KR20120023084A - 세포 응집 덩어리 형성용 용기, 세포 응집 덩어리의 형성방법, 물질의 스크리닝 방법, 및 세포의 기능 탐색 방법 - Google Patents

세포 응집 덩어리 형성용 용기, 세포 응집 덩어리의 형성방법, 물질의 스크리닝 방법, 및 세포의 기능 탐색 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20120023084A
KR20120023084A KR1020117029714A KR20117029714A KR20120023084A KR 20120023084 A KR20120023084 A KR 20120023084A KR 1020117029714 A KR1020117029714 A KR 1020117029714A KR 20117029714 A KR20117029714 A KR 20117029714A KR 20120023084 A KR20120023084 A KR 20120023084A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
group
container
cell
mass
forming
Prior art date
Application number
KR1020117029714A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101307305B1 (ko
Inventor
시게요시 후지와라
케이고 타케이
아야 히라야마
유키미츠 스다
Original Assignee
가부시키가이샤 시세이도
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가부시키가이샤 시세이도 filed Critical 가부시키가이샤 시세이도
Publication of KR20120023084A publication Critical patent/KR20120023084A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101307305B1 publication Critical patent/KR101307305B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/062—Sensory transducers, e.g. photoreceptors; Sensory neurons, e.g. for hearing, taste, smell, pH, touch, temperature, pain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0671—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Abstract

세포 응집 덩어리 형성용 용기는 일반식
Figure pct00018

(식 중, R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 탄소수가 1 이상 6 이하의 알킬기이며, m은 2 이상 6 이하의 정수이다)으로 나타내어지는 기와, 아미노기, 카르복실기 및 히드록실기 중 적어도 하나가 표면 근방에 존재한다.

Description

세포 응집 덩어리 형성용 용기 및 세포 응집 덩어리의 형성방법{CONTAINER FOR FORMATION OF AGGREGATED CELL MASS, AND METHOD FOR FORMATION OF AGGREGATED CELL MASS}
본 발명은 세포 응집 덩어리 형성용 용기, 세포 응집 덩어리의 형성방법, 세포 응집 덩어리, 물질의 스크리닝 방법 및 세포의 기능 탐색 방법에 관한 것이다.
종래, 접착성 세포 및 비접착성 세포를 배양함으로써 세포 응집 덩어리가 형성되고 있다.
특허문헌 1에는 다능성 신경 줄기세포를 포함하는 조직을 적어도 1종의 줄기세포 증식인자를 포함하는 배지에 현탁하고, 신경 줄기세포 응집 덩어리 형성용 용기에 파종, 배양함으로서 신경 줄기세포 응집 덩어리를 형성시키는 방법이 개시되어 있다. 이 때, 신경 줄기세포 응집 덩어리 형성용 용기는 내면에 비수용성 경화 피막층을 갖고, 수용성 수지를 용기 내면에 피복시켜서 수용성 수지 피복층을 형성한 후에 수용성 수지 피복층을 경화시켜서 비수용성 경화 피막층으로 변성함으로써 제조된다. 또한, 수용성 수지로서 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과 다른 모노머(예를 들면 부틸메타크릴레이트 등)의 공중합체가 예시되어 있다.
그러나, 이러한 신경 줄기세포 응집 덩어리 형성용 용기를 이용하여 접착성 세포를 배양해도 비수용성 경화 피막층이 접착성 세포의 접착을 저해하기 때문에 접착성 세포가 사멸하여 접착성 세포의 세포 응집 덩어리를 형성할 수 없다고 하는 문제가 있다.
일본 특허 공개 2008-220205호 공보
본 발명은 상기 종래 기술이 갖는 문제를 감안하여, 접착성 세포의 세포 응집 덩어리를 형성하는 것이 가능한 세포 응집 덩어리 형성용 용기 및 그 세포 응집 덩어리 형성용 용기를 사용하는 세포 응집 덩어리의 형성방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 상기 세포 응집 덩어리의 형성방법을 이용하는 물질의 스크리닝 방법 및 세포의 기능 탐색 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
청구항 1에 기재된 발명은 세포 응집 덩어리 형성용 용기에 있어서, 일반식
Figure pct00001
(식 중, R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 탄소수가 1 이상 6 이하의 알킬기이며, m은 2 이상 6 이하의 정수이다)
으로 나타내어지는 기와, 아미노기, 카르복실기 및 히드록실기 중 적어도 하나가 표면 근방에 존재하는 것을 특징으로 한다.
청구항 2에 기재된 발명은 청구항 1에 기재된 세포 응집 덩어리 형성용 용기에 있어서, 카르복실기, 아미노기 및 히드록실기가 표면 근방에 존재하는 용기에 카르복실기, 아미노기 또는 히드록실기에 대하여 반응성을 갖는 관능기 및 상기 일반식으로 나타내어지는 기를 갖고 분자량이 225 이상 650 이하인 화합물을 반응시킴으로써 제조되어 있는 것을 특징으로 한다.
청구항 3에 기재된 발명은 청구항 2에 기재된 세포 응집 덩어리 형성용 용기에 있어서, 상기 카르복실기, 아미노기 및 히드록실기가 표면 근방에 존재하는 용기는 산소, 오존 및 수증기 중 적어도 하나와, 암모니아 및/또는 질소를 포함하는 분위기 하에서 플라즈마 처리되어 있는 것을 특징으로 한다.
청구항 4에 기재된 발명은 청구항 1에 기재된 세포 응집 덩어리 형성용 용기에 있어서, 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기, 실라놀기, 반금속 산화물 유래의 히드록실기 및 금속 산화물 유래의 히드록실기 중 적어도 하나가 표면 근방에 존재하는 용기에, 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기 및 상기 일반식으로 나타내어지는 기를 갖고 분자량이 315 이상 650 이하인 제 1 화합물과, 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기와, 아미노기, 가수분해에 의해 카르복실기를 생성하는 것이 가능한 관능기 및 가수분해에 의해 히드록실기를 생성하는 것이 가능한 관능기 중 적어도 하나를 갖는 제 2 화합물을 반응시킴으로써 제조되어 있는 것을 특징으로 한다.
청구항 5에 기재된 발명은 청구항 1에 기재된 세포 응집 덩어리 형성용 용기에 있어서, 상기 일반식으로 나타내어지는 기와, 아미노기, 카르복실기 및 히드록실기 중 적어도 하나를 갖는 수지를 포함하는 층이 표면에 형성되어 있는 것을 특징으로 한다.
청구항 6에 기재된 발명은 세포 응집 덩어리의 형성방법에 있어서, 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 세포 응집 덩어리 형성용 용기를 이용하여 체세포를 배양해서 세포 응집 덩어리를 형성하는 것을 특징으로 한다.
청구항 7에 기재된 발명은 청구항 6에 기재된 세포 응집 덩어리의 형성방법에 있어서, 상기 체세포는 접착성 세포인 것을 특징으로 한다.
청구항 8에 기재된 발명은 물질의 스크리닝 방법에 있어서, 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 세포 응집 덩어리 형성용 용기를 이용하여 체세포를 배양해서 세포 응집 덩어리를 형성하는 공정과, 그 세포 응집 덩어리를 이용하여 물질을 스크리닝하는 공정을 갖는 것을 특징으로 한다.
청구항 9에 기재된 발명은 청구항 8에 기재된 물질의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 체세포는 접착성 세포인 것을 특징으로 한다.
청구항 10에 기재된 발명은 세포의 기능 탐색 방법에 있어서, 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 세포 응집 덩어리 형성용 용기를 이용하여 체세포를 배양해서 세포 응집 덩어리를 형성하는 공정과, 그 세포 응집 덩어리를 이용하여 세포의 기능을 탐색하는 공정을 갖는 것을 특징으로 한다.
청구항 11에 기재된 발명은 청구항 10에 기재된 세포의 기능 탐색 방법에 있어서, 상기 체세포는 접착성 세포인 것을 특징으로 한다.
(발명의 효과)
본 발명에 의하면 접착성 세포의 세포 응집 덩어리를 형성하는 것이 가능한 세포 응집 덩어리 형성용 용기 및 그 세포 응집 덩어리 형성용 용기를 사용하는 세포 응집 덩어리의 형성방법을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면 상기 세포 응집 덩어리의 형성방법을 사용하는 물질의 스크리닝 방법 및 세포의 기능 탐색 방법을 제공할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 세포 응집 덩어리 형성용 용기를 이용하여 세포 응집 덩어리를 형성하는 방법의 일례를 나타낸 도면(그 1)이다.
도 1b는 본 발명의 세포 응집 덩어리 형성용 용기를 이용하여 세포 응집 덩어리를 형성하는 방법의 일례를 나타낸 도면(그 2)이다.
도 2a는 실시예 1의 세포 응집 덩어리(2일간 배양했을 경우)를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 2b는 실시예 1의 세포 응집 덩어리(5일간 배양했을 경우)를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 3은 비교예 1의 배양세포(5일간 배양했을 경우)를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 4a는 실시예 1의 세포 응집 덩어리의 알칼리포스파타아제 활성의 평가 결과를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 4b는 비교예 1의 배양세포의 알칼리포스파타아제 활성의 평가 결과를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 5는 실시예 1의 세포 응집 덩어리의 면역 이중염색의 평가 결과(그 1)를 나타내는 형광 현미경 사진이다.
도 6은 실시예 1의 세포 응집 덩어리의 면역 이중염색의 평가 결과(그 2)를 나타내는 형광 현미경 사진이다.
도 7은 실시예 1의 세포 응집 덩어리의 면역 이중염색의 평가 결과(그 3)를 나타내는 형광 현미경 사진이다.
도 8은 실시예 1의 세포 응집 덩어리의 면역 이중염색의 평가 결과(그 4)를 나타내는 형광 현미경 사진이다.
도 9는 실시예 2의 세포 응집 덩어리(7일간 배양했을 경우)를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 10은 실시예 3의 세포 응집 덩어리(7일간 배양했을 경우)를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 11은 비교예 2의 배양세포(7일간 배양했을 경우)를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 12는 실시예 2의 세포 응집 덩어리의 면역염색의 평가 결과를 나타내는 사진이다.
이어서, 본 발명을 실시하기 위한 형태를 도면과 함께 설명한다.
본 발명의 세포 응집 덩어리 형성용 용기는 일반식
Figure pct00002
(식 중, R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 탄소수가 1?6의 알킬기이며, m은 2?6의 정수이다)
으로 나타내어지는 포스포릴콜린 유사기와, 아미노기, 카르복실기 및 히드록실기 중 적어도 하나가 표면 근방에 존재한다.
도 1에 본 발명의 세포 응집 덩어리 형성용 용기를 이용하여 세포 응집 덩어리를 형성하는 방법의 일례를 나타낸다. 세포 응집 덩어리 형성용 용기(D)에 접착성 세포(C) 및 배지(도시하지 않음)를 첨가하면 세포 응집 덩어리 형성용 용기(D)의 일부에 접착성 세포(C)가 접착한다(도 1a 참조). 이것은 세포 응집 덩어리 형성용 용기(D)의 아미노기, 카르복실기 및 히드록실기 중 적어도 하나가 표면 근방에 존재하는 영역(D1)에 접착성 세포(C)가 접착하기 때문이라 생각된다. 이어서, 접착성 세포(C)를 배양하면 접착성 세포(C)가 증식하고, 자율적으로 접착성 세포(C)의 세포 응집 덩어리(C')가 형성된다(도 1b 참조). 이것은 세포 응집 덩어리 형성용 용기(D)의 아미노기, 카르복실기 또는 히드록실기가 표면 근방에 존재하지 않는 영역(D2)은 접착성 세포(C)의 접착을 억제하기 때문에 접착성 세포(C) 상에 증식한 접착성 세포(C)가 형성되기 때문이라고 생각된다. 이 때문에, 세포 응집 덩어리 형성용 용기(D)를 이용하여 접착성 세포(C)를 배양하면 접착성 세포(C)의 세포 응집 덩어리(C')를 형성할 수 있다.
본 발명의 세포 응집 덩어리 형성용 용기의 형태로서는 특별하게 한정되지 않지만, 접시, 멀티웰플레이트(multi well plate), 플라스크, 롤러 병(roller bottle), 세포배양 프로세스를 갖는 디바이스의 유닛 등을 들 수 있다.
[본 발명의 세포 응집 덩어리 형성용 용기의 제 1 실시형태]
본 발명의 세포 응집 덩어리 형성용 용기의 제 1 실시형태는 카르복실기, 아미노기 및 히드록실기가 표면 근방에 존재하는 용기에, 카르복실기, 아미노기 또는 히드록실기에 대하여 반응성을 갖는 관능기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면개질제를 반응시킴으로써 제조되고 있다. 이 때, 표면개질제의 분자량은 225?650이다. 이것에 의해, 포스포릴콜린 유사기를 고밀도로 도입할 수 있다.
용기의 표면 근방에 아미노기를 도입하는 방법으로서는 특별하게 한정되지 않지만, 질소 플라즈마 처리, 암모니아 플라즈마 처리, 표면처리제를 반응시키는 방법, 실리콘 기상 처리 등을 들 수 있다.
질소 플라즈마 처리에서는 질소 가스 분위기 하에 저온 플라즈마를 발생시킴으로써 용기의 표면 근방에 아미노기를 도입한다[예를 들면, Surface and Coatings Technology 116-119(1999) 802-807, Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 195(2001) 81-95, Macromol. Chem. Phys. 200. 989-996(1999) 참조]. 구체적으로는, 용기를 반응용기 내에 수용하고, 반응용기 내를 진공펌프에 의해 진공으로 한 후 질소 가스를 도입하고, 글로우 방전을 행한다.
암모니아 플라즈마 처리에서는 암모니아 가스 분위기 하에 저온 플라즈마를 발생시킴으로써 용기의 표면 근방에 아미노기를 도입한다. 구체적으로는, 용기를 반응용기 내에 수용하고, 반응용기 내를 진공펌프에 의해 진공으로 한 후 암모니아 가스를 도입하고, 글로우 방전을 행한다.
용기를 구성하는 재료로서는 특별하게 한정되지 않지만, 폴리염화비닐, 아크릴 수지, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 시클로올레핀 수지, 폴리카보네이트, 유리 등을 들 수 있다.
표면처리제를 반응시키는 방법에서는 아미노기를 갖는 알콕시실란, 클로로 실란, 실라잔 등의 표면처리제를 이용하여 알콕시실릴기 등의 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기, 실라놀기, 반금속 산화물 유래의 히드록실기 및 금속 산화물 유래의 히드록실기 중 적어도 하나가 표면 근방에 존재하는 용기의 표면 근방에 아미노기를 도입한다. 구체적으로는, 우선 용기 내에 물/2-프로판올 혼합액을 투입하고, 3-아미노프로필트리메톡시실란을 첨가한 후 100℃로 가열하고, 6시간 반응시킨다. 이어서, 실온으로 냉각한 후 메탄올로 세정하고, 건조한다.
용기를 구성하는 재료로서는 특별하게 한정되지 않지만, 메타크릴산 3-트리메톡시실릴프로필-메타크릴산 메틸-디비닐벤젠 공중합체, 폴리염화비닐, 아크릴 수지, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 시클로올레핀 수지, 폴리카보네이트, 실리카, 유리, 알루미나, 탤크, 클레이, 마이카, 석면, 산화티타늄, 아연화, 산화철 등을 들 수 있다.
실리콘 기상 처리에서는 1,3,5,7-테트라메틸시클로테트라실록산을 이용하여 용기의 표면 근방에 히드로실릴기를 도입한 후 아미노기를 갖는 알켄을 반응시킴으로써 용기의 표면 근방에 아미노기를 도입한다(예를 들면, 일본 특허 공고 평 1-54379호 공보, 일본 특허 공고 평 1-54380호 공보, 일본 특허 공고 평 1-54381호 공보 참조). 구체적으로는, 우선 1,3,5,7-테트라메틸시클로테트라실록산과, 용기를 데시케이터 속에 넣고 아스피레이터(aspirator)로 탈기한다. 이어서, 80℃에서 16시간 반응시킨 후 용기를 인출하여 120℃에서 건조시킨다. 또한, 얻어진 용기를 에탄올 속에 침지하여 알릴아민을 첨가한 후 염화백금산의 에탄올 용액을 첨가하고, 60℃에서 2시간 교반한다. 반응이 종료된 후 에탄올로 세정하고, 감압 건조한다.
용기를 구성하는 재료로서는 특별하게 한정되지 않지만, 스티렌-디비닐벤젠 공중합체, 폴리염화비닐, 아크릴 수지, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 시클로올레핀 수지, 폴리카보네이트, 마이카, 탤크, 카올린, 알루미나, 산화티타늄, 산화아연, 산화철 등을 들 수 있다.
아미노기를 갖는 알켄으로서는 알릴아민에 한정되지 않고, 비닐기를 갖는 아민, 아크릴기를 갖는 아민 등이면 된다. 또한 아미노기는 부톡시카르보닐기, 벤질옥시카르보닐기 등에 의해 보호되어 있어도 좋다. 또한, 아미노기를 갖는 알켄 대신에 에폭시기 등의, 예를 들면 디아민과의 반응에 의해 아미노기를 도입하는 것이 가능한 관능기를 갖는 알켄을 사용해도 좋다.
용기의 표면 근방에 카르복실기 및/또는 히드록실기를 도입하는 방법으로서는 특별하게 한정되지 않지만, 산소 플라즈마 처리, 오존 처리, 수증기 플라즈마 처리 등을 들 수 있다.
산소 플라즈마 처리에서는 산소 가스의 분위기 하에 저온 플라즈마를 발생시킴으로써 용기의 표면 근방에 카르복실기 및 히드록실기를 도입한다. 구체적으로는, 용기를 반응용기 내에 수용하고, 반응용기 내를 진공펌프에 의해 진공으로 한 후 산소 가스를 도입하고, 글로우 방전한다.
오존 처리에서는 용기에 오존 수용액을 투입함으로써 용기의 표면 근방에 카르복실기 및 히드록실기를 도입한다. 구체적으로는, 용기에 40ppm의 오존 수용액을 투입하여 실온에서 15분간 처리한다.
수증기 플라즈마 처리에서는 수증기의 분위기 하에 저온 플라즈마를 발생시킴으로써 용기의 표면 근방에 히드록실기를 도입한다. 구체적으로는, 용기를 반응용기 내에 수용하고, 반응용기 내를 진공펌프에 의해 진공으로 한 후 수증기를 도입하고, 글로우 방전한다.
용기를 구성하는 재료로서는 특별하게 한정되지 않지만, 폴리스티렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리카보네이트, 폴리메타크릴산 메틸, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에테르에테르케톤, 시클로올레핀 수지, 폴리카보네이트 등을 들 수 있다.
용기의 표면 근방에 카르복실기를 도입하는 방법으로서는 특별하게 한정되지 않지만, 표면처리제를 반응시키는 방법, 실리콘 기상 처리 등을 들 수 있다.
표면처리제를 반응시키는 방법에서는 카르복실기를 갖는 알콕시실란, 클로로실란, 실라잔 등의 표면처리제를 이용하여 알콕시실릴기 등의 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기, 실라놀기, 반금속 산화물 유래의 히드록실기 및 금속 산화물 유래의 히드록실기 중 적어도 하나가 표면 근방에 존재하는 용기의 표면 근방에 카르복실기를 도입한다. 구체적으로는, 우선 트리에톡시실릴프로필 무수 숙신산을 N,N-디메틸포름아미드에 용해시키고, 증류수와 4-디메틸아미노 피리딘을 첨가하고, 16시간 실온에서 교반하여 카르복실기를 갖는 실란커플링제를 합성한다. 이어서, 용기에 물/2-프로판올 혼합액을 투입하고, 카르복실기를 갖는 실란커플링제를 첨가한 후 100℃로 가열하여 6시간 반응시킨다. 또한, 실온으로 냉각한 후 메탄올로 세정하여 건조한다.
용기를 구성하는 재료로서는 특별하게 한정되지 않지만, 메타크릴산 3-트리메톡시실릴프로필-메타크릴산 메틸-디비닐벤젠 공중합체, 실리카, 유리, 알루미나, 탤크, 클레이, 마이카, 석면, 산화티타늄, 아연화, 산화철 등을 들 수 있다.
실리콘 기상 처리에서는 1,3,5,7-테트라메틸시클로테트라실록산을 이용하여 용기의 표면 근방에 히드로실릴기를 도입한 후 카르복실기를 갖는 알켄을 반응시킴으로써 용기의 표면 근방에 카르복실기를 도입한다(예를 들면, 일본 특허 공고 평 1-54379호 공보, 일본 특허 공고 평 1-54380호 공보, 일본 특허 공고 평 1-54381호 공보 참조). 구체적으로는, 우선 1,3,5,7-테트라메틸시클로테트라실록산을 넣은 용기를 데시케이터 속에 넣고 아스피레이터로 탈기한다. 이어서, 80℃에서 16시간 반응시킨 후 용기를 인출하고, 120℃에서 건조시킨다. 또한, 얻어진 용기를 에탄올 속에 침지하고, 알릴카르복실산을 첨가한 후 염화백금산의 에탄올 용액을 첨가하여 60℃에서 2시간 교반한다. 반응이 종료된 후 에탄올로 세정하고, 감압 건조한다.
용기를 구성하는 재료로서는 특별하게 한정되지 않지만, 스티렌-디비닐벤젠 공중합체, 마이카, 탤크, 카올린, 알루미나, 산화티타늄, 산화아연, 산화철 등을 들 수 있다.
카르복실기를 갖는 알켄으로서는 알릴카르복실산에 한정되지 않고, 비닐기를 갖는 카르복실산, 아크릴기를 갖는 카르복실산 등이면 된다.
용기의 표면 근방에 아미노기, 카르복실기 및 히드록실기를 도입하는 방법으로서는 특별하게 한정되지 않지만, 산소 가스 및 암모니아 가스를 포함하는 분위기 하에서 플라즈마 처리하는 방법 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 용기를 반응용기 내에 수용하고, 반응용기 내를 진공펌프에 의해 진공으로 한 후 산소 가스 및 암모니아 가스를 도입하고, 글로우 방전을 행하여 저온 플라즈마를 발생시킨다.
카르복실기에 대하여 반응성을 갖는 관능기로서는 아미노기, 히드록실기 등을 들 수 있지만, 반응성이 높기 때문에 아미노기가 바람직하다.
아미노기 또는 히드록실기에 대하여 반응성을 갖는 관능기로서는 카르복실기, 알데히드기 등을 들 수 있지만, 반응성이 높기 때문에 카르복실기가 바람직하다.
또한, 표면개질제는 카르복실기, 아미노기 또는 히드록실기에 대하여 반응성을 갖는 관능기가 스페이서를 통해서 포스포릴콜린 유사기에 결합되어 있는 것이 바람직하다. 스페이서로서는 특별하게 한정되지 않지만, 메틸렌기, 옥시에틸렌기, 아미노기를 1개 이상 갖는 알킬렌기 등을 들 수 있다.
이어서, 아미노기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면개질제에 대하여 설명한다.
아미노기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면개질제로서는 특별하게 한정되지 않지만, 일본 특허 공개 2006-7203호 공보, 일본 특허 공개 2006-7204호 공보, 일본 특허 공개 2008-174491호 공보에 개시되어 있는 화합물 등을 들 수 있다.
용기의 표면 근방에 존재하는 카르복실기와 표면개질제가 갖는 아미노기는 일반적인 반응에 의해 축합시키면 아미드 결합을 형성한다. 구체적으로는, 용기에 N-히드록시숙신이미드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 용액을 투입하고, 용기의 카르복실기를 활성 에스테르화시킨 후 표면개질제를 첨가한다.
이어서, 히드록실기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면개질제에 대하여 설명한다.
히드록실기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면개질제로서는 특별하게 한정되지 않지만, L-α-글리세로포스포릴콜린 등을 들 수 있다.
용기의 표면 근방에 존재하는 카르복실기와 표면개질제가 갖는 히드록실기는 일반적인 반응에 의해 축합시키면 에스테르 결합을 형성한다. 구체적으로는, 브롬화시안을 이용하여 표면개질제의 히드록실기를 활성화시킨 후 용기에 투입한다.
이어서, 카르복실기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면개질제에 대하여 설명한다.
카르복실기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면개질제로서는 특별하게 한정되지 않지만, 일본 특허 공개 2006-11381호 공보에 개시되어 있는 화합물 등을 들 수 있다.
용기의 표면 근방에 존재하는 아미노기와 표면개질제가 갖는 카르복실기는 일반적인 반응에 의해 축합시키면 아미드 결합을 형성한다. 구체적으로는, 표면개질제를 N-히드록시숙신이미드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 용액에 첨가해서 카르복실기를 활성 에스테르화시킨 후 용기에 투입한다.
용기의 표면 근방에 존재하는 히드록실기와 표면개질제가 갖는 카르복실기는 일반적인 반응에 의해 축합시키면 에스테르 결합을 형성한다. 구체적으로는, 브롬화시안을 이용하여 표면개질제의 히드록실기를 활성화시킨 후 용기를 침지한다.
이어서, 알데히드기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면개질제에 대하여 설명한다.
알데히드기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면개질제로서는 특별하게 한정되지 않지만, 일본 특허 공개 2006-11383호 공보에 개시되어 있는 화합물 등을 들 수 있다.
용기의 표면 근방에 존재하는 아미노기와 표면개질제가 갖는 알데히드기는 일반적인 반응에 의해 축합시키면 이미노 결합을 형성한다. 구체적으로는, 용기에 표면개질제 및 메탄올을 투입하고, 실온에서 6시간 방치한 후 시아노트리히드로붕소산 나트륨을 0℃에서 첨가해서 하룻밤 가열 교반한다. 또한, 반응 용매로서는 메탄올 이외에도 물, 에탄올, 2-프로판올 등의 프로톤성 용매를 사용할 수 있지만, 메탄올을 사용했을 경우의 도입율이 높은 경향이 있다.
용기의 표면 근방에 존재하는 히드록실기와 표면개질제가 갖는 알데히드기는 일반적인 반응에 의해 부가시키면 아세탈 결합을 형성한다. 구체적으로는, 용기 및 표면개질제를 메탄올 중, 실온에서 6시간 방치한 후 시아노트리히드로붕소산 나트륨을 0℃에서 첨가하여 하룻밤 가열 교반한다. 또한, 반응 용매로서는 메탄올 이외에도 물, 에탄올, 2-프로판올 등의 프로톤성 용매를 사용할 수 있지만, 메탄올을 사용했을 경우의 도입율이 높은 경향이 있다.
또한, 카르복실기, 아미노기 및 히드록실기가 표면 근방에 존재하는 용기 대신에 알데히드기와, 아미노기 및/또는 히드록실기가 표면 근방에 존재하는 용기를 이용하여 알데히드기에 대하여 반응성을 갖는 관능기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면개질제를 반응시켜도 좋다.
용기의 표면 근방에 알데히드기를 도입하는 방법으로서는 특별하게 한정되지 않지만, 표면 근방에 아미노기가 존재하는 용기에 글루타르알데히드를 반응시키는 방법 등을 들 수 있다.
알데히드기에 대하여 반응성을 갖는 관능기로서는 아미노기, 히드록실기 등을 들 수 있지만, 반응성이 높기 때문에 아미노기가 바람직하다.
또한, 표면개질제는 알데히드기에 대하여 반응성을 갖는 관능기가 스페이서를 통해서 포스포릴콜린 유사기에 결합되어 있는 것이 바람직하다. 스페이서로서는 특별하게 한정되지 않지만, 메틸렌기, 옥시에틸렌기, 아미노기를 1개 이상 갖는 알킬렌기 등을 들 수 있다.
이어서, 아미노기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면개질제에 대하여 설명한다.
아미노기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면개질제로서는 특별하게 한정되지 않지만, 일본 특허 공개 2006-7203호 공보, 일본 특허 공개 2006-7204호 공보, 일본 특허 공개 2008-174491호 공보에 개시되어 있는 화합물 등을 들 수 있다.
용기의 표면 근방에 존재하는 알데히드기와 표면개질제가 갖는 아미노기는 일반적인 반응에 의해 축합시키면 이미노 결합을 형성한다. 구체적으로는, 용기 및 표면개질제를 메탄올 중 실온에서 6시간 방치한 후, 시아노트리히드로붕소산 나트륨을 0℃에서 첨가하여 하룻밤 가열 교반한다. 또한, 반응 용매로서는 메탄올 이외에도 물, 에탄올, 2-프로판올 등의 프로톤성 용매를 사용할 수 있지만, 메탄올을 사용했을 경우의 도입율이 높은 경향이 있다.
이어서, 히드록실기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면개질제에 대하여 설명한다.
히드록실기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면개질제로서는 특별하게 한정되지 않지만, L-α-글리세로포스포릴콜린 등을 들 수 있다.
용기의 표면 근방에 존재하는 알데히드기와 표면개질제가 갖는 히드록실기는 일반적인 반응에 의해 부가시키면 아세탈 결합을 형성한다. 구체적으로는, 용기 및 표면개질제를 메탄올 중, 실온에서 6시간 방치한 후 시아노트리히드로붕소산 나트륨을 0℃에서 첨가하여 하룻밤 가열 교반한다. 또한, 반응 용매로서는 메탄올 이외에도 물, 에탄올, 2-프로판올 등의 프로톤성 용매를 사용할 수 있지만, 메탄올을 사용했을 경우의 도입율이 높은 경향이 있다.
또한, 카르복실기, 아미노기 및 히드록실기가 표면 근방에 존재하는 용기 대신에 카르복실기와, 아미노기 또는 히드록실기가 표면 근방에 존재하는 용기를 이용하여 아미노기 또는 히드록실기에 대하여 반응성을 갖는 관능기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면개질제를 반응시켜도 좋다.
또한, 카르복실기, 아미노기 및 히드록실기가 표면 근방에 존재하는 용기 대신에 아미노기 및 히드록실기가 표면 근방에 존재하는 용기를 이용하여 아미노기 또는 히드록실기에 대하여 반응성을 갖는 관능기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면개질제를, 용기의 표면 근방에 미반응의 아미노기 및/또는 히드록실기가 잔류하도록 반응시켜도 좋다.
또한, 카르복실기, 아미노기 및 히드록실기가 표면 근방에 존재하는 용기 대신에 카르복실기, 아미노기 또는 히드록실기가 표면 근방에 존재하는 용기를 이용하여 카르복실기, 아미노기 또는 히드록실기에 대하여 반응성을 갖는 관능기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면개질제를, 용기의 표면 근방에 미반응의 카르복실기, 아미노기 또는 히드록실기가 잔류하도록 반응시켜도 좋다.
[본 발명의 세포 응집 덩어리 형성용 용기의 제 2 실시형태]
본 발명의 세포 응집 덩어리 형성용 용기의 제 2 실시형태는 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기, 실라놀기, 반금속 산화물 유래의 히드록실기 및 금속 산화물 유래의 히드록실기 중 적어도 하나가 표면 근방에 존재하는 용기에, 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖는 제 1 표면개질제와, 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기와, 아미노기, 카르복실기 및 히드록실기 중 적어도 하나를 갖는 제 2 표면개질제를 반응시킴으로써 제조되고 있다. 이 때, 제 1 표면개질제의 분자량은 315?650이다. 이것에 의해, 포스포릴콜린 유사기를 고밀도로 도입할 수 있다.
용기의 표면 근방에 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기 및/또는 실라놀기를 도입하는 방법으로서는 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기를 갖는 폴리머(이하, 가수분해성 폴리머라고 한다)와, 알콕시실란을 함유하는 도포액을 용기에 도포하는 방법을 들 수 있다.
가수분해성 폴리머와 알콕시실란을 함유하는 도포액을 용기에 도포하면 가수분해성 폴리머와 알콕시실란이 가수분해되어 실라놀기가 생성된다. 또한, 실라놀기끼리의 탈수 축합에 의해 가수분해성 폴리머가 가교되고, 실라놀기가 도입된 가교 폴리머층이 형성된다. 구체적으로는, 재료에 도포액을 도포한 후에 물, 산 또는 알칼리를 도포하거나, 가열하거나 한다. 또한 물, 산 또는 알칼리를 재료에 도포한 후에 도포액을 도포해도 좋다. 또한, 도포액에 물, 산 또는 알칼리를 혼합해도 좋다. 이 경우, 도포액 중에서 가수분해가 일어나기 때문에 도포시에 도포액을 적당하게 조제하는 것이 바람직하다. 또한, 물, 산 또는 알칼리를 사용하는 경우에는 가열해도 좋지만, 통상 실온에서 충분히 반응이 진행된다. 또한, 물, 산 또는 알칼리를 사용하지 않아도 대기 중의 수분에 의해 완만하게 반응이 진행된다.
가수분해에 사용되는 산 또는 알칼리로서는 가수분해시키는 것이 가능한 것이면 특별하게 한정되지 않고, 2종 이상 혼합해서 사용할 수 있고, 수용액으로서 사용해도 좋다.
도포액으로서는 유기용매 중에 가수분해성 폴리머와, 알콕시실란을 용해 또는 분산시킨 것을 사용할 수 있다. 유기용매로서는 특별하게 한정되지 않지만, 지방족 탄화수소, 방향족 탄화수소, 염소화 탄화수소, 에테르, 탄소수가 1?4인 1?4가의 지방족 알코올 등의 알코올, 에틸셀로솔브, 부틸셀로솔브 등의 셀로솔브, 디옥산, 아세트산 메틸, 디포름아미드 등을 들 수 있고, 2종 이상 병용해도 좋다.
도포액 중의 가수분해성 폴리머의 함유량은, 통상 0.001?20질량%이며, 0.1?5질량%가 바람직하다. 도포액 중의 가수분해성 폴리머의 함유량이 0.001질량% 미만이면 1회의 도포로 충분한 효과가 얻어지지 않는 경우가 있고, 20질량%를 초과하면 도포성이 저하될 경우가 있다.
또한, 알콕시실란에 대한 가수분해성 폴리머의 질량비는, 통상 0.01?20%이며, 0.2?5%가 바람직하다. 알콕시실란에 대한 가수분해성 폴리머의 질량비가 0.01% 미만이면 가교 폴리머층의 강도가 불충분해질 경우가 있고, 20%를 초과하면 가교 폴리머층에 도입되는 실라놀기의 양이 불충분해질 경우가 있다.
도포액을 도포하는 방법으로서는 특별하게 한정되지 않지만, 침지 도포법, 스프레이 도포법, 스핀 캐스트법 등을 들 수 있다.
용기를 구성하는 재료로서는 특별하게 한정되지 않지만, PP(폴리프로필렌), 시클로올레핀 수지, 폴리카보네이트, PET(폴리에틸렌테레프탈레이트), PEEK, 불소계 수지, 폴리스티렌, 폴리염화비닐 등의 유기재료; 금, 티타늄, 알루미늄, 철, 구리, 스테인레스, 알루미나, 산화티타늄, 산화아연 등의 무기재료 등을 들 수 있다.
가수분해성 폴리머로서는 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기를 갖는 폴리머이면 특별하게 한정되지 않지만, 일반식
Figure pct00003
(식 중, R1은 수소원자 또는 메틸기이며, R2는 탄소수가 1?6의 알킬렌기, 바람직하게는 프로필렌기이며, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 탄소수가 1?6의 알콕실기, 바람직하게는 메톡실기 또는 에톡실기이다)
으로 나타내어지는 모노머(A-1)를 중합함으로써 얻어지는 호모폴리머 또는 코폴리머[이하, 폴리머(A)라고 함]를 사용할 수 있다. 이 때, 모노머(A-1)를 2종 이상 사용해도 좋다.
또한, 폴리머(A)를 합성할 때에, 일반식
Figure pct00004
(식 중, R1은 수소원자 또는 메틸기이며, R2는 탄소수가 1?18의 직쇄상, 분기상 또는 환상의 알킬기, 바람직하게는 탄소수 1?6의 알킬기, 특히 바람직하게는 메틸기이다)
으로 나타내어지는 모노머(A-2)를 공중합해도 좋다. 이 때, 모노머(A-2)를 2종 이상 사용해도 좋다.
또한, 폴리머(A)를 합성할 때에, 일반식
Figure pct00005
[식 중, R1은 수소원자 또는 메틸기이며, R2는 탄소수가 1?6의 알킬렌기, 바람직하게는 에틸렌기, 프로필렌기 또는 2-히드록시프로필렌기이며, X는 일반식
Figure pct00006
(식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 및 R9는 각각 독립적으로 탄소수가 1?6의 직쇄 또는 분기상의 알킬기, 바람직하게는 메틸기이다)
으로 나타내어지는 관능기(X-1), 일반식
(식 중, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 탄소수가 1?6의 직쇄 또는 분기상의 알킬기, 바람직하게는 메틸기이며, R7은 탄소수가 1?6의 직쇄 또는 분기상의 알킬기, 바람직하게는 부틸기이며, x는 양의 정수이다)
으로 나타내어지는 관능기(X-2) 또는 일반식
Figure pct00008
(식 중, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 탄소수가 1?6의 직쇄 또는 분기상의 알킬기, 바람직하게는 메틸기이며, R7은 탄소수가 1?6의 알킬렌기, 바람직하게는 에틸렌기, 프로필렌기 또는 2-히드록시프로필렌기이며, R8은 수소원자또는 메틸기이며, y는 양의 정수이다)으로 나타내어지는 관능기(X-3)이다.]
으로 나타내어지는 모노머(A-3)를 공중합해도 좋다. 또한, X가 관능기(X-2) 또는 관능기(X-3)일 경우 모노머(A-3)는 분자량이 1000?100000인 것이 바람직하고, 2000?20000이 특히 바람직하다. 이 때, 모노머(A-3)를 2종 이상 사용해도 좋다.
또한, 폴리머(A)를 합성할 때에, 일반식
Figure pct00009
(식 중, R1은 수소원자 또는 메틸기이며, R2는 탄소수가 1?6의 알킬렌기, 바람직하게는 에틸렌기 또는 프로필렌기이며, Y는 일반식
Figure pct00010
[식 중, R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 탄소수가 1?6의 알킬기, 바람직하게는 메틸기이며, Z-는 할로겐화물 이온 또는 유기산 또는 무기산의 공역 이온이다)
으로 나타내어지는 관능기(Y-1) 또는 일반식
Figure pct00011
(식 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수가 1?6의 알킬기, 바람직하게는 메틸기이다)으로 나타내어지는 관능기(Y-2)이다.]
으로 나타내어지는 모노머(A-4)를 공중합해도 좋다. 이 때, 모노머(A-4)를 2종 이상 사용해도 좋다.
즉, 폴리머(A)를 합성할 때에 모노머(A-1)와 함께 모노머(A-2), 모노머(A-3) 및 모노머(A-4) 중 적어도 하나를 공중합해도 좋다.
폴리머(A)를 합성할 때에 사용되는 전체 모노머 중의 모노머(A-1)의 함유량이 40?85질량%인 것이 바람직하다. 전체 모노머 중의 모노머(A-1)의 함유량이 40질량% 미만이면 가교밀도가 저하되어서 친수화의 효과가 충분하게 지속되지 않을 경우가 있고, 85질량%를 초과하면 가교 폴리머층의 균일성이 저하될 경우가 있다.
또한, 폴리머(A)를 합성할 때에 사용되는 전체 모노머 중의 모노머(A-2)의 함유량은, 통상 1?75질량%이며, 10?60질량%가 바람직하다. 전체 모노머 중의 모노머(A-2)의 함유량이 1질량% 미만이면 가교 폴리머층의 내수성이 저하할 경우가 있고, 75질량%를 초과하면 폴리머(A)가 알코올에 난용성으로 될 경우가 있다.
또한, 폴리머(A)를 합성할 때에 사용되는 전체 모노머 중의 모노머(A-3)의 함유량은, 통상 1?70질량%이며, 5?60질량%가 바람직하다. 전체 모노머 중의 모노머(A-3)의 함유량이 1질량% 미만이면 가교 폴리머층의 내수성이 저하할 경우가 있고, 70질량%를 초과하면 폴리머(A)가 알코올에 난용성이 될 경우가 있다.
또한, 모노머(A-1), 모노머(A-2) 및 모노머(A-3)의 총 질량에 대한 모노머(A-4)의 질량의 비는, 통상 0.01?1이며, 0.05?0.5가 바람직하다. 이 비가 0.01미만이면 가교 폴리머층의 유연성이 저하할 경우가 있고, 1을 초과하면 가교 폴리머층의 내수성이 저하할 경우가 있다.
폴리머(A)의 수평균 분자량은 2000?150000인 것이 바람직하다. 폴리머(A)의 수평균 분자량이 2000 미만이면 가교 폴리머층을 형성하는 시간이 길어질 경우가 있고, 150000을 초과하면 도포액의 점도가 높아져서 도포성이나 작업성이 떨어질 경우가 있다.
또한, 폴리머(A)의 구체예 및 제조방법은 일본 특허 공개 평 11-302129호 공보 등에 개시되어 있다.
또한, 가수분해성 폴리머로서는, 일반식
Figure pct00012
(식 중, R1은 탄소수가 1?22의 알킬기 또는 페닐기, 바람직하게는 메틸기이다)
으로 나타내어지는 구성단위(B-1)를 갖는 호모폴리머 또는 코폴리머[이하, 폴리머(B)라고 함]를 사용할 수 있다. 이 때, 폴리머(B)는 구성단위(B-1)를 2종 이상 가져도 좋다.
또한, 폴리머(B)는 일반식
Figure pct00013
(식 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수가 1?22의 알킬기 또는 페닐기, 바람직하게는 메틸기이다)
으로 나타내어지는 구성단위(B-2)를 가져도 좋다. 이 때, 폴리머(B)는 구성단위(B-2)를 2종 이상 가져도 좋다.
폴리머(B)는 구성단위(B-1)의 함유량이 1?90질량%인 것이 바람직하다. 구성단위(B-1)의 함유량이 1질량% 미만이면 가교밀도가 저하해서 친수화의 효과가 충분하게 지속되지 않을 경우가 있고, 90질량%를 초과하면 가교 폴리머층의 균일성이 저하할 경우가 있다.
또한, 폴리머(B)는 구성단위(B-2)의 함유량이 10?99질량%인 것이 바람직하다. 구성단위(B-2)의 함유량이 10질량% 미만이면 가교 폴리머층의 균일성이 저하할 경우가 있고, 99질량%를 초과하면 가교밀도가 저하되어 친수화의 효과가 충분하게 지속되지 않을 경우가 있다.
폴리머(B)의 수평균 분자량은 2000?500000인 것이 바람직하다. 수평균 분자량이 2000 미만이면 가교 폴리머층을 형성하는 시간이 길어질 경우가 있고, 500000을 초과하면 도포액의 점도가 높아져서 도포성이나 작업성이 떨어질 경우가 있다.
가수분해성 폴리머로서 폴리머(A) 및 폴리머(B)를 병용해도 좋고, 가수분해성 폴리머와 비가수분해성 폴리머를 병용해도 좋다. 비가수분해성 폴리머로서는 특별하게 한정되지 않지만, 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기를 갖지 않는 폴리머(A), 폴리머(B) 등을 들 수 있다.
용기의 표면 근방에 실라놀기를 도입하는 방법으로서는 특별하게 한정되지 않지만, 실리콘 수지를 포함하는 도포액을 용기에 도포함으로써 실라놀기를 갖는 실리콘 수지를 포함하는 막을 형성하는 방법 등을 들 수 있다.
실라놀기를 갖는 실리콘 수지를 포함하는 막은 물의 접촉각이 3?8°인 것이 바람직하다. 물의 접촉각이 3°미만인 막을 형성하는 것은 곤란하고, 물의 접촉각이 8°를 초과하는 막을 형성하면 포스포릴콜린 유사기를 고밀도로 도입할 수 없게 될 경우가 있다.
도포액에 포함되는 실리콘 수지로서는 특별하게 한정되지 않지만, 일반식
(R 1 O) n Si(R 2 ) 4-n
(식 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수가 1?8의 알킬기이며, n은 1?4의 정수이며, n이 1 또는 2일 경우 복수의 R2는 동일하여도 달라도 좋고, n이 2 또는 3일 경우 복수의 R1은 동일하여도 달라도 좋다)
으로 나타내어지는 알콕시실란을 가수분해한 후 축합함으로써 얻어지는 수지를 들 수 있고, 2종 이상 병용해도 좋다. 이 때, 물의 접촉각이 3?8°인 막에 포함되는 실라놀기를 갖는 실리콘 수지는 도포액에 포함되는 실리콘 수지와 동일하여도 좋고, 달라도 좋다.
도포액에 포함되는 유기용매로서는 특별하게 한정되지 않지만, 지방족 탄화수소, 방향족 탄화수소, 염소화 탄화수소, 에테르, 탄소수가 1?4인 1?4가의 지방족 알코올 등의 알코올, 에틸셀로솔브, 부틸셀로솔브 등의 셀로솔브, 디옥산, 아세트산 메틸, 디포름아미드 등을 들 수 있고, 2종 이상 병용해도 좋다.
도포액 중의 실리콘 수지의 함유량은, 통상 0.001?1질량%이며, 0.1?1질량%가 바람직하다. 도포액 중의 실리콘 수지의 함유량이 0.001질량% 미만이면 균일한 막이 형성되지 않을 경우가 있고, 20질량%를 초과하면 도포성이 저하할 경우가 있다.
도포액을 도포하는 방법으로서는 특별하게 한정되지 않지만, 침지 도포법, 스프레이 도포법, 스핀 캐스트법 등을 들 수 있다.
용기를 구성하는 재료로서는 특별하게 한정되지 않지만, 폴리카보네이트, PET(폴리에틸렌테레프탈레이트), 폴리스티렌, 아크릴 수지 등의 유기재료; 금, 티타늄, 알루미늄, 철, 구리, 스테인레스, 알루미나, 산화티타늄, 산화아연 등의 무기재료 등을 들 수 있다.
또한, 실라놀기가 표면 근방에 존재하는 용기로서 유리제의 용기를 사용해도 좋다.
금속 산화물 유래의 히드록실기가 표면 근방에 존재하는 용기를 구성하는 금속 산화물로서는 특별하게 한정되지 않지만, 산화티타늄, 산화아연, 산화철, 산화크롬, 산화알루미늄 등을 들 수 있다.
반금속 산화물 유래의 히드록실기가 표면 근방에 존재하는 용기를 구성하는 금속 산화물로서는 특별하게 한정되지 않지만, 산화게르마늄, 산화비소, 산화붕소 등을 들 수 있다.
가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기, 실라놀기, 반금속 산화물 유래의 히드록실기 및 금속 산화물 유래의 히드록실기 중 적어도 하나에 대하여 반응성을 갖는 관능기로서는 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기를 들 수 있다.
또한 제 1 표면개질제는 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기가 스페이서를 통해서 포스포릴콜린 유사기에 결합되어 있는 것이 바람직하다. 스페이서로서는 특별하게 한정되지 않지만, 메틸렌기, 옥시에틸렌기, 아미노기를 1개 이상 갖는 알킬렌기 등을 들 수 있다.
가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기로서는 히드로실릴기, 알콕시실릴기, 할로실릴기, 이실옥시실릴기, 아미노실릴기 등을 들 수 있지만, 안정성, 반응성 등의 점으로부터 탄소수가 1?6인 알콕시실릴기 또는 히드로실릴기가 바람직하다.
제 1 표면개질제로서는 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기 및 포스포릴콜린 유사기를 갖고 있으면 특별하게 한정되지 않지만, 일본 특허 공개 2006-11380호 공보에 개시되어 있는 화합물을 들 수 있다.
제 2 표면개질제로서는 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기와, 아미노기, 가수분해에 의해 카르복실기를 생성하는 것이 가능한 관능기 및 가수분해에 의해 히드록실기를 생성하는 것이 가능한 관능기 중 적어도 하나를 갖고 있으면 특별하게 한정되지 않지만, 3-아미노프로필트리메톡시실란, p-아미노페닐트리메톡시실란 등의 아미노기를 갖는 화합물; 3-(트리에톡시실릴)프로필숙신산 무수물 등의 가수분해에 의해 카르복실기를 생성하는 것이 가능한 관능기를 갖는 화합물; 3-글리시독시프로필트리메톡시실란, 3-글리시독시프로필메틸디에톡시실란 등의 가수분해에 의해 히드록실기를 생성하는 것이 가능한 관능기를 갖는 화합물 등을 들 수 있고, 2종 이상 병용해도 좋다.
제 2 표면개질제가 가수분해에 의해 카르복실기 및/또는 히드록실기를 생성하는 것이 가능한 관능기를 갖는 경우에는 가수분해에 의해 카르복실기 및/또는 히드록실기를 생성하는 것이 가능한 관능기를 용기의 표면 근방에 도입한 후 가수분해하면 좋다.
또한, 제 2 표면개질제가 갖는 아미노기는 보호기에 의해 보호되어 있어도 좋다. 또한, 제 2 표면개질제는 가수분해에 의해 카르복실기 또는 히드록실기를 생성하는 것이 가능한 관능기 대신에 가수분해 이외의 반응에 의해 탈보호하는 것이 가능한 보호기에 의해 보호되어 있는 카르복실기 또는 히드록실기를 갖고 있어도 좋다.
제 2 표면개질제가 보호기에 의해 보호되어 있는 아미노기, 카르복실기 및 히드록실기 중 적어도 하나를 갖는 경우에는 보호기에 의해 보호되어 있는 아미노기, 카르복실기 및 히드록실기 중 적어도 하나를 용기의 표면 근방에 도입한 후 탈보호하면 좋다.
이어서, 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기, 실라놀기, 반금속 산화물 유래의 히드록실기 및 금속 산화물 유래의 히드록실기 중 적어도 하나가 표면 근방에 존재하는 용기에, 포스포릴콜린 유사기와, 아미노기, 가수분해에 의해 카르복실기를 생성하는 것이 가능한 관능기 및 가수분해에 의해 히드록실기를 생성하는 것이 가능한 관능기 중 적어도 하나를 도입하는 방법에 대하여 설명한다.
우선, 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기, 실라놀기, 반금속 산화물 유래의 히드록실기 및 금속 산화물 유래의 히드록실기가 표면 근방에 존재하는 용기에, 제 1 표면개질제 및 제 2 표면개질제를 포함하는 도포액을 도포한다. 이 때, 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기가 가수분해되어 실라놀기가 생성된다. 또한, 표면개질제 유래의 실라놀기와, 용기 유래의 실라놀기, 반금속 산화물 유래의 히드록실기 및 금속 산화물 유래의 히드록실기 중 적어도 하나의 탈수 축합에 의해 용기의 표면이 개질된다. 구체적으로는, 용기에 도포액을 도포한 후에 물, 산 또는 알칼리를 도포하거나, 가열하거나 한다. 또한, 물, 산 또는 알칼리를 용기에 도포한 후에 도포액을 도포해도 좋다. 또한, 도포액에 물, 산 또는 알칼리를 혼합해도 좋다. 이 경우, 도포액 중에서 가수분해가 일어나기 때문에 도포시에 도포액을 적당하게 조제하는 것이 바람직하다. 또한, 물, 산 또는 알칼리를 사용하는 경우에는 가열해도 좋지만, 통상 실온에서 충분히 반응이 진행된다. 또한, 물, 산 또는 알칼리를 사용하지 않아도 대기 중의 수분에 의해 완만하게 반응이 진행된다.
산 또는 알칼리로서는 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기를 가수분해시키는 것이 가능하면 특별하게 한정되지 않고, 2종 이상 병용해도 좋다. 또한, 가수분해에 사용되는 산 또는 알칼리는 수용액으로서 사용해도 좋다.
도포액으로서는 유기용매 중에 제 1 표면개질제 및 제 2 표면처리제를 용해 또는 분산시킨 것을 사용할 수 있다. 유기용매로서는 지방족 탄화수소, 방향족 탄화수소, 염소화 탄화수소, 에테르, 탄소수가 1?4인 1?4가의 지방족 알코올 등의 알코올, 에틸셀로솔브, 부틸셀로솔브 등의 셀로솔브, 디옥산, 아세트산 메틸, 디포름아미드 등을 들 수 있다.
도포액 중의 제 1 표면개질제의 함유량은, 통상 0.1?30질량%이며, 1?10질량%가 바람직하다. 도포액 중의 제 1 표면개질제의 함유량이 0.1질량% 미만이면 1회의 도포로 제 1 표면개질제를 충분하게 도포할 수 없는 경우가 있고, 30질량%를 초과하면 도포성이 저하할 경우가 있다.
제 2 표면처리제가 아미노기를 가질 경우 도포액 중의 제 2 표면처리제의 아미노기에 대한 제 1 표면개질제의 포스포릴콜린 유사기의 당량비는, 통상 3/7?19이다.
도포액을 도포하는 방법으로서는 특별하게 한정되지 않지만, 침지 도포법, 스프레이 도포법, 스핀 캐스트법 등을 들 수 있다.
또한, 제 1 표면처리제를 포함하는 도포액 및 제 2 표면처리제를 포함하는 도포액을 각각 용기에 도포해도 좋다.
또한, 용기의 표면 근방에 미반응의 실라놀기, 반금속 산화물 유래의 히드록실기 및 금속 산화물 유래의 히드록실기 중 적어도 하나가 잔류하도록 표면개질제 유래의 실라놀기와, 용기 유래의 실라놀기, 반금속 산화물 유래의 히드록실기 및 금속 산화물 유래의 히드록실기 중 적어도 하나를 반응시켜도 좋다.
[본 발명의 세포 응집 덩어리 형성용 용기의 제 3 실시형태]
본 발명의 세포 응집 덩어리 형성용 용기의 제 3 실시형태는 포스포릴콜린 유사기와, 아미노기, 카르복실기 및 히드록실기 중 적어도 하나를 갖는 수지를 포함하는 층이 표면에 형성되어 있다.
포스포릴콜린 유사기와, 아미노기, 카르복실기 및 히드록실기 중 적어도 하나를 갖는 수지로서는 특별하게 한정되지 않지만, 포스포릴콜린 유사기를 갖는 모노머와, 아미노기를 갖는 모노머, 카르복실기를 갖는 모노머 및 히드록실기를 갖는 모노머 중 적어도 하나를 공중합함으로써 얻어지는 수지를 들 수 있다(예를 들면, 일본 특허 공개 평7-184990호 공보 참조).
용기를 구성하는 재료로서는 특별하게 한정되지 않지만, 시클로올레핀 수지, 폴리카보네이트, PET(폴리에틸렌테레프탈레이트), 폴리스티렌, 아크릴 수지 등의 유기재료; 금, 티타늄, 알루미늄, 철, 구리, 스테인레스, 알루미나, 산화티타늄, 산화아연 등의 무기재료 등을 들 수 있다.
또한, 유기재료로 구성되는 용기를 사용할 경우 용기에 대한 접착성을 고려하면 포스포릴콜린 유사기를 갖는 모노머와, 아미노기, 카르복실기 및 히드록실기 중 적어도 하나를 갖는 모노머와, 소수성기를 갖는 모노머를 공중합함으로써 얻어지는 수지를 사용하는 것이 바람직하다.
소수성기를 갖는 모노머로서는 특별하게 한정되지 않지만, 메타크릴산 부틸 등을 들 수 있다.
용기의 표면 근방에 포스포릴콜린 유사기와, 아미노기, 카르복실기 및 히드록실기 중 적어도 하나를 갖는 수지를 포함하는 층을 형성하는 방법으로서는, 포스포릴콜린 유사기와, 아미노기, 카르복실기 및 히드록실기 중 적어도 하나를 갖는 수지를 포함하는 도포액을 용기에 도포하는 방법을 들 수 있다.
도포액으로서는 유기용매 중에 수지를 용해 또는 분산시킨 것을 사용할 수 있다. 유기용매로서는 지방족 탄화수소, 방향족 탄화수소, 염소화 탄화수소, 에테르, 탄소수가 1?4인 1?4가의 지방족 알코올 등의 알코올, 에틸셀로솔브, 부틸셀로솔브 등의 셀로솔브, 디옥산, 아세트산 메틸, 디포름아미드 등을 들 수 있다.
도포액 중의 수지의 함유량은, 통상 0.1?30질량%이며, 1?10질량%가 바람직하다. 도포액 중의 수지의 함유량이 0.1질량% 미만이면 1회의 도포로 수지를 충분하게 도포할 수 없는 경우가 있고, 30질량%를 초과하면 도포성이 저하할 경우가 있다.
도포액을 도포하는 방법으로서는 특별하게 한정되지 않지만, 침지 도포법, 스프레이 도포법, 스핀 캐스트법 등을 들 수 있다.
본 발명의 세포 응집 덩어리의 형성방법은 본 발명의 세포 응집 덩어리 형성용 용기를 이용하여 체세포를 배양해서 세포 응집 덩어리를 형성한다. 이것에 의해, 접착성 세포의 세포 응집 덩어리를 형성할 수 있다. 본원 명세서 및 특허청구범위에 있어서 체세포는 다능성 줄기세포를 포함한다.
또한, 본 발명의 세포 응집 덩어리의 형성방법을 이용하여 부유배양에 의해 세포 응집 덩어리를 형성하는 것이 가능한 비접착성 세포를 부유배양하면 세포 응집 덩어리를 형성할 수 있다.
본 발명의 세포 응집 덩어리의 형성방법에 적용하는 것이 가능한 체세포로서는 특별하게 한정되지 않지만, 간엽계 줄기세포, 간세포, 간 줄기세포, 심근세포, 암세포, 암 줄기세포, 섬유아세포, 신경세포, 혈관내피전구세포 등의 접착성 세포; 신경계 줄기세포, 조혈 줄기세포, 림프종 세포 등의 비접착성 세포를 들 수 있다.
본 발명의 세포 응집 덩어리의 형성방법에 인간, 래트, 마우스, 영장류 등의 포유류에 유래하는 체세포를 적용하면, 후술하는 물질의 스크리닝 방법 및 세포의 기능 탐색 방법에 유용하다.
본 발명에 있어서 체세포를 배양하는 방법으로서는 특별하게 한정되지 않고, 체세포에 따라서 공지의 조건을 적용할 수 있지만, 10질량%의 소태아혈청(FBS), 1mM의 글루타민, 적당량의 항생물질을 포함하는 둘베코 개변 배지(DMEM)를 이용하여 5체적%의 이산화탄소를 포함하는 분위기 하, 37℃에서 체세포를 배양하는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명의 물질의 스크리닝 방법은 본 발명의 세포 응집 덩어리의 형성방법에 의해 형성되어 있는 세포 응집 덩어리를 이용하여 물질을 스크리닝한다. 이 때, 본 발명의 물질의 스크리닝 방법은 간세포나 심근세포를 이용하여 물질의 독성을 평가하는 방법, 암세포를 이용하여 약제의 효과를 시험하는 방법 등의 공지의 물질의 스크리닝 방법에 적용할 수 있다. 물질의 독성을 평가하는 방법으로서는 MTT 분석, 알라마 블루(alamar blue) 분석 등의 세포증식을 기준으로 하는 방법을 들 수 있다. 또한, RT-PCR, ELISA 등의 방법에 의해 염증성 사이토카인의 생산 방출, 암화에 관련되는 인자인 SDF-1, LIF, EGFR 등의 양을 정량할 수도 있다.
또한, 본 발명의 물질의 스크리닝 방법은 개체마다의 체세포의 세포 응집 덩어리를 이용하여 물질을 스크리닝함으로써 테일러메이드 의료에 응용할 수 있다.
본 발명의 세포의 기능 탐색 방법은 본 발명의 세포 응집 덩어리의 형성방법에 의해 형성되어 있는 세포 응집 덩어리를 이용하여 세포의 기능을 탐색한다. 이 때, 본 발명의 세포의 기능 탐색 방법은 체세포의 생화학적 기능을 해명하는 방법, 바이오마커를 탐색하는 방법 등의 공지의 세포의 기능 탐색 방법에 적용할 수 있다.
실시예
[실시예 1]
프라이마리아 접시(Primaria dish)(니혼 벡톤 디킨슨사 제품)에 N-히드록시숙신이미드 1g, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 1g의 1질량% 수용액을 투입한 후, 화학식
Figure pct00014
으로 나타내어지는 화합물 1g을 물 100ml에 용해시킨 용액을 첨가하고, 에스테르화했다. 이어서, 프라이마리아 접시로부터 액을 인출하고, 실온에서 5시간 건조시킨 후 수세하고, 건조시켜 세포 응집 덩어리 형성용 용기를 얻었다. 또한, 프라이마리아 접시는 산소와 암모니아를 포함하는 분위기 하에서 플라즈마 처리되어 있는 폴리스티렌제의 접시이다.
세포 응집 덩어리 형성용 용기에 MensenPRO RS 배지(Invitrogen사 제품) 10ml 및 간엽계 줄기세포로서의 인간 지방 유래 줄기세포(Invitrogen사 제품) 1×106개/용기를 첨가하고, 인간 지방 유래 줄기세포를 배양한 결과, 세포가 증식하여 세포 응집 덩어리를 형성했다(도 2a 및 도 2b 참조).
[비교예 1]
표면처리되어 있지 않은 폴리스티렌제의 페트리 접시(Petri dish)(니혼 벡톤 디킨슨사 제품)에 MensenPRO RS 배지(Invitrogen사 제품) 10ml 및 인간 지방 유래 줄기세포(Invitrogen사 제품) 1×106개/접시를 첨가하고, 인간 지방 유래 줄기세포를 배양한 결과, 세포가 단층의 상태에서 확산?증식하여 세포 응집 덩어리를 형성하지 않았다(도 3 참조).
[알칼리포스파타아제 활성]
실시예 1의 세포 응집 덩어리 및 비교예 1의 배양세포에 4질량% 파라포름알데히드?인산 완충액을 첨가해서 5분간 처리한 후, TBS 완충액 및 TBST 완충액을 이용하여 세정했다. 이어서, BM 퍼플 AP 기질(Roche사 제품)을 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후 TBST 완충액을 이용하여 세정했다. 평가 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타낸다. 도 4a 및 도 4b로부터 실시예 1의 세포 응집 덩어리는 알칼리포스파타아제 활성이 양성이지만, 비교예 1의 배양세포는 알칼리포스파타아제 활성이 음성인 것을 알 수 있다.
[면역 이중염색]
실시예 1의 세포 응집 덩어리 및 비교예 1의 배양세포에 4질량% 파라포름알데히드?인산 완충액을 첨가해서 5분간 처리한 후, TBS 완충액 및 TBST 완충액을 이용하여 세정했다. 이어서, 제1의 1차 항체를 카탈로그에 기재되어 있는 방법으로 희석하고, 세포에 반응시킨 후 제1의 Alexa Fluor 표식 2차 항체(Invitrogen사 제품)를 세포에 반응시키고, TBST 완충액을 이용하여 세정했다. 또한, 제2의 1차 항체를 카탈로그에 기재되어 있는 방법으로 희석하고, 세포에 반응시킨 후 제2의 Alexa Fluor 표식 2차 항체(Invitrogen사 제품)를 세포에 반응시키고, TBST 완충액을 이용하여 세정했다. 평가 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00015
또한, Nestin(Abcam사 제품), CD271(Abcam사 제품) 및 CD133(Abcam사 제품)은 각각 신경 유래 줄기세포 마커, 지방 유래 줄기세포 마커 및 줄기세포 마커이며, PDGFRa(R&D사 제품) 및 PDGFRb(R&D사 제품)는 간엽계 줄기세포 마커이다. 또한, 실시예 1의 세포 응집 덩어리의 평가 결과를 도 5?도 8에 나타낸다. 표 1로부터 실시예 1의 세포 응집 덩어리는 Nestin이 양성이기 때문에 지방 유래 줄기세포가 in vitro에서 신경 유래 줄기세포의 성질을 획득할 수 있는 것을 알 수 있다.
[실시예 2]
3-아미노프로필트리메톡시실란의 0.15mol/L 메탄올 용액 0.5mL, 화학식
Figure pct00016
으로 나타내어지는 화합물(A)의 0.15mol/L 메탄올 용액 9.5mL 및 메탄올 10mL로 이루어지는 도포액을 얻었다.
얻어진 도포액을 글라스보텀 접시(glass bottom dish)(마쯔나미 쇼시 고교사 제품)에 도포하여 실온에서 건조시켰다. 이어서, 가열 건조하고, 실온에서 건조시킨 후 수세하고, 건조시켜서 세포 응집 덩어리 형성용 용기를 얻었다.
세포 응집 덩어리 형성용 용기에 MensenPRO RS 배지(Invitrogen사 제품) 2.5ml 및 인간 지방 유래 줄기세포(Invitrogen사 제품) 1×105개/용기를 첨가하고, 인간 지방 유래 줄기세포를 배양한 결과, 세포가 증식하여 세포 응집 덩어리를 형성했다(도 9 참조).
[실시예 3]
3-아미노프로필트리메톡시실란의 0.15mol/L 메탄올 용액 7mL, 화합물(A)의 0.15mol/L 메탄올 용액 3mL 및 메탄올 10mL로 이루어지는 도포액을 얻었다.
얻어진 도포액을 글라스보텀 접시(마쯔나미 쇼시 고교사 제품)에 도포하여 실온에서 건조시켰다. 이어서, 가열 건조하고, 실온에서 건조시킨 후 수세하고, 건조시켜서 세포 응집 덩어리 형성용 용기를 얻었다.
세포 응집 덩어리 형성용 용기에 MensenPRO RS 배지(Invitrogen사 제품) 2.5ml 및 인간 지방 유래 줄기세포(Invitrogen사 제품) 1×105개/용기를 첨가하고, 인간 지방 유래 줄기세포를 배양한 결과, 세포가 증식하여 세포 응집 덩어리를 형성했다(도 10 참조).
[비교예 2]
표면처리되어 있지 않은 글라스보텀 접시(마쯔나미 쇼시 고교사 제품)에 MensenPRO RS 배지(Invitrogen사 제품) 2.5ml 및 인간 지방 유래 줄기세포(Invitrogen사 제품) 1×105개/접시를 첨가하고, 인간 지방 유래 줄기세포를 배양한 결과, 세포가 단층의 상태에서 확산?증식하여 세포 응집 덩어리를 형성하지 않았다(도 11 참조).
[면역염색]
실시예 2의 세포 응집 덩어리의 배양세포에 4질량% 파라포름알데히드?인산 완충액을 첨가해서 5분간 처리한 후, 0.2질량% Triton X-100(로슈 다이아구노스틱스사 제품)/TBS 완충액 및 0.2질량% Tween20(토쿄 카세이 고교사 제품)/TBS 완충액을 이용하여 세정했다. 이어서, Protein Block(DAKO사 제품)으로 비특이 반응을 블록킹했다. 또한, 200배로 희석한 1차 항체의 항CD271 래빗 폴리크로날 항체(abcam사 제품) 및 CD90 마우스 모노클로날 항체(abcam사 제품)를 세포에 하룻밤 반응시킨 후, 0.2질량% Tween20(토쿄 카세이 고교사 제품)/TBS 완충액을 이용하여 세정했다. 이어서, 250배로 희석한 각각 녹색 및 적색으로 발색하는 형광 2차 항체의 Alexa488 항래빗 항체(Invitrogen사 제품) 및 Alexa594 항마우스 항체(Invitrogen사 제품)를 세포에 2시간 반응시킨 후, 0.2질량% Tween20(토쿄 카세이 고교사 제품)/TBS 완충액을 이용하여 세정했다. 또한, 청색으로 발색하는 Vectorshield-DAPI(Vector사 제품)로 핵을 염색한 후, 공초점 레이저 현미경 LSM 5 PASCAL(Carl Zeiss사 제품)을 이용하여 관찰했다. 그 결과, 실시예 2의 세포 응집 덩어리가 녹색으로 발색하고 있던 것으로부터 CD271이 양성인 것을 알 수 있었다(도 12 참조).
또한, 실시예 3의 세포 응집 덩어리도 실시예 2의 세포 응집 덩어리와 마찬가지로 녹색으로 발색하고, CD271이 양성이었다.
본 국제 출원은 2009년 6월 15일에 출원된 일본국 특허 출원 2009-142254에 의거하는 우선권을 주장하는 것이며, 일본국 특허 출원 2009-142254의 전체 내용을 본 국제 출원에 원용한다.
C : 접착성 세포
D : 세포 응집 덩어리 형성용 용기

Claims (11)

  1. 일반식
    Figure pct00017

    (식 중, R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 탄소수가 1 이상 6 이하의 알킬기이며, m은 2 이상 6 이하의 정수이다)
    으로 나타내어지는 기와, 아미노기, 카르복실기 및 히드록실기 중 적어도 하나가 표면 근방에 존재하는 것을 특징으로 하는 세포 응집 덩어리 형성용 용기.
  2. 제 1 항에 있어서,
    카르복실기, 아미노기 및 히드록실기가 표면 근방에 존재하는 용기에, 카르복실기, 아미노기 또는 히드록실기에 대하여 반응성을 갖는 관능기 및 상기 일반식으로 나타내어지는 기를 갖고 분자량이 225 이상 650 이하인 화합물을 반응시킴으로써 제조되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 응집 덩어리 형성용 용기.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 카르복실기, 아미노기 및 히드록실기가 표면 근방에 존재하는 용기는 산소, 오존 및 수증기 중 적어도 하나와, 암모니아 및/또는 질소를 포함하는 분위기 하에서 플라즈마 처리되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 응집 덩어리 형성용 용기.
  4. 제 1 항에 있어서,
    가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기, 실라놀기, 반금속 산화물 유래의 히드록실기 및 금속 산화물 유래의 히드록실기 중 적어도 하나가 표면 근방에 존재하는 용기에, 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기 및 상기 일반식으로 나타내어지는 기를 갖고 분자량이 315 이상 650 이하인 제 1 화합물과, 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 것이 가능한 관능기와, 아미노기, 가수분해에 의해 카르복실기를 생성하는 것이 가능한 관능기 및 가수분해에 의해 히드록실기를 생성하는 것이 가능한 관능기 중 적어도 하나를 갖는 제 2 화합물을 반응시킴으로써 제조되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 응집 덩어리 형성용 용기.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 일반식으로 나타내어지는 기와, 아미노기, 카르복실기 및 히드록실기 중 적어도 하나를 갖는 수지를 포함하는 층이 표면에 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 응집 덩어리 형성용 용기.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 응집 덩어리 형성용 용기를 이용하여 체세포를 배양해서 세포 응집 덩어리를 형성하는 것을 특징으로 하는 세포 응집 덩어리의 형성방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 체세포는 접착성 세포인 것을 특징으로 하는 세포 응집 덩어리의 형성방법.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 응집 덩어리 형성용 용기를 이용하여 체세포를 배양해서 세포 응집 덩어리를 형성하는 공정과,
    그 세포 응집 덩어리를 이용하여 물질을 스크리닝하는 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 물질의 스크리닝 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 체세포는 접착성 세포인 것을 특징으로 하는 물질의 스크리닝 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 응집 덩어리 형성용 용기를 이용하여 체세포를 배양해서 세포 응집 덩어리를 형성하는 공정과,
    그 세포 응집 덩어리를 이용하여 세포의 기능을 탐색하는 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 세포의 기능 탐색 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 체세포는 접착성 세포인 것을 특징으로 하는 세포의 기능 탐색 방법.
KR1020117029714A 2009-06-15 2010-06-15 세포 응집 덩어리 형성용 용기, 세포 응집 덩어리의 형성방법, 물질의 스크리닝 방법, 및 세포의 기능 탐색 방법 KR101307305B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2009-142254 2009-06-15
JP2009142254 2009-06-15
PCT/JP2010/060142 WO2010147122A1 (ja) 2009-06-15 2010-06-15 細胞凝集塊形成用容器及び細胞凝集塊の形成方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120023084A true KR20120023084A (ko) 2012-03-12
KR101307305B1 KR101307305B1 (ko) 2013-09-11

Family

ID=43356439

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117029714A KR101307305B1 (ko) 2009-06-15 2010-06-15 세포 응집 덩어리 형성용 용기, 세포 응집 덩어리의 형성방법, 물질의 스크리닝 방법, 및 세포의 기능 탐색 방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9347031B2 (ko)
EP (1) EP2444477A4 (ko)
JP (1) JP4719824B2 (ko)
KR (1) KR101307305B1 (ko)
CN (1) CN102459559A (ko)
RU (1) RU2012101112A (ko)
WO (1) WO2010147122A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102459559A (zh) * 2009-06-15 2012-05-16 株式会社资生堂 细胞凝集块形成用容器及细胞凝集块的形成方法
JP5095855B2 (ja) * 2010-12-13 2012-12-12 株式会社 資生堂 細胞凝集塊の形成方法
JP2013135640A (ja) * 2011-12-28 2013-07-11 Shiseido Co Ltd 神経幹細胞から神経細胞及び／又はグリア細胞を形成する培養方法
CN112552769B (zh) * 2013-06-07 2021-12-17 日产化学工业株式会社 具有抑制生物物质附着的能力的离子络合材料及其制造方法
JP6183070B2 (ja) * 2013-08-30 2017-08-23 日油株式会社 細胞凝集塊の製造方法、及び薬剤のスクリーニング方法

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61268763A (ja) 1984-11-26 1986-11-28 Shiseido Co Ltd 処理粉体の製造方法
JPS63113082A (ja) 1985-07-29 1988-05-18 Shiseido Co Ltd 改質粉体
JP2703904B2 (ja) 1987-08-26 1998-01-26 日本電気株式会社 半導体集積回路測定用探針基板
JPS6454381A (en) 1987-08-26 1989-03-01 Fujikura Ltd Optical fiber magnetic field sensor
JPH06105286B2 (ja) 1987-08-26 1994-12-21 富士通株式会社 自動試験機能を有する電子回路パッケ−ジ
JPH0646831A (ja) 1992-07-30 1994-02-22 Sumitomo Bakelite Co Ltd 細胞培養基材及びその製造方法
JPH06153905A (ja) * 1992-11-24 1994-06-03 Sanyo Chem Ind Ltd 細胞培養基材および細胞培養方法
JPH07184990A (ja) 1993-12-28 1995-07-25 Kuraray Co Ltd 医療用高分子材料および医療材料
JP3670841B2 (ja) 1997-05-30 2005-07-13 株式会社資生堂 毛髪処理用組成物及び毛髪処理方法
JP2004290111A (ja) * 2003-03-27 2004-10-21 Sumitomo Bakelite Co Ltd 細胞培養容器及びその製造方法
US20050019801A1 (en) * 2003-06-04 2005-01-27 Curis, Inc. Stem cell-based methods for identifying and characterizing agents
JP4774989B2 (ja) 2003-06-25 2011-09-21 日油株式会社 胚様体形成用容器及び胚様体の形成方法
JP4086305B2 (ja) * 2003-12-02 2008-05-14 株式会社資生堂 ホスホリルコリン基含有化合物及び該化合物からなる表面改質剤
JP4591926B2 (ja) * 2004-05-21 2010-12-01 株式会社資生堂 素材の表面改質方法
JP3809177B2 (ja) 2004-05-24 2006-08-16 株式会社資生堂 アフィニティー粒子及びアフィニティー分離方法
JP3715308B1 (ja) 2004-05-24 2005-11-09 株式会社資生堂 眼用レンズ材料及びその製造方法
JP3715310B1 (ja) 2004-05-24 2005-11-09 株式会社資生堂 蛋白質吸着防止眼用レンズ材料及びその製造方法
JP3715309B1 (ja) 2004-05-24 2005-11-09 株式会社資生堂 眼用レンズ材料及びその製造方法
JP3922648B2 (ja) 2004-05-24 2007-05-30 株式会社資生堂 アフィニティー粒子及びアフィニティー分離方法
JP4967238B2 (ja) * 2005-01-31 2012-07-04 住友ベークライト株式会社 細胞培養容器の製造方法および細胞培養容器
JP4887222B2 (ja) 2006-06-16 2012-02-29 ニプロ株式会社 細胞培養容器、その製造方法、及び細胞培養方法
JP2008061609A (ja) * 2006-09-08 2008-03-21 Sumitomo Bakelite Co Ltd 細胞培養容器の製造方法および細胞培養容器。
JP4191225B2 (ja) 2007-01-18 2008-12-03 株式会社資生堂 表面改質方法及び表面改質材料
JP2008220205A (ja) 2007-03-09 2008-09-25 Sumitomo Bakelite Co Ltd 神経幹細胞凝集塊形成用容器、その製造方法、及び神経幹細胞凝集塊の作成方法。
JP2009050194A (ja) * 2007-08-27 2009-03-12 Sumitomo Bakelite Co Ltd 細胞凝集塊形成培養用容器
JP2009142254A (ja) 2007-12-11 2009-07-02 Yamaguchi Prefecture 防鳥網の支持装置及びその方法
KR101539804B1 (ko) 2008-03-31 2015-07-27 가부시키가이샤 시세이도 폴리실록산, 아크릴계 화합물 및 비닐계 화합물
WO2010101126A1 (ja) * 2009-03-02 2010-09-10 株式会社資生堂 表面改質基板並びにバイオチップ及びその製造方法
CN102459559A (zh) * 2009-06-15 2012-05-16 株式会社资生堂 细胞凝集块形成用容器及细胞凝集块的形成方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2444477A4 (en) 2013-01-09
CN102459559A (zh) 2012-05-16
US20120156696A1 (en) 2012-06-21
JP4719824B2 (ja) 2011-07-06
JPWO2010147122A1 (ja) 2012-12-06
RU2012101112A (ru) 2013-07-27
WO2010147122A1 (ja) 2010-12-23
KR101307305B1 (ko) 2013-09-11
EP2444477A1 (en) 2012-04-25
US9347031B2 (en) 2016-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101307305B1 (ko) 세포 응집 덩어리 형성용 용기, 세포 응집 덩어리의 형성방법, 물질의 스크리닝 방법, 및 세포의 기능 탐색 방법
KR101969115B1 (ko) 표면 상호작용을 통한 3차원 세포 스페로이드 제작을 위한 배양용기 및 그 용도
Zhang et al. High-throughput superhydrophobic microwell arrays for investigating multifactorial stem cell niches
KR101355899B1 (ko) 세포 응집덩어리의 형성방법
JP2012527896A (ja) 細胞を付着させ、培養し、検査するための基体
Zuchowska et al. Adhesion of MRC‐5 and A549 cells on poly (dimethylsiloxane) surface modified by proteins
Leivo et al. A durable and biocompatible ascorbic acid-based covalent coating method of polydimethylsiloxane for dynamic cell culture
WO2020230885A1 (ja) 細胞培養用足場材料及び細胞培養用容器
Molyneaux et al. Physically‐cross‐linked poly (vinyl alcohol) cell culture plate coatings facilitate preservation of cell–cell interactions, spheroid formation, and stemness
Singh et al. Three‐dimensional cryogel matrix for spheroid formation and anti‐cancer drug screening
Xia et al. Cell attachment/detachment behavior on poly (N-isopropylacrylamide)-based microgel films: the effect of microgel structure and swelling ratio
US11447733B2 (en) Transparent disc-shaped microparticles coated with polydopamine
Darge et al. Preparation of thermosensitive PNIPAm‐based copolymer coated cytodex 3 microcarriers for efficient nonenzymatic cell harvesting during 3D culturing
Cooperstein et al. Synthesis and optimization of fluorescent poly (N-isopropyl acrylamide)-coated surfaces by atom transfer radical polymerization for cell culture and detachment
Lee et al. Promoting the selection and maintenance of fetal liver stem/progenitor cell colonies by layer-by-layer polypeptide tethered supported lipid bilayer
Pulugu et al. Polystyrene-Based Slippery Surfaces Enable the Generation and Easy Retrieval of Tumor Spheroids
Dehili et al. Comparison of primary rat hepatocyte attachment to collagen and plasma‐polymerised allylamine on glass
JP7250248B2 (ja) ブロック共重合体、それを含む表面処理剤及び膜、並びに、それを用いた細胞培養用器材及び細胞培養方法
CA2537997A1 (en) Methods of surface modification to enhance cell adhesion
KR20220139402A (ko) 세포 배양 기판, 이의 제조방법 및 용도
Liu et al. Robust and flexible fabrication of chemical micropatterns for tumor spheroid preparation
Kim et al. Behavior of CHO cells on phosphated cellulose membranes
Cao et al. The effect of curvature on chondrocytes migration and bone mesenchymal stem cells differentiation
Schulte et al. On‐Demand Cell Sheet Release with Low Density Peptide‐Functionalized Non‐LCST Polymer Brushes
JP2013135640A (ja) 神経幹細胞から神経細胞及び／又はグリア細胞を形成する培養方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160805

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170803

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180807

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190820

Year of fee payment: 7