JP2016025871A - 細胞凝集塊形成用培養容器 - Google Patents

Abstract

【課題】効率よく、容易に質の高い細胞凝集塊を形成することができ、かつ、その場で細胞凝集塊を移し換えることなく細胞機能を評価することを可能にする胞凝集塊培養容器を提供する。【解決手段】２個以上のウェルを有する細胞凝集塊形成用培養容器であって、該ウェルが遮光性部材で形成され、ウェルの内面が細胞非接着化処理を施されてなることを特徴とする細胞凝集塊形成用培養容器である。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞凝集塊を簡便に形成させるための培養容器であり、かつ遮光性を有する培養容器に関するものである。

細胞凝集塊の形成技術は、当初、肝実質細胞の高度な機能維持のための培養方法として開発された。この方法は、肝実質細胞が一般的な単層培養においては、１、２日で本来の肝機能を消失するのに対し、肝実質細胞同士で凝集塊を形成する条件で培養すると、細胞同士が凝集塊を形成した上に組織化を生じることにより、長期にわたりその機能を保持することが知られている。例えば、プロテオグリカンコートによる肝細胞凝集塊の培養により２週間以上肝機能が維持された例（非特許文献１）がある。

つぎにがん細胞に細胞凝集塊の形成技術が活用された。この場合は、凝集塊を形成する条件で培養すると、がん細胞同士が組織化を生じ、あたかもがん組織のような挙動をとることが観察され、抗がん剤のスクリーニングへの応用が期待されている（特許文献１）。

近年、細胞そのものまたは細胞から分泌された蛋白質などの成分を発光・蛍光測定し細胞機能を評価する分析法が一般的になっている。
例えば、凝集塊を形成した癌細胞のＡＴＰ活性をルシフェラーゼによって測定する方法や、細胞凝集塊を形成させた後、表面分子を蛍光標識し蛍光観察により測定する方法が良く利用されている。

いずれの場合も、以下の２ステップを必要とする。
（１）細胞凝集塊を形成させる。
（２）蛍光・発光で細胞機能を測定する。
現在、市販されている凝集塊形成用プレートは、基材表面を疎水性もしくは超親水性処理し、基材表面への細胞接着を抑制することで、細胞同士の相互作用により凝集塊を形成させる方法が一般的であり、かつ細胞観察が可能なようにすべて透明樹脂で成形されたものである。しかしながら透明なプレートでの発光、蛍光の分析においては、容器が透明であるがゆえに隣接するウェルからの発光、蛍光の光が漏れ、それにより正しい測定値を得ることが困難であった。

したがって、発光、蛍光観察を行う場合には、市販の白色や黒色プレートに移し変えることが必要である。この場合、細胞凝集塊を移し換える操作が必要となるが、細胞凝集塊が不安定である場合、ピペットやディスペンサーによる移し換え操作において凝集塊が崩壊する、もしくは凝集塊が移し換えのために使用するピペットやディスペンサーに吸着されてしまう、という問題点が生じる。特に、がん細胞の場合は、細胞同士の接着性の乏しい細胞が多く、多くの場合、ガン細胞の凝集塊が移し換え操作において単細胞分散と同じ状態に陥ってしまう。

特開２００８−２２７４３号公報

Ｎ．Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１８６，ｐ２２７（１９９０）

本発明は、効率よく、容易に質の高い細胞凝集塊を形成することができ、かつ、その場で細胞凝集塊を移し換えることなく細胞機能を評価することを可能にする胞凝集塊培養容器を提供することを目的としている。

そこで、本発明者等が鋭意検討した結果、２個以上のウェルを有する培養容器において、各ウェルの内面を細胞非接着処理し、かつ、当該ウェルの部分を遮光性部材で形成することにより、上記目的を達成することができることを見出して、本発明を完成させた。
すなわち、
このような目的は、下記（１）〜（６）に記載の本発明により達成される。
（１）２個以上のウェルを有する細胞凝集塊形成用培養容器であって、
該ウェルが遮光性部材で形成され、
ウェルの内面が細胞非接着化処理を施されてなることを特徴とする
細胞凝集塊形成用培養容器。
（２）前記遮光性部材が、着色樹脂で構成されているものである（１）記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
（３）前記着色樹脂が、白色樹脂である（２）記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
（４）細胞凝集塊を形成させるための細胞非接着化処理が、表面親水化処理である請求項（１）〜（３）いずれか記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
（５）ウェルの側壁内面が底内面に向かって縮径する部分を有するものである（１）〜（４）いずれか記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
（６）縮径する部分が、円錐状又は半球状であることを特徴とする（５）記載の細胞凝集塊形成用培養容器。

本発明によれば、種々の細胞から、効率よく、容易に細胞凝集塊を形成することができ、かつ、その場で細胞凝集塊を移し換えることなく細胞機能を評価することを可能にする細胞凝集塊培養容器が提供される。

図１は、培養ウェル断面形状を示す。 図２は、培養ウェル断面形状を示す。 図３は、隣接するウェルへの光の漏れの測定結果を示すグラフである。

本発明の培養容器において重要な点は、図１の（ａ）から（ｃ）および図２にて示したように、ラウンドボトムやＶボトムと呼ばれる側面が底面に向かって縮径し、縮径部分が半球若しくは円錐状のマルチウェルプレートを使用すると１ウェルに１個の細胞凝集塊が均一な大きさで形成されることであり、これにより細胞凝集塊の評価・研究に好適に用いることができることにある。図１（ａ）ではウェルの底面が半球状である態様を示し、図１（ｂ）ではウェルの底面が円錐状である態様を示し、図１（ｃ）ではウェルの底面が円錐状であり、かつ、その最下部が平面である態様を示す。また、図２では、後述するように、垂直方向における断面が略Ｕ字形状の底部、及び、略円形の開口部を有するウェルを有し、かつ、当該各ウェルの底部内面が所定の形状を有する態様を示す。このように縮径部分を円錐状、半球状になるようにウェルを形成することにより、細胞をウェルに播種した際に、細胞自身の自重により容器底面に集合し細胞凝集塊を形成しやすくなる。

本発明の培養容器は、樹脂製の材料で成形することができる。この樹脂材料は、上記培養容器をディスポーザルタイプにすることができるのに加え、種々の形状を容易に成形することができる。上記樹脂材料としては、例えば、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、エチレン-プロピレン共重合体等のポリオレフィン系樹脂または環状ポリオレフィン系樹脂、ポリスチレン、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン系樹脂等のポリスチレン系樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂等のメタクリル系樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリブチレンテレフタレート樹脂、ポリアリレート樹脂、ポリサルホン樹脂、ポリエーテルサルホン樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂、ポリエーテルイミド樹脂、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂、ポリメチルペンテン樹脂、ポリアクリロニトリル等のアクリル系樹脂、プロピオネート樹脂等の繊維素系樹脂等が挙げられる。これらの中でも培養容器に求められる成形性、滅菌性の点においてポリスチレン樹脂が特に好ましい。

上記樹脂材料から本発明の培養容器を製造する場合、例えば射出成形、ブロー成形、インジェクションブロー成形により、製造することができる。
本発明の細胞培養容器の形態としては、例えば、マルチウェルプレートおよびシャーレ（ディッシュ）、フラスコ等の容器類が挙げられ、更にシート状の成形品であっても、容器底面等の細胞が培養できる環境下に設置して使用することができる。これらの中でも、バイオリアクターの生成または薬効や毒物の評価、人工臓器の開発研究等で用いられる６〜３８４穴のマルチウェルプレートやシャーレが好ましい。これにより、細胞凝集塊を用いた評価、研究の精度を向上させることができる。

発光または蛍光現象を用いた標識物質を測定するために、培養容器のウェル間を遮光し、発光または蛍光が隣接するウェルに漏れないようにするための方法としては、着色樹脂で成形する方法、透明樹脂で成形した後、容器を不透過性塗料等で塗装する方法、同じく鍍金や蒸着により金属皮膜を形成し不透過性を付与する方法などが挙げられるが、着色樹脂材料を用いる方法が最も簡便である。
透明樹脂に顔料を加えて混練、成形しても、透明樹脂に顔料を混練した成形樹脂材料を用いて成形することもできる。顔料の分散性を考えると顔料を混練した成形樹脂材料を用いて成形することが好ましい。

使用する顔料は特に指定するものではないが、白色の場合は酸化チタン、黒色の場合はカーボンブラックを用いることが好ましい。
どちらも顔料の含有量が高いほど、遮光性は向上するが、樹脂成形品としての強度が低下する。従って、酸化チタンの場合は７〜１５％含有量、カーボンブラックの場合は３〜１０％の含有量が好ましい。
前記遮光の程度は、隣接するウェルへの光透過率が少なければ少ないほど良く、１％以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．１％以下であり、最も好ましくは０．０１％以下である。
発光または蛍光現象を用いた標識物質の測定において、測定感度を重視する場合は、白色顔料を使用することが好ましい。黒色顔料使用の場合、バックグランド値は安定するが、測定感度は、同条件で測定した白色顔料を用いた培養容器に比べ低くなる傾向にあり、微量な検体測定においては白色顔料を使用することがより好ましい。
また、白色顔料を使用した培養容器では、細胞凝集塊の状態の確認や、培養液の有無の確認などにおいて黒色顔料を使用した培養容器に比べてより確認がしやすいといった効果がある。

特に、図２に示したようなウェルを有する培養容器においては、各ウェルの底部内面の曲率半径（Ｒ'）を３．０ｍｍ以下とすることにより細胞同士が充分な密度で集まる為、前述の効果を得ることができるため、好ましい。
また、底部内面の曲率半径（Ｒ'）が３．０ｍｍ以上である従来の培養容器に比べて、ウェル形状が底部（２）に向けて細くなるため、底部（２）から同じ高さで培地を吸引した場合の培地交換効率（培地全体量に対する吸引除去する培地量の割合）に優れる点も本発明の大きな特徴の一つである。

更に、曲率半径（Ｒ'）を１．０ｍｍ以上とすることにより、培養時に発生する死細胞が底面への凝集が高密度になりすぎることなく倒立顕微鏡による顕鏡性に優れる為、ウェル内の細胞または胚様体の観察を正確に行うことができる。

また、前述の略円形の開口部（３）の直径を４．０ｍｍ以上とすることでマルチディスペンサーを使用する場合の操作性に優れ、１１．０ｍｍ以下とすることで培養容器１枚あたり４８個以上の複数のウェルを設けることができる。

ウェル（１）の容量は８０μＬ以上、５００μＬ以下であることが好ましい。こうすることで、１ウェルあたり１個の細胞、例えばヒトＥＳ細胞の胚様（ＥＢ）体を形成するに必要充分な量の培地を添加することができる。
より好ましくは８０μＬ以上、２００μＬ以下である。こうすることで、培地や試薬の使用量を減らすことができる。

図２に示すように、上記培養ウェル（１）の側面の稜線を上記培養ウェルの底部（２）を越えて延長した直線（ａ）と、上記開口部（３）の中心から垂直に前記培養ウェルの底部（２）を越えて延長した直線（ｂ）と、が交差する角度（θ）が４°以上、３０°以下であることが好ましい。こうすることで、培地中の細胞がより底部（２）に集まりやすくなり、更に培地交換の際のディスペンサーチップ操作も容易となる。より好ましくは、５°以上、１５°以下である。こうすることで略Ｕ字形状の底部（２）と側面がよりなだらかにつながる形状となり培地中の細胞が更に集まりやすくなり、より良好な形状のＥＢ体を形成させることができる。

また、本発明においては、細胞非接着化処理が、基材表面の親水化処理であることが好ましい。ここで言うところの表面親水化処理には以下の処理方法がある。
（１）水溶性樹脂の培養容器内面での架橋固定
（２）親水性樹脂による表面塗布

まず、（１）の方法について詳しく述べる。
この方法は、水溶性樹脂を培養容器内面に被覆させて架橋し水溶性被覆層を形成する水溶性樹脂被覆層を形成させることを特徴とする。
ここで言う水溶性樹脂とは、水分子とのイオンもしくは水素結合により水和し、その結果として水に溶解するものであり、言い換えれば、水溶性樹脂とは水に溶解するために分子内の主鎖に対して必要充分な量のイオン性もしくは極性の側鎖を持つ樹脂である。なお、ここで水溶性樹脂とは、２５℃の水１００ｇに対して１．０ｇ以上溶解可能なものをいう。

上記水溶性樹脂としては、例えば、ポリ酢酸ビニルのケン化物、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、ポリペンタエリスリトールトリアクリレート、ポリペンタエリスリトールテトラアクリレート、ポリジエチレングリコールジアクリレート、およびそれらを構成するモノマー同士の共重合体、また２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと他のモノマー（例えばブチルメタクリレート等）との共重合体等が挙げられる。これらの中でもポリ酢酸ビニルのケン化物、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールの中から選ばれる１種以上と上記反応基からなる構造が好ましい。これにより、種々の細胞に対する刺激を抑制し、細胞凝集塊の形成速度、形成率、および形成した細胞凝集塊の質を向上することができる。

ここで、ポリ酢酸ビニルのケン化物とは、例えば、ポリビニルアルコールまたはビニルアルコールと他の化合物との共重合体をいう。さらには、例えば、ビニルアルコールと、親水基変性、疎水基変性、アニオン変性、カチオン変性、アミド基変性またはアセトアセチル基のような反応基変性させた変性酢酸ビニルのケン化物等も含まれる。

また、前記水溶性樹脂として重合体を用いる場合、その平均重合度は、特に限定されないが、１００〜１０，０００が好ましく、特に２００〜５，０００が好ましい。平均重合度が前記下限値未満であると細胞培養容器の表面に均一に皮膜を成形するのが困難となる場合があり、前記上限値を超えると前記水溶性樹脂の粘度が高くなり作業性が低下する場合がある。

また、上記ポリ酢酸ビニルのケン化物を用いる場合、上記ポリ酢酸ビニルのケン化物のケン化度は特に限定されないが、該ポリ酢酸ビニル全体の２０ｍｏｌ％以上、１００ｍｏｌ％以下が好ましく、特に５０ｍｏｌ％以上、９５ｍｏｌ％以下が好ましい。

このような水溶性樹脂としては、例えば下記式（Ｉａ）または（Ｉｂ）で表される構成単位を含むものが好ましい。これにより、実用的な３００〜５００ｎｍの波長で均一な皮膜が形成する事ができ、細胞の接着量を低減し、細胞凝集塊形成効果を低減する効果を特に向上することができる。

前記水溶性樹脂の式（Ｉａ）または（Ｉｂ）で表されるＲはカルボニルとアミンを有するアルキル基であれば特に限定するものではないが、例えば下記式（ＩＩ）で表されるものが好ましい。これにより前記極性の側鎖の合成が容易におこなえる。
細胞培養容器を、水溶性樹脂に浸漬する際、水溶性樹脂を溶媒に溶解した状態で浸漬することが好ましく、その際に使用する溶媒は水もしくは溶解度を高めるために水と有機溶媒の混合物を使用することができる。

例えば、前記式（Ｉａ）または（Ｉｂ）で示される水溶性樹脂を使用する場合には、５ないし４０容量％のアルコール水溶液を前記溶媒に使用することで、水溶性樹脂の溶解性が高くなり、均一な被覆層を形成することができる。
溶解する水溶性樹脂の濃度は０．０１ないし３０重量％が好ましく、特に０．１ないし１０重量％が好ましい。
ここで水溶性樹脂の濃度が低すぎても、高すぎても、均一な被覆層が得られず、充分な細胞の接着低減効果が得られず良好な細胞凝集塊が形成されない。

上記水溶性樹脂を用いた被覆層の厚みとしては、１００ｎｍ以上５，０００ｎｍ以下が好ましく、１５０以上１，０００ｎｍ以下がより好ましい。被覆層の厚みを上記下限値以上にすることにより細胞が基材から受ける物理的な刺激をより抑えることができ、厚みを上記上限値以下とすることにより被覆層に取り込まれるたんぱく質の量を少なくし、たんぱく質を介した細胞の接着を抑えることが出来るため、細胞凝集塊形成率を更に向上させることができる。

上記水溶性樹脂を培養容器内面に被覆させる方法としては、例えば、スピンコート、ディッピング、または上記水溶性樹脂溶液を培養容器内面に分注した後、容器を傾けて溶液を排出する方法を用いることができる。この様な方法で培養容器内面に水溶性樹脂を接触させた後、培養容器内面に残留した水溶性樹脂溶液を乾燥させることで水溶性樹脂被覆層を形成することができる。

本発明の製造方法においては、上記工程後に、上記水溶性樹脂被覆層を硬化させて非水溶性硬化皮膜層に変性する非水溶性硬化皮膜変性工程を有することを特徴とする。
上記水溶性樹脂被覆層を非水溶性硬化皮膜層とすることで、密度の高いイオン性もしくは極性の側鎖を持つ表面を構築することができる。この表面に構築されたイオン性もしくは極性の側鎖は、培養液と接触した際に、静電相互作用もしくは水素結合により水分子と水和し、培養容器表面は実質的に水分子の密な水和層となり、この水和層は細胞に対する基材表面からの刺激を抑制し、質的に良好な細胞凝集塊が迅速に形成されることとなる。こうすることで、培養液を接触させた際に、水溶性樹脂の被覆層が溶解、遊離することを防ぎ、培養容器として必要な耐水性を獲得することができる。

上記水溶性樹脂被覆層を硬化させる方法は、特に限定するものではなく、水溶性樹脂の側鎖に、硬化させるための官能基、例えば放射線反応性、感光性、熱反応性の官能基を有する水溶性樹脂を導入し、この部分を硬化させることで可能となる。例えば、感光性の官能基であれば、ジアゾ基、アジド基、シンモナイル基等が挙げられ、また、熱反応性および放射線反応性の官能基であれば、ビニル基、エポキシ基等を挙げることができる。これらの中でも硬化処理を迅速におこなうことができ、簡易な設備で硬化させることができる感光性の官能基を有する水溶性樹脂が特に好ましい。

上記感光性の官能基としては、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）に示したように、アジド基を含む官能基が特に好ましい。これを用いることにより、実用的な２３０〜５００ｎｍの波長で反応させることができ、更に優れた解像性により皮膜の形成性を向上することができる。このように、表面に予め水溶性樹脂被覆層を形成し、該被覆層を硬化させて非水溶性硬化皮膜層に変性する工程によって上記の厚みの被覆層と同等の厚みの皮膜層を得ることができる。

水溶性樹脂を使用するもう一つの利点としては、硬化後に表面を水で洗浄することで、未反応の樹脂を容易に洗い流すことができるという点である。もし、硬化反応性が悪い等の原因で溶出物が確認された場合は、硬化後に洗浄工程を入れることにより、溶出物を低減し、更に良好な細胞凝集塊生成率を得ることができる。

次に、（２）の方法について述べる。
塗布する親水性樹脂としては、ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ−ＨＥＭＡ）、ホスホリルコリン基含有高分子化合物、ポリエチレングリコール鎖含有高分子化合物等があるが、特にこれらに限定する物ではない。

例えば、ポリ−ＨＥＭＡの２％エタノール溶液を、容器内に１００μＬ分注しエタノールを蒸発させ容器表面にポリ−ＨＥＭＡの層を形成させることができる。蒸発後、超純水や緩衝液で洗浄することで、容器表面に吸着していない余分なポリ−ＨＥＭＡ分子を除去することができる。
（１）の方法に比べ、（２）の方法は表面の親水化が高分子化合物の容器表面への吸着現象だけであるので効果は弱いが、方法が簡便であることが利点である。

培養容器の必須条件である滅菌に関しては、例えば、エチレンオキサイドガス滅菌、乾熱滅菌、蒸気滅菌、放射線滅菌等が挙げられるが、γ線あるいは電子線を用いた放射線滅菌が好ましく、大量生産を行う場合は放射線透過性の点でγ線滅菌が特に好ましい。
放射線の吸収線量については特に限定するものではないが、吸収線量が低すぎると滅菌性は確保されず、高すぎると細胞培養容器および被覆層が劣化してしまう場合がある。

前記のようにして作製された培養容器は、以下の特徴を有する。
基材表面が細胞非接着処理された円錐状、または半球状であるので細胞が底部に集まり易く、細胞凝集塊を形成しやすい。
また、形成した細胞凝集塊をそのままのプレートで蛍光、発光測定に用いることが可能である。

以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

（実施例１）
樹脂材料としてポリスチレン樹脂(ＰＳジャパン社製、ＨＦ７７)に白色色素、チタンホワイト顔料（住化カラー製）を混合した樹脂を用いて、射出成形により９６ウェルマルチウェルプレートを成形した。各ウェルの形状は、図２に示したとおりであり、曲率半径Ｒ'が２．０ｍｍ，２．６ｍｍおよび３．２ｍｍ、角度θが８５°であった。得られたプレートにプラズマ処理装置（ＢＲＡＮＳＯＮ／ＩＰＣ社製 ＳＥＲＩＥＳ７０００）を用いてプラズマ処理（酸素プラズマ１０分）を行い、前処理としてプレート表面に濡れ性を付与した。

次に、水溶性樹脂として側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（東洋合成工業社製 ＡＷＰ：式（Ｉａ）の化合物（ｎ＝３）、水溶性樹脂の平均重合度１６００、感光基の導入率０．６５ｍｏｌ％）を着色樹脂にて遮光したポリプロプレン容器中で、２５容量％エタノール水溶液に溶解し、０．３重量％の溶液を調整した。

上述のプレートに、自動分注機（ＢｉｏＴｅｃ社製、オートセラウォッシャーＡＭＷ−９６ＳＩＩ）を使用し、１ウェルにつき３００μＬの前述の水溶性樹脂溶液を加え、１分間浸漬した後、プレートを裏返して溶液を充分廃棄し、２５℃で１７時間一次乾燥した後、ＵＶランプで２５０ｎｍのＵＶ光を２．０ｍＷ／ｃｍ^２×３０秒間照射して水溶性樹脂を硬化した後、超純水で３回繰り返し洗浄し、乾燥後、γ線を吸収線量５．８ｋＧｙで照射（ラジエ工業株式会社）して、本発明の培養容器（プレート）を得た。

得られた容器について、以下の評価を行った。
（１）ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞）を用いた凝集塊（スフェロイド）形成の検討
ＨｅｐＧ２細胞を培養液（ダルベッコ改変ＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清）に１×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で分散させた細胞懸濁液を調製し、前述のプレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下にて３日間培養した。
３日後各ウェルについて、凝集塊が形成されていることを顕微鏡下で確認した。
具体的には、着色プレートであるので通常細胞観察に用いられる位相差倒立顕微鏡での観察は不可能であるので、光学顕微鏡下に培養容器を置き、上面より光を投光し、容器上面より細胞の状態を観察し、凝集塊がもれなく形成されていることを確認した。

（実施例２）
（２）隣接するウェルへの光透過性の測定
隣接するウェルへの光透過性の評価は以下の方法で実施した。
ある特定のウェルで化学発光させ、そのウェルに隣接するすべてのウェルで計測されたフォトン数の平均を光の漏れとみなし、化学発光させたウェルで計測されたフォトン数に対する割合で光の漏れを評価した。具体的な方法は以下の通りである。

アルカリホスファターゼ標識ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体（以下ＡＬＰ抗体と略、インビトロジェン社製、６５−６１２２）を炭酸緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３・１５ｍＭ、ＮａＨＣＯ３・３５ｍＭ、ＮａＮ３・０．０２％）で２０００倍希釈する。
前記ＡＬＰ抗体希釈液１ｍＬを容量４ｍＬのセラムチューブ（住友ベークライト製、ＭＳ−４６０４Ｗ）に入れ、チューブ全体をアルミホイルで覆い遮光する。
前記チューブ内に発光基質液Ｌｕｍｉｐｈｏｓ５３０（Ｌｕｍｉｇｅｎ社製、和光純薬５３７−２４６６２）を２ｍＬ加え、３７℃の恒温層で３０分、静置してＡＬＰと発光基質を反応させる。反応後、恒温層から出し、遮光下で１時間静置させる。
あらかじめ発光バックグランド値を測定しておいた容器のウェルにＡＬＰ抗体−基質反応液を２００μＬ分注する。
発光測定プレートリーダー（ベルトールド社製、ＭＩＣＲＯＬＵＭＡＴ ＬＢ９６Ｄ）ですべてのウェルの発光を測定し、光の漏れを透過率として測定する。

透過率は以下の式で求める。
透過率（％）＝（反応試薬を入れたウェルのフォトン数―バックグランドのフォトン数）／（隣接するウェルのフォトン数―バックグランドのフォトン数）×１００

測定結果の一例を図３に示す。Ｓ−４の４のウェルにＡＬＰ抗体−基質反応液２００μＬを分注、発光測定でフォトン数を測定したものである。図３より、反応液を入れたウェルの直近のウェルでも少ないながらもフォトンが検出され光の漏れが発生していることが観察できるが、その光の透過率は、最大で０．００８８％、最小で０．００２５％であり、その平均値は、０．００５５％であり、光の漏れが抑制されていることが良くわかる。

本発明の細胞凝集塊作成用培養容器を用いることで、細胞機能を維持した培養が可能であり、さらに機能細胞を用いたアッセイにも使用可能である。

そこで、本発明者等が鋭意検討した結果、２個以上のウェルを有する培養容器において、各ウェルの内面を細胞非接着処理し、かつ、当該ウェルの部分を遮光性部材で形成することにより、上記目的を達成することができることを見出して、本発明を完成させた。
すなわち、
このような目的は、下記（１）〜（８）に記載の本発明により達成される。
（１）２個以上のウェルを有する細胞凝集塊形成用培養容器であって、
当該細胞凝集塊形成用培養容器がＥＳ細胞の胚様体を形成するためのものであり、
該ウェルが遮光性部材で形成され、ウェルの内面が細胞非接着化処理を施されてなり、
前記ウェルは、隣接する他のウェルへの光透過率が１％以下であることを特徴とする細胞凝集塊形成用培養容器。
（２）前記遮光性部材が、着色樹脂で構成されているものである（１）記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
（３）前記着色樹脂が、白色樹脂である（２）記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
（４）細胞凝集塊を形成させるための細胞非接着化処理が、表面親水化処理である請求項（１）〜（３）いずれか記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
（５）前記表面親水化処理は、下記式（Ｉａ）または（Ｉｂ）で表される化合物を用いて行われることを特徴とする（４）に記載の細胞凝集塊形成用培養容器。

（６）ウェルの側壁内面が底内面に向かって縮径する部分を有するものである（１）〜（５）いずれか記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
（７）縮径する部分が、円錐状又は半球状であることを特徴とする（６）記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
（８）前記ウェルが、垂直方向における断面が略Ｕ字形状の底部及び、略円形の開口部を有し、かつ、前記底部内面の少なくとも曲面部分が親水性樹脂層を備えていると共に、前記底部内面の曲率半径（Ｒ）が、１．０ｍｍ以上、３．０ｍｍ以下であることを特徴とする（４）または（５）に記載の細胞凝集塊形成用培養容器。

前記のようにして作製された培養容器は、以下の特徴を有する。
基材表面が細胞非接着処理された円錐状、または半球状であるので細胞が底部に集まり易く、細胞凝集塊を形成しやすい。
また、形成した細胞凝集塊をそのままのプレートで蛍光、発光測定に用いることが可能である。
以下、参考形態の例を示す。
１．２個以上のウェルを有する細胞凝集塊形成用培養容器であって、
該ウェルが遮光性部材で形成され、ウェルの内面が細胞非接着化処理を施されてなることを特徴とする細胞凝集塊形成用培養容器。
２．前記遮光性部材が、着色樹脂で構成されているものである１．記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
３．前記着色樹脂が、白色樹脂である２．記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
４．細胞凝集塊を形成させるための細胞非接着化処理が、表面親水化処理である１．〜３．いずれか記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
５．前記表面親水化処理は、下記式（Ｉａ）または（Ｉｂ）で表される化合物を用いて行われることを特徴とする４．に記載の細胞凝集塊形成用培養容器。

６．ウェルの側壁内面が底内面に向かって縮径する部分を有するものである１．〜５．いずれか記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
７．縮径する部分が、円錐状又は半球状であることを特徴とする６．記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
８．前記ウェルが、垂直方向における断面が略Ｕ字形状の底部及び、略円形の開口部を有し、かつ、前記底部内面の少なくとも曲面部分が親水性樹脂層を備えていると共に、前記底部内面の曲率半径（Ｒ）が、１．０ｍｍ以上、３．０ｍｍ以下であることを特徴とする４．または５．に記載の細胞凝集塊形成用培養容器。

Claims (8)

1. ２個以上のウェルを有する細胞凝集塊形成用培養容器であって、
   該ウェルが遮光性部材で形成され、ウェルの内面が細胞非接着化処理を施されてなることを特徴とする細胞凝集塊形成用培養容器。
2. 前記遮光性部材が、着色樹脂で構成されているものである請求項１記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
3. 前記着色樹脂が、白色樹脂である請求項２記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
4. 細胞凝集塊を形成させるための細胞非接着化処理が、表面親水化処理である請求項１〜３いずれか記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
5. 前記表面親水化処理は、下記式（Ｉａ）または（Ｉｂ）で表される化合物を用いて行われることを特徴とする請求項４に記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
   

   

   
6. ウェルの側壁内面が底内面に向かって縮径する部分を有するものである請求項１〜５いずれか記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
7. 縮径する部分が、円錐状又は半球状であることを特徴とする請求項６記載の細胞凝集塊形成用培養容器。
8. 前記ウェルが、垂直方向における断面が略Ｕ字形状の底部及び、略円形の開口部を有し、かつ、前記底部内面の少なくとも曲面部分が親水性樹脂層を備えていると共に、前記底部内面の曲率半径（Ｒ）が、１．０ｍｍ以上、３．０ｍｍ以下であることを特徴とする請求項４または５に記載の細胞凝集塊形成用培養容器。

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