TWI534263B - The method of forming a collection of cells - Google Patents

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TWI534263B TW100145664A TW100145664A TWI534263B TW I534263 B TWI534263 B TW I534263B TW 100145664 A TW100145664 A TW 100145664A TW 100145664 A TW100145664 A TW 100145664A TW I534263 B TWI534263 B TW I534263B
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Description

細胞集合塊之形成方法
本發明係關於一種細胞集合塊之形成方法、物質之篩選方法、細胞之功能探索方法、細胞集合塊及培養容器。
先前，藉由培養黏著性細胞及非黏著性細胞而形成細胞集合塊。
於專利文獻1中，揭示有藉由使包含多能性神經幹細胞之組織懸浮於含有至少一種幹細胞增殖因子之培養基中，並於神經幹細胞集合塊形成用容器中進行播種、培養而形成神經幹細胞集合塊之方法。此時，神經幹細胞集合塊形成用容器於內表面具有非水溶性硬化皮膜層，其係藉由如下方式製造：於使水溶性樹脂被覆於容器內表面而形成水溶性樹脂被覆層後，使水溶性樹脂被覆層硬化而改質為非水溶性硬化皮膜層。又，作為水溶性樹脂，可例示2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼與其他單體(例如，甲基丙烯酸丁酯等)之共聚物。
但是，即便使用此種神經幹細胞集合塊形成用容器培養黏著性細胞，亦存在因非水溶性硬化皮膜層阻礙黏著性細胞之黏著而導致黏著性細胞死亡，從而無法形成黏著性細胞之細胞集合塊之問題。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：日本專利特開2008-220205號公報
本發明之目的在於：鑒於上述先前技術所具有之問題，提供一種可形成黏著性細胞之細胞集合塊的細胞集合塊之形成方法、使用該細胞集合塊之形成方法的物質之篩選方法及細胞之功能探索方法、細胞集合塊及培養容器。
本發明之細胞集合塊之形成方法係一種使用培養容器培養黏著性細胞而形成細胞集合塊之方法，上述培養容器於表面附近存在胺基、羧基及/或羥基、與通式
[化1]
(式中，R1、R2及R3分別獨立為碳數1以上6以下之烷基，m為2以上6以下之整數)
所表示之基。
本發明之物質之篩選方法具有使用本發明之細胞集合塊之形成方法形成細胞集合塊之步驟、及使用該細胞集合塊篩選物質之步驟。
本發明之細胞之功能探索方法具有使用本發明之細胞集合塊之形成方法形成細胞集合塊之步驟、及使用該細胞集合塊探索細胞之功能之步驟。
本發明之細胞集合塊係黏著性細胞增殖並自主性地集合而成之細胞集合塊，且上述黏著性細胞為間葉幹細胞、肝細胞或癌細胞。
本發明之培養容器於表面附近存在胺基、羧基及/或羥基、與通式
[化2]
(式中，R1、R2及R3分別獨立為碳數1以上6以下之烷基，m為2以上6以下之整數)
所表示之基。
根據本發明，可提供一種可形成黏著性細胞之細胞集合塊的細胞集合塊之形成方法、使用該細胞集合塊之形成方法的物質之篩選方法及細胞之功能探索方法、細胞集合塊及培養容器。
其次，對用以實施本發明之形態與圖式一同進行說明。
於圖1中表示形成本發明之細胞集合塊之方法之一例。
培養容器D於底面具有：區域D1，其於表面附近存在胺基、羧基及/或羥基；及區域D2，其於表面附近存在通式(1)所表示之基。
若於培養容器D中添加黏著性細胞C及培養基M，則黏著性細胞C黏著於培養容器D之底面(參照圖1A)。可認為其原因在於：黏著性細胞C黏著於培養容器D之底面之於表面附近存在胺基、羧基及/或羥基的區域D1。其次，若培養黏著性細胞C，則黏著性細胞C增殖並且自主性地集合而形成細胞集合塊C'(參照圖1B)。可認為其原因在於：由於培養容器D之底面之於表面附近存在通式(1)所表示之基的區域D2抑制黏著性細胞C之黏著，故而於黏著性細胞C上形成有增殖之黏著性細胞C。因此，若使用培養容器D培養黏著性細胞C，則可形成黏著性細胞C增殖並且自主性地集合而成之細胞集合塊C'。
作為黏著性細胞C，並無特別限定，可列舉：間葉幹細胞、肝細胞、肝幹細胞、心肌細胞、癌細胞、癌幹細胞、纖維細胞、神經細胞、血管內皮前驅細胞、上皮細胞等。
作為培養容器D之形態，並無特別限定，可列舉：培養皿、多孔板、燒瓶、旋轉瓶、具有細胞培養過程之裝置之單元等。
[培養容器D之第一實施形態]
培養容器D之第一實施形態係藉由於表面附近存在羧基、胺基及羥基之容器中，使具有對於羧基、胺基或羥基具有反應性之基、及通式(1)所表示之基的表面改質劑進行反應而製造。此時，表面改質劑之分子量為225~650。藉此，可以高密度導入通式(1)所表示之基。
作為向容器之表面附近導入胺基之方法，並無特別限定，可列舉：氮電漿處理、氨電漿處理、使表面處理劑進行反應之方法、聚矽氧氣相處理等。
於氮電漿處理中，係藉由於氮氣環境下產生低溫電漿而向容器之表面附近導入胺基(例如，參照Surface and Coatings Technology 116-119(1999) 802-807,Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 195(2001) 81-95,Macromol. Chem. Phys. 200. 989-996(1999))。具體而言，係將容器收納於反應容器內，利用真空泵使反應容器內形成真空後，導入氮氣並進行輝光放電。
於氨電漿處理中，係藉由於氨氣環境下產生低溫電漿而向容器之表面附近導入胺基。具體而言，係將容器收納於反應容器內，利用真空泵使反應容器內形成真空後，導入氨氣並進行輝光放電。
作為構成容器之材料，並無特別限定，可列舉：聚氯乙烯、丙烯酸系樹脂、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚酯、環烯樹脂、聚碳酸酯、玻璃等。
於使表面處理劑進行反應之方法中，係使用具有胺基之烷氧矽烷、氯矽烷、矽氮烷等表面處理劑，於在表面附近存在烷氧基矽烷基等可藉由水解而生成矽烷醇基之基、矽烷醇基、來自半金屬氧化物之羥基及/或來自金屬氧化物之羥基的容器之表面附近導入胺基。具體而言，首先，向容器內添加水/2-丙醇混合液，並添加3-胺基丙基三甲氧基矽烷後，加熱至100℃並使其反應6小時。其次，於冷卻至室溫後，利用甲醇清洗乾淨並進行乾燥。
作為構成容器之材料，並無特別限定，可列舉：甲基丙烯酸3-三甲氧基甲矽烷基丙基-甲基丙烯酸甲酯-二乙烯基苯共聚物、聚氯乙烯、丙烯酸系樹脂、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚酯、環烯樹脂、聚碳酸酯、二氧化矽、玻璃、氧化鋁、滑石、黏土、雲母、石棉、氧化鈦、鋅白、氧化鐵等。
於聚矽氧氣相處理中，係藉由於使用1,3,5,7-四甲基環四矽氧烷向容器之表面附近導入氫矽烷基後，使具有胺基之烯烴進行反應而向容器之表面附近導入胺基(例如，參照日本專利特公平1-54379號公報、日本專利特公平1-54380號公報、日本專利特公平1-54381號公報)。具體而言，首先，將1,3,5,7-四甲基環四矽氧烷與容器放入乾燥器中，利用抽氣器進行脫氣。其次，於80℃下反應16小時後，取出容器並於120℃下使其乾燥。進而，將所獲得之容器浸於乙醇中，於添加烯丙胺後添加氯鉑酸之乙醇溶液並於60℃下攪拌2小時。於反應結束後，利用乙醇清洗乾淨並進行減壓乾燥。
作為構成容器之材料，並無特別限定，可列舉：苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚氯乙烯、丙烯酸系樹脂、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚酯、環烯樹脂、聚碳酸酯、雲母、滑石、高嶺土、氧化鋁、氧化鈦、氧化鋅、氧化鐵等。
作為具有胺基之烯烴，並不限定於烯丙胺，只要為具有乙烯基之胺、具有丙烯基之胺等即可。又，胺基亦可藉由丁氧基羰基、苄氧羰基等加以保護。進而，亦可使用具有環氧基等例如可藉由與二胺之反應而導入胺基之基的烯烴代替具有胺基之烯烴。
作為向容器之表面附近導入羧基及/或羥基之方法，並無特別限定，可列舉氧電漿處理、臭氧處理、水蒸氣電漿處理等。
於氧電漿處理中，係藉由於氧氣環境下產生低溫電漿而向容器之表面附近導入羧基及羥基。具體而言，係將容器收納於反應容器內，利用真空泵使反應容器內形成真空後，導入氧氣並進行輝光放電。
於臭氧處理中，係藉由於容器中添加臭氧水溶液而向容器之表面附近導入羧基及羥基。具體而言，係於容器中添加40 ppm之臭氧水溶液並於室溫下處理15分鐘。
於水蒸氣電漿處理中，係藉由於水蒸氣環境下產生低溫電漿而向容器之表面附近導入羥基。具體而言，係將容器收納於反應容器內，利用真空泵使反應容器內形成真空後，導入水蒸氣並進行輝光放電。
作為構成容器之材料，並無特別限定，可列舉聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯、聚醚醚酮、環烯樹脂、聚碳酸酯等。
作為向容器之表面附近導入羧基之方法，並無特別限定，可列舉使表面處理劑進行反應之方法、聚矽氧氣相處理等。
於使表面處理劑進行反應之方法中，係使用具有羧基之烷氧矽烷、氯矽烷、矽氮烷等表面處理劑，於表面附近存在烷氧基矽烷基等可藉由水解而生成矽烷醇基之基、矽烷醇基、來自半金屬氧化物之羥基及/或來自金屬氧化物之羥基的容器之表面附近導入羧基。具體而言，首先，使三乙氧基矽烷基丙基琥珀酸酐溶解於N,N-二甲基甲醯胺中，添加蒸餾水與4-二甲胺基吡啶并於室溫下攪拌16小時而合成具有羧基之矽烷偶合劑。其次，於容器中添加水/2-丙醇混合液，於添加具有羧基之矽烷偶合劑後，加熱至100℃並使其反應6小時。進而，於冷卻至室溫後，利用甲醇清洗乾淨並進行乾燥。
作為構成容器之材料，並無特別限定，可列舉：甲基丙烯酸3-三甲氧基甲矽烷基丙基-甲基丙烯酸甲酯-二乙烯基苯共聚物、二氧化矽、玻璃、氧化鋁、滑石、黏土、雲母、石棉、氧化鈦、鋅白、氧化鐵等。
於聚矽氧氣相處理中，係藉由使用1,3,5,7-四甲基環四矽氧烷向容器之表面附近導入氫矽烷基後，使具有羧基之烯烴進行反應而向容器之表面附近導入羧基(例如，參照日本專利特公平1-54379號公報、日本專利特公平1-54380號公報、日本專利特公平1-54381號公報)。具體而言，首先，將放入有1,3,5,7-四甲基環四矽氧烷之容器放入乾燥器中並利用抽氣器進行脫氣。其次，於80℃下反應16小時後，取出容器並於120℃下使其乾燥。進而，將所獲得之容器浸於乙醇中，於添加甲酸烯丙酯後，添加氯鉑酸之乙醇溶液並於60℃下攪拌2小時。於反應結束後，利用乙醇清洗乾淨並進行減壓乾燥。
作為構成容器之材料，並無特別限定，可列舉苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、雲母、滑石、高嶺土、氧化鋁、氧化鈦、氧化鋅、氧化鐵等。
作為具有羧基之烯烴，並不限定於甲酸烯丙酯，只要為具有乙烯基之羧酸、具有丙烯基之羧酸等即可。
作為向容器之表面附近導入胺基、羧基及羥基之方法，並無特別限定，可列舉於含有氧氣及氨氣之環境下進行電漿處理之方法等。具體而言，係將容器收納於反應容器內，利用真空泵使反應容器內形成真空後，導入氧氣及氨氣並進行輝光放電而產生低溫電漿。
作為對於羧基具有反應性之基，可列舉胺基、羥基等，就反應性較高之觀點而言，較佳為胺基。
作為對於胺基或羥基具有反應性之基，可列舉羧基、醛基等，就反應性較高之觀點而言，較佳為羧基。
又，關於表面改質劑，較佳為對於羧基、胺基或羥基具有反應性之基經由間隔基(spacer)而與通式(1)所表示之基鍵結。作為間隔基，並無特別限定，可列舉：亞甲基、氧乙烯基、具有1個以上胺基之伸烷基等。
其次，對具有胺基及通式(1)所表示之基之表面改質劑進行說明。
作為具有胺基及通式(1)所表示之基之表面改質劑，並無特別限定，可列舉日本專利特開2006-7203號公報、日本專利特開2006-7204號公報、日本專利特開2008-174491號公報所揭示之化合物等。
若使存在於容器之表面附近之羧基、與表面改質劑所具有之胺基藉由通常之反應而縮合，則形成醯胺鍵。具體而言，係於容器中添加N-羥基琥珀醯亞胺、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺之溶液，使存在於容器之表面附近之羧基活性酯化後，將表面改質劑添加於容器中。
其次，對具有羥基及通式(1)所表示之基之表面改質劑進行說明。
作為具有羥基及通式(1)所表示之基之表面改質劑，並無特別限定，可列舉L-α-甘油磷酸膽鹼等。
若存在於容器之表面附近之羧基、與表面改質劑所具有之羥基藉由通常之反應而縮合，則形成酯鍵。
具體而言，係將使用溴化氰使羥基活化之表面改質劑添加於容器中。
其次，對具有羧基與通式(1)所表示之基之表面改質劑進行說明。
作為具有羧基與通式(1)所表示之基之表面改質劑，並無特別限定，可列舉日本專利特開2006-11381號公報所揭示之化合物等。
若存在於容器之表面附近之胺基、與表面改質劑所具有之羧基藉由通常之反應而縮合，則形成醯胺鍵。具體而言，係將使用N-羥基琥珀醯亞胺、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺之溶液使羧基活性酯化之表面改質劑添加於容器中。
若使存在於容器之表面附近之羥基、與表面改質劑所具有之羧基藉由通常之反應而縮合，則形成酯鍵。
具體而言，係於使用溴化氰使存在於容器之表面附近之羥基活化後，添加表面改質劑。
其次，對具有醛基及通式(1)所表示之基之表面改質劑進行說明。
作為具有醛基及通式(1)所表示之基之表面改質劑，並無特別限定，可列舉日本專利特開2006-11383號公報所揭示之化合物等。
若使存在於容器之表面附近之胺基、與表面改質劑所具有之醛基藉由通常之反應而縮合，則形成亞胺鍵。具體而言，係於容器中添加表面改質劑及甲醇，於室溫下放置6小時後，於0℃下添加氰基三氫硼酸鈉並加熱攪拌一晚。作為反應溶劑，除甲醇以外，亦可使用水、乙醇、2-丙醇等質子性溶劑，但有使用甲醇之情形時之導入率較高之傾向。
若使存在於容器之表面附近之羥基、與表面改質劑所具有之醛基藉由通常之反應而加成，則形成縮醛鍵。具體而言，係於容器中添加表面改質劑及甲醇，於室溫下放置6小時後，於0℃下添加氰基三氫硼酸鈉並加熱攪拌一晚。作為反應溶劑，除甲醇以外，亦可使用水、乙醇、2-丙醇等質子性溶劑，但有使用甲醇之情形時之導入率較高之傾向。
再者，亦可使用表面附近存在醛基與胺基及/或羥基之容器代替表面附近存在羧基、胺基及羥基之容器，使含有對於醛基具有反應性之基、及通式(1)所表示之基之表面改質劑進行反應。
作為向容器之表面附近導入醛基之方法，並無特別限定，可列舉於表面附近存在胺基之容器中使戊二醛進行反應之方法等。
作為對於醛基具有反應性之基，可列舉胺基、羥基等，就反應性較高之觀點而言，較佳為胺基。
又，關於表面改質劑，較佳為對於醛基具有反應性之基經由間隔基而與通式(1)所表示之基鍵結。
作為間隔基，並無特別限定，可列舉：亞甲基、氧乙烯基、具有1個以上胺基之伸烷基等。
其次，對具有胺基及通式(1)所表示之基之表面改質劑進行說明。
作為具有胺基及通式(1)所表示之基之表面改質劑，並無特別限定，可列舉日本專利特開2006-7203號公報、日本專利特開2006-7204號公報、日本專利特開2008-174491號公報所揭示之化合物等。
若使存在於容器之表面附近之醛基、與表面改質劑所具有之胺基藉由通常之反應而縮合，則形成亞胺鍵。具體而言，係於容器中添加表面改質劑及甲醇，於室溫下放置6小時後，於0℃下添加氰基三氫硼酸鈉並加熱攪拌一晚。作為反應溶劑，除甲醇以外，亦可使用水、乙醇、2-丙醇等質子性溶劑，但有使用甲醇之情形時之導入率較高之傾向。
其次，對具有羥基及通式(1)所表示之基之表面改質劑進行說明。
作為具有羥基及通式(1)所表示之基之表面改質劑，並無特別限定，可列舉L-α-甘油磷酸膽鹼等。
若使存在於容器之表面附近之醛基、與表面改質劑所具有之羥基藉由通常之反應而加成，則形成縮醛鍵。具體而言，係於容器中添加表面改質劑及甲醇，於室溫下放置6小時後，於0℃下添加氰基三氫硼酸鈉並加熱攪拌一晚。作為反應溶劑，除甲醇以外，亦可使用水、乙醇、2-丙醇等質子性溶劑，但有使用甲醇之情形時之導入率較高之傾向。
又，亦可使用表面附近存在胺基或羥基、及羧基之容器代替表面附近存在羧基、胺基及羥基之容器，使含有對於胺基或羥基具有反應性之基、及通式(1)所表示之基之表面改質劑進行反應。
進而，亦可使用表面附近存在胺基及羥基之容器代替表面附近存在羧基、胺基及羥基之容器，使含有對於胺基或羥基具有反應性之基、及磷酸膽鹼類似基之表面改質劑以於容器之表面附近殘留未反應之胺基及/或羥基之方式進行反應。
又，亦可使用表面附近存在羧基、胺基或羥基之容器代替表面附近存在羧基、胺基及羥基之容器，使含有對於羧基、胺基或羥基具有反應性之基、及通式(1)所表示之基之表面改質劑以於容器之表面附近殘留未反應之羧基、胺基或羥基之方式進行反應。
[培養容器D之第二實施形態]
培養容器D之第二實施形態係藉由如下方式製造：於表面附近存在可藉由水解而生成矽烷醇基之基、矽烷醇基、來自半金屬氧化物之羥基及/或來自金屬氧化物之羥基之容器中，使具有可藉由水解而生成矽烷醇基之基、及通式(1)所表示之基之第一表面改質劑，與具有胺基、羧基及/或羥基、及可藉由水解而生成矽烷醇基之基之第二表面改質劑進行反應。此時，第一表面改質劑之分子量為315~650。藉此，可高密度地導入通式(1)所表示之基。
再者，於黏著性細胞C為間葉幹細胞之情形時，第二表面改質劑所具有之胺基、羧基及/或羥基相對於第一表面改質劑所具有之通式(1)所表示之基的莫耳比較佳為0.001~2.4。若莫耳比未達0.001，則存在細胞不黏著之情況，若超過2.4，則存在細胞以單層之狀態增殖而不集合之情況。
作為向容器之表面附近導入可藉由水解而生成矽烷醇基之基及/或矽烷醇基之方法，可列舉將含有具有可藉由水解而生成矽烷醇基之基之聚合物(以下稱作水解性聚合物)、及烷氧矽烷之塗佈液塗佈於容器上之方法。
若將含有水解性聚合物及烷氧矽烷之塗佈液塗佈於容器上，則使水解性聚合物及烷氧矽烷水解而生成矽烷醇基。進而，藉由矽烷醇基彼此之脫水縮合，使水解性聚合物交聯而形成導入有矽烷醇基之交聯聚合物層。具體而言，係於材料上塗佈塗佈液後，塗佈水、酸或鹼，或進行加熱。又，亦可於將水、酸或鹼塗佈於材料上之後，塗佈塗佈液。進而，亦可於塗佈液中混合水、酸或鹼。於此情形時，為了於塗佈液中引起水解，較佳為於塗佈時適當製備塗佈液。再者，於使用水、酸或鹼之情形時，亦可進行加熱，但通常反應可於室溫下充分進行。又，即便不使用水、酸或鹼，亦可藉由大氣中之水分而緩慢地進行反應。
作為水解所使用之酸或鹼，只要為可進行水解者，則無特別限定，可混合二種以上使用，亦可製成水溶液使用。
作為塗佈液，可使用使水解性聚合物及烷氧矽烷於有機溶劑中溶解或分散而成者。作為有機溶劑，並無特別限定，可列舉：脂肪族烴、芳香族烴、氯化烴、醚、碳數1~4之1~4價之脂肪族醇等醇，乙基溶纖劑、丁基溶纖劑等溶纖劑，二烷、乙酸甲酯、二甲醯胺等，亦可併用二種以上。
塗佈液中之水解性聚合物之含量通常為0.001~20質量%，較佳為0.1~5質量%。若塗佈液中之水解性聚合物之含量未達0.001質量%，則有無法藉由1次塗佈獲得充分之效果之情況，若超過20質量%，則有塗佈性降低之情況。
又，水解性聚合物相對於烷氧矽烷之質量比通常為0.01~20%，較佳為0.2~5%。若水解性聚合物相對於烷氧矽烷之質量比未達0.01%，則存在交聯聚合物層之強度變得不充分之情況，若超過20%，則存在導入至交聯聚合物層之矽烷醇基之量變得不充分之情況。
作為塗佈塗佈液之方法，並無特別限定，可列舉浸漬塗佈法、噴霧塗佈法、旋轉塗佈法(spin cast)等。
作為構成容器之材料，並無特別限定，可列舉：PP(聚丙烯，polypropylene)、環烯樹脂、聚碳酸酯、PET(聚對苯二甲酸乙二酯，polyethylene terephthalate)、PEEK(聚醚醚酮，polyetheretherketone)、氟系樹脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯等有機材料；金、鈦、鋁、鐵、銅、不鏽鋼、氧化鋁、氧化鈦、氧化鋅等無機材料等。
作為水解性聚合物，只要為具有可藉由水解而生成矽烷醇基之基之聚合物，則並無特別限定，可使用藉由使通式
[化3]
(式中，R1為氫原子或甲基，R2為碳數1~6之伸烷基，較佳為丙烯基，R3、R4及R5分別獨立為碳數1~6之烷氧基，較佳為甲氧基或乙氧基)所表示之單體(A-1)聚合而獲得之均聚物或共聚物(以下稱作聚合物(A))。此時，亦可併用二種以上之單體(A-1)。
又，於合成聚合物(A)時，亦可使通式
[化4]
(式中，R1為氫原子或甲基，R2為碳數1~18之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷基，較佳為碳數1~6之烷基，特佳為甲基)所表示之單體(A-2)共聚合。此時，亦可併用二種以上之單體(A-2)。
又，於合成聚合物(A)時，亦可使通式
[化5]
(式中，R1為氫原子或甲基，R2為碳數1~6之伸烷基，較佳為乙烯基、丙烯基或2-羥基丙烯基，X為通式
[化6]
(式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8及R9分別獨立為碳數1~6之直鏈或支鏈狀之烷基，較佳為甲基)所表示之基(X-1)、通式
[化7]
(式中，R1、R2、R3、R4、R5及R6分別獨立為碳數1~6之直鏈或支鏈狀之烷基，較佳為甲基，R7為碳數1~6之直鏈或支鏈狀之烷基，較佳為丁基，x為正整數)所表示之基(X-2)或通式
[化8]
(式中，R1、R2、R3、R4、R5及R6分別獨立為碳數1~6之直鏈或支鏈狀之烷基，較佳為甲基，R7為碳數1~6之伸烷基，較佳為乙烯基、丙烯基或2-羥基丙烯基，R8為氫原子或甲基，y為正整數)所表示之基(X-3))所表示之單體(A-3)共聚合。再者，於X為基(X-2)或(X-3)之情形時，單體(A-3)之分子量較佳為1000~100000，特佳為2000~20000。此時，亦可併用二種以上之單體(A-3)。
又，於合成聚合物(A)時，亦可使通式
[化9]
(式中，R1為氫原子或甲基，R2為碳數1~6之伸烷基，較佳為乙烯基或丙烯基，Y為通式
[化10]
(式中，R1、R2及R3分別獨立為碳數1~6之烷基，較佳為甲基，Z-為鹵化物離子、有機酸或無機酸之共軛離子)所表示之基(Y-1)或通式
[化11]
(式中，R1及R2分別獨立為碳數1~6之烷基，較佳為甲基)所表示之基(Y-2))所表示之單體(A-4)共聚合。此時，亦可併用二種以上之單體(A-4)。
即，於合成聚合物(A)時，亦可使單體(A-2)、單體(A-3)及/或單體(A-4)與單體(A-1)一同共聚合。
合成聚合物(A)時所使用之所有單體中之單體(A-1)之含量較佳為40~85質量%。若所有單體中之單體(A-1)之含量未達40質量%，則有交聯密度降低，親水化之效果無法充分持續之情況，若超過85質量%，則有交聯聚合物層之均勻性降低之情況。
又，合成聚合物(A)時所使用之所有單體中之單體(A-2)之含量通常為1~75質量%，較佳為10~60質量%。若所有單體中之單體(A-2)之含量未達1質量%，則有交聯聚合物層之耐水性降低之情況，若超過75質量%，則有聚合物(A)於醇中成為難溶性之情況。
進而，合成聚合物(A)時所使用之所有單體中之單體(A-3)之含量通常為1~70質量%，較佳為5~60質量%。若所有單體中之單體(A-3)之含量未達1質量%，則有交聯聚合物層之耐水性降低之情況，若超過70質量%，則有聚合物(A)於醇中成為難溶性之情況。
又，單體(A-4)之質量相對於單體(A-1)、單體(A-2)及單體(A-3)之總質量之比例通常為0.01~1，較佳為0.05~0.5。若該比例未達0.01，則有交聯聚合物層之柔軟性降低之情況，若超過1，則有交聯聚合物層之耐水性降低之情況。
聚合物(A)之數目平均分子量較佳為2000~150000。若聚合物(A)之數目平均分子量未達2000，則有形成交聯聚合物層之時間變長之情況，若超過150000，則有塗佈液之黏度升高而使塗佈性或可加工性變差之情況。
再者，聚合物(A)之具體例及製造方法係於日本專利特開平11-302129號公報等中加以揭示。
又，作為水解性聚合物，可使用具有通式
[化12]
(式中，R1為碳數1~22之烷基或苯基，較佳為甲基)所表示之結構單元(B-1)之均聚物或共聚物(以下稱作聚合物(B))。此時，聚合物(B)亦可具有二種以上之結構單元(B-1)。
又，聚合物(B)亦可具有通式
[化13]
(式中，R1及R2分別獨立為碳數1~22之烷基或苯基，較佳為甲基)所表示之結構單元(B-2)。此時，聚合物(B)亦可具有兩種以上之結構單元(B-2)。
聚合物(B)較佳為結構單元(B-1)之含量為1~90質量%。若結構單元(B-1)之含量未達1質量%，則有交聯密度降低而使親水化之效果無法充分地持續之情況，若超過90質量%，則有交聯聚合物層之均勻性降低之情況。
進而，聚合物(B)較佳為結構單元(B-2)之含量為10~99質量%。若結構單元(B-2)之含量未達10質量%，則有交聯聚合物層之均勻性降低之情況，若超過99質量%，則有交聯密度降低而使親水化之效果無法充分地持續之情況。
聚合物(B)之數目平均分子量較佳為2000~500000。若數目平均分子量未達2000，則有形成交聯聚合物層之時間變長之情況，若超過500000，則有塗佈液之黏度升高而使塗佈性或可加工性變差之情況。
作為水解性聚合物，可併用聚合物(A)及聚合物(B)，亦可併用水解性聚合物與非水解性聚合物。作為非水解性聚合物，並無特別限定，可列舉不具有可藉由水解而生成矽烷醇基之基之聚合物(A)、聚合物(B)等。
作為向容器之表面附近導入矽烷醇基之方法，並無特別限定，可列舉藉由將含有聚矽氧樹脂之塗佈液塗佈於容器上而形成含有具有矽烷醇基之聚矽氧樹脂的膜之方法等。
含有具有矽烷醇基之聚矽氧樹脂之膜較佳為水之接觸角為3~8°。形成水之接觸角未達3°之膜的步驟較困難，若形成水之接觸角超過8°之膜，則有無法高密度地導入通式(1)所表示之基之情況。
作為塗佈液所含有之聚矽氧樹脂，並無特別限定，可列舉使通式
(R1O)nSi(R2)4-n
(式中，R1及R2分別獨立為碳數1~8之烷基，n為1~4之整數，於n為1或2之情形時，複數個R2可相同亦可不同，於n為2或3之情形時，複數個R1可相同亦可不同)所表示之烷氧矽烷水解後進行縮合而獲得之樹脂，亦可併用二種以上。此時，水之接觸角為3~8°之膜所含有之具有矽烷醇基之聚矽氧樹脂與塗佈液所含有之聚矽氧樹脂可相同，亦可不同。
作為塗佈液所含有之有機溶劑，並無特別限定，可列舉：脂肪族烴、芳香族烴、氯化烴、醚、碳數1~4之1~4價之脂肪族醇等醇，乙基溶纖劑、丁基溶纖劑等溶纖劑，二烷、乙酸甲酯、二甲醯胺等，亦可併用二種以上。
塗佈液中之聚矽氧樹脂之含量通常為0.001~1質量%，較佳為0.1~1質量%。若塗佈液中之聚矽氧樹脂之含量未達0.001質量%，則有無法形成均勻之膜之情況，若超過20質量%，則有塗佈性降低之情況。
作為塗佈塗佈液之方法，並無特別限定，可列舉浸漬塗佈法、噴霧塗佈法、旋轉塗佈法等。
作為構成容器之材料，並無特別限定，可列舉：聚碳酸酯、PET(聚對苯二甲酸乙二酯)、聚苯乙烯、丙烯酸系樹脂等有機材料；金、鈦、鋁、鐵、銅、不鏽鋼、氧化鋁、氧化鈦、氧化鋅等無機材料等。
又，作為表面附近存在矽烷醇基之容器，亦可使用玻璃製之容器。
作為構成表面附近存在來自金屬氧化物之羥基之容器之金屬氧化物，並無特別限定，可列舉氧化鈦、氧化鋅、氧化鐵、氧化鉻、氧化鋁等。
作為構成表面附近存在來自半金屬氧化物之羥基之容器之金屬氧化物，並無特別限定，可列舉氧化鍺、氧化砷、氧化硼等。
作為對於可藉由水解而生成矽烷醇基之基、矽烷醇基、來自半金屬氧化物之羥基及/或來自金屬氧化物之羥基具有反應性之基，可列舉可藉由水解而生成矽烷醇基之基。
又，關於第一表面改質劑，較佳為可藉由水解而生成矽烷醇基之基經由間隔基而與通式(1)所表示之基鍵結。作為間隔基，並無特別限定，可列舉：亞甲基、氧乙烯基、具有1個以上胺基之伸烷基等。
作為可藉由水解而生成矽烷醇基之基，可列舉氫矽烷基、烷氧基矽烷基、鹵矽烷基、醯氧基矽烷基、胺基矽烷基等，就穩定性、反應性等觀點而言，較佳為碳數1~6之烷氧基矽烷基或氫矽烷基。
作為第一表面改質劑，只要具有可藉由水解而生成矽烷醇基之基、及通式(1)所表示之基，則並無特別限定，可列舉日本專利特開2006-11380號公報所揭示之化合物。
作為第二表面改質劑，只要為具有胺基、可藉由水解而生成羧基之基及/或可藉由水解而生成羥基之基、及可藉由水解而生成矽烷醇基之基，則並無特別限定，可列舉：3-胺基丙基三甲氧基矽烷、對胺基苯基三甲氧基矽烷等具有胺基之化合物；3-(三乙氧基矽烷基)丙基丁二酸酐等具有可藉由水解而生成羧基之基之化合物；3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基矽烷、3-縮水甘油氧基丙基甲基二乙氧基矽烷等具有可藉由水解而生成羥基之基之化合物等，亦可併用二種以上。
於第二表面改質劑具有可藉由水解而生成羧基及/或羥基之基之情形時，將可藉由水解而生成羧基及/或羥基之基導入容器之表面附近後，只要藉由水解而生成羧基及/或羥基即可。
再者，第二表面改質劑所具有之胺基亦可藉由保護基加以保護。又，第二表面改質劑亦可具有藉由可利用水解以外之反應而脫保護之保護基所保護之羧基或羥基，代替可藉由水解而生成羧基或羥基之基。
於第二表面改質劑具有藉由保護基所保護之胺基羧基及/或羥基之情形時，將藉由保護基所保護之胺基、羧基及/或羥基導入容器之表面附近後，只要藉由脫保護而生成胺基、羧基及/或羥基即可。
其次，對於向表面附近存在可藉由水解而生成矽烷醇基之基、矽烷醇基、來自半金屬氧化物之羥基及/或來自金屬氧化物之羥基之容器中，導入胺基、可藉由水解而生成羧基之基及/或可藉由水解而生成羥基之基、及通式(1)所表示之基的方法進行說明。
首先，於表面附近存在可藉由水解而生成矽烷醇基之基、矽烷醇基、來自半金屬氧化物之羥基及/或來自金屬氧化物之羥基之容器上，塗佈含有第一表面改質劑及第二表面改質劑之塗佈液。此時，使可藉由水解而生成矽烷醇基之基水解而生成矽烷醇基。進而，藉由存在於容器之表面附近之矽烷醇基、藉由半金屬氧化物之水解而生成之羥基及/或藉由金屬氧化物之水解而生成之羥基、及藉由表面改質劑之水解而生成之矽烷醇基之脫水縮合，而使容器之表面改質。具體而言，係將塗佈液塗佈於容器上後，塗佈水、酸或鹼，或進行加熱。又，亦可於將水、酸或鹼塗佈於容器上後，塗佈塗佈液。進而，亦可於塗佈液中混合水、酸或鹼。於此情形時，為了於塗佈液中引起水解，較佳為於塗佈時適當製備塗佈液。再者，於使用水、酸或鹼之情形時，亦可進行加熱，但通常於室溫下充分地進行反應。又，即便不使用水、酸或鹼，亦可藉由大氣中之水分而緩慢地進行反應。
作為酸或鹼，只要可使可藉由水解而生成矽烷醇基之基水解者，則並無特別限定，亦可併用二種以上。再者，水解所使用之酸或鹼亦可製成水溶液而使用。
作為塗佈液，可使用使第一表面改質劑及第二表面處理劑溶解或分散於有機溶劑中而成者。作為有機溶劑，可列舉：脂肪族烴、芳香族烴、氯化烴、醚、碳數1~4之1~4價之脂肪族醇等醇，乙基溶纖劑、丁基溶纖劑等溶纖劑，二烷、乙酸甲酯、二甲醯胺等。
塗佈液中之第一表面改質劑之含量通常為0.1~30質量%，較佳為1~10質量%。若塗佈液中之第一表面改質劑之含量未達0.1質量%，則有無法藉由1次塗佈而充分塗佈第一表面改質劑之情況，若超過30質量%，則有塗佈性降低之情況。
作為塗佈塗佈液之方法，並無特別限定，可列舉浸漬塗佈法、噴霧塗佈法、旋轉塗佈法等。
再者，亦可將含有第一表面處理劑之塗佈液及含有第二表面處理劑之塗佈液分別塗佈於容器上。
又，亦可以於容器之表面附近殘留未反應之矽烷醇基、來自半金屬氧化物之羥基及/或來自金屬氧化物之羥基之方式，使來自表面改質劑之矽烷醇基、與來自容器之矽烷醇基、來自半金屬氧化物之羥基及/或來自金屬氧化物之羥基進行反應。
[培養容器D之第三實施形態]
培養容器D之第三實施形態係於表面形成含有具有胺基、羧基及/或羥基、及通式(1)所表示之基的樹脂之層。
作為具有胺基、羧基及/或羥基、及通式(1)所表示之基之樹脂，並無特別限定，可列舉使具有通式(1)所表示之基之單體、與具有胺基之單體、具有羧基之單體及/或具有羥基之單體共聚合而獲得之樹脂(例如，參照日本專利特開平7-184990號公報)。
作為構成容器之材料，並無特別限定，可列舉：環烯樹脂、聚碳酸酯、PET(聚對苯二甲酸乙二酯)、聚苯乙烯、丙烯酸系樹脂等有機材料；金、鈦、鋁、鐵、銅、不鏽鋼、氧化鋁、氧化鈦、氧化鋅等無機材料等。
再者，於使用由有機材料所構成之容器之情形時，若考慮對於容器之黏著性，則較佳為使用使具有通式(1)所表示之基之單體、具有胺基、羧基及/或羥基之單體及具有疏水性基之單體共聚合而獲得之樹脂。
作為具有疏水性基之單體，並無特別限定，可列舉甲基丙烯酸丁酯等。
作為於容器之表面附近形成含有具有胺基、羧基及/或羥基、及通式(1)所表示之基的樹脂之層之方法，可列舉：將含有具有胺基、羧基及/或羥基、及通式(1)所表示之基的樹脂之塗佈液塗佈於容器上之方法。
作為塗佈液，可使用使樹脂溶解或分散於有機溶劑中而成者。作為有機溶劑，可列舉：脂肪族烴、芳香族烴、氯化烴、醚、碳數1~4之1~4價之脂肪族醇等醇，乙基溶纖劑、丁基溶纖劑等溶纖劑，二烷、乙酸甲酯、二甲醯胺等。
塗佈液中之樹脂之含量通常為0.1~30質量%，較佳為1~10質量%。若塗佈液中之樹脂之含量未達0.1質量%，則有無法藉由1次塗佈即充分塗佈樹脂之情況，若超過30質量%，則有塗佈性降低之情況。
作為塗佈塗佈液之方法，並無特別限定，可列舉浸漬塗佈法、噴霧塗佈法、旋轉塗佈法等。
若於本發明之細胞集合塊之形成方法中使用來自人類、大白鼠、小白鼠、靈長類等哺乳類之黏著性細胞，則對下述物質之篩選方法及細胞之功能探索方法有用。
於本發明中，作為培養黏著性細胞之方法，並無特別限定，可根據黏著性細胞而應用公知之條件，可列舉：使用含有10質量%之胎牛血清(FBS，Fetal Bovine Serum)、1 mM之麩胺酸、適量之抗生素之杜貝可改良培養基(DMEM，Dulbecco's Modified Eagle Medium)，於含有5體積%之二氧化碳環境下，於37℃下培養黏著性細胞之方法等。
本發明之物質之篩選方法係使用藉由本發明之細胞集合塊之形成方法所形成之細胞集合塊而篩選物質。此時，本發明之物質之篩選方法可應用於使用肝細胞或心肌細胞評價物質之毒性之方法、使用癌細胞試驗藥劑之效果之方法等公知的物質之篩選方法。作為評價物質之毒性之方法，可列舉MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)分析、阿爾瑪藍(Alamar Blue)分析等以細胞增殖為基準之方法。又，亦可藉由RT-PCR(逆轉錄聚合酶鏈式反應，Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)、ELISA(酵素結合免疫吸附分析，Enzyme Linked Immunosorbent Assay)等方法而定量與發炎性細胞激素之產生釋出、癌化相關聯之因子的SDF-1(基質細胞衍生因子-1，Stromalcell-derivedfactor-1)、LIF(白血病抑制因子，leukemia inhibitory factor)、EGFR(表皮生長因子受體，Epidermal Growth Factor Receptor)等之量。
又，本發明之物質之篩選方法可藉由使用每個個體之黏著性細胞之細胞集合塊篩選物質而應用於定製醫療。
本發明之細胞之功能探索方法係使用藉由本發明之細胞集合塊之形成方法所形成之細胞集合塊而探索細胞之功能。此時，本發明之細胞之功能探索方法可應用於闡明黏著性細胞之生物化學功能之方法、探索生物標記之方法等公知之細胞之功能探索方法。
實施例
[實施例1]
於Primaria培養皿(日本Becton Dickinson公司製造)中添加N-羥基琥珀醯亞胺1 g、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺1 g之1質量%水溶液後，添加使化學式
[化14]
所表示之化合物(A)1 g溶解於水100 ml中而成之溶液，進行醯胺化。其次，自Primaria培養皿中取出反應液，於室溫下乾燥5小時後，進行水洗並使其乾燥而獲得培養容器。再者，Primaria培養皿係於含有氧及氨之環境下經電漿處理之聚苯乙烯製培養皿。
於培養容器中添加MensenPRO RS培養基(Invitrogen公司製造)10 ml及作為間葉幹細胞之人類脂肪源性幹細胞(Invitrogen公司製造)1×106個/容器，於對人類脂肪源性幹細胞進行培養後，形成細胞增殖並自主性地集合而成之細胞集合塊(參照圖2A及圖2B)。
[比較例1]
於未經表面處理之聚苯乙烯製皮氏培養皿(petri dish)(日本Becton Dickinson公司製造)中，添加MensenPRO RS培養基(Invitrogen公司製造)10 ml及人類脂肪源性幹細胞(Invitrogen公司製造)1×106個/培養皿，於對人類脂肪源幹細胞進行培養後，細胞以單層之狀態增殖而未形成細胞集合塊(參照圖3)。
[鹼性磷酸酶活性]
於實施例1之細胞集合塊及比較例1之培養細胞中添加4質量%之三聚甲醛-磷酸緩衝液並進行5分鐘之處理後，使用TBS(Tris-Buffered Saline)緩衝液及TBST(Tris-Buffered Saline with Tween 20)緩衝液清洗乾淨。其次，添加BM Purple AP基質(Roche公司製造)並於37℃下反應1小時後，使用TBST緩衝液清洗乾淨。將評價結果示於圖4A及圖4B。自圖4A及圖4B可知，實施例1之細胞集合塊之鹼性磷酸酶活性為陽性，但比較例1之培養細胞之鹼性磷酸酶活性為陰性。
[免疫雙重染色]
於實施例1之細胞集合塊及比較例1之培養細胞中添加4質量%之三聚甲醛-磷酸緩衝液並進行5分鐘之處理後，使用TBS緩衝液及TBST緩衝液清洗乾淨。其次，根據目錄所記載之方法使第一一次抗體稀釋並與細胞反應後，使第一Alexa Fluor標識二次抗體(Invitrogen公司製造)與細胞反應，使用TBST緩衝液清洗乾淨。進而，根據目錄所記載之方法使第二一次抗體稀釋並與細胞反應後，使第二Alexa Fluor標識二次抗體(Invitrogen公司製造)與細胞反應，使用TBST緩衝液清洗乾淨。將評價結果示於表1。
再者，Nestin(Abcam公司製造)、CD271(Abcam公司製造)及CD133(Abcam公司製造)分別為神經源性幹細胞標記、脂肪源性幹細胞標記及幹細胞標記，PDGFRa(R&D公司製造)及PDGFRb(R&D公司製造)為間葉幹細胞標記。又，將實施例1之細胞集合塊之評價結果示於圖5~8。自表1可知，由於實施例1之細胞集合塊之Nestin為陽性，故而脂肪源性幹細胞可於活體外獲得神經源性幹細胞之性質。
[實施例2-1]
獲得包含3-胺基丙基三甲氧基矽烷之0.15 mol/L之甲醇溶液0.01 mL、化學式
[化15]
所表示之化合物(B)之0.15 mol/L之甲醇溶液9.99 mL及甲醇10 mL的塗佈液。
將所獲得之塗佈液塗佈於玻璃底培養皿(松浪硝子工業公司製造)上並於室溫下進行乾燥。其次，於進行加熱乾燥並於室溫下乾燥後，進行水洗並使其乾燥而獲得培養容器。
於培養容器中添加MensenPRO RS培養基(Invitrogen公司製造)2.5 ml及人類脂肪源性幹細胞(Invitrogen公司製造)1×105個/容器，於對人類脂肪源幹細胞進行培養後，形成細胞增殖並自主性地集合而成之細胞集合塊(參照圖9)。
[實施例2-2]
獲得包含3-胺基丙基三甲氧基矽烷之0.15 mol/L之甲醇溶液0.5 mL、化合物(B)之0.15 mol/L之甲醇溶液9.5 mL及甲醇10 mL的塗佈液。
將所獲得之塗佈液塗佈於玻璃底培養皿(松浪硝子工業公司製造)上並於室溫下進行乾燥。其次，於進行加熱乾燥並於室溫下乾燥後，進行水洗並使其乾燥而獲得培養容器。
於培養容器中添加MensenPRO RS培養基(Invitrogen公司製造)2.5 ml及人類脂肪源性幹細胞(Invitrogen公司製造)1×105個/容器，於對人類脂肪源幹細胞進行培養後，形成細胞增殖並自主性地集合而成之細胞集合塊(參照圖10)。
[實施例2-3]
獲得包含3-胺基丙基三甲氧基矽烷之0.15 mol/L之甲醇溶液7 mL、化合物(B)之0.15 mol/L之甲醇溶液3 mL及甲醇10 mL的塗佈液。
將所獲得之塗佈液塗佈於玻璃底培養皿(松浪硝子工業公司製造)上並於室溫下進行乾燥。其次，於進行加熱乾燥並於室溫下乾燥後，進行水洗並使其乾燥而獲得培養容器。
於培養容器中添加MensenPRO RS培養基(Invitrogen公司製造)2.5 ml及人類脂肪源性幹細胞(Invitrogen公司製造)1×105個/容器，於對人類脂肪源幹細胞進行培養後，形成細胞增殖並自主性地集合而成之細胞集合塊(參照圖11)。
[比較例2]
於未經表面處理之玻璃底培養皿(松浪硝子工業公司製造)中添加MensenPRO RS培養基(Invitrogen公司製造)2.5 ml及人類脂肪源性幹細胞(Invitrogen公司製造)1×105個/培養皿，於對人類脂肪源幹細胞進行培養後，細胞以單層之狀態增殖而未形成細胞集合塊(參照圖12)。
[免疫染色]
於實施例2-2之細胞集合塊中添加4質量%之三聚甲醛-磷酸緩衝液並進行5分鐘之處理後，使用0.2質量%之Triton X-100(Roche-Diagnostics公司製造)/TBS緩衝液及0.2質量%之Tween20(東京化成工業公司製造)/TBS緩衝液清洗乾淨。其次，以Protein Block(DAKO公司製造)阻斷非特異反應。進而，使稀釋為200倍之一次抗體之抗CD271兔多株抗體(abcam公司製造)及CD90小白鼠單株抗體(abcam公司製造)與細胞反應一晚後，使用0.2質量%之Tween20(東京化成工業公司製造)/TBS緩衝液清洗乾淨。其次，使稀釋為250倍之分別發出綠色及紅色之螢光二次抗體Alexa488抗兔抗體(Invitrogen公司製造)及Alexa594抗小白鼠抗體(Invitrogen公司製造)與細胞反應2小時後，使用0.2質量%之Tween20(東京化成工業公司製造)/TBS緩衝液清洗乾淨。進而，於利用發出藍色之Vectorshield-DAPl(Vector公司製造)對核進行染色後，使用共軛焦雷射顯微鏡LSM 5 PASCAL(Carl Zeiss公司製造)進行觀察。其結果，由於實施例2-2之細胞集合塊發出綠色而可知CD271為陽性(參照圖13)。
再者，實施例2-1及實施例2-3之細胞集合塊亦與實施例2-2之細胞集合塊同樣地發出綠色而CD271為陽性。
[實施例3]
於Primaria培養皿(日本Becton Dickinson公司製造)中添加使N-羥基琥珀醯亞胺89 mg、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺149 mg溶解於水10 mL中而成之水溶液後，添加使化合物(A)200 mg溶解於水10 ml中而成之溶液，並進行醯胺化。其次，自Primaria培養皿中取出反應液後，進行水洗並使其乾燥而獲得培養容器。
於培養容器中添加含有10質量%之胎牛血清(FBS)之MEM培養基(SIGMA-ALDRICH公司製造)3 ml及作為癌細胞之人類肝癌細胞(Primary Cell公司製造)1×105個/容器，於對人類肝癌細胞進行培養後，形成細胞增殖並自主性地集合而成之細胞集合塊(參照圖14)。
[比較例3]
於Primaria培養皿(日本Becton Dickinson公司製造)中添加含有10質量%之胎牛血清(FBS)之MEM培養基(SIGMA-ALDRICH公司製造)3 ml及作為癌細胞之人類肝癌細胞(Primary Cell公司製造)1×105個/容器，於對人類肝癌細胞進行培養後，細胞以單層之狀態增殖而未形成細胞集合塊(參照圖15)。
[白蛋白之產生量]
使用人類白蛋白測定套組(Cosmo Bio公司製造)並利用ELISA法測定對實施例3及比較例3之人類肝癌細胞進行培養之培養基中的白蛋白之產生量。將評價結果示於圖16。自圖16可知，實施例3之細胞集合塊之白蛋白之產生量大於比較例3之培養細胞。
[CYP1A1之活性]
將實施例3之細胞集合塊及比較例3之培養細胞於含有10質量%之胎牛血清(FBS)、8 μM之7-乙氧基試鹵靈及10 μM之雙香豆素之MEM培養基(SIGMA-ALDRICH公司製造)中，於37℃下培養30分鐘。其次，於培養上清液中添加含有β-葡萄糖醛酸酶及芳基硫酸酯酶之乙酸緩衝液並於37℃下反應2小時。進而，藉由螢光測定(激發波長530 nm，螢光波長590 nm)對溶液中之試鹵靈量進行測定，而評價細胞所產生之CYP1A1之活性。
將評價結果示於圖17。自圖17可知實施例3之細胞集合塊之CYP1A1之活性大於比較例3之培養細胞。
[基因表現]
使用Lightcycler 480-II(Roche公司製造)並利用PCR(聚合酶鏈式反應，Polymerase Chain Reaction)法測定實施例3之細胞集合塊及比較例3之培養細胞之基因表現。將評價結果示於圖18。自圖18可知，實施例3之細胞集合塊之CYP1A1、ALB、LDLR、ATP51及CollA1之基因表現大於比較例3之培養細胞。再者，使用GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，甘油醛3-磷酸脫氫酶)作為內部標準。
[實施例4]
除使用人類乳腺源性癌細胞(理研BRC製造)代替人類肝癌細胞(Primary Cell公司製造)以外，以與實施例3相同之方式培養人類乳腺源癌細胞後，形成細胞增殖並自主性地集合而成之細胞集合塊(參照圖19)。
[比較例4]
除使用人類乳腺源癌細胞(理研BRC製造)代替人類肝癌細胞(Primary Cell公司製造)以外，以與比較例3相同之方式培養人類乳腺源癌細胞後，細胞以單層之狀態增殖而未形成細胞集合塊(參照圖20)。
[鹼性磷酸酶活性]
於實施例4之細胞集合塊及比較例4之培養細胞中添加4質量%之三聚甲醛-磷酸緩衝液並進行5分鐘之處理後，使用TBS緩衝液及TBST緩衝液清洗乾淨。其次，添加BM Purple AP基質(Roche公司製造)並於37℃下反應1小時後，使用TBST緩衝液清洗乾淨。將評價結果示於圖21A及圖21B。自圖21A及圖21B可知，實施例4之細胞集合塊之鹼性磷酸酶活性為陽性，比較例4之培養細胞之鹼性磷酸酶活性為陰性。
[基因表現]
使用Lightcycler 480-II(Roche公司製造)並利用PCR法測定實施例4之細胞集合塊及比較例4之培養細胞之基因表現。將評價結果示於圖22。自圖22可知，實施例4之細胞集合塊之VEGF-A(Vascular endothelial growth factor-A，血管內皮生長因子-A)之基因表現大於比較例4之培養細胞。再者，使用GAPDH作為內部標準。
本國際申請案係基於2010年12月13日提出申請之日本專利申請案2010-277394及2011年12月2日提出申請之日本專利申請案2011-265210，並對其主張優先權者，且將日本專利申請案2010-277394及日本專利申請案2011-265210之全部內容引用於本國際申請案中。
C．．．黏著性細胞
C'．．．細胞集合塊
D．．．培養容器
M．．．培養基
圖1A係表示形成本發明之細胞集合塊之方法的一例之圖(其1)。
圖1B係表示形成本發明之細胞集合塊之方法的一例之圖(其2)。
圖2A係表示實施例1之細胞集合塊(培養2日之情形時)之光學顯微鏡照片。
圖2B係表示實施例1之細胞集合塊(培養5日之情形時)之光學顯微鏡照片。
圖3係表示比較例1之培養細胞(培養5日之情形時)之光學顯微鏡照片。
圖4A係表示實施例1之細胞集合塊之鹼性磷酸酶活性的評價結果之光學顯微鏡照片。
圖4B係表示比較例1之培養細胞之鹼性磷酸酶活性的評價結果之光學顯微鏡照片。
圖5係表示實施例1之細胞集合塊之免疫雙重染色的評價結果(其1)之螢光顯微鏡照片。
圖6係表示實施例1之細胞集合塊之免疫雙重染色的評價結果(其2)之螢光顯微鏡照片。
圖7係表示實施例1之細胞集合塊之免疫雙重染色的評價結果(其3)之螢光顯微鏡照片。
圖8係表示實施例1之細胞集合塊之免疫雙重染色的評價結果(其4)之螢光顯微鏡照片。
圖9係表示實施例2-1之細胞集合塊(培養2日之情形時)之光學顯微鏡照片。
圖10係表示實施例2-2之細胞集合塊(培養7日之情形時)之光學顯微鏡照片。
圖11係表示實施例2-3之細胞集合塊(培養7日之情形時)之光學顯微鏡照片。
圖12係表示比較例2之培養細胞(培養7日之情形時)之光學顯微鏡照片。
圖13係表示實施例2-2之細胞集合塊之免疫染色的評價結果之照片。
圖14係表示實施例3之細胞集合塊(培養11日之情形時)之光學顯微鏡照片。
圖15係表示比較例3之培養細胞(培養11日之情形時)之光學顯微鏡照片。
圖16係表示實施例3之細胞集合塊及比較例3之培養細胞的白蛋白之產生量之評價結果之圖。
圖17係表示實施例3之細胞集合塊及比較例3之培養細胞的CYP1A1之活性之評價結果之圖。
圖18係表示實施例3之細胞集合塊及比較例3之培養細胞的基因表現之評價結果之圖。
圖19係表示實施例4之細胞集合塊(培養8日之情形時)之光學顯微鏡照片。
圖20係表示比較例4之培養細胞(培養8日之情形時)之光學顯微鏡照片。
圖21A係表示實施例4之細胞集合塊之鹼性磷酸酶活性的評價結果之光學顯微鏡照片。
圖21B係表示比較例4之培養細胞之鹼性磷酸酶活性的評價結果之光學顯微鏡照片。
圖22係表示實施例4之細胞集合塊及比較例4之培養細胞的基因表現之評價結果之圖。
C．．．黏著性細胞
D．．．培養容器
M．．．培養基

Claims (11)

  1. 一種細胞集合塊之形成方法，其特徵在於：其係使用培養容器培養黏著性細胞而形成細胞集合塊者，上述培養容器於表面附近存在胺基、羧基及/或羥基、與通式 (式中，R1、R2及R3分別獨立為碳數1以上6以下之烷基，m為2以上6以下之整數)所表示之基，且上述培養容器係藉由於表面附近存在羧基、胺基及羥基之容器中，使具有對於羧基、胺基或羥基具有反應性之基、及上述通式所表示之基、且分子量為225以上、650以下之化合物進行反應而製造。
  2. 如請求項1之細胞集合塊之形成方法，其中上述表面附近存在羧基、胺基及羥基之容器係藉由於含有氧、臭氧及/或水蒸氣、與氨及/或氮之環境下進行電漿處理而製造。
  3. 一種細胞集合塊之形成方法，其特徵在於：其係使用培養容器培養黏著性細胞而形成細胞集合塊者，上述培養容器於表面附近存在胺基、羧基及/或羥基、 與通式 (式中，R1、R2及R3分別獨立為碳數1以上6以下之烷基，m為2以上6以下之整數)所表示之基，且上述培養容器係藉由如下方法製造：於表面附近存在可藉由水解而生成矽烷醇基之基、矽烷醇基、來自半金屬氧化物之羥基及/或來自金屬氧化物之羥基的容器中，使具有可藉由水解而生成矽烷醇基之基及上述通式所表示之基、且分子量為315以上、650以下之第一化合物，與具有胺基、可藉由水解而生成羧基之基及/或可藉由水解而生成羥基之基、及可藉由水解而生成矽烷醇基之基的第二化合物進行反應。
  4. 一種細胞集合塊之形成方法，其特徵在於：其係使用培養容器培養黏著性細胞而形成細胞集合塊者，上述培養容器於表面附近存在胺基、羧基及/或羥基、與通式 (式中，R1、R2及R3分別獨立為碳數1以上6以下之烷基，m為2以上6以下之整數)所表示之基，且上述培養容器於表面形成有含有具有胺基、羧基及/或羥基、及上述通式所表示之基的樹脂之層。
  5. 一種物質之篩選方法，其特徵在於包括：使用如請求項1至4中任一項之細胞集合塊之形成方法而形成細胞集合塊之步驟，及使用該細胞集合塊篩選物質之步驟。
  6. 一種細胞之功能探索方法，其特徵在於包括：使用如請求項1至4中任一項之細胞集合塊之形成方法而形成細胞集合塊之步驟，及使用該細胞集合塊探索細胞之功能之步驟。
  7. 一種容器之製造方法，其係製造於表面附近存在胺基、羧基及/或羥基、與下述通式所表示之基的容器者；該製造方法包含：於表面附近存在有羧基、胺基及羥基之容器中，使化合物反應，該化合物具有對羧基、胺基或羥基具有反應性之基、及通式 (式中，R1、R2及R3分別獨立為碳數1以上6以下之烷基，m為2以上6以下之整數)所表示之基，且分子量為225以上、650以下。
  8. 如請求項7之容器之製造方法，其係進一步包含：於含有氧、臭氧及/或水蒸氣、與氨及/或氮之環境下進行電漿處理。
  9. 一種容器之製造方法，其係製造於表面附近存在胺基、羧基及/或羥基、與下述通式所表示之基的容器者；該製造方法包含：於表面附近存在可藉由水解而生成矽烷醇基之基、矽烷醇基、來自半金屬氧化物之羥基及/或來自金屬氧化物之羥基的容器中，使第一化合物與第二化合物進行反應，該第一化合物具有可藉由水解而生成矽烷醇基之基、及通式 (式中，R1、R2及R3分別獨立為碳數1以上6以下之烷基，m為2以上6以下之整數)所表示之基，且分子量為315以上、650以下，該第二化合物具有胺基、可藉由水解而生成羧基之基及/或可藉由水解而生成羥基之基、及可藉由水解而生成 矽烷醇基之基。
  10. 一種容器之製造方法，其係包含：於容器表面形成有含有具有胺基、羧基及/或羥基、及通式 (式中，R1、R2及R3分別獨立為碳數1以上6以下之烷基，m為2以上6以下之整數)所表示之基的樹脂之層。
  11. 一種容器，其係藉由如請求項7至10中任一項之容器之製造方法所製造者。
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