硅烷的质量比通常为0.01%～20%，优选为0.2%～5%。如果水解性聚合物相对于烷氧基硅烷的质量比小于0.01%，则交联聚合物层的强度变得不充分，如果水解性聚合物相对于烷氧基硅烷的质量比超过20%，则导入交联聚合物层的硅烷醇基的量变得不充分。
涂布涂布液的方法并无特别限定，可以列举浸渍涂布法、喷雾涂布法、旋铸法等。
构成容器的材料并无特别限定，可以列举：PP(聚丙烯)、环烯烃树脂、聚碳酸酯、PET(聚对苯二甲酸乙二酯)、PEEK、氟系树脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯等有机材料；金、钛、铝、铁、铜、不锈钢、氧化铝、二氧化钛、氧化锌等无机材料等。
水解性聚合物只要为具有可以通过水解生成硅烷醇基的官能团的聚合物即可，并无特别限定，可以使用通过将由通式：
[化学式3]
(式中，R1为氢原子或甲基；R2为碳原子数1～6的亚烷基，优选亚丙基；R3、R4及R5分别独立为碳原子数1～6的烷氧基，优选甲氧基或乙氧基。) 表示的单体(A-1)聚合而得的均聚物或共聚物(以下称为聚合物(A))。此时，可以使用二种以上单体(A-1)。
另外，在合成聚合物(A)时，可以将由通式：
[化学式4]
Figure 522314DEST_PATH_IMAGE005
（式中，R1为氢原子或甲基，R2为碳原子数1～18的直链状、分支状或环状烷基、优选碳原子数1～6的烷基、特别优选甲基。) 表示的单体(A-2)共聚合。此时，可以使用二种以上单体(A-2)。
另外，在合成聚合物(A)时，可以将由通式：
[化学式5]
Figure 874798DEST_PATH_IMAGE006
(式中，R1为氢原子或甲基，R2为碳原子数1～6的亚烷基、优选亚乙基、亚丙基或2-羟基亚丙基，X为由通式：
[化学式6]
Figure 879663DEST_PATH_IMAGE007
(式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8及R9分别独立为碳原子数1～6的直链或分支状烷基，优选甲基。)
表示的官能团(X-1)、由通式：
[化学式7]
Figure 445161DEST_PATH_IMAGE008
(式中，R1、R2、R3、R4、R5及R6分别独立为碳原子数1～6的直链或分支状烷基、优选甲基，R7为碳原子数1～6的直链或分支状烷基、优选丁基，x为正整数。)
表示的官能团(X-2)、或由通式：
[化学式8]
Figure 865778DEST_PATH_IMAGE009
(式中，R1、R2、R3、R4、R5及R6分别独立为碳原子数1～6的直链或分支状烷基、优选甲基，R7为碳原子数1～6的亚烷基、优选亚乙基、亚丙基或2-羟基亚丙基，R8为氢原子或甲基，y为正整数。)
表示的官能团(X-3)。)
表示的单体(A-3)共聚合。另外，X为官能团(X-2)或(X-3)时，单体(A-3)优选分子量为1000～100000，特别优选2000～20000。此时，可以使用二种以上单体(A-3)。
另外，在合成聚合物(A)时，可以将由通式：
[化学式9]
Figure 400664DEST_PATH_IMAGE010
(式中，R1为氢原子或甲基，R2为碳原子数1～6的亚烷基、优选亚乙基或亚丙基，Y为由通式：
[化学式10]
Figure 514114DEST_PATH_IMAGE011
(式中，R1、R2及R3分别独立为碳原子数1～6的烷基、优选甲基，Z-为卤化物离子或有机酸或无机酸的共轭离子。)
表示的官能团(Y-1)或由通式：
[化学式11]
(式中，R1及R2分别独立为碳原子数1～6的烷基、优选甲基。)
表示的官能团(Y-2)。)
表示的单体(A-4)共聚合。此时，可以使用二种以上单体(A-4)。
即，在合成聚合物(A)时，可以与单体(A-1)一起将单体(A-2)、单体(A-3)及单体(A-4)中的至少一种共聚合。
合成聚合物(A)时所用的全部单体中的单体(A-1)的含量优选为40～85质量%。如果全部单体中的单体(A-1)的含量小于40质量%，则交联密度降低，亲水化的效果不充分地持续，如果全部单体中的单体(A-1)的含量超过85质量%，则交联聚合物层的均匀性降低。
另外，合成聚合物(A)时所用的全部单体中的单体(A-2)的含量通常为1～75质量%，优选为10～60质量%。如果全部单体中的单体(A-2)的含量小于1质量%，则交联聚合物层的耐水性降低，如果全部单体中的单体(A-2)的含量超过75质量%，则聚合物(A)变得难溶于醇。
而且，合成聚合物(A)时所用的全部单体中的单体(A-3)的含量通常为1～70质量%，优选为5～60质量%。如果全部单体中的单体(A-3)的含量小于1质量%，则交联聚合物层的耐水性降低，如果全部单体中的单体(A-3)的含量超过70质量%，则聚合物(A)变得难溶于醇。
另外，单体(A-4)相对于单体(A-1)、单体(A-2)及单体(A-3)的总质量的质量比通常为0.01～1，优选为0.05～0.5。如果此比小于0.01，则交联聚合物层的柔软性降低，如果此比超过1，则交联聚合物层的耐水性降低。
聚合物(A)的数均分子量优选为2000～150000。如果聚合物(A)的数均分子量小于2000，则形成交联聚合物层的时间变长，如果聚合物(A)的数均分子量超过150000，则涂布液的粘度变高，涂布性或作业性变差。
另外，聚合物(A)的具体例及制造方法公开于日本特开平11-302129号公报等中。
另外，水解性聚合物可以使用具有由通式：
[化学式12]
Figure 725969DEST_PATH_IMAGE013
(式中，R1为碳原子数1～22的烷基或苯基、优选甲基。)
表示的结构单元(B-1)的均聚物或共聚物(以下称为聚合物(B))。此时，聚合物(B)可以具有二种以上结构单元(B-1)。
另外，聚合物(B)可以具有由通式：
[化学式13]
Figure 787466DEST_PATH_IMAGE014
(式中，R1及R2分别独立为碳原子数1～22的烷基或苯基、优选甲基。)
表示的结构单元(B-2)。此时，聚合物(B)可以具有二种以上结构单元(B-2)。
聚合物(B)优选结构单元(B-1)的含量为1～90质量%。如果结构单元(B-1)的含量小于1质量%，则交联密度降低，亲水化的效果不充分地持续，如果结构单元(B-1)的含量超过90质量%，则交联聚合物层的均匀性降低。
而且，聚合物(B)优选结构单元(B-2)的含量为10～99质量%。如果结构单元(B-2)的含量小于10质量%，则交联聚合物层的均匀性降低，如果结构单元(B-2)的含量超过99质量%，则交联密度降低，亲水化的效果不充分地持续。
聚合物(B)的数均分子量优选为2000～500000。如果数均分子量小于2000，则形成交联聚合物层的时间变长，如果数均分子量超过500000，则涂布液的粘度变高，涂布性或作业性变差。
水解性聚合物可以组合应用聚合物(A)及聚合物(B)，也可以组合应用水解性聚合物和非水解性聚合物。非水解性聚合物并无特别限定，可以列举：不具有可以通过水解生成硅烷醇基的官能团的聚合物(A)、聚合物(B)等。
在容器的表面附近导入硅烷醇基的方法并无特别限定，可以列举：通过将包含有机硅树脂的涂布液涂布于容器上而形成包含具有硅烷醇基的有机硅树脂的膜的方法等。
包含具有硅烷醇基的有机硅树脂的膜优选水的接触角为3°～8°。形成水的接触角小于3°的膜是困难的，如果形成水的接触角超过8°的膜，则无法高密度地导入磷酸胆碱类似基团。
涂布液所含的有机硅树脂并无特别限定，可以列举将由通式：
(R1O)nSi(R2)4-n
(式中，R1及R2分别独立为碳原子数1～8的烷基，n为1～4的整数，n为1或2时，多个R2可以相同也可以不同，n为2或3时，多个R1可以相同也可以不同。)
表示的烷氧基硅烷水解后进行缩合而得的树脂，可以组合应用二种以上。此时，水的接触角为3°～8°的膜所含的具有硅烷醇基的有机硅树脂和涂布液所含的有机硅树脂可以相同，也可以不同。
涂布液所含的有机溶剂并无特别限定，可以列举：脂肪族烃，芳香族烃，氯化烃，醚，碳原子数为1～4的1～4价脂肪族醇等醇，乙基溶纤剂、丁基溶纤剂等溶纤剂，二
Figure 71817DEST_PATH_IMAGE003
烷，乙酸甲酯，二甲酰胺等，其可以组合应用二种以上。
涂布液中的有机硅树脂的含量通常为0.001～1质量%，优选为0.1～1质量%。如果涂布液中的有机硅树脂的含量小于0.001质量%，则不形成均匀的膜，如果涂布液中的有机硅树脂的含量超过20质量%，则涂布性降低。
涂布涂布液的方法并无特别限定，可以列举：浸渍涂布法、喷雾涂布法、旋铸(spincast)法等。
构成容器的材料并无特别限定，可以列举：聚碳酸酯、PET(聚对苯二甲酸乙二酯)、聚苯乙烯、丙烯酸类树脂等有机材料；金、钛、铝、铁、铜、不锈钢、氧化铝、二氧化钛、氧化锌等无机材料等。
另外，表面附近存在硅烷醇基的容器可以使用玻璃制容器。
构成表面附近存在衍生自金属氧化物的羟基的容器的金属氧化物并无特别限定，可以列举：二氧化钛、氧化锌、氧化铁、氧化铬、氧化铝等。
构成表面附近存在衍生自半金属氧化物的羟基的容器的金属氧化物并无特别限定，可以列举：氧化锗、氧化砷、氧化硼等。
对可以通过水解生成硅烷醇基的官能团、硅烷醇基、衍生自半金属氧化物的羟基及衍生自金属氧化物的羟基中的至少一种有反应性的官能团可以列举：可以通过水解生成硅烷醇基的官能团。
另外，对于第一表面改性剂，优选可以通过水解生成硅烷醇基的官能团通过间隔基与磷酸胆碱类似基团结合。间隔基并无特别限定，可以列举：亚甲基、氧基亚乙基、具有1个以上氨基的亚烷基等。
可以通过水解生成硅烷醇基的官能团可以列举：氢硅烷基、烷氧基甲硅烷基、卤化甲硅烷基、酰氧基甲硅烷基、氨基甲硅烷基等，从稳定性、反应性等的方面来看，优选碳原子数为1～6的烷氧基甲硅烷基或氢硅烷基。
第一表面改性剂只要具有可以通过水解生成硅烷醇基的官能团及磷酸胆碱类似基团即可，并无特别限定，可以列举日本特开2006-11380号公报所公开的化合物。
第二表面改性剂只要具有可以通过水解生成硅烷醇基的官能团，以及氨基、可以通过水解生成羧基的官能团及可以通过水解生成羟基的官能团中的至少一种即可，并无特别限定，可以列举：3-氨基丙基三甲氧基硅烷、对氨基苯基三甲氧基硅烷等具有氨基的化合物；3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐等具有可以通过水解生成羧基的官能团的化合物；3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基甲基二乙氧基硅烷等具有可以通过水解生成羟基的官能团的化合物等，可以组合应用二种以上。
在第二表面改性剂具有可以通过水解生成羧基和/或羟基的官能团时，将可以通过水解生成羧基和/或羟基的官能团导入容器的表面附近后，进行水解即可。
另外，第二表面改性剂所具有的氨基可以由保护基保护。另外，对于第二表面改性剂，代替可以通过水解生成羧基或羟基的官能团，可以具有由可以通过水解以外的反应脱保护的保护基保护的羧基或羟基。
第二表面改性剂具有由保护基保护的氨基、羧基及羟基中的至少一种时，将由保护基保护的氨基、羧基及羟基中的至少一种导入至容器的表面附近后进行脱保护即可。
接着，对在表面附近存在可以通过水解生成硅烷醇基的官能团、硅烷醇基、衍生自半金属氧化物的羟基及衍生自金属氧化物的羟基中的至少一种的容器中，导入磷酸胆碱类似基团，以及氨基、可以通过水解生成羧基的官能团及可以通过水解生成羟基的官能团中的至少一种的方法进行说明。
首先，在表面附近存在可以通过水解生成硅烷醇基的官能团、硅烷醇基、衍生自半金属氧化物的羟基及衍生自金属氧化物的羟基的容器中，涂布包含第一表面改性剂及第二表面改性剂的涂布液。此时，将可以通过水解生成硅烷醇基的官能团水解，生成硅烷醇基。接着，通过衍生自表面改性剂的硅烷醇基，以及衍生自容器的硅烷醇基、衍生自半金属氧化物的羟基及衍生自金属氧化物的羟基中的至少一种的脱水缩合，将容器的表面改性。具体而言，将涂布液涂布于容器后，涂布水、酸或碱，并进行加热。另外，可以在将水、酸或碱涂布于容器后对涂布液进行涂布。并且，可以在涂布液中混合水、酸或碱。此时，由于在涂布液中引起水解，因此优选在涂布时适当制备涂布液。另外，在使用水、酸或碱时，可以进行加热，但通常在室温进行充分反应。另外，可以不使用水、酸或碱，利用大气中的水分缓慢地进行反应。
酸或碱可以使能够通过水解生成硅烷醇基的官能团水解即可，并无特别限定，可以组合应用二种以上。另外，水解所用的酸或碱可以作为水溶液使用。
涂布液可以使用使第一表面改性剂及第二表面处理剂溶解或分散于有机溶剂的涂布液。有机溶剂可以列举：脂肪族烃，芳香族烃，氯化烃，醚，碳原子数为1～4的1～4价脂肪族醇等醇，乙基溶纤剂、丁基溶纤剂等溶纤剂，二
Figure 546661DEST_PATH_IMAGE003
烷，乙酸甲酯，二甲酰胺等。
涂布液中的第一表面改性剂的含量通常为0.1～30质量%，优选为1～10质量%。如果涂布液中的第一表面改性剂的含量小于0.1质量%，则无法通过1次涂布而充分地涂布第一表面改性剂，如果涂布液中的第一表面改性剂的含量超过30质量%，则涂布性降低。
在第二表面处理剂具有氨基时，涂布液中的第一表面改性剂的磷酸胆碱类似基团相对于第二表面处理剂的氨基的当量比通常为3/7～19。
对涂布液进行涂布的方法并无特别限定，可以列举：浸渍涂布法、喷雾涂布法、旋铸法等。
另外，可以将包含第一表面处理剂的涂布液及包含第二表面处理剂的涂布液分别涂布于容器。
另外，可以使衍生自表面改性剂的硅烷醇基，以及衍生自容器的硅烷醇基、衍生自半金属氧化物的羟基及衍生自金属氧化物的羟基中的至少一种反应，使得在容器的表面附近残留未反应的硅烷醇基、衍生自半金属氧化物的羟基及衍生自金属氧化物的羟基中的至少一种。
[本发明的细胞凝集块形成用容器的第三实施方案]
本发明的细胞凝集块形成用容器的第三实施方案是在表面形成包含树脂的层，所述树脂具有磷酸胆碱类似基团，以及氨基、羧基及羟基中的至少一种。
具有磷酸胆碱类似基团以及氨基、羧基及羟基中的至少一种的树脂并无特别限定，可以列举通过使具有磷酸胆碱类似基团的单体，以及具有氨基的单体、具有羧基的单体及具有羟基的单体中的至少一种共聚合而得的树脂(例如参照日本特开平7-184990号公报)。
构成容器的材料并无特别限定，可以列举：环烯烃树脂、聚碳酸酯、PET(聚对苯二甲酸乙二酯)、聚苯乙烯、丙烯酸类树脂等有机材料；金、钛、铝、铁、铜、不锈钢、氧化铝、二氧化钛、氧化锌等无机材料等。
另外，使用由有机材料构成的容器时，如果考虑对容器的粘附性，则优选使用通过下列方式得到的树脂：将具有磷酸胆碱类似基团的单体，以及具有氨基、羧基及羟基中的至少一种的单体，以及具有疏水性基团的单体进行共聚合。
具有疏水性基团的单体并无特别限定，可以列举甲基丙烯酸丁酯等。
对于在容器的表面附近形成包含具有磷酸胆碱类似基团，以及氨基、羧基及羟基中的至少一种的树脂的层的方法，可以列举将包含树脂的涂布液涂布于容器的方法，所述树脂具有磷酸胆碱类似基团，以及氨基、羧基及羟基中的至少一种。
涂布液可以使用使树脂溶解或分散于有机溶剂中的涂布液。有机溶剂可以列举：脂肪族烃，芳香族烃，氯化烃，醚，碳原子数为1～4的1～4价脂肪族醇等醇，乙基溶纤剂、丁基溶纤剂等溶纤剂，二
Figure 574660DEST_PATH_IMAGE003
烷，乙酸甲酯，二甲酰胺等。
涂布液中的树脂的含量通常为0.1～30质量%，优选为1～10质量%。如果涂布液中的树脂的含量小于0.1质量%，则无法通过1次涂布而充分地涂布树脂，如果涂布液中的树脂的含量超过30质量%，则涂布性降低。
对涂布液进行涂布的方法并无特别限定，可以列举浸渍涂布法、喷雾涂布法、旋铸法等。
本发明的细胞凝集块的形成方法是使用本发明的细胞凝集块形成用容器培养体细胞而形成细胞凝集块。由此可以形成粘附性细胞的细胞凝集块。在本申请说明书及权利要求范围中，体细胞包括多能性干细胞。
另外，如果使用本发明的细胞凝集块的形成方法对可通过悬浮培养形成细胞凝集块的非粘附性细胞进行悬浮培养，则可以形成细胞凝集块。
适用于本发明的细胞凝集块的形成方法的体细胞并无特别限定，可以列举：间充质干细胞、肝细胞、肝干细胞、心肌细胞、癌细胞、癌干细胞、成纤维细胞、神经细胞、血管内皮前体细胞等粘附性细胞；神经系干细胞、造血干细胞、淋巴瘤细胞等非粘附性细胞。
在本发明的细胞凝集块的形成方法中，如果适用人、大鼠、小鼠、灵长类等哺乳类衍生的体细胞，则对于后述的物质的筛选方法及细胞的功能探索方法是有用的。
本发明中，对培养体细胞的方法并无特别限定，可以根据体细胞而适用公知的条件，可以列举下列方法：使用包含10质量%的胎牛血清(FBS)、1mM的谷酰胺、适量抗生素的Dulbecco改良培养基(DMEM)，在包含5体积%的二氧化碳的气氛下，于37℃培养体细胞。
本发明的物质的筛选方法是使用通过本发明的细胞凝集块的形成方法形成的细胞凝集块来筛选物质。此时，本发明的物质的筛选方法可以适用于使用肝细胞或心肌细胞来评价物质毒性的方法、使用癌细胞来试验药剂效果的方法等公知的物质的筛选方法。评价物质毒性的方法可以列举：MTT分析、AlamarBlue分析等以细胞增殖为基准的方法。另外，通过RT-PCR、ELISA等方法，也可以对炎性细胞因子的产生释放、与癌化相关的因子即SDF-1、LIF、EGFR等的量进行定量。
另外，本发明的物质的筛选方法可以通过使用每个个体的体细胞的细胞凝集块来筛选物质而应用于定制医疗中。
本发明的细胞的功能探索方法是使用通过本发明的细胞凝集块的形成方法形成的细胞凝集块来探索细胞的功能。此时，本发明的细胞的功能探索方法可以适用于阐明体细胞的生物化学功能的方法、探索生物标记的方法等公知的细胞的功能探索方法。
实施例
[实施例1]
在Primaria培养皿(日本ベクトン・ディッキンソン社制造)中，投入1g N-羟基琥珀酰亚胺、1g 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的1质量%水溶液后，添加使1g由化学式
[化学式14]
Figure 818559DEST_PATH_IMAGE015
表示的化合物溶解于100ml水而成的溶液，进行酯化。接着，从Primaria培养皿取出液体，于室温干燥5小时后，进行水洗、干燥，获得细胞凝集块形成用容器。另外，Primaria培养皿是在包含氧气和氨气的气氛下进行等离子体处理的聚苯乙烯制培养皿。
在细胞凝集块形成用容器中添加10ml的MensenPRO RS培养基(Invitrogen公司制造)及1×106个/容器的作为间充质干细胞的人脂肪衍生干细胞(Invitrogen公司制造)，对人脂肪衍生干细胞进行培养，结果细胞增殖，形成细胞凝集块(参照图2A及图2B)。
[比较例1]
在未经表面处理的聚苯乙烯制陪替氏培养皿(日本ベクトン・ディッキンソン社制造)中，添加10ml的MensenPRO RS培养基(Invitrogen公司制造)及1×106个/培养皿的人脂肪衍生干细胞(Invitrogen公司制造)1×106个/培养皿，对人脂肪衍生干细胞进行培养，结果细胞以单层状态伸展、增殖，不形成细胞凝集块(参照图3)。
[碱性磷酸酶活性]
在实施例1的细胞凝集块及比较例1的培养细胞中添加4质量%低聚甲醛-磷酸缓冲液处理5分钟后，使用TBS缓冲液及TBST缓冲液清洗。接着，添加BM Purple AP基质(Roche公司制造)，于37℃反应1小时后，使用TBST缓冲液清洗。将评价结果示于图4A及图4B中。根据图4A及图4B可知，实施例1的细胞凝集块的碱性磷酸酶活性为阳性，而比较例1的培养细胞的碱性磷酸酶活性为阴性。
[免疫双重染色]
在实施例1的细胞凝集块及比较例1的培养细胞中添加4质量%低聚甲醛-磷酸缓冲液处理5分钟后，使用TBS缓冲液及TBST缓冲液清洗。接着，通过目录所记载的方法稀释第一初次抗体，该抗体与细胞反应后，使第一Alexa Fluor标记二次抗体(Invitrogen公司制造)与细胞反应，使用TBST缓冲液清洗。进一步的，通过目录所记载的方法稀释第二初次抗体，该抗体与细胞反应后，使第二Alexa Fluor标记二次抗体(Invitrogen公司制造)与细胞反应，使用TBST缓冲液清洗。将评价结果示于表1中。
[表1]
实施例1 比较例1
巢蛋白(Nestin) 阳性 阴性
CD271 高 低
CD133 阳性 阴性
PDGFRa 高 低
PDGFRb 高 低
另外，Nestin(Abcam公司制造)、CD271(Abcam公司制造)及CD133(Abcam公司制造)分别为神经衍生干细胞标记、脂肪衍生干细胞标记及干细胞标记，PDGFRa(R＆D公司制造)及PDGFRb(R＆D公司制造)为间充质干细胞标记。另外，将实施例1的细胞凝集块的评价结果示于图5～图8中。根据表1可知，由于实施例1的细胞凝集块的Nestin为阳性，因此脂肪衍生干细胞在体外可以获得神经衍生干细胞的性质。
[实施例2]
获得包含0.5mL的3-氨基丙基三甲氧基硅烷的0.15mol/L甲醇溶液、9.5mL的由化学式
[化学式15]
Figure 8232DEST_PATH_IMAGE016
表示的化合物(A)的0.15mol/L甲醇溶液及10mL甲醇的涂布液。
将所得的涂布液涂布于玻璃底培养皿(松浪硝子工业公司制造)，于室温干燥。接着进行加热干燥，在室温干燥后，进行水洗、干燥，获得细胞凝集块形成用容器。
在细胞凝集块形成用容器中，添加2.5ml的MensenPRO RS培养基(Invitrogen公司制造)及1×105个/容器的人脂肪衍生干细胞(Invitrogen公司制造)，对人脂肪衍生干细胞进行培养，结果细胞增殖，形成细胞凝集块(参照图9)。
[实施例3]
获得包含7mL的3-氨基丙基三甲氧基硅烷的0.15mol/L甲醇溶液、3mL的化合物(A)的0.15mol/L甲醇溶液及10mL甲醇的涂布液。
将所得的涂布液涂布于玻璃底培养皿(松浪硝子工业公司制造)，于室温干燥。接着进行加热干燥，于室温干燥后，进行水洗、干燥，获得细胞凝集块形成用容器。
在细胞凝集块形成用容器中，添加2.5ml的MensenPRO RS培养基(Invitrogen公司制造)及1×105个/容器的人脂肪衍生干细胞(Invitrogen公司制造)，对人脂肪衍生干细胞进行培养，结果细胞增殖，形成细胞凝集块(参照图10)。
[比较例2]
在未经表面处理的玻璃底培养皿(松浪硝子工业公司制造)中，添加2.5ml的MensenPRO RS培养基(Invitrogen公司制造)及1×105个/培养皿的人脂肪衍生干细胞(Invitrogen公司制造)，对人脂肪衍生干细胞进行培养，结果细胞以单层状态伸展、增殖，不形成细胞凝集块(参照图11)。
[免疫染色]
在实施例2的细胞凝集块的培养细胞中添加4质量%低聚甲醛-磷酸缓冲液处理5分钟后，使用0.2质量%的Triton X-100(ロシュ・ダイアグノスティックス社制造)/TBS缓冲液及0.2质量%的Tween20(东京化成工业公司制造)/TBS缓冲液进行清洗。接着，利用Protein Block(DAKO公司制造)封闭非特异反应。进一步地，使稀释为200倍的初次抗体即抗CD271兔多克隆抗体(abcam公司制造)及CD90小鼠单克隆抗体(abcam公司制造)与细胞反应一晩后，使用0.2质量%的Tween20(东京化成工业公司制造)/TBS缓冲液进行清洗。接着，使稀释为250倍的分别发出绿色及红色的荧光二次抗体即Alexa488抗兔抗体(Invitrogen公司制造)及Alexa594抗小鼠抗体(Invitrogen公司制造)与细胞反应2小时后，使用0.2质量%的Tween20(东京化成工业公司制造)/TBS缓冲液进行清洗。进一步地，利用发出蓝色的Vectorshield-DAPI(Vector公司制造)对核染色后，使用共聚焦激光显微镜LSM 5 PASCAL(Carl Zeiss公司制造)进行观察。结果可知，由于实施例2的细胞凝集块发出绿色，因此CD271为阳性(参照图12)。
另外，实施例3的细胞凝集块也与实施例2的细胞凝集块同样发出绿色，CD271为阳性。
本国际申请主张基于2009年6月15日申请的日本专利申请2009-142254的优先权，日本专利申请2009-142254的全部内容在本国际申请中引用。
[符号说明]
C 粘附性细胞
D 细胞凝集块形成用容器。

Claims (11)

1.细胞凝集块形成用容器，其特征在于：其表面附近存在由通式：
[化学式1]
Figure 2010800264758100001DEST_PATH_IMAGE001
表示的基团，以及氨基、羧基和羟基中的至少一种，该式中，R1、R2及R3分别独立为碳原子数1以上6以下的烷基，m为2以上6以下的整数。
2.根据权利要求1所述的细胞凝集块形成用容器，其特征在于通过以下方式制造：在表面附近存在羧基、氨基及羟基的容器中，使具有对羧基、氨基或羟基有反应性的官能团及由所述通式表示的基团、且分子量为225以上650以下的化合物反应。
3.根据权利要求2所述的细胞凝集块形成用容器，其特征在于：在包含氧气、臭氧及水蒸气中的至少一种和氨气和/或氮气的气氛下对在表面附近存在所述羧基、氨基及羟基的容器进行等离子体处理。
4.根据权利要求1所述的细胞凝集块形成用容器，其特征在于通过以下方式制造：在表面附近存在可以通过水解生成硅烷醇基的官能团、硅烷醇基、衍生自半金属氧化物的羟基及衍生自金属氧化物的羟基中的至少一种的容器中，使第一化合物和第二化合物反应，所述第一化合物具有可以通过水解生成硅烷醇基的官能团及所述通式表示的基团、且分子量为315以上650以下，所述第二化合物具有可以通过水解生成硅烷醇基的官能团，以及氨基、可以通过水解生成羧基的官能团及可以通过水解生成羟基的官能团中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的细胞凝集块形成用容器，其特征在于：在表面形成包含树脂的层，所述树脂具有所述通式表示的基团，以及氨基、羧基及羟基中的至少一种。
6.细胞凝集块的形成方法，其特征在于：使用根据权利要求1至5中任一项所述的细胞凝集块形成用容器对体细胞进行培养而形成细胞凝集块。
7.根据权利要求6所述的细胞凝集块的形成方法，其特征在于：所述体细胞为粘附性细胞。
8.物质的筛选方法，其特征在于具有：使用根据权利要求1至5中任一项所述的细胞凝集块形成用容器对体细胞进行培养而形成细胞凝集块的步骤；和使用该细胞凝集块筛选物质的步骤。
9.根据权利要求8所述的物质的筛选方法，其特征在于：所述体细胞为粘附性细胞。
10.细胞的功能探索方法，其特征在于具有：使用根据权利要求1至5中任一项所述的细胞凝集块形成用容器对体细胞进行培养而形成细胞凝集块的步骤；和使用该细胞凝集块探索细胞的功能的步骤。
11.根据权利要求10所述的细胞的功能探索方法，其特征在于：所述体细胞为粘附性细胞。
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