CN109620965A - 一种温敏性聚合物囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种温敏性聚合物囊泡及其制备方法和应用，温敏性聚合物囊泡包括由两亲性含温敏嵌段聚合物组装而成的囊泡本体，结合在所述囊泡本体上可靶向牙周膜干细胞(PDLSCs)的生物素修饰过的Biotin‑CD146单克隆抗体及链霉亲和素(SA)，可以作为硫化氢载体的应用。与现有技术相比，本发明具有牙周膜干细胞(PDLSCs)靶向性、能改善PDLSCs的增殖分化能力，促进炎症环境下的牙周组织改建，提升炎症状态下的正畸疗效和安全性等优点，并为气体分子在临床上的应用提供技术支持。

Description

一种温敏性聚合物囊泡及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于高分子材料领域，尤其是涉及一种包载硫化氢供体并靶向牙周膜干细胞的温敏性聚合物囊泡及其制备方法和应用。
背景技术
由于正畸治疗中患者难以保持良好的口腔卫生，常引起牙周组织炎症，如不能及时控制容易导致牙周附着丧失和牙槽骨迅速吸收。即使在牙周基础治疗完成后，牙周组织再生和重建能力也会下降，制约着正畸治疗的安全、有效实施。在正畸牙周改建的过程中，牙周膜细胞(PDLCs)，特别是其中的间充质干细胞——牙周膜干细胞(PDLSCs)，决定了牙周组织的再生及改建潜能。在炎症微环境中，PDLCs整体表现出多向分化能力下降，可导致牙周组织代谢失衡，影响正畸治疗效果。因此，在炎症微环境中，如何保护PDLSCs，进而促进牙周改建，是正畸学亟待探讨的重要问题。
气体分子硫化氢(H2S)作为内源性的信号分子，可通过多种路径起到抗炎作用。生理水平的硫化氢对维持PDLSCs的增殖和分化能力有重要意义，其在牙周组织炎症中有保护PDLCs、抑制破骨细胞分化、促进成骨细胞分化的作用，具有控制牙周炎症的潜在价值。
鉴于H2S在多种疾病模型中的重要作用，诸多学者尝试通过干预H2S水平实现对疾病的控制。目前，给药手段集中于直接注射供体NaHS、缓释供体GYY4137或与抗炎药物组合应用，均存在难以控制气体分子浓度、无法靶向组织或细胞等问题，制约着其作用的发挥。由于硫化氢的抗炎作用具有时间和浓度依赖性，因此能精确给药、靶向运输、可控释放的载体亟待开发。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种无毒副作用、包载有硫化氢供体、靶向牙周膜干细胞、容易降解、生物相容性好、进入细胞的速度较快并且具有不对称的膜结构的、用作药物载体的聚合物囊泡。
本发明的另一个目的在于提供一种上述包载硫化氢供体并靶向牙周膜干细胞的温敏性聚合物囊泡的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供上述包载硫化氢供体并靶向牙周膜干细胞的温敏性聚合物囊泡的用途。。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种温敏性聚合物囊泡，包括：
由两亲性含温敏嵌段聚合物组装而成的囊泡本体，
结合在所述囊泡本体上可靶向牙周膜干细胞(PDLSCs)的生物素修饰过的Biotin-CD146单克隆抗体及链霉亲和素(SA)，
所述两亲性含温敏嵌段聚合物为聚氧乙烯-嵌段-聚(N-异丙基丙烯酰胺-无规-甲基香豆素甲基丙烯酸羟乙酯-嵌段-聚丙烯酸。
制备得到的包载硫化氢供体并靶向牙周膜干细胞温敏性聚合物囊泡由两亲性嵌段聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA自组装而成，作为亲水链段的PEO和PAA形成所述聚合物囊泡的内、外部晕层，无规共聚的链段P(NIPAM-stat-CMA)形成所述聚合物囊泡的膜层。
所述链霉亲和素(SA)与所述Biotin-CD146单克隆抗体的摩尔比为(4～8):1。
所述温敏性聚合物囊泡的粒径为100～280nm。
一种温敏性聚合物囊泡的制备方法，采用以下步骤：
(1)链转移剂三硫酯(DDMAT)的合成：
将磷酸钾按二硫化碳质量比为1:1～3混合加入到第一类溶剂中反应1～3h，加入十二碳硫醇加成反应1～3h，十二碳硫醇与二硫化碳的质量比为1:1～3，加入2-溴异丁酸酯化反应13～24h，2-溴异丁酸与二硫化碳的质量比为1:1～3，经减压蒸馏去除第一类溶剂，经溶解、萃取、洗涤得到亮黄色的三硫酯(DDMAT)；
(2)大分子引发剂(PEO-DDMAT)的合成：
将单甲氧基聚环氧乙烷(MPEO)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)按照摩尔比为(3～6):1混合后加入到甲苯中，通过共沸蒸馏溶剂来除水，在除水后的溶液中加入步骤(1)所得的三硫酯(DDMAT)，二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐(DPTS)，按照摩尔比为(3～5):(8～12):1，与适量二氯甲烷混合后，在室温下搅拌，反应20h；过滤得到的混合物，将其滤液滴加到冷的正己烷中，沉淀纯化并在室温下真空干燥，制备得到大分子引发剂(PEO-DDMAT)；
(3)PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)的合成：
将步骤(2)所得的大分子引发剂(PEO-DDMAT)与N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、香豆素单体(CMA)按照摩尔比为1:(80～133):(11～20)混合后加入到第二类溶剂中，通入氩气除氧；然后加入自由基引发剂，与大分子引发剂(PEO-DDMAT)的摩尔比为(0.15～0.20):1，通入氩气后将反应密封并浸入70℃的油浴锅中，反应24h后，通过暴露于空气终止反应；处理后得到聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)；
(4)PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PtBA的合成：
将步骤(3)所得的聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)与丙烯酸叔丁酯(tBA)按照摩尔比为1:(12～16)混合后加入到第二类溶剂中，通入氩气除氧，加入自由基引发剂，与聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)的摩尔比为(0.15～0.20):1，通入氩气后将反应密封并浸入70℃的油浴锅中，反应18～48h后，通过暴露于空气终止反应，处理后得到聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PtBA；
(5)PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA的合成：
将步骤(4)所得聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PtBA溶解二氯甲烷中，加入摩尔数相当于PtBA的酯基摩尔数5～10倍的三氟乙酸，常温下搅拌，水解4～15h，处理后得到聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA；
(6)聚合物囊泡的制备步骤：
将步骤(5)所得聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA溶解在四氢呋喃中，控制浓度为2～5mg/mL，在剧烈搅拌的条件下，以15～45d/min的速度将溶液滴加到两倍于四氢呋喃体积的有硫化氢供体的水溶液中，透析除去四氢呋喃，在紫外光下交联，得到包载有硫化氢供体的温度响应型聚合物囊泡；
(7)囊泡表面抗体连接的步骤：
在步骤(6)所得的包载了有硫化氢供体的聚合物囊泡溶液中加入摩尔比为1:1～2的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下搅拌30分钟，然后加入链霉亲和素(SA)，继续搅拌12h，在去离子水中透析除去副产物；
将生物素修饰过的Biotin-CD146单克隆抗体按照抗体：链霉亲和素(SA)摩尔比1:4～8的比例加入包载了有硫化氢供体的囊泡溶液中，避光搅拌过夜，被生物素修饰过的CD146抗体结合在囊泡表面，制备得到包载硫化氢供体并靶向牙周膜干细胞的温敏性聚合物囊泡。
步骤(1)中所述第一类溶剂为甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲醇、丙酮、二甲亚砜或二甲基甲酰胺中的一种或几种。
步骤(2)制备得到大分子引发剂(PEO-DDMAT)在4℃下储存。
步骤(3)及步骤(4)中所述自由基引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)。
步骤(3)及步骤(4)中所述第二类溶剂为二氧六环、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、苯甲醚或对二甲苯中的一种或几种。
步骤(6)中所述硫化氢供体为硫氢化钠。
温敏性聚合物囊作为硫化氢载体的应用，能够用于改善PDLSCs的增殖分化能力，促进炎症环境下的牙周组织改建，提升炎症状态下的正畸疗效和安全性，并为气体分子在临床上的应用提供技术支持。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明的包载硫化氢供体并靶向牙周膜干细胞的聚合物囊泡是由两亲性含温敏嵌段聚合物通过自组装而形成的，该聚合物表面通过链霉亲和素连接有生物素修饰的Biotin-CD146单克隆抗体，能够靶向牙周膜干细胞(PDLSCs)而使囊泡内包载的硫化氢供体进入PDLSCs内，从而改善PDLSCs的增殖分化能力，促进炎症环境下的牙周组织改建，提升炎症状态下的正畸疗效和安全性，并为气体分子在临床上的应用提供技术支持。
(2)本发明的包载硫化氢供体并靶向牙周膜干细胞的温敏性聚合物囊泡的制备方法采用紫外光来引发香豆素单体的交联反应，能够有效地固定聚合物囊泡的形貌，使最终得到的温敏性聚合物囊泡具有非常好的稳定性。
(3)本发明的温敏性聚合物囊泡结合了生物素修饰的Biotin-CD146单克隆抗体，CD146为PDLSCs的干细胞表面标志物，可显著提升PDLSCs对聚合物囊泡的内吞效率。
(4)本发明的温敏性聚合物囊泡含有对温度响应的基团，当温度低于温敏性嵌段的临界溶解温度(LCST)时，囊泡膜结构变得疏松，从而快速、有效地向PDLSCs释放包载在聚合物囊泡内的硫化氢供体。
(5)香豆素基团在接受紫外光照射后发生交联反应，从而固定温敏性聚合物囊泡的形貌，使其形貌也不致受到pH值的影响，以及不会因为温度降低而囊泡解体，因此，本发明的温敏性聚合物囊泡不会受到生物体或外界环境的pH值的影响，或者由于环境温度降低而在未进入PDLSCs前解体，在生物体内也有很好的稳定性和良好的生物相容性，不会引起生物体的排异反应。
附图说明
图1为实施例1制备得到的温敏性聚合物囊泡的TEM图；
图2为实施例1制备得到的温敏性聚合物囊泡的动态光散射图；
图3为实施例1制备得到的温敏性聚合物囊泡的温度响应结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种温敏性聚合物囊泡、该种温敏性聚合物囊泡的制备方法及其应用。
温敏性聚合物囊泡，包括囊泡本体和连接在该囊泡本体上的biotin-CD146单克隆抗体。
其中，囊泡本体由两亲性含温敏嵌段聚合物组装而成，两亲性含温敏嵌段聚合物为聚氧乙烯-嵌段-聚(N-异丙基丙烯酰胺-无规-甲基香豆素甲基丙烯酸羟乙酯)-嵌段-聚丙烯酸，简称为PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA。
温敏性聚合物囊泡的粒径为100～280nm。包载硫化氢供体并靶向牙周膜干细胞的温敏性聚合物囊泡连接的链霉亲和素(SA)与所述生物素修饰过的Biotin-CD146单克隆抗体的摩尔比为4～8:1。
温敏性聚合物囊泡的制备方法，包括如下步骤：
(1)温敏性聚合物的合成步骤：
a.以PEO-DDMAT作为大分子引发剂，将N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、香豆素单体(CMA)、自由基引发剂(AIBN)加入至圆底烧瓶中，然后加入适量的第二类溶剂，混合并除去反应体系中的氧气，然后在70℃下反应24h后，通过暴露于空气终止反应，所得的聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)与丙烯酸叔丁酯(tBA)、自由基引发剂(AIBN)和第二类溶剂相混合，除去反应体系中的氧气，然后在70℃下反应24h后，通过暴露于空气终止反应，得到聚合物溶液；
b.将所得到的聚合物溶液经过旋蒸、溶解、在正己烷中沉淀三次，并在25℃下真空干燥后得到聚合物粉末；
c.将所得到的聚合物溶解在适当的二氯甲烷中，加入摩适量的三氟乙酸，常温下搅拌，水解4～15h，后处理得到聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA；
(2)聚合物囊泡水溶液的制备步骤：
将步骤(1)所得聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA以2～5mg/mLL的浓度溶解在四氢呋喃中，在剧烈搅拌下以15～45d/min的速度滴加到两倍于四氢呋喃体积的有硫化氢供体的水溶液中，透析除去四氢呋喃，在紫外光下交联，得到包载有硫化氢供体的聚合物囊泡水溶液；
(3)连接有抗体的聚合物囊泡的制备步骤：
将步骤(2)所得的聚合物囊泡水溶液与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合并搅拌，然后加入链霉亲和素(SA)，继续搅拌，在去离子水中透析后，将Biotin-CD146单克隆抗体与囊泡溶液混合并搅拌，得连接有抗体的聚合物囊泡。
其中，在步骤(1)中，大分子引发剂、N-异丙基丙烯酰胺、香豆素单体、丙烯酸叔丁酯、自由基引发剂的摩尔比例可以为1:(80～133):(11～20):(12～16):0.15。
在步骤(1)中，第二类溶剂均为二氧六环、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、苯甲醚和对二甲苯中的一至几种。
在步骤(1)中，后处理步骤依次包括旋蒸、溶解、透析和冻干。
在步骤(2)中，硫化氢供体为硫氢化钠。
温敏性聚合物囊泡的应用
对细胞进行分组：control组、张力组、LPS组、张力+LPS组。张力组：用Flexcell细胞张力系统对hPDLCs/hPDLSCs施加循环张力24h；LPS组：通过LPS(1μg/mL)诱导炎症微环境24h；张力+LPS组：用Flexcell细胞张力系统对hPDLCs/hPDLSCs施加循环张力24h的同时用LPS(1μg/mL)诱导炎症微环境。张力作用的同时，通过梯度浓度GYY4137及包载梯度浓度GYY4137的囊泡进行细胞干预，检测hPDLCs/hPDLSCs增殖、分化、凋亡、炎症表达的变化。上述预期实验结果为：包载最适浓度的GYY4137囊泡组中成骨相关基因与蛋白表达升高，炎症相关基因与蛋白表达降低，从而证明包载硫化氢供体的囊泡对hPDLCs/hPDLSCs有促进成骨并抑制炎症的作用。
以下结合更进一步的实施例做说明。
实施例1
本实施例提供了一种温敏性聚合物囊泡的制备方法，包括如下步骤：
(1)温敏性聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA的合成步骤：
a.用0.68g(0.30mmol)PEO-DDMAT作为大分子引发剂，将2.71g(24.00mmol)N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、1.00g(3.3mmol)香豆素单体(CMA)、7.38mg(0.045mmol)自由基引发剂(AIBN)加入至25mL圆底烧瓶中，然后加入3mL的二氧六环，待反应物全部溶解，用鼓泡法吹氩气15分钟，以除去反应体系中的氧气(形成无氧环境)，进行可逆加成-断裂链转移聚合反应(RAFT)，反应温度为50℃，反应时间为48h，通过暴露于空气终止反应，所得的聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)与0.46g(3.6mmol)丙烯酸叔丁酯(tBA)7.38mg(0.045mmol)自由基引发剂(AIBN)和3mL的二氧六环溶液相混合，除去反应体系中的氧气，然后在50℃下反应48h后，通过暴露于空气终止反应，得到聚合物溶液；
b.将所得到的聚合物溶液经过旋蒸、溶解、在正己烷中沉淀三次，并在25℃下真空干燥后得到聚合物粉末；
c.将所得到的聚合物溶解在适当的二氯甲烷中，加入摩尔数相当于PtBA的酯基摩尔数5倍的三氟乙酸，常温下搅拌，水解4h，后处理得到聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA；
(2)聚合物囊泡水溶液的制备步骤：
将步骤(1)所得聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA溶解在四氢呋喃中，配制成浓度为2.00mg/mLL的溶液，在剧烈搅拌下，以15d/min的速度滴加到两倍于四氢呋喃体积的有硫化氢供体的水溶液中，透析后，在紫外光下交联，得到包载有硫化氢供体的聚合物囊泡水溶液。该聚合物囊泡水溶液中所含聚合物囊泡的TEM图如图1所示，该图清楚地显示该聚合物囊泡的粒径约为210nm。
(3)连接有抗体的聚合物囊泡的制备步骤：
将步骤(2)所得的聚合物囊泡水溶液与1.21mg(6.30×10-3mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.72mg(6.30×10-3mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合并搅拌，然后加入0.38mg(7.40×10-6mmol)链霉亲和素(SA)，继续搅拌，在去离子水中透析后，将1.23×10-6mmol的Biotin-CD146单克隆抗体与囊泡溶液混合并搅拌，得连接有抗体的聚合物囊泡。图2为该温敏性聚合物囊泡溶液所含有的温敏性聚合物囊泡的动态光散射(DLS)图。由图2可知，温敏性聚合物囊泡的粒径非常均一(多分散系数为0.078)，粒径为208nm。
当聚合物囊泡溶液处于不同的温度下，温敏性聚合物囊泡的尺寸会随着温度的降低而增大，其温度响应结果即在不同温度下的粒径变化如图3所示。
实施例2
本实施例提供了一种温敏性聚合物囊泡的制备方法，包括如下步骤：
(1)温敏性聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA的合成步骤：
a.用0.68g(0.30mmol)PEO-DDMAT作为大分子引发剂，将3.39g(30.00mmol)N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、1.21g(4.0mmol)香豆素单体(CMA)、7.38mg(0.045mmol)自由基引发剂(AIBN)加入至25mL圆底烧瓶中，然后加入5mL的二甲基甲酰胺，待反应物全部溶解，用鼓泡法吹氩气15分钟，以除去反应体系中的氧气(形成无氧环境)，进行可逆加成-断裂链转移聚合反应(RAFT)，反应温度为60℃，反应时间为36h，通过暴露于空气终止反应，所得的聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)与0.51g(4.0mmol)丙烯酸叔丁酯(tBA)7.38mg(0.045mmol)自由基引发剂(AIBN)和5mL的二甲基甲酰胺溶液相混合，除去反应体系中的氧气，然后在60℃下反应36h后，通过暴露于空气终止反应，得到聚合物溶液；
b.将所得到的聚合物溶液经过旋蒸、溶解、在正己烷中沉淀三次，并在25℃下真空干燥后得到聚合物粉末；
c.将所得到的聚合物溶解在适当的二氯甲烷中，加入摩尔数相当于PtBA的酯基摩尔数7倍的三氟乙酸，常温下搅拌，水解8h，后处理得到聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA；
(2)聚合物囊泡水溶液的制备步骤：
将步骤(1)所得聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA溶解在四氢呋喃中，配制成浓度为3.00mg/mLL的溶液，在剧烈搅拌下，以22d/min的速度滴加到两倍于四氢呋喃体积的有硫化氢供体的水溶液中，透析后，在紫外光下交联，得到包载有硫化氢供体的聚合物囊泡水溶液。该聚合物囊泡水溶液中所含聚合物囊泡的粒径约为240nm。
(3)连接有抗体的聚合物囊泡的制备步骤：
将步骤(2)所得的聚合物囊泡水溶液与1.34mg(7.00×10-3mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.80mg(7.00×10-3mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合并搅拌，然后加入0.42mg(8.22×10-6mmol)链霉亲和素(SA)，继续搅拌，在去离子水中透析后，将1.37×10-6mmol的Biotin-CD146单克隆抗体与囊泡溶液混合并搅拌，得连接有抗体的聚合物囊泡。
实施例3
本实施例提供了一种温敏性聚合物囊泡的制备方法，包括如下步骤：
(1)温敏性聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA的合成步骤：
a.用0.68g(0.30mmol)PEO-DDMAT作为大分子引发剂，将3.96g(35.00mmol)N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、1.51g(5.0mmol)香豆素单体(CMA)、7.38mg(0.045mmol)自由基引发剂(AIBN)加入至25mL圆底烧瓶中，然后加入7mL的二甲基甲酰胺，待反应物全部溶解，用鼓泡法吹氩气15分钟，以除去反应体系中的氧气(形成无氧环境)，进行可逆加成-断裂链转移聚合反应(RAFT)，反应温度为70℃，反应时间为24h，通过暴露于空气终止反应，所得的聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)与0.56g(4.4mmol)丙烯酸叔丁酯(tBA)7.38mg(0.045mmol)自由基引发剂(AIBN)和7mL的二甲基甲酰胺溶液相混合，除去反应体系中的氧气，然后在70℃下反应24h后，通过暴露于空气终止反应，得到聚合物溶液；
b.将所得到的聚合物溶液经过旋蒸、溶解、在正己烷中沉淀三次，并在25℃下真空干燥后得到聚合物粉末；
c.将所得到的聚合物溶解在适当的二氯甲烷中，加入摩尔数相当于PtBA的酯基摩尔数9倍的三氟乙酸，常温下搅拌，水解12h，后处理得到聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA；
(2)聚合物囊泡水溶液的制备步骤：
将步骤(1)所得聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA溶解在四氢呋喃中，配制成浓度为4.00mg/mLL的溶液，在剧烈搅拌下，以30d/min的速度滴加到两倍于四氢呋喃体积的有硫化氢供体的水溶液中，透析后，在紫外光下交联，得到包载有硫化氢供体的聚合物囊泡水溶液。该聚合物囊泡水溶液中所含聚合物囊泡的粒径约为250nm。
(3)连接有抗体的聚合物囊泡的制备步骤：
将步骤(2)所得的聚合物囊泡水溶液与1.47mg(7.70×10-3mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.88mg(7.70×10-3mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合并搅拌，然后加入0.46mg(9.04×10-6mmol)链霉亲和素(SA)，继续搅拌，在去离子水中透析后，将1.51×10-6mmol的Biotin-CD146单克隆抗体与囊泡溶液混合并搅拌，得连接有抗体的聚合物囊泡。
实施例4
本实施例提供了一种温敏性聚合物囊泡的制备方法，包括如下步骤：
(1)温敏性聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA的合成步骤：
a.用0.68g(0.30mmol)PEO-DDMAT作为大分子引发剂，将4.53g(40.00mmol)N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、1.81g(6.0mmol)香豆素单体(CMA)、7.38mg(0.045mmol)自由基引发剂(AIBN)加入至25mL圆底烧瓶中，然后加入10mL的二甲基甲酰胺，待反应物全部溶解，用鼓泡法吹氩气15分钟，以除去反应体系中的氧气(形成无氧环境)，进行可逆加成-断裂链转移聚合反应(RAFT)，反应温度为80℃，反应时间为18h，通过暴露于空气终止反应，所得的聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)与0.61g(4.8mmol)丙烯酸叔丁酯(tBA)7.38mg(0.045mmol)自由基引发剂(AIBN)和10mL的二甲基甲酰胺溶液相混合，除去反应体系中的氧气，然后在80℃下反应18h后，通过暴露于空气终止反应，得到聚合物溶液；
b.将所得到的聚合物溶液经过旋蒸、溶解、在正己烷中沉淀三次，并在25℃下真空干燥后得到聚合物粉末；
c.将所得到的聚合物溶解在适当的二氯甲烷中，加入摩尔数相当于PtBA的酯基摩尔数10倍的三氟乙酸，常温下搅拌，水解15h，后处理得到聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA；
(2)聚合物囊泡水溶液的制备步骤：
将步骤(1)所得聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA溶解在四氢呋喃中，配制成浓度为5.00mg/mLL的溶液，在剧烈搅拌下，以45d/min的速度滴加到两倍于四氢呋喃体积的有硫化氢供体的水溶液中，透析后，在紫外光下交联，得到包载有硫化氢供体的聚合物囊泡水溶液。该聚合物囊泡水溶液中所含聚合物囊泡的粒径约为270nm。
(3)连接有抗体的聚合物囊泡的制备步骤：
将步骤(2)所得的聚合物囊泡水溶液与1.60mg(8.40×10-3mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.96mg(8.40×10-3mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合并搅拌，然后加入0.50mg(9.86×10-6mmol)链霉亲和素(SA)，继续搅拌，在去离子水中透析后，将1.65×10-6mmol的Biotin-CD146单克隆抗体与囊泡溶液混合并搅拌，得连接有抗体的聚合物囊泡。
实施例5
一种温敏性聚合物囊泡，粒径为100nm，包括：由两亲性含温敏嵌段聚合物聚氧乙烯-嵌段-聚(N-异丙基丙烯酰胺-无规-甲基香豆素甲基丙烯酸羟乙酯-嵌段-聚丙烯酸组装而成的囊泡本体，结合在囊泡本体上可靶向牙周膜干细胞(PDLSCs)的生物素修饰过的Biotin-CD146单克隆抗体及链霉亲和素(SA)，链霉亲和素(SA)与Biotin-CD146单克隆抗体的摩尔比为4:1。该温敏性聚合物囊可以作为硫化氢载体。
温敏性聚合物囊泡的制备方法采用以下步骤：
(1)链转移剂三硫酯(DDMAT)的合成：
将磷酸钾按二硫化碳质量比为1:1混合加入到二氯甲烷溶剂中反应1h，加入十二碳硫醇加成反应1h，十二碳硫醇与二硫化碳的质量比为1:1，加入2-溴异丁酸酯化反应13h，2-溴异丁酸与二硫化碳的质量比为1:1，经减压蒸馏去除二氯甲烷溶剂，经溶解、萃取、洗涤得到亮黄色的三硫酯(DDMAT)；
(2)大分子引发剂(PEO-DDMAT)的合成：
将单甲氧基聚环氧乙烷(MPEO)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)按照摩尔比为3:1混合后加入到甲苯中，通过共沸蒸馏溶剂来除水，在除水后的溶液中加入步骤(1)所得的三硫酯(DDMAT)，二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐(DPTS)，按照摩尔比为3:8:1，与二氯甲烷混合后，在室温下搅拌，反应20h；过滤得到的混合物，将其滤液滴加到冷的正己烷中，沉淀纯化并在室温下真空干燥，制备得到大分子引发剂(PEO-DDMAT)，在4℃下储存；
(3)PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)的合成：
将步骤(2)所得的大分子引发剂(PEO-DDMAT)与N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、香豆素单体(CMA)按照摩尔比为1:80:11混合后加入到二甲基甲酰胺溶剂中，通入氩气除氧；然后加入自由基引发剂偶氮二异丁腈，与大分子引发剂(PEO-DDMAT)的摩尔比为0.15:1，通入氩气后将反应密封并浸入70℃的油浴锅中，反应24h后，通过暴露于空气终止反应；处理后得到聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)；
(4)PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PtBA的合成：
将步骤(3)所得的聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)与丙烯酸叔丁酯(tBA)按照摩尔比为1:12混合后加入到二甲基甲酰胺溶剂中，通入氩气除氧，加入自由基引发剂偶氮二异丁腈，与聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)的摩尔比为0.15:1，通入氩气后将反应密封并浸入70℃的油浴锅中，反应18h后，通过暴露于空气终止反应，处理后得到聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PtBA；
(5)PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA的合成：
将步骤(4)所得聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PtBA溶解二氯甲烷中，加入摩尔数相当于PtBA的酯基摩尔数5倍的三氟乙酸，常温下搅拌，水解4h，处理后得到聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA；
(6)聚合物囊泡的制备步骤：
将步骤(5)所得聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA溶解在四氢呋喃中，控制浓度为2mg/mL，在剧烈搅拌的条件下，以15d/min的速度将溶液滴加到两倍于四氢呋喃体积的有硫氢化钠的水溶液中，透析除去四氢呋喃，在紫外光下交联，得到包载有硫化氢供体的温度响应型聚合物囊泡；
(7)囊泡表面抗体连接的步骤：
在步骤(6)所得的包载了有硫化氢供体的聚合物囊泡溶液中加入摩尔比为1:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下搅拌30分钟，然后加入链霉亲和素(SA)，继续搅拌12h，在去离子水中透析除去副产物；
将生物素修饰过的Biotin-CD146单克隆抗体按照抗体：链霉亲和素(SA)摩尔比1:4的比例加入包载了有硫化氢供体的囊泡溶液中，避光搅拌过夜，被生物素修饰过的CD146抗体结合在囊泡表面，制备得到包载硫化氢供体并靶向牙周膜干细胞的温敏性聚合物囊泡。
实施例6
一种温敏性聚合物囊泡，粒径为280nm，包括：由两亲性含温敏嵌段聚合物聚氧乙烯-嵌段-聚(N-异丙基丙烯酰胺-无规-甲基香豆素甲基丙烯酸羟乙酯-嵌段-聚丙烯酸组装而成的囊泡本体，结合在囊泡本体上可靶向牙周膜干细胞(PDLSCs)的生物素修饰过的Biotin-CD146单克隆抗体及链霉亲和素(SA)，链霉亲和素(SA)与Biotin-CD146单克隆抗体的摩尔比为8:1。该温敏性聚合物囊可以作为硫化氢载体。
一种温敏性聚合物囊泡的制备方法，采用以下步骤：
(1)链转移剂三硫酯(DDMAT)的合成：
将磷酸钾按二硫化碳质量比为1:3混合加入到丙酮溶剂中反应3h，加入十二碳硫醇加成反应3h，十二碳硫醇与二硫化碳的质量比为1:3，加入2-溴异丁酸酯化反应124h，2-溴异丁酸与二硫化碳的质量比为1:3，经减压蒸馏去除丙酮溶剂，经溶解、萃取、洗涤得到亮黄色的三硫酯(DDMAT)；
(2)大分子引发剂(PEO-DDMAT)的合成：
将单甲氧基聚环氧乙烷(MPEO)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)按照摩尔比为6:1混合后加入到甲苯中，通过共沸蒸馏溶剂来除水，在除水后的溶液中加入步骤(1)所得的三硫酯(DDMAT)，二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐(DPTS)，按照摩尔比为5:12:1，与二氯甲烷混合后，在室温下搅拌，反应20h；过滤得到的混合物，将其滤液滴加到冷的正己烷中，沉淀纯化并在室温下真空干燥，制备得到大分子引发剂(PEO-DDMAT)；
(3)PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)的合成：
将步骤(2)所得的大分子引发剂(PEO-DDMAT)与N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、香豆素单体(CMA)按照摩尔比为1:133:20混合后加入到对二甲苯溶剂中，通入氩气除氧；然后加入自由基引发剂偶氮二异丁腈，与大分子引发剂(PEO-DDMAT)的摩尔比为0.20:1，通入氩气后将反应密封并浸入70℃的油浴锅中，反应24h后，通过暴露于空气终止反应；处理后得到聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)；
(4)PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PtBA的合成：
将步骤(3)所得的聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)与丙烯酸叔丁酯(tBA)按照摩尔比为1:16混合后加入到对二甲苯溶剂中，通入氩气除氧，加入自由基引发剂偶氮二异丁腈，与聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)的摩尔比为0.20:1，通入氩气后将反应密封并浸入70℃的油浴锅中，反应18～48h后，通过暴露于空气终止反应，处理后得到聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PtBA；
(5)PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA的合成：
将步骤(4)所得聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PtBA溶解二氯甲烷中，加入摩尔数相当于PtBA的酯基摩尔数10倍的三氟乙酸，常温下搅拌，水解15h，处理后得到聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA；
(6)聚合物囊泡的制备步骤：
将步骤(5)所得聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA溶解在四氢呋喃中，控制浓度为5mg/mL，在剧烈搅拌的条件下，以45d/min的速度将溶液滴加到两倍于四氢呋喃体积的有硫氢化钠的水溶液中，透析除去四氢呋喃，在紫外光下交联，得到包载有硫化氢供体的温度响应型聚合物囊泡；
(7)囊泡表面抗体连接的步骤：
在步骤(6)所得的包载了有硫化氢供体的聚合物囊泡溶液中加入摩尔比为1:2的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下搅拌30分钟，然后加入链霉亲和素(SA)，继续搅拌12h，在去离子水中透析除去副产物；
将生物素修饰过的Biotin-CD146单克隆抗体按照抗体：链霉亲和素(SA)摩尔比1:8的比例加入包载了有硫化氢供体的囊泡溶液中，避光搅拌过夜，被生物素修饰过的CD146抗体结合在囊泡表面，制备得到包载硫化氢供体并靶向牙周膜干细胞的温敏性聚合物囊泡。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种温敏性聚合物囊泡，其特征在于，包括：
由两亲性含温敏嵌段聚合物组装而成的囊泡本体，
结合在所述囊泡本体上可靶向牙周膜干细胞(PDLSCs)的生物素修饰过的Biotin-CD146单克隆抗体及链霉亲和素(SA)，
所述两亲性含温敏嵌段聚合物为聚氧乙烯-嵌段-聚(N-异丙基丙烯酰胺-无规-甲基香豆素甲基丙烯酸羟乙酯-嵌段-聚丙烯酸。
2.根据权利要求1所述的一种温敏性聚合物囊泡，其特征在于，所述链霉亲和素(SA)与所述Biotin-CD146单克隆抗体的摩尔比为4～8:1。
3.根据权利要求1所述的一种温敏性聚合物囊泡，其特征在于，所述温敏性聚合物囊泡的粒径为100～280nm。
4.如权利要求1所述的一种温敏性聚合物囊泡的制备方法，其特征在于，该方法采用以下步骤：
(1)链转移剂三硫酯(DDMAT)的合成：
将磷酸钾按二硫化碳质量比为1:1～3混合加入到第一类溶剂中反应1～3h，加入十二碳硫醇加成反应1～3h，十二碳硫醇与二硫化碳的质量比为1:1～3，加入2-溴异丁酸酯化反应13～24h，2-溴异丁酸与二硫化碳的质量比为1:1～3，经减压蒸馏去除第一类溶剂，经溶解、萃取、洗涤得到亮黄色的三硫酯(DDMAT)；
(2)大分子引发剂(PEO-DDMAT)的合成：
将单甲氧基聚环氧乙烷(MPEO)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)按照摩尔比为3～6:1混合后加入到甲苯中，通过共沸蒸馏溶剂来除水，在除水后的溶液中加入步骤(1)所得的三硫酯(DDMAT)，二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐(DPTS)，按照摩尔比为3～5:8～12:1，与二氯甲烷混合后，在室温下搅拌，反应20h；过滤得到的混合物，将其滤液滴加到冷的正己烷中，沉淀纯化并在室温下真空干燥，制备得到大分子引发剂(PEO-DDMAT)；
(3)PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)的合成：
将步骤(2)所得的大分子引发剂(PEO-DDMAT)与N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、香豆素单体(CMA)按照摩尔比为1:(80～133):(11～20)混合后加入到第二类溶剂中，通入氩气除氧；然后加入自由基引发剂，与大分子引发剂(PEO-DDMAT)的摩尔比为0.15～0.20:1，通入氩气后将反应密封并浸入70℃的油浴锅中，反应24h后，通过暴露于空气终止反应；处理后得到聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)；
(4)PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PtBA的合成：
将步骤(3)所得的聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)与丙烯酸叔丁酯(tBA)按照摩尔比为1:(12～16)混合后加入到第二类溶剂中，通入氩气除氧，加入自由基引发剂，与聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)的摩尔比为0.15～0.20:1，通入氩气后将反应密封并浸入70℃的油浴锅中，反应18～48h后，通过暴露于空气终止反应，处理后得到聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PtBA；
(5)PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA的合成：
将步骤(4)所得聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PtBA溶解二氯甲烷中，加入摩尔数相当于PtBA的酯基摩尔数5～10倍的三氟乙酸，常温下搅拌，水解4～15h，处理后得到聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA；
(6)聚合物囊泡的制备步骤：
将步骤(5)所得聚合物PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA)-b-PAA溶解在四氢呋喃中，控制浓度为2～5mg/mL，在剧烈搅拌的条件下，以15～45d/min的速度将溶液滴加到两倍于四氢呋喃体积的有硫化氢供体的水溶液中，透析除去四氢呋喃，在紫外光下交联，得到包载有硫化氢供体的温度响应型聚合物囊泡；
(7)囊泡表面抗体连接的步骤：
在步骤(6)所得的包载了有硫化氢供体的聚合物囊泡溶液中加入摩尔比为1:1～2的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下搅拌30分钟，然后加入链霉亲和素(SA)，继续搅拌12h，在去离子水中透析除去副产物；
将生物素修饰过的Biotin-CD146单克隆抗体按照抗体：链霉亲和素(SA)摩尔比1:4～8的比例加入包载了有硫化氢供体的囊泡溶液中，避光搅拌过夜，被生物素修饰过的CD146抗体结合在囊泡表面，制备得到包载硫化氢供体并靶向牙周膜干细胞的温敏性聚合物囊泡。
5.根据权利要求4所述的一种温敏性聚合物囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述第一类溶剂为甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲醇、丙酮、二甲亚砜或二甲基甲酰胺中的一种或几种。
6.根据权利要求4所述的一种温敏性聚合物囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(2)制备得到大分子引发剂(PEO-DDMAT)在4℃下储存。
7.根据权利要求4所述的一种温敏性聚合物囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(3)及步骤(4)中所述自由基引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)。
8.根据权利要求4所述的一种温敏性聚合物囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(3)及步骤(4)中所述第二类溶剂为二氧六环、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、苯甲醚或对二甲苯中的一种或几种。
9.根据权利要求4所述的一种温敏性聚合物囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述硫化氢供体为硫氢化钠。
10.如权利要求1所述的一种温敏性聚合物囊作为硫化氢载体的应用。
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