JP2003144140A - 唾液腺腺管上皮由来幹細胞及びその用途 - Google Patents
唾液腺腺管上皮由来幹細胞及びその用途Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 肝細胞へ分化可能な幹細胞を提供すること。
【解決手段】 唾液腺腺管上皮に由来し、生体外での培
養により、アルファフェトプロテイン陽性細胞、アルブ
ミン陽性細胞、アミラーゼ陽性細胞、インスリン陽性細
胞及びグルカゴン陽性細胞へ分化し得る幹細胞を提供し
た。 【効果】 本発明により、肝細胞へ分化可能な幹細胞が
初めて提供された。本発明の肝細胞は、肝臓のみなら
ず、膵臓や唾液腺のような複数の臓器細胞に分化可能で
ある。また、本発明の幹細胞は、成体からも調製するこ
とができる。しかも、唾液腺から細胞を調製すること
は、腹部や胸部にある内臓から細胞を調製する場合に比
べて、危険性及び患者の負担がはるかに小さい。このた
め、本発明の幹細胞は、移植を受ける患者自身から容易
に調製することができ、移植の際に問題となる拒絶反応
を容易かつ確実に回避することができる。
養により、アルファフェトプロテイン陽性細胞、アルブ
ミン陽性細胞、アミラーゼ陽性細胞、インスリン陽性細
胞及びグルカゴン陽性細胞へ分化し得る幹細胞を提供し
た。 【効果】 本発明により、肝細胞へ分化可能な幹細胞が
初めて提供された。本発明の肝細胞は、肝臓のみなら
ず、膵臓や唾液腺のような複数の臓器細胞に分化可能で
ある。また、本発明の幹細胞は、成体からも調製するこ
とができる。しかも、唾液腺から細胞を調製すること
は、腹部や胸部にある内臓から細胞を調製する場合に比
べて、危険性及び患者の負担がはるかに小さい。このた
め、本発明の幹細胞は、移植を受ける患者自身から容易
に調製することができ、移植の際に問題となる拒絶反応
を容易かつ確実に回避することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、唾液腺腺管上皮由
来幹細胞及びその臓器再生のための移植用細胞としての
用途に関する。
来幹細胞及びその臓器再生のための移植用細胞としての
用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】再生医療に有用なポテンシャルを有する
幹細胞についての研究が盛んになされている。今日まで
に報告された代表的な幹細胞として、間葉系細胞、神経
幹細胞、造血幹細胞、そして膵幹細胞が挙げられる。
幹細胞についての研究が盛んになされている。今日まで
に報告された代表的な幹細胞として、間葉系細胞、神経
幹細胞、造血幹細胞、そして膵幹細胞が挙げられる。
【０００３】間葉系幹細胞はヒト成体骨髄液より分離さ
れた(Pittenger, M. F. et al., Science 284, 143(199
9))。この細胞は脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞へのin vi
troに於ける分化誘導が可能である。神経幹細胞(Gage,
P.H., science 287, 1433-1438(2000))については１９
９２年に成体の中枢神経系からの最初の分離の報告がな
されており、2001年には成体の皮膚真皮から神経細胞に
分化可能な幹細胞の分離(Toma, J.G.et al., Nature Ce
ll Biology, 3, 778-784(2001))が報告されている。
れた(Pittenger, M. F. et al., Science 284, 143(199
9))。この細胞は脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞へのin vi
troに於ける分化誘導が可能である。神経幹細胞(Gage,
P.H., science 287, 1433-1438(2000))については１９
９２年に成体の中枢神経系からの最初の分離の報告がな
されており、2001年には成体の皮膚真皮から神経細胞に
分化可能な幹細胞の分離(Toma, J.G.et al., Nature Ce
ll Biology, 3, 778-784(2001))が報告されている。
【０００４】造血幹細胞は既に多くの研究がなされてい
るが、その分化機能について報告されたのは比較的新し
い。１９９９年に骨髄細胞が肝細胞に分化することがPe
tersenらによって明らかにされ(Petersen B.E. et al.,
Science 284, 1168(1999))、翌年にはマウス造血幹細
胞をc-kittil、Thy-llow、Linneg、Sca-1+にてsorting
した細胞分画が、幹細胞に分化転換することが示されて
いる(Lagasse, E. et al., Nature Medicine 6, 1229-1
234(2000))。この他にも造血幹細胞には分化転換能があ
ると考えられており、心筋(Orlic, D. et al., Nature
410, 701-705(2001))や、さらには肺胞上皮、腸管上
皮、皮膚(Orlic, D. et al.,上掲)への分化も報告され
ている。
るが、その分化機能について報告されたのは比較的新し
い。１９９９年に骨髄細胞が肝細胞に分化することがPe
tersenらによって明らかにされ(Petersen B.E. et al.,
Science 284, 1168(1999))、翌年にはマウス造血幹細
胞をc-kittil、Thy-llow、Linneg、Sca-1+にてsorting
した細胞分画が、幹細胞に分化転換することが示されて
いる(Lagasse, E. et al., Nature Medicine 6, 1229-1
234(2000))。この他にも造血幹細胞には分化転換能があ
ると考えられており、心筋(Orlic, D. et al., Nature
410, 701-705(2001))や、さらには肺胞上皮、腸管上
皮、皮膚(Orlic, D. et al.,上掲)への分化も報告され
ている。
【０００５】以上のように、間葉系もしくは外胚葉系の
細胞についての幹細胞研究は進んでいるが、内胚葉系幹
細胞の報告は未だ少ない。肝幹細胞についてはその存在
は確実視されているが、未だ確定的な幹細胞の報告はな
い。膵臓についてはCorneliusらのグループが成体マウ
ス膵臓より膵島産生幹細胞(islet producing stem cell
s (IPSCs)の分離を行っており、さらにIPSCsよりin vit
roにて作成した膵島の移植実験を報告している(Ramiya,
V.K. et al., Nature Medicine 6, 278-282(2000))。
この細胞についても、α、β、δ細胞への分化は確認さ
れているが、その他の細胞への分化能は確認されていな
い。膵島よりネスチン陽性にて分離した幹細胞が膵臓の
内、外分泌及び肝臓の表現型へと分化したとの報告はあ
るが(Zulewski, H. et al., Diabetes 50, 521-533(200
1)、分化マーカーの免疫組織学的検索は示されていな
い。
細胞についての幹細胞研究は進んでいるが、内胚葉系幹
細胞の報告は未だ少ない。肝幹細胞についてはその存在
は確実視されているが、未だ確定的な幹細胞の報告はな
い。膵臓についてはCorneliusらのグループが成体マウ
ス膵臓より膵島産生幹細胞(islet producing stem cell
s (IPSCs)の分離を行っており、さらにIPSCsよりin vit
roにて作成した膵島の移植実験を報告している(Ramiya,
V.K. et al., Nature Medicine 6, 278-282(2000))。
この細胞についても、α、β、δ細胞への分化は確認さ
れているが、その他の細胞への分化能は確認されていな
い。膵島よりネスチン陽性にて分離した幹細胞が膵臓の
内、外分泌及び肝臓の表現型へと分化したとの報告はあ
るが(Zulewski, H. et al., Diabetes 50, 521-533(200
1)、分化マーカーの免疫組織学的検索は示されていな
い。
【０００６】ES細胞（胚性幹細胞）から、肝臓もしくは
膵臓細胞の誘導も試みられており、実際に膵臓のα、β
細胞については分化誘導が可能である(Lumeisky, N, et
al., Science 292, 1389-1394(2001))。しかし肝細胞
への誘導については未だ報告はない。
膵臓細胞の誘導も試みられており、実際に膵臓のα、β
細胞については分化誘導が可能である(Lumeisky, N, et
al., Science 292, 1389-1394(2001))。しかし肝細胞
への誘導については未だ報告はない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】以上の通り、肝細胞へ
分化可能な幹細胞は未だ得られていない。従って、肝臓
を含む、複数の臓器細胞に分化可能な幹細胞も得られて
いない。また、幹細胞を、再生医療用途に用いる場合、
移植による拒絶反応を防止する観点から、患者自身の細
胞を移植することが最も好ましい。従って、成体からも
調製することが可能な幹細胞が得られれば再生医療にと
って特に有利である。
分化可能な幹細胞は未だ得られていない。従って、肝臓
を含む、複数の臓器細胞に分化可能な幹細胞も得られて
いない。また、幹細胞を、再生医療用途に用いる場合、
移植による拒絶反応を防止する観点から、患者自身の細
胞を移植することが最も好ましい。従って、成体からも
調製することが可能な幹細胞が得られれば再生医療にと
って特に有利である。
【０００８】本発明の目的は、肝細胞へ分化可能な幹細
胞を提供することである。また、本発明の目的は、肝臓
を含む、複数の臓器細胞に分化可能な幹細胞を提供する
ことである。さらに、本発明の目的は、成体からも調製
することができる、肝細胞へ分化可能な幹細胞を提供す
ることである。
胞を提供することである。また、本発明の目的は、肝臓
を含む、複数の臓器細胞に分化可能な幹細胞を提供する
ことである。さらに、本発明の目的は、成体からも調製
することができる、肝細胞へ分化可能な幹細胞を提供す
ることである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、唾液腺腺管上皮から、肝細胞、膵臓細胞及び
唾液腺細胞へ分化可能な幹細胞を分離することに成功
し、本発明を完成した。
究の結果、唾液腺腺管上皮から、肝細胞、膵臓細胞及び
唾液腺細胞へ分化可能な幹細胞を分離することに成功
し、本発明を完成した。
【００１０】すなわち、本発明は、唾液腺腺管上皮に由
来し、生体外での培養により、アルファフェトプロテイ
ン陽性細胞、アルブミン陽性細胞、アミラーゼ陽性細
胞、インスリン陽性細胞及びグルカゴン陽性細胞へ分化
し得る幹細胞を提供する。また、本発明は、上記本発明
の幹細胞を含む、臓器再生のための移植用細胞を提供す
る。
来し、生体外での培養により、アルファフェトプロテイ
ン陽性細胞、アルブミン陽性細胞、アミラーゼ陽性細
胞、インスリン陽性細胞及びグルカゴン陽性細胞へ分化
し得る幹細胞を提供する。また、本発明は、上記本発明
の幹細胞を含む、臓器再生のための移植用細胞を提供す
る。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明の幹細胞は、下記実施例に
詳述するように、顎下腺の主排泄導管を結紮し、結紮に
より萎縮した顎下腺において盛んに増殖する腺管上皮か
ら分離された、唾液腺腺管上皮由来のものである。な
お、下記実施例に記載する幹細胞は、結紮した唾液腺か
ら分離されたが、結紮していない通常の唾液腺の腺管上
皮も少なくともある程度は増殖しているので、結紮して
いない通常の唾液腺の腺管上皮から分離することもでき
る。
詳述するように、顎下腺の主排泄導管を結紮し、結紮に
より萎縮した顎下腺において盛んに増殖する腺管上皮か
ら分離された、唾液腺腺管上皮由来のものである。な
お、下記実施例に記載する幹細胞は、結紮した唾液腺か
ら分離されたが、結紮していない通常の唾液腺の腺管上
皮も少なくともある程度は増殖しているので、結紮して
いない通常の唾液腺の腺管上皮から分離することもでき
る。
【００１２】本発明の細胞は、(1)増殖能、(2)自己保持
能、(3)多分化能（複数の分化した娘細胞を生み出せ
る）を有しており、最も未分化な幹細胞(actual stem c
ells)である(Potten, C.S. et al., Development 110,
1001, 1990)。上記(1)、(2)、(3)の各能力についてさら
に詳細に述べると、(1)コラーゲン被覆プレート上の培
養において、対数増殖期に於ける本細胞の倍加時間(dou
bling time)は、約１８時間である。(2)培養系におい
て、本細胞は、第５日目以降よりクラスターを形成し、
各種分化マーカーを出現させる。それら終分化に達した
細胞群が、蓄積した細胞外基質と共にプレート面から剥
離した後も、ごく少数の細胞は依然プレート面に残って
おり、再び増殖を開始する。この現象から、生体外(in
vitro)に於ける分化誘導時においても、幹細胞の維持が
行われていると考えられる。(3)本発明の細胞は既に分
離から９ヶ月が経過しているが、その間の長期継代培養
期間中において、多分化能を喪失していない。これらの
ことより、本発明の細胞が、幹細胞であることは明らか
である。
能、(3)多分化能（複数の分化した娘細胞を生み出せ
る）を有しており、最も未分化な幹細胞(actual stem c
ells)である(Potten, C.S. et al., Development 110,
1001, 1990)。上記(1)、(2)、(3)の各能力についてさら
に詳細に述べると、(1)コラーゲン被覆プレート上の培
養において、対数増殖期に於ける本細胞の倍加時間(dou
bling time)は、約１８時間である。(2)培養系におい
て、本細胞は、第５日目以降よりクラスターを形成し、
各種分化マーカーを出現させる。それら終分化に達した
細胞群が、蓄積した細胞外基質と共にプレート面から剥
離した後も、ごく少数の細胞は依然プレート面に残って
おり、再び増殖を開始する。この現象から、生体外(in
vitro)に於ける分化誘導時においても、幹細胞の維持が
行われていると考えられる。(3)本発明の細胞は既に分
離から９ヶ月が経過しているが、その間の長期継代培養
期間中において、多分化能を喪失していない。これらの
ことより、本発明の細胞が、幹細胞であることは明らか
である。
【００１３】唾液腺腺管上皮から分離された細胞を、単
一細胞から生体外でプレート培養すると、当初は分化マ
ーカーを発現していないが、コンフルーエンシーを経過
して細胞が積層し始める頃から、分化マーカーを発現す
る種々の細胞が出現し始める。分化マーカーを発現する
細胞は、主として、細胞が積層している部分（コード及
びクラスター部分）に存在する。発現される分化マーカ
ーは、アルファフェトプロテイン(AFP)、アルブミン、
アミラーゼ、インスリン及びグルカゴンである（なお、
言うまでもなく、これらの全ての分化マーカーを単一の
細胞が発現しているのではなく、これらの各種分化マー
カーをそれぞれ発現する、異なる複数の細胞を含む細胞
群が生じる）。上記マーカーのうち、AFP及びアルブミ
ンは肝臓への分化マーカーであり、インスリン及びグル
カゴンは、膵臓（膵臓内分泌（ランゲルハンス島））へ
の分化マーカーであり、アミラーゼは唾液腺及び膵臓
（外分泌）への分化マーカーである。従って、本発明の
幹細胞は、少なくとも、肝臓、膵臓及び唾液腺に分化で
きる多能性(multipotential)幹細胞である。なお、上記
した種々の分化マーカーを発現する種々の細胞は、本発
明の幹細胞を同一の、通常の培養条件で培養することに
より出現するもので、これらの細胞を出現させるために
EGF等の増殖因子を培地に添加する必要はない。
一細胞から生体外でプレート培養すると、当初は分化マ
ーカーを発現していないが、コンフルーエンシーを経過
して細胞が積層し始める頃から、分化マーカーを発現す
る種々の細胞が出現し始める。分化マーカーを発現する
細胞は、主として、細胞が積層している部分（コード及
びクラスター部分）に存在する。発現される分化マーカ
ーは、アルファフェトプロテイン(AFP)、アルブミン、
アミラーゼ、インスリン及びグルカゴンである（なお、
言うまでもなく、これらの全ての分化マーカーを単一の
細胞が発現しているのではなく、これらの各種分化マー
カーをそれぞれ発現する、異なる複数の細胞を含む細胞
群が生じる）。上記マーカーのうち、AFP及びアルブミ
ンは肝臓への分化マーカーであり、インスリン及びグル
カゴンは、膵臓（膵臓内分泌（ランゲルハンス島））へ
の分化マーカーであり、アミラーゼは唾液腺及び膵臓
（外分泌）への分化マーカーである。従って、本発明の
幹細胞は、少なくとも、肝臓、膵臓及び唾液腺に分化で
きる多能性(multipotential)幹細胞である。なお、上記
した種々の分化マーカーを発現する種々の細胞は、本発
明の幹細胞を同一の、通常の培養条件で培養することに
より出現するもので、これらの細胞を出現させるために
EGF等の増殖因子を培地に添加する必要はない。
【００１４】また、下記実施例において、本発明の幹細
胞は、成体から得られた。再生医療のために細胞を移植
する場合、移植による拒絶反応を防止する観点から、患
者自身の細胞を移植することが最も好ましい。本発明の
幹細胞は、成体から得ることができるので、移植を受け
る患者自身から調製することができ、移植するのに非常
に有利である。なお、本発明の幹細胞は、成体のみなら
ず、未成熟な子から得ることもできる。また、下記実施
例において、本発明の幹細胞は、ラット及びマウスから
得られたが、唾液腺を有する、ヒトを含む他の哺乳動物
から得ることもできる。
胞は、成体から得られた。再生医療のために細胞を移植
する場合、移植による拒絶反応を防止する観点から、患
者自身の細胞を移植することが最も好ましい。本発明の
幹細胞は、成体から得ることができるので、移植を受け
る患者自身から調製することができ、移植するのに非常
に有利である。なお、本発明の幹細胞は、成体のみなら
ず、未成熟な子から得ることもできる。また、下記実施
例において、本発明の幹細胞は、ラット及びマウスから
得られたが、唾液腺を有する、ヒトを含む他の哺乳動物
から得ることもできる。
【００１５】本発明の細胞は、唾液腺腺管上皮から分離
された細胞のみならず、その初代培養細胞や、これを継
代培養した細胞であって、上記各種分化マーカーを発現
する各種細胞を生じることができる幹細胞が本発明の範
囲内に入ることは言うまでもない。
された細胞のみならず、その初代培養細胞や、これを継
代培養した細胞であって、上記各種分化マーカーを発現
する各種細胞を生じることができる幹細胞が本発明の範
囲内に入ることは言うまでもない。
【００１６】本発明の幹細胞は、少なくとも肝臓、膵臓
及び唾液腺に分化することができるので、本発明の幹細
胞を移植してこれらの臓器の再生を行うことが可能であ
る。幹細胞の移植は、幹細胞の浮遊液を宿主体に注入す
ることにより容易に行うことができる。注入は、脾臓内
や、再生しようとする臓器若しくはその近傍、又は静脈
内等に対して行うことができる。また、注入する幹細胞
の数は、特に限定されず、症状や宿主の体重、投与方法
等に応じて適宜選択できるが、通常、102〜101 0個程度
である。
及び唾液腺に分化することができるので、本発明の幹細
胞を移植してこれらの臓器の再生を行うことが可能であ
る。幹細胞の移植は、幹細胞の浮遊液を宿主体に注入す
ることにより容易に行うことができる。注入は、脾臓内
や、再生しようとする臓器若しくはその近傍、又は静脈
内等に対して行うことができる。また、注入する幹細胞
の数は、特に限定されず、症状や宿主の体重、投与方法
等に応じて適宜選択できるが、通常、102〜101 0個程度
である。
【００１７】下記実施例に具体的に記載されるように、
肝臓の2/3を切除した動物の脾臓に本発明の幹細胞の浮
遊液を投与することにより、肝臓を再生することができ
た。そして、再生した肝臓を構成する細胞には、投与し
た幹細胞由来の細胞が含まれていることが遺伝子検査に
より確認された。従って、本発明の幹細胞は、少なくと
も、肝臓の再生のための移植用細胞として用いることが
できる。また、本発明の幹細胞を培養することにより発
現される上記分化マーカーから明らかなように、本発明
の幹細胞から膵臓細胞を生じることも可能であり、従っ
て、本発明の幹細胞は、膵臓の再生やI型糖尿病の治療
に用いることもできる。
肝臓の2/3を切除した動物の脾臓に本発明の幹細胞の浮
遊液を投与することにより、肝臓を再生することができ
た。そして、再生した肝臓を構成する細胞には、投与し
た幹細胞由来の細胞が含まれていることが遺伝子検査に
より確認された。従って、本発明の幹細胞は、少なくと
も、肝臓の再生のための移植用細胞として用いることが
できる。また、本発明の幹細胞を培養することにより発
現される上記分化マーカーから明らかなように、本発明
の幹細胞から膵臓細胞を生じることも可能であり、従っ
て、本発明の幹細胞は、膵臓の再生やI型糖尿病の治療
に用いることもできる。
【００１８】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００１９】実施例１ 幹細胞の調製
(1) 唾液腺腺管上皮細胞分画のin vivoに於ける増殖法
４〜５週齢の雄ラットの唾液腺の主排泄導管を下記に記
載するように結紮した。主唾液腺には、耳下腺、顎下
腺、舌下腺の３つがあるが、最も明瞭で腺容積の大きな
顎下腺を選択した。
載するように結紮した。主唾液腺には、耳下腺、顎下
腺、舌下腺の３つがあるが、最も明瞭で腺容積の大きな
顎下腺を選択した。
【００２０】ラットはペントバルビタール腹腔内投与に
て麻酔を行った。ラットを解剖台上にて固定の上、頚部
を伸展させ頚部皮膚を正中切開した。皮膚を反転する
と、正中腺にて左右の接着している顎下腺が確認され
た。腺組織を被包している結合織を剥離し、左右の顎下
腺をそれぞれ反転した。顎下腺の反転により、図１のよ
うな頚部解剖図が得られた。顎下腺の主排泄導管は、外
上顎動脈と、外頚静脈の分枝である前顔面静脈に並走し
た後、二腹筋前枝下に潜っているので、これら大血管に
は触れずに主排泄導管のみを二重結紮した。結紮終了後
は左右の顎下腺を元の位置に戻し、顎下腺を被包してい
る結合織を縫合の後、皮膚縫合を行った。
て麻酔を行った。ラットを解剖台上にて固定の上、頚部
を伸展させ頚部皮膚を正中切開した。皮膚を反転する
と、正中腺にて左右の接着している顎下腺が確認され
た。腺組織を被包している結合織を剥離し、左右の顎下
腺をそれぞれ反転した。顎下腺の反転により、図１のよ
うな頚部解剖図が得られた。顎下腺の主排泄導管は、外
上顎動脈と、外頚静脈の分枝である前顔面静脈に並走し
た後、二腹筋前枝下に潜っているので、これら大血管に
は触れずに主排泄導管のみを二重結紮した。結紮終了後
は左右の顎下腺を元の位置に戻し、顎下腺を被包してい
る結合織を縫合の後、皮膚縫合を行った。
【００２１】両側顎下腺導管の二重結紮施術後６日目に
ラットを脱血屠殺し、両側の顎下腺を摘出した。主排泄
導管を結紮された顎下腺は、同時期の正常対照ラットの
顎下腺に比べ明らかに萎縮していた。これらの結紮後萎
縮顎下腺を組織学的に検討すると、腺房細胞のほとんど
が脱落しており、また管腔構造を形成する腺管上皮細胞
の顕著な増殖が観察された。
ラットを脱血屠殺し、両側の顎下腺を摘出した。主排泄
導管を結紮された顎下腺は、同時期の正常対照ラットの
顎下腺に比べ明らかに萎縮していた。これらの結紮後萎
縮顎下腺を組織学的に検討すると、腺房細胞のほとんど
が脱落しており、また管腔構造を形成する腺管上皮細胞
の顕著な増殖が観察された。
【００２２】(2) 導管結紮処理唾液腺組織の消化、細
胞分離法 (1)にて得られた導管結紮顎下腺を使用した。ラット屠
殺後に摘出し回収した１０〜１２個の顎下腺（５〜６ラ
ット）は、径２mm大になるまで細切した。細切した組織
はEGTA緩衝液(1L中、NaCl 8g, KCl 0.4 g, NaH2PO4 69
mg, Na2HPO4 75mg, HEPES 2.38 g, EGTA 0.19 g, NaHCO
3 0.35 g,グルコース 0.9 g, フェノールレッド 6 mg)
３０ｍｌと共に５０ｍｌ遠心管に移し、３７℃で２０分
間、１０回／分の速度で回転振盪した。インキュベーシ
ョン後、組織細片液は遠心(100xg、５分、室温）し、上
清は捨てた。得られたペレットは６０ｍｌの消化液(dig
estion medium)(60 ml中、DMEM/F12:1;1 60 ml, コラ
ゲナーゼ 100 mg, ヒアルロニダーゼ 80 mg)に分散
した後、５０ｍｌ遠心管に移し、３７℃で４０分間、１
０回／分の速度で回転振盪した。インキュベーション
後、組織細片液は遠心(100xg、５分、室温）し、上清は
捨てた。得られたペレットは６０ｍｌの分散液(dispers
ion medium)(60 ml中、DMEM/F12:1;1 60 ml,ディスパ
ーゼ 80 mg(1000U/ml))に分散した後、５０ｍｌ遠心管
に移し３７℃で６０分間、１０回／分の速度で回転振盪
した。回転振盪の途中で数回、１０ｍｌピペットにてピ
ペッティングを行い、組織細片液を機械的に分散させ
た。インキュベーション後、組織細片液は細胞濾過器を
通して細胞浮遊液を得た。細胞浮遊液は遠心(100xg、５
分、４℃）し、これより細胞ペレットを得た。細胞ペレ
ットは１０ｍｌのDMEM/F-12に懸濁し、培地にて３回洗
浄した。
胞分離法 (1)にて得られた導管結紮顎下腺を使用した。ラット屠
殺後に摘出し回収した１０〜１２個の顎下腺（５〜６ラ
ット）は、径２mm大になるまで細切した。細切した組織
はEGTA緩衝液(1L中、NaCl 8g, KCl 0.4 g, NaH2PO4 69
mg, Na2HPO4 75mg, HEPES 2.38 g, EGTA 0.19 g, NaHCO
3 0.35 g,グルコース 0.9 g, フェノールレッド 6 mg)
３０ｍｌと共に５０ｍｌ遠心管に移し、３７℃で２０分
間、１０回／分の速度で回転振盪した。インキュベーシ
ョン後、組織細片液は遠心(100xg、５分、室温）し、上
清は捨てた。得られたペレットは６０ｍｌの消化液(dig
estion medium)(60 ml中、DMEM/F12:1;1 60 ml, コラ
ゲナーゼ 100 mg, ヒアルロニダーゼ 80 mg)に分散
した後、５０ｍｌ遠心管に移し、３７℃で４０分間、１
０回／分の速度で回転振盪した。インキュベーション
後、組織細片液は遠心(100xg、５分、室温）し、上清は
捨てた。得られたペレットは６０ｍｌの分散液(dispers
ion medium)(60 ml中、DMEM/F12:1;1 60 ml,ディスパ
ーゼ 80 mg(1000U/ml))に分散した後、５０ｍｌ遠心管
に移し３７℃で６０分間、１０回／分の速度で回転振盪
した。回転振盪の途中で数回、１０ｍｌピペットにてピ
ペッティングを行い、組織細片液を機械的に分散させ
た。インキュベーション後、組織細片液は細胞濾過器を
通して細胞浮遊液を得た。細胞浮遊液は遠心(100xg、５
分、４℃）し、これより細胞ペレットを得た。細胞ペレ
ットは１０ｍｌのDMEM/F-12に懸濁し、培地にて３回洗
浄した。
【００２３】細胞数のカウントと、細胞生存率のチェッ
クを行った。１０個の腺組織から得られた細胞の総数は
2.0〜2.5 x 107個程度であった。また細胞の生存率は、
９５％以上であった。
クを行った。１０個の腺組織から得られた細胞の総数は
2.0〜2.5 x 107個程度であった。また細胞の生存率は、
９５％以上であった。
【００２４】(3) 唾液腺腺管上皮細胞の初代培養及び
セルラインの作成法 (2)で得られた細胞懸濁液を2.0〜5.0 x 105/100 mmディ
ッシュの濃度にて播いて初代培養を開始した。培養用の
ディッシュには、Ｉ型コラーゲン被覆ディッシュを使用
した。初代培養用培地としては、ウィリアムのＥ培地
に、10 ng/ml組換えヒトEGF(上皮成長因子）、10% FBS
(ウシ胎児血清)、10-8 mol/Lインスリン、10-6 mol/Lデ
キサメタゾン、100 U/mLペニシリンＧ、100μU/mlスト
レプトマイシンを添加した培地を使用した。
セルラインの作成法 (2)で得られた細胞懸濁液を2.0〜5.0 x 105/100 mmディ
ッシュの濃度にて播いて初代培養を開始した。培養用の
ディッシュには、Ｉ型コラーゲン被覆ディッシュを使用
した。初代培養用培地としては、ウィリアムのＥ培地
に、10 ng/ml組換えヒトEGF(上皮成長因子）、10% FBS
(ウシ胎児血清)、10-8 mol/Lインスリン、10-6 mol/Lデ
キサメタゾン、100 U/mLペニシリンＧ、100μU/mlスト
レプトマイシンを添加した培地を使用した。
【００２５】(2)より得られた細胞懸濁液は、完全な単
一細胞懸濁液にまで全細胞が分散されておらず、初代培
養の開始時には、数個から成る細胞塊がそのままプレー
ト面に接着した部位が何ヶ所も観察された。またプレー
ト面に接着しない細胞も存在するが、それらは唾液腺組
織内に浸潤したリンパ球等の炎症細胞であると考えられ
た。非接着性細胞は、培地交換の際に全て吸引除去し
た。
一細胞懸濁液にまで全細胞が分散されておらず、初代培
養の開始時には、数個から成る細胞塊がそのままプレー
ト面に接着した部位が何ヶ所も観察された。またプレー
ト面に接着しない細胞も存在するが、それらは唾液腺組
織内に浸潤したリンパ球等の炎症細胞であると考えられ
た。非接着性細胞は、培地交換の際に全て吸引除去し
た。
【００２６】プレート面に接着した上皮細胞塊のうちの
いくつかは旺盛な増殖能を示し、それらは敷石状の細胞
から成るコロニーを形成した。各コロニーを形成する細
胞の数が数十個以上になるまでコロニーが成長した段階
で、クローニングリングを用いてコロニーのピックアッ
プ(P2)を行った。コロニーを形成する細胞は、PBSにて
２回洗浄し、0.03%トリプシン-EDTA処理にてプレート面
より剥離させた。ピックアップした細胞は、Ｉ型コラー
ゲン被覆２４ウェルプレートに移して培養を継続した。
いくつかは旺盛な増殖能を示し、それらは敷石状の細胞
から成るコロニーを形成した。各コロニーを形成する細
胞の数が数十個以上になるまでコロニーが成長した段階
で、クローニングリングを用いてコロニーのピックアッ
プ(P2)を行った。コロニーを形成する細胞は、PBSにて
２回洗浄し、0.03%トリプシン-EDTA処理にてプレート面
より剥離させた。ピックアップした細胞は、Ｉ型コラー
ゲン被覆２４ウェルプレートに移して培養を継続した。
【００２７】２４ウェル一面に増殖した細胞は、３５ｍ
ｍディッシュ(P3)、６０ｍｍディッシュ(P4)と順次細胞
数を増やし、最終的に100 mmディッシュ(P5)にまでサイ
ズを拡大した。100 mmディッシュに拡大した時点で初代
培養用培地よりEGFを抜き、以後はそれをこの細胞の維
持培地とした。EGF除去後も培養には全く支障は生じな
かった。
ｍディッシュ(P3)、６０ｍｍディッシュ(P4)と順次細胞
数を増やし、最終的に100 mmディッシュ(P5)にまでサイ
ズを拡大した。100 mmディッシュに拡大した時点で初代
培養用培地よりEGFを抜き、以後はそれをこの細胞の維
持培地とした。EGF除去後も培養には全く支障は生じな
かった。
【００２８】さらに、１００ｍｍディッシュに増殖した
上皮細胞より、単一細胞培養を行った。腺管上皮細胞
は、0.03%トリプシン-EDTAにて剥離後、ピペッティング
に機械的に分散させ、細胞濾過器(孔径40μｍ）を通し
た。細胞は初代培養の時とは異なり、単一細胞にまで分
散が可能であった。細胞は1.0 x 102/100 mmディッシュ
程度にまで薄めて播き、各々が単一細胞にてプレートに
接着したのを確認した。一部の細胞は脱落したが、コロ
ニーの形成部位も数カ所に見られた。これらコロニー形
成部位より細胞をピックアップし、３５ｍｍディッシュ
にて培養を継続した。以後は培養のサイズを拡大してセ
ルラインとした。上記方法により２つのセルラインを得
た。さらに、得られた２つのセルライン(Aライン及びB
ライン）のうち、Nラインから継代培養を行い、SN-1(su
bculture of N line-1)からSN-4の４つのサブクローン
を得た。
上皮細胞より、単一細胞培養を行った。腺管上皮細胞
は、0.03%トリプシン-EDTAにて剥離後、ピペッティング
に機械的に分散させ、細胞濾過器(孔径40μｍ）を通し
た。細胞は初代培養の時とは異なり、単一細胞にまで分
散が可能であった。細胞は1.0 x 102/100 mmディッシュ
程度にまで薄めて播き、各々が単一細胞にてプレートに
接着したのを確認した。一部の細胞は脱落したが、コロ
ニーの形成部位も数カ所に見られた。これらコロニー形
成部位より細胞をピックアップし、３５ｍｍディッシュ
にて培養を継続した。以後は培養のサイズを拡大してセ
ルラインとした。上記方法により２つのセルラインを得
た。さらに、得られた２つのセルライン(Aライン及びB
ライン）のうち、Nラインから継代培養を行い、SN-1(su
bculture of N line-1)からSN-4の４つのサブクローン
を得た。
【００２９】実施例２ 細胞の性質
実施例１で得られたセルラインを2 x 105細胞/100 mmデ
ィッシュの濃度でプレートすると、３日後(day 3)には
単層に増殖してコンフルーエント(1.0 x 106細胞／ディ
ッシュ）になった。コンフルーエンシー後(day 5-)より
徐々に単層の各所にて細胞が積層し始め、二層の部位
(コード、cord)が形成され始めた。さらに、cordの一部
には細胞塊(クラスター、cluster)が形成された。この
後、単層細胞は次第に脱落した。コード及びクラスター
形成部位は暫く残るが、こちらも培養がday 15以上に及
ぶと徐々に脱落し、day30以降には完全にプレートから
剥離した。全てのコード及びクラスター剥離後は、少数
の細胞のみがディッシュ上に残された。これらの細胞は
さらに培養を継続すると、再び増殖してコロニーを形成
し、単層を形成した。その後もコードとクラスターの形
成が初回と同様に観察され、以後も同様のサイクルを繰
り返した。
ィッシュの濃度でプレートすると、３日後(day 3)には
単層に増殖してコンフルーエント(1.0 x 106細胞／ディ
ッシュ）になった。コンフルーエンシー後(day 5-)より
徐々に単層の各所にて細胞が積層し始め、二層の部位
(コード、cord)が形成され始めた。さらに、cordの一部
には細胞塊(クラスター、cluster)が形成された。この
後、単層細胞は次第に脱落した。コード及びクラスター
形成部位は暫く残るが、こちらも培養がday 15以上に及
ぶと徐々に脱落し、day30以降には完全にプレートから
剥離した。全てのコード及びクラスター剥離後は、少数
の細胞のみがディッシュ上に残された。これらの細胞は
さらに培養を継続すると、再び増殖してコロニーを形成
し、単層を形成した。その後もコードとクラスターの形
成が初回と同様に観察され、以後も同様のサイクルを繰
り返した。
【００３０】免疫細胞染色法又はフローサイトメトリー
により、細胞が発現するマーカーについて調べた。染色
に用いた蛍光標識抗体は、いずれも市販のものであり、
方法のプロトコールも市販の蛍光標識抗体又は市販のフ
ローサイトメトリー装置に添付の指示書に従って行っ
た。すなわち、免疫細胞染色は、DAKO社の免疫組織／細
胞染色ガイドに従って行った。また、フローサイトメト
リーは、BD Phermingen社のFCM staining protocolに従
って行った。使用した抗体の一覧を下記に示す。なお、
「抗ラット」の記載のない抗体は、全て製造者の情報又
はその抗体を用いた論文の情報より、ラットと反応する
ことを確認している。
により、細胞が発現するマーカーについて調べた。染色
に用いた蛍光標識抗体は、いずれも市販のものであり、
方法のプロトコールも市販の蛍光標識抗体又は市販のフ
ローサイトメトリー装置に添付の指示書に従って行っ
た。すなわち、免疫細胞染色は、DAKO社の免疫組織／細
胞染色ガイドに従って行った。また、フローサイトメト
リーは、BD Phermingen社のFCM staining protocolに従
って行った。使用した抗体の一覧を下記に示す。なお、
「抗ラット」の記載のない抗体は、全て製造者の情報又
はその抗体を用いた論文の情報より、ラットと反応する
ことを確認している。
【００３１】抗体一覧
ウサギ抗ヒトAFPポリクローナル抗体(A008. code numbe
r) DAKO社製 マウス抗ラットインスリン／プロインスリンモノクロー
ナル抗体(5E4/3) Biogenesis社製 マウス抗ラットインテグリンα6β1モノクローナル抗体
(MAB1410. Catalog number) Chemicon社製 ヤギ抗ヒトアミラーゼポリクローナル抗体(C-20) Sant
a Cruz社製 マウス抗ラットCD34モノクローナル抗体(ICO115) Sant
a Cruz社製 ウサギ抗c-kitポリクローナル抗体(H-300) Santa Cruz
社製 ウサギ抗ラットアルブミンポリクローナル抗体 ICT社
製 ウサギ抗ヒトグルカゴンポリクローナル抗体(A0565) D
AKO社製 抗CK19モノクローナル抗体(catalog number NCL-CK19/
clone b170) Novocastra Laboratories Ltd社製 抗ラットネスチンモノクローナル抗体(catalog number
556309/ clone Rat401)BD PharMingen社製 抗ラットCD45モノクローナル抗体(catalog number 2213
4D/ clone OX-1) BD PharMingen社製 抗ラットThy-1モノクローナル抗体(catalog number 222
12D/ clone OX-7) BD PharMingen社製 抗ラットラミニンポリクローナル抗体(/catalog number
Z0097/) DAKO社製
r) DAKO社製 マウス抗ラットインスリン／プロインスリンモノクロー
ナル抗体(5E4/3) Biogenesis社製 マウス抗ラットインテグリンα6β1モノクローナル抗体
(MAB1410. Catalog number) Chemicon社製 ヤギ抗ヒトアミラーゼポリクローナル抗体(C-20) Sant
a Cruz社製 マウス抗ラットCD34モノクローナル抗体(ICO115) Sant
a Cruz社製 ウサギ抗c-kitポリクローナル抗体(H-300) Santa Cruz
社製 ウサギ抗ラットアルブミンポリクローナル抗体 ICT社
製 ウサギ抗ヒトグルカゴンポリクローナル抗体(A0565) D
AKO社製 抗CK19モノクローナル抗体(catalog number NCL-CK19/
clone b170) Novocastra Laboratories Ltd社製 抗ラットネスチンモノクローナル抗体(catalog number
556309/ clone Rat401)BD PharMingen社製 抗ラットCD45モノクローナル抗体(catalog number 2213
4D/ clone OX-1) BD PharMingen社製 抗ラットThy-1モノクローナル抗体(catalog number 222
12D/ clone OX-7) BD PharMingen社製 抗ラットラミニンポリクローナル抗体(/catalog number
Z0097/) DAKO社製
【００３２】２０代継代培養以降の細胞について、免疫
細胞染色を行った。その結果、プレート後day 5-にてア
ルブミン陽性細胞が観察されたが、肝上皮細胞(oval ce
ll)の代表的マーカーであるCK19陽性細胞は見られなか
った。唾液腺（及び膵臓）外分泌腺細胞マーカーである
アミラーゼ陽性細胞も、アルブミンと同じくday 5以降
に確認された。一部には、複数個のアミラーゼ陽性細胞
から成る腺房様構造も観察された。同時に検索を行った
膵内分泌細胞マーカーであるインスリン及びグルカゴン
についても、陽性細胞が確認された。インスリンとグル
カゴンの二重染色では、各々の陽性細胞が互いに接着
し、クラスターの形成が見られた。さらに、肝細胞のpo
tential幹細胞のマーカーであるAFP陽性細胞も観察され
た。また、膵臓の幹細胞として考えられているネスチン
(nestin)陽性細胞も観察された。これら分化マーカー陽
性細胞の分布は、全てコード及びクラスター部位に限定
されていた。これらの陽性細胞は、上記した４つのサブ
クローンのプレート５日以降(day 5-)の全てにおいて観
察された。これらより、上記方法により唾液腺腺管上皮
から分離された個々の細胞は全て多能性(multipotent)
であると考えられる。
細胞染色を行った。その結果、プレート後day 5-にてア
ルブミン陽性細胞が観察されたが、肝上皮細胞(oval ce
ll)の代表的マーカーであるCK19陽性細胞は見られなか
った。唾液腺（及び膵臓）外分泌腺細胞マーカーである
アミラーゼ陽性細胞も、アルブミンと同じくday 5以降
に確認された。一部には、複数個のアミラーゼ陽性細胞
から成る腺房様構造も観察された。同時に検索を行った
膵内分泌細胞マーカーであるインスリン及びグルカゴン
についても、陽性細胞が確認された。インスリンとグル
カゴンの二重染色では、各々の陽性細胞が互いに接着
し、クラスターの形成が見られた。さらに、肝細胞のpo
tential幹細胞のマーカーであるAFP陽性細胞も観察され
た。また、膵臓の幹細胞として考えられているネスチン
(nestin)陽性細胞も観察された。これら分化マーカー陽
性細胞の分布は、全てコード及びクラスター部位に限定
されていた。これらの陽性細胞は、上記した４つのサブ
クローンのプレート５日以降(day 5-)の全てにおいて観
察された。これらより、上記方法により唾液腺腺管上皮
から分離された個々の細胞は全て多能性(multipotent)
であると考えられる。
【００３３】また、肝幹細胞の候補に挙げられている肝
上皮細胞及び肝前駆細胞（再生肝中）にて報告されてい
るマーカーについて検索を行った。免疫細胞染色及びフ
ローサイトメトリー分析により、プレート後１２〜２４
時間の細胞を調べたところ、肝前駆細胞にて報告されて
いる(VLA-6)(α6β1インテグリン）の発現が確認され
た。同時にVLA-6のリガンドであるラミニンの発現も認
められた。肝上皮細胞の代表的マーカーであるAFP及びC
K19の発現はなかった。また、造血幹細胞及び肝上皮細
胞にて報告のある表面抗原についても検索を行ったが、
Thy-1+細胞の割合が2.5%、c-kit+細胞の割合が５％程度
であった。CD34に関しては、c-kit+細胞集団が同時にCD
34弱陽性を示した。CD45陽性細胞は全く存在していなか
った。
上皮細胞及び肝前駆細胞（再生肝中）にて報告されてい
るマーカーについて検索を行った。免疫細胞染色及びフ
ローサイトメトリー分析により、プレート後１２〜２４
時間の細胞を調べたところ、肝前駆細胞にて報告されて
いる(VLA-6)(α6β1インテグリン）の発現が確認され
た。同時にVLA-6のリガンドであるラミニンの発現も認
められた。肝上皮細胞の代表的マーカーであるAFP及びC
K19の発現はなかった。また、造血幹細胞及び肝上皮細
胞にて報告のある表面抗原についても検索を行ったが、
Thy-1+細胞の割合が2.5%、c-kit+細胞の割合が５％程度
であった。CD34に関しては、c-kit+細胞集団が同時にCD
34弱陽性を示した。CD45陽性細胞は全く存在していなか
った。
【００３４】さらに、実施例１で得られた細胞が、組織
幹細胞の形質として知られているサイドポピュレーショ
ン(side-population(SP))形質を示すか否かを調べるた
めに、常法によりHoechst 33342（商品名）染色を行っ
たところ、SP分画の存在が確認された。５０μＭのベラ
パミル(verapamil)存在下で、SP分画の完全な消失は見
られなかったが、Hoechst 33342陽性の細胞集団におい
て、Hoechst 33342強度の増強が見られた。以上より、
本発明の細胞は、Hoechst 33342染色に関してベラパミ
ル感受性であり、SP細胞の特徴であるHoechst dye effl
ux componentが存在することがわかった。
幹細胞の形質として知られているサイドポピュレーショ
ン(side-population(SP))形質を示すか否かを調べるた
めに、常法によりHoechst 33342（商品名）染色を行っ
たところ、SP分画の存在が確認された。５０μＭのベラ
パミル(verapamil)存在下で、SP分画の完全な消失は見
られなかったが、Hoechst 33342陽性の細胞集団におい
て、Hoechst 33342強度の増強が見られた。以上より、
本発明の細胞は、Hoechst 33342染色に関してベラパミ
ル感受性であり、SP細胞の特徴であるHoechst dye effl
ux componentが存在することがわかった。
【００３５】実施例３ 生体への細胞移植（その１）
実施例１(2)で調製した、導管結紮処理唾液腺組織を消
化した細胞懸濁液を雌ラットに移植した。雌ラットは、
2AAF/PHプロトコールに従い、細胞移植６日前より2 mg/
日の2-アセチルアミノフルオレンを投与開始し、2/3部
分肝切除の後に細胞移植を行った。細胞移植は、細胞懸
濁液をレシピエント（被移植動物）の脾臓に注入するこ
とにより行った。注入した総細胞数は、約8.0 x 106個
であった。レシピエント肝におけるドナー細胞の検出
は、常法により、Ｙ染色体上のSRY遺伝子を、ＤＮＡプ
ローブを用いたin situハイブリダイゼーションで検出
することにより行った。レシピエントは雌ラットであ
り、ドナーは雄ラットであるので、Ｙ染色体上に存在す
る遺伝子は、レシピエントには存在せず、ドナーにのみ
存在する。従って、SRY遺伝子が細胞中に検出されれ
ば、その細胞はドナー由来であることがわかる。このcr
oss-sex移植は、雄SDラットから雌SDラットへと、雄LEA
ラットから雌LECラットの２つのモデルにつて行った。
化した細胞懸濁液を雌ラットに移植した。雌ラットは、
2AAF/PHプロトコールに従い、細胞移植６日前より2 mg/
日の2-アセチルアミノフルオレンを投与開始し、2/3部
分肝切除の後に細胞移植を行った。細胞移植は、細胞懸
濁液をレシピエント（被移植動物）の脾臓に注入するこ
とにより行った。注入した総細胞数は、約8.0 x 106個
であった。レシピエント肝におけるドナー細胞の検出
は、常法により、Ｙ染色体上のSRY遺伝子を、ＤＮＡプ
ローブを用いたin situハイブリダイゼーションで検出
することにより行った。レシピエントは雌ラットであ
り、ドナーは雄ラットであるので、Ｙ染色体上に存在す
る遺伝子は、レシピエントには存在せず、ドナーにのみ
存在する。従って、SRY遺伝子が細胞中に検出されれ
ば、その細胞はドナー由来であることがわかる。このcr
oss-sex移植は、雄SDラットから雌SDラットへと、雄LEA
ラットから雌LECラットの２つのモデルにつて行った。
【００３６】その結果、両方の移植モデルにて移植後２
週目には、門脈三管領域周辺に管腔構造を形成し、卵形
の核を持つ細胞集団の増殖(atypical ductular prolife
ration)が各所に見られた。これらの細胞はCK19陽性で
あり、肝上皮細胞と考えられる。また、同部位のSRY遺
伝子のin situ ハイブリダイゼーションにて一部の細胞
にシグナルが見られ、それらはドナー由来と考えられ
た。他に胆管上皮細胞に、またごく少数の肝細胞にもSR
Yシグナル陽性を認めた。移植後４週の肝組織では、ほ
とんど肝上皮細胞は消失していた。SRY陽性細胞は、胆
管上皮細胞及び肝細胞の一部に変わらず認められた。こ
のように、レシピエントの再生肝臓内にドナーの唾液腺
腺管上皮由来の細胞が確認された。移植後１〜２週目に
は上皮細胞内に、また、移植後２週以降には形態学的に
正常な胆管上皮細胞及び肝細胞の存在を確認した。移植
後５週後までの組織学的検討では、脾臓、肝臓内に核異
形等を呈する腫瘍細胞は見られなかった。また、in sit
uハイブリダイゼーションと免疫組織化学の二重染色法
により、抗ラットアルブミン陽性細胞の一部にSRY遺伝
子陽性細胞を確認した。なお、免疫組織染色は、上記し
た市販のウサギ抗ラットアルブミンポリクローナル抗体
を用い、DAKO社の免疫組織／細胞染色ガイドに従って行
った。
週目には、門脈三管領域周辺に管腔構造を形成し、卵形
の核を持つ細胞集団の増殖(atypical ductular prolife
ration)が各所に見られた。これらの細胞はCK19陽性で
あり、肝上皮細胞と考えられる。また、同部位のSRY遺
伝子のin situ ハイブリダイゼーションにて一部の細胞
にシグナルが見られ、それらはドナー由来と考えられ
た。他に胆管上皮細胞に、またごく少数の肝細胞にもSR
Yシグナル陽性を認めた。移植後４週の肝組織では、ほ
とんど肝上皮細胞は消失していた。SRY陽性細胞は、胆
管上皮細胞及び肝細胞の一部に変わらず認められた。こ
のように、レシピエントの再生肝臓内にドナーの唾液腺
腺管上皮由来の細胞が確認された。移植後１〜２週目に
は上皮細胞内に、また、移植後２週以降には形態学的に
正常な胆管上皮細胞及び肝細胞の存在を確認した。移植
後５週後までの組織学的検討では、脾臓、肝臓内に核異
形等を呈する腫瘍細胞は見られなかった。また、in sit
uハイブリダイゼーションと免疫組織化学の二重染色法
により、抗ラットアルブミン陽性細胞の一部にSRY遺伝
子陽性細胞を確認した。なお、免疫組織染色は、上記し
た市販のウサギ抗ラットアルブミンポリクローナル抗体
を用い、DAKO社の免疫組織／細胞染色ガイドに従って行
った。
【００３７】以上のように、実施例１(2)で調製した、
導管結紮処理唾液腺組織中に、生体内において肝細胞に
分化する幹細胞が存在することが明らかになった。
導管結紮処理唾液腺組織中に、生体内において肝細胞に
分化する幹細胞が存在することが明らかになった。
【００３８】実施例４ 生体への細胞移植（その２）
実施例１(3)で調製した、長期（３ヶ月）に渡って継代
培養した細胞の懸濁液を調製した。細胞懸濁液の調製
は、１型コラーゲンプレート上にて３〜４日培養して増
殖せしめた単層の細胞を、トリプシン-EDTA(0.05%トリ
プシン、0.53 mM EDTA)にて処理し、プレート面より剥
離、分散することにより行った。これを実施例３と同様
にして雌ラットに投与した。投与した細胞の総数は、約
1.0 x 106個であった。
培養した細胞の懸濁液を調製した。細胞懸濁液の調製
は、１型コラーゲンプレート上にて３〜４日培養して増
殖せしめた単層の細胞を、トリプシン-EDTA(0.05%トリ
プシン、0.53 mM EDTA)にて処理し、プレート面より剥
離、分散することにより行った。これを実施例３と同様
にして雌ラットに投与した。投与した細胞の総数は、約
1.0 x 106個であった。
【００３９】その結果、実施例３の場合と同じく、肝上
皮細胞、胆管細胞及び肝細胞への分化が確認された。ま
た、移植後５週目までの検討では、レシピエント肝臓内
に結節形成や、核異形を示す細胞などの出現はマクロ及
びミクロの病理学的検索にて見られなかった。また、SR
Y遺伝子in situハイブリダイゼーションと免疫組織化学
の二重染色法により、抗ラットアルブミン陽性細胞の一
部にSRY陽性を確認した。これらの所見より、本発明の
肝細胞は長期培養後もアルブミン産生能を有する機能的
な肝細胞への分化能を維持していると考えられた。
皮細胞、胆管細胞及び肝細胞への分化が確認された。ま
た、移植後５週目までの検討では、レシピエント肝臓内
に結節形成や、核異形を示す細胞などの出現はマクロ及
びミクロの病理学的検索にて見られなかった。また、SR
Y遺伝子in situハイブリダイゼーションと免疫組織化学
の二重染色法により、抗ラットアルブミン陽性細胞の一
部にSRY陽性を確認した。これらの所見より、本発明の
肝細胞は長期培養後もアルブミン産生能を有する機能的
な肝細胞への分化能を維持していると考えられた。
【００４０】実施例５ 生体への細胞移植（その３）
ラットに代えて、マウスを用い、実施例１(1)(2)及び実
施例３と同様な操作を行った。顎下腺主排泄導管の結紮
に供したマウスは、雄のC57BL/6NCrj(CharlesRiver Jap
an Inc.より市販）であった。導管結紮６日後にはducta
l proliferationと腺細胞の消失が確認された。また、
移植実験のレシピエントとしては雌のC57BL/6マウスを
用いた。なお、実施例３と同じく、ドナー細胞の検出は
Ｙ染色体上のsry遺伝子を検出することにより行った。
すなわち、レシピエント細胞にはsry遺伝子は存在しな
いが、ドナー細胞にはsry遺伝子が存在するので、ある
細胞がsry遺伝子陽性であれば、その細胞はドナー由来
であることがわかる。
施例３と同様な操作を行った。顎下腺主排泄導管の結紮
に供したマウスは、雄のC57BL/6NCrj(CharlesRiver Jap
an Inc.より市販）であった。導管結紮６日後にはducta
l proliferationと腺細胞の消失が確認された。また、
移植実験のレシピエントとしては雌のC57BL/6マウスを
用いた。なお、実施例３と同じく、ドナー細胞の検出は
Ｙ染色体上のsry遺伝子を検出することにより行った。
すなわち、レシピエント細胞にはsry遺伝子は存在しな
いが、ドナー細胞にはsry遺伝子が存在するので、ある
細胞がsry遺伝子陽性であれば、その細胞はドナー由来
であることがわかる。
【００４１】移植後２週目の肝臓にてsry遺伝子陽性の
ドナー細胞を確認した。また、これらの細胞はアルブミ
ン陽性を示した。これらの結果は、実施例３及び４に記
載したラットに於ける結果と同様であり、マウスにおい
ても多分化能を有する組織肝細胞が存在していることが
わかった。
ドナー細胞を確認した。また、これらの細胞はアルブミ
ン陽性を示した。これらの結果は、実施例３及び４に記
載したラットに於ける結果と同様であり、マウスにおい
ても多分化能を有する組織肝細胞が存在していることが
わかった。
【００４２】
【発明の効果】本発明により、肝細胞へ分化可能な幹細
胞が初めて提供された。本発明の肝細胞は、肝臓のみな
らず、膵臓や唾液腺のような複数の臓器細胞に分化可能
である。また、本発明の幹細胞は、成体からも調製する
ことができる。しかも、唾液腺から細胞を調製すること
は、腹部や胸部にある内臓から細胞を調製する場合に比
べて、危険性及び患者の負担がはるかに小さい。このた
め、本発明の幹細胞は、移植を受ける患者自身から容易
に調製することができ、移植の際に問題となる拒絶反応
を容易かつ確実に回避することができる。従って、本発
明の幹細胞は、肝臓再生等の、再生医療に大いに貢献す
るものと考えられる。
胞が初めて提供された。本発明の肝細胞は、肝臓のみな
らず、膵臓や唾液腺のような複数の臓器細胞に分化可能
である。また、本発明の幹細胞は、成体からも調製する
ことができる。しかも、唾液腺から細胞を調製すること
は、腹部や胸部にある内臓から細胞を調製する場合に比
べて、危険性及び患者の負担がはるかに小さい。このた
め、本発明の幹細胞は、移植を受ける患者自身から容易
に調製することができ、移植の際に問題となる拒絶反応
を容易かつ確実に回避することができる。従って、本発
明の幹細胞は、肝臓再生等の、再生医療に大いに貢献す
るものと考えられる。
【図１】顎下腺の主排泄導管の結紮方法を説明するため
の図である。
の図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 中村 公俊
熊本県熊本市出水１丁目１−10−1103
Ｆターム(参考） 4B065 AA93X AC12 BA30 CA44
4C087 AA01 AA03 BB54 BB63 CA04
MA67 NA14 ZA66 ZA75 ZB21
Claims (6)
- 【請求項１】 唾液腺腺管上皮に由来し、生体外での培
養により、アルファフェトプロテイン陽性細胞、アルブ
ミン陽性細胞、アミラーゼ陽性細胞、インスリン陽性細
胞及びグルカゴン陽性細胞へ分化し得る幹細胞。 - 【請求項２】 成体由来である請求項１記載の幹細胞。
- 【請求項３】 請求項１又は２記載の幹細胞を含む、臓
器再生のための移植用細胞。 - 【請求項４】 前記臓器が肝臓又は膵臓である請求項３
記載の細胞。 - 【請求項５】 前記臓器が肝臓である請求項４記載の細
胞。 - 【請求項６】 移植を受ける個体由来である請求項３な
いし５のいずれか１項に記載の細胞。
Priority Applications (8)
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|---|---|---|---|
| JP2001350541A JP2003144140A (ja) | 2001-11-15 | 2001-11-15 | 唾液腺腺管上皮由来幹細胞及びその用途 |
| US10/495,450 US20050084964A1 (en) | 2001-11-15 | 2002-11-15 | Stem cells originating in salivary duet epithelial cells and use thereof |
| PCT/JP2002/011914 WO2003042375A1 (fr) | 2001-11-15 | 2002-11-15 | Cellules souches issues de cellules epitheliales du duo salivaire et utilisation associee |
| EP02781773A EP1452587A4 (en) | 2001-11-15 | 2002-11-15 | STEM CELLS DERIVED FROM STORM DUETTEPLITHELZELLES AND USE THEREOF |
| KR10-2004-7007358A KR20040068135A (ko) | 2001-11-15 | 2002-11-15 | 타액선 선관상피 유래 줄기세포 및 그 용도 |
| AU2002349641A AU2002349641B2 (en) | 2001-11-15 | 2002-11-15 | Stem cells originating in salivary duct epithelial cells and use thereof |
| US11/713,705 US20070154463A1 (en) | 2001-11-15 | 2007-03-05 | Stem cell originated from salivary gland duct epithelium and use of the same |
| AU2008203432A AU2008203432A1 (en) | 2001-11-15 | 2008-07-31 | Stem cells originating in salivary duct epithelial cells and use thereof |
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|---|---|---|---|
| JP2001350541A JP2003144140A (ja) | 2001-11-15 | 2001-11-15 | 唾液腺腺管上皮由来幹細胞及びその用途 |
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|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003144140A true JP2003144140A (ja) | 2003-05-20 |
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ID=19163019
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001350541A Pending JP2003144140A (ja) | 2001-11-15 | 2001-11-15 | 唾液腺腺管上皮由来幹細胞及びその用途 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP1452587A4 (ja) |
| JP (1) | JP2003144140A (ja) |
| KR (1) | KR20040068135A (ja) |
| AU (1) | AU2002349641B2 (ja) |
| WO (1) | WO2003042375A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7659121B2 (en) | 2003-02-20 | 2010-02-09 | Bios Research Institute, Inc. | Human salivary gland-origin stem cell |
| CN112410288A (zh) * | 2020-11-12 | 2021-02-26 | 安徽惠恩生物科技股份有限公司 | 一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法 |
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| DE10362002B4 (de) * | 2003-06-23 | 2006-10-12 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Adulte pluripotente Stammzellen |
| JP2008009140A (ja) * | 2006-06-29 | 2008-01-17 | Fujitsu Ltd | 画像処理装置および画像処理方法 |
| KR101430708B1 (ko) * | 2012-05-24 | 2014-08-14 | 한국원자력의학원 | 인간 침샘 줄기세포, 그 제조방법, 그 배양액, 및 침샘 손상 치료를 위한 그 용도 |
| RU2510276C1 (ru) * | 2012-09-25 | 2014-03-27 | Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет | Способ получения клеток для заместительной клеточной терапии патологий печени |
| WO2014092575A1 (en) | 2012-12-14 | 2014-06-19 | Rijksuniversiteit Groningen | Means and methods for obtaining salivary gland stem cells and use thereof |
| RU2631005C1 (ru) * | 2016-10-06 | 2017-09-15 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Способ культивирования клеток слюнной железы человека |
-
2001
- 2001-11-15 JP JP2001350541A patent/JP2003144140A/ja active Pending
-
2002
- 2002-11-15 EP EP02781773A patent/EP1452587A4/en not_active Withdrawn
- 2002-11-15 KR KR10-2004-7007358A patent/KR20040068135A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-11-15 US US10/495,450 patent/US20050084964A1/en not_active Abandoned
- 2002-11-15 WO PCT/JP2002/011914 patent/WO2003042375A1/ja active Application Filing
- 2002-11-15 AU AU2002349641A patent/AU2002349641B2/en not_active Ceased
-
2007
- 2007-03-05 US US11/713,705 patent/US20070154463A1/en not_active Abandoned
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7659121B2 (en) | 2003-02-20 | 2010-02-09 | Bios Research Institute, Inc. | Human salivary gland-origin stem cell |
| CN112410288A (zh) * | 2020-11-12 | 2021-02-26 | 安徽惠恩生物科技股份有限公司 | 一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20050084964A1 (en) | 2005-04-21 |
| EP1452587A1 (en) | 2004-09-01 |
| WO2003042375A1 (fr) | 2003-05-22 |
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| KR20040068135A (ko) | 2004-07-30 |
| EP1452587A4 (en) | 2005-01-19 |
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