KR20150069469A

KR20150069469A - 치아 주변 조직의 초자화 동결보존용 조성물 및 이를 이용하는 초자화 동결보존방법

Info

Publication number: KR20150069469A
Application number: KR1020130155916A
Authority: KR
Inventors: 노규진; 박봉욱
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2013-12-13
Filing date: 2013-12-13
Publication date: 2015-06-23
Also published as: KR101551900B1

Abstract

본 발명은 인체로부터 분리된 조직의 초자화 동결보존용 조성물 및 이를 이용하는 초자화 동결보존방법에 관한 것으로, 구체적으로는 에틸렌 글라이콜(Ethylene glycol), 수크로오스(Sucrose) 및 글루코오스를 함유하는 치아 주변 조직의 초자화 동결보존용 조성물과 이를 이용한 동결보존방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 세포의 분리 및 배양 단계 없이 간단한 절차로 치아를 초자화 동결보존할 수 있고, 건강하고 젊은 시기의 줄기세포를 고효율로 보관할 수 있어 세포치료분야에 유용하다.

Description

치아 주변 조직의 초자화 동결보존용 조성물 및 이를 이용하는 초자화 동결보존방법 {Composition for Cryopreservation of Teeth Related Tissues and Cryopreservation Method for Using Same}

본 발명은 인체로부터 분리된 조직의 초자화 동결보존용 조성물 및 이를 이용하는 초자화 동결보존방법에 관한 것으로, 구체적으로는 에틸렌 글라이콜(Ethylene glycol), 수크로오스(Sucrose) 및 글루코오스를 함유하는 치아 주변 조직의 초자화 동결보존용 조성물과 이를 이용한 동결보존방법에 관한 것이다.

사랑니(wisdom tooth, 지치)는 제3 대구치라고도 하며, 일반적으로 큰어금니와 비슷한 형태를 띄면서 큰어금니의 세 번째 위치에 가장 늦게 맹출하는 치아이다. 보통 사춘기를 기점으로 하여 20대 전후에 아래턱과 위턱의 좌우에 한 개씩 총 4개의 사랑니가 치아의 여덞번째 자리에 맹출하게 된다. 정상적으로 맹출할 경우에는 저작 및 관리에 큰 문제가 없는 경우가 많지만 공간이 부족하거나, 맹출 방향이 정상 치열과 다르게 비뚤어지는 경우에는 다양한 질환과 불편을 야기하기도 한다. 사람마다 사랑니의 형태가 매우 다양하게 나타나기도 하며 또한 다른 치아에 비해 퇴화되기도 하여, 그 결과 정상적인 기능을 기대하기 어려운 경우가 나타나기도 한다.

사랑니의 부적절한 맹출에 따른 각종 질환에는 크게 맹출장애(tooth eruption disorder), 충치(dental caries), 치관 주위염(pericoronitis) 및 낭종(cyst)이 있다. 첫째로 맹출장애에 있어서는, 사랑니의 경우 영구치열의 구강 가장 깊은 곳에서 맹출하므로 맹출시에 공간이 부족하여 정상적인 위치에 바로 잡지 못하는 경우가 많다. 정상치열과 비교해서 전후좌우로 비스듬하게 맹출되는 경우가 많으며, 사랑니의 일부만 맹출되는 매복지치의 형태 및 제2 대구치에 걸려서 맹출하지 못하며 압박을 하는 수평지치 형태로 나타나기도 한다. 둘째로 충치에 있어서는, 사랑니는 가장 구강 깊은 곳에 자리잡는 치아이며 교합면의 열구가 보통의 어금니보다 깊은 경향이 있어 위생관리에 소홀하면 쉽게 충치를 유발하게 된다. 충치가 상아질까지 진행이 되면 차가운 자극에 시린 증상이 나타나며, 신경조직이 있는 치수까지 진행이 되면 큰 통증이 나타나게 된다. 셋째로 치관 주위염에 있어서는, 사랑니의 맹출이 일부만 진행 되어 잇몸조직이 부분적으로 사랑니를 덮고 있는 상태에서 세균의 침입에 의한 염증으로 인해 기인한다. 염증으로 인한 충혈 및 출혈이 동반되고 불쾌취, 고름, 부종 등이 발생하기도 한다. 넷째로 낭종에 있어서는, 사랑니와 관련된 염증성 질환이 만성으로 진행되는 경우 발생하며 맹출 부위 주변에 물혹같은 주위 조직을 만드는 병변을 말한다. 사랑니가 제대로 맹출하지 못한 매몰치의 경우에는 낭종이 되거나 세포의 이상증식으로 양성 종양이 생길 수도 있으며, 이는 턱뼈를 점차 흡수하면서 자라게 되어 병변이 상당히 진행된 이후에는 신경조직을 압박하여 통증을 유발한다. 이러한 문제를 예방 및 해결하기 위해서 비정상적인 사랑니의 맹출 및 매복지치의 증상이 진단되면 턱뼈 안에서 사랑니를 제거하는 사랑니 발치를 시행한다.

본 발명자들은 이전에 매복지치 발치시에 얻은 조직(치수, 치낭, 치근유두)을 이용하여 성공적으로 중간엽줄기세포를 분리, 검증 및 임상적용의 결과로 사랑니 주변조직에 줄기세포능이 좋은 세포가 존재하며 임상적 활용가치가 있음을 증명하였다. 첫째로 사람 골수유래, 피부유래 및 치낭유래 줄기세포의 in vitro 및 in vivo 골분화 능력을 비교하여 치낭유래 줄기세포의 골분화 능력이 우수함을 관찰(Park BW et al., Differentiation, 83: 249-259, 2012)하였고, 둘째로 사람 치아 주변 조직에서의 중간엽줄기세포를 분리하고 골분화 특성이 있음을 연구 (Park BW et al., J Oral Maxillofa Surg, 67:507-514, 2009; Song J et al., J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg., 36:186-196, 2010) 하였다.

또한, 사람 지치주변의 골막기원 줄기세포의 분리 골분화 특성의 연구(Park BW et al., Arch Oral Biol,52:983-989, 2007; Park BW et al., Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod., 105:554-560, 2008; Mol Biol Rep 2011;38:1443-1450; Hah YS et al., Mol Biol Rep., 2887-2894, 2011)를 통하여 하악 지치 발치시 골막조직을 소량 채취하여 줄기세포를 추출 및 배양하였고, 사람 골막 기원 세포의 in vitro 골유도시 특정 유전자의 발현 및 억제를 조사하였다.

또 다른 연구에서는 사람 치아유래 줄기세포의 실험실내 분화 및 특성화(Jeon BG et al., Cell Tissue Res., 345:149-161, 2011)를 통해 사람 지치발치 후 치아 주변 조직인 치낭, 치수, 치근유두 조직에서 중간엽줄기세포를 추출하였고 줄기세포의 분화능 telomere 전사인자 등을 확인하였다.

즉, 발치 후 버려지는 사랑니 주위 조직의 자가 줄기세포 치료원으로서의 가능성을 확인하였다.이는 부수적인 수술 없이도 자가줄기세포원을 수집할 수 있으며, 사랑니는 20대 전후의 비교적 성숙한 나이까지 다능성의 줄기세포를 얻을 수 있는 강력한 원천이 될 수 있다. 그러나 발치된 사랑니 및 부속조직물은 의료폐기물로서 버려지고 있는 실정이다.

한편, 줄기세포 연구의 최종 목적 중 하나는 조직재생이나 줄기세포 치료가 필요한 환자에게 자가줄기세포를 공급하여 면역반응이 없으면서 빠른 치료효과를 얻으려는 것이다. 이러한 목적을 위해서는 줄기세포가 필요한 시점에 줄기세포를 채취할 수 있어야 하지만, 현재 줄기세포 관리 실태는 많은 환자들이 줄기세포가 필요한 시점에 자가줄기세포를 확보하기 힘들어 타인의 동종 줄기세포를 이식을 받을 수 밖에 없는 상황이다.

이에, 본 발명자들은 폐기되는 사랑니 주변조직을 동결보존하고자 예의 노력한 결과, 에틸렌 글라이콜(Ethylene glycol), 수크로오스(Sucrose) 및 글루코오스를 함유하는 조직의 초자화 동결보존용 조성물을 이용하고 동결 프로그램에 따라 조직을 초자화 동결보존하는 경우, 조직 내의 세포를 효과적으로 보존할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 인체로부터 분리된 조직의 초자화 동결보존용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 인체로 부터 분리된 조직의 초자화 동결보존방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1~2M 에틸렌 글라이콜(Ethylene glycol), 0.01~0.1M 수크로오스(Sucrose) 및 0.01~0.1M 글루코오스를 함유하는 인체로부터 분리된 조직의 초자화 동결보존용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 조직을 항생제가 함유된 용액으로 세척하는 단계; (b) 상기 세척된 조직을 초자화 동결보존용 조성물과 혼합하는 단계; 및 (c) 상기 혼합물을 동결 프로그램에 따라 동결하는 단계를 포함하는 인체로부터 분리된 조직의 초자화 동결보존방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 세포의 분리 및 배양 단계 없이 간단한 절차로 치아를 초자화 동결보존할 수 있고, 건강하고 젊은 시기의 줄기세포를 고효율로 보관할 수 있어 세포치료분야에 유용하다.

도 1은 Kryo 360-1.7를 이용하여 조직을 동결하는 프로그램 그래프를 나타낸 것이다.
도 2는 치아의 신선 조직 유래 줄기세포를 일차 배양한 모습을 나타낸 사진이다.
도 3은 치아의 동결 조직 유래 줄기세포를 일차 배양한 모습을 나타낸 사진이다.
도 4는 치아의 신선 조직 유래 줄기세포를 약 3주간 2-3차 계대 배양한 사진이다 (좌측: 신선 조직 유래 세포; 우측: 동결 조직 유래 세포).
도 5는 치아의 신선 조직 유래 줄기세포를와 동결 후 해동한 치아의 신선 조직 유래 줄기세포의 증식을 비교한 생장곡선 그래프이다.
도 6은 치아조직 유래 줄기세포를에서 동결 전 후의 줄기세포 마커 발현을 qPCR로 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 기존방법(-1℃/min) 또는 본 발명의 방법을 사용하여 조직을 동결하였을 경우 세포의 생존률을 비교한 결과를 나타낸 것이다 (상단: PI/DAPI 염색 결과 사진; 하단: 염색결과를 정량화한 그래프).
도 8은 골 형성 분화 3주 후 알칼라인포스파테이즈, 알리자린 레드 S 및 폰 코사 염색을 통해 골 분화된 세포에서 골회질(bone minerals)을 관찰한 사진이다.
도 9는 지방 생성 분화 3주 후 오일-레드 O 염색을 통하여 지방 생성 분화된 세포에서 유지질 조직을 관찰한 사진이다. 2)
도 10은 골 형성 분화 3주 후 골 형성 분화된 세포에서 발현되는 오스테오모듈린, 오스테오넥틴 및 BMP2를 RT-PCR을 통하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 지방 생성 분화 3주 후 지방 생성 분화된 세포에서 발현되는 PPARγ2, FABP4 및 LPL을 RT-PCR을 통하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 치아의 신선 조직 유래 줄기세포의 세포 표면 항원인자를 유세포분석기를 통하여 조사한 결과를 나타낸 것이다(상단: 유세포분석 결과; 하단: 유세포분석 결과를 정량화한 그래프).
도 13은 치아의 동결 조직 유래 줄기세포의 세포 표면 항원인자를 유세포분석기를 통하여 조사한 결과를 나타낸 것이다(상단: 유세포분석 결과; 하단: 유세포분석 결과를 정량화한 그래프).
도 14는 동결한 조직과 신선한 조직의 세포자살 관련 유전자 발현을 qPCR을 통하여 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 해동 후 2회 계대한 세포에서 세포자살과 관련한 인자 및 줄기세포 마커 유전자의 발현을 qPCR을 통하여 조사한 결과를 나타낸 것이다(A: qPCR 정량 결과; B: qPCR 산물 전기영동 사진).

본 발명에서는, 동결된 조직 내에 존재하는 세포의 손상을 최소화함으로써 세포의 특성을 성공적으로 유지할 수 있는 조직의 초자화 동결보존용 조성물을 제조하였고 이것을 사용하는 동결 프로그램을 확립하였다.

본 발명은 일 관점에서, 1~2M 에틸렌 글라이콜(Ethylene glycol), 0.01~0.1M 수크로오스(Sucrose) 및 0.01~0.1M 글루코오스를 함유하는 인체로부터 분리된 조직의 초자화 동결보존용 조성물에 관한 것이다.

상기 수크로오스는 다양한 생물체에 높은 농도로 발견되며 생물체가 건조되더라도 생존하게 하는 기능을 가지고 있다. 이 물질은 세포가 동결되거나 건조될 때에 안정되게 하는 기능을 가지고 있어서 이를 혼합한 용액은 세포의 초자화를 형성하여 냉동보존이나 건조과정에서 단백질을 보호하며 인지질의 파괴를 방지함으로서 세포막을 보호한다. 수크로오스의 농도가 0.2M 미만인 경우에는 세포의 해동 후 생존율이 급격이 감소하게 되며, 0.4M을 초과하는 경우에는 세포 독성이 나타나는 문제점이 있다.

상기 에틸렌 글라이콜은 비교적 세포 독성이 적으며, 세포막 내에 빠르게 확산 침투하여 신속하게 평형을 이루는 장점이 있다. 에틸렌글리콜의 함량은 용액 중 40부피% 이상, 바람직하게는 40~60부피%인 것이 바람직하다. 상기 함량이 40부피% 미만인 경우에는 세포의 해동 후 생존율이 급격히 감소하는 문제점이 있으며, 60부피%를 초과하는 경우에는 세포 독성이 나타나는 문제점이 있다.

본 발명에서 사용되는 "초자화 동결보존용 조성물" 이란 동결에 의한 세포의 상해를 방지하는 효과를 가지는 동결 보호제를 적어도 1종류 포함하는 용액을 의미한다. 동결 보호제로서 비세포 침투성 초자화제 및/또는 세포 침투성 초자화제가 이용된다. 비세포 침투성 초자화제로는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 피콜(Ficoll; Amersham Pharmacia·biotech사 제조) 및 덱스트란 등의 다당류 및 자당 등이 바람직하고, 세포 침투성 초자화제로는 글리세롤, 프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜 및 DMSO 등이 바람직하다. 또한, 용매로는 생리적 염류 용액이 바람직하다. 구체적으로는 DMEM, 인산 완충액, 링거액, 링거-록액, 타이로이드액, 아르액, 행크 용액, 록액, 이글의 최소 필수 배양액, 햄의 합성 배양액 F12, 그린 배양액, 레이보빗쯔의 L-15 배양액, 치즈 필수 배양액, 수식 이글 배양액, 웨이마우스 배양액, 크렙스 배양액, 그리고 무혈청 배양액 MCDB153, MCDB151, MCDB104, MCDB131, MCDB402, MCDB201, MCDB302, MCDB105 및 MCDB110 등을 사용할 수 있다. 당업자는 특정 용도에 따라 최대 생존율을 유지하기에 적합한 공지된 동해보호제 및 동결, 저장, 해동 및 세정 절차를 이용하여 상기 용액들을 변형 및 최적화할 수 있다.

본 발명의 조직의 크기는 0.5mm³ 내지 2mm³인 것이 바람직하고, 상기 조직은 치아 주변 조직일 수 있다.

상기 치아 주변 조직은 치낭조직, 치수조직 및 치수유두조직으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 사랑니(wisdom teeth) 주변 조직인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 조직은 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)를 함유하고 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 사랑니 주변 조직을 세척하고 일정크기로 자른 다음, 에틸렌 글라이콜, 수크로오스 및 글루코오스를 함유하는 초자화 동결보존용 조성물과 혼합한 후 동결 프로그램에 따라 조직을 동결보존하였다.

본 발명의 다른 실시예에는 3개월간 보관한 조직을 해동하였다. 액체질소에 보관된 동결용 튜브를 37℃의 물에서 급속 해동한 다음, 동결 보존제를 완전히 제거하기 위하여 수 차례 세척한 후 콜라게나제를 30분간 처리하여 중간엽줄기세포를 분리하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 조직 초자화 동결보존용 조성물과 동결 프로그램을 사용하여 사랑니 주변조직을 동결하는 경우 사랑니 유래 줄기세포의 특성이 동결 후에도 잘 유지되고 있음을 확인하였다. 분리한 줄기세포를 12회 계대한 후 생장곡선을 비교한 결과 세포의 증식능력이 동결전과 거의 유사하였음을 관찰하였고, 세포의 형태 또한 변형 없이 유지되고 있었다. 중간엽줄기세포의 마커 유전자 발현과 표면항원 발현을 qPCR과 유세포분석기로 분석한 결과, 동결한 조직 유래의 세포에서 동결 전과 동일한 수준의 발현을 유지하고 있었으며, 골 형성 분화 및 지방 유도 분화능력 또한 변화없음을 관찰하였다.

다른 관점에서, 본 발명은 (a) 조직을 항생제가 함유된 용액으로 세척하는 단계; (b) 상기 세척된 조직을 초자화 동결보존용 조성물과 혼합하는 단계; 및 (c) 상기 혼합물을 동결 프로그램에 따라 동결하는 단계를 포함하는 조직의 초자화 동결보존방법에 관한 것이다.

상기 동결 프로그램은 (a) 시작온도를 기점으로 3℃ 범위 내에서 30분간 온도를 유지하는 단계; (b) -10.0℃ 내지 -15.0℃ 까지 -1.5℃/min 내지 -2.5℃/min의 속도로 냉각하는 단계; (c) -10.0℃ 내지 -15.0℃ 까지 냉각한 후 5분간 온도를 유지하는 단계; (d) -30.0℃ 내지 -50.0℃ 까지 -0.1℃/min 내지 -0.9℃/min의 속도로 냉각하는 단계; (e) -130.0℃ 내지 -150.0℃ 까지 -5℃/min 내지 -15℃/min의 속도로 냉각하는 단계; 및 (f) 동결된 조직을 액체질소(liquid nitrogen) 하에서 보관하는 단계를 순차적으로 시행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 초자화 동결보존용 조성물은 1~2M 에틸렌 글라이콜(Ethylene glycol), 0.01~0.1M 수크로오스(Sucrose) 및 0.01~0.1M 글루코오스를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명의 동결 프로그램을 사용하여 사랑니 주변조직을 동결하는 경우, 분당 1℃씩 온도를 감소시키는 기존의 방법보다 세포의 생존률이 약 3배 이상 높은 것을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 조직 초자화 동결보존용 조성물과 동결 프로그램을 사용하여 사랑니 주변조직을 동결하는 경우, 세포자살에 관여하는 단백질의 유전자 발현이 감소하고 자살을 억제하는 단백질의 유전자 발현은 증가하며, 이들의 발현이 계배대양에 따라 정상수준으로 돌아오는 것을 확인하였다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 치아 주변 조직의 동결보존과 동결조직에서의 줄기세포 추출 및 배양

본 발명을 위하여 20세 전후의 매복지치 환자에게서 발치 된 후 폐기되는 치아 주변 조직을 이용하였고, 실시예에 사용된 샘플은 경상대학교병원 구강악안면외과에서 제공되었다. 모든 실시예는 윤리기준을 준수하면서 이루어졌다.

실시예에 사용된 치아 주변 조직은 발치 후 4시간 이내에 수송되었으며, 보관 및 수송은 4℃ 조건에서 이루어졌다. 수송된 조직은 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin; Gibco)이 함유된 소독된 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline; Invitrogen)로 수 차례 세척하였다. 조직 내로 동결보호제가 침투하기 쉽도록 조직을 1mm³의 조각으로 분리하였다. 분리한 조각은 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin; Invitrogen)이 함유된 소독된 DPBS로 한번 세척한 후 동결 보존제와 혼합하여, 동결용 튜브(cryotube vial; Thermo scientific)에 옮겼다.

동결 보존제는 1.5M 에틸렌글라이콜(ethylene glycol; Sigma), 0.05M 수크로오스(sucrose; Sigma)와 0.05M 글루코오스(glucose; Sigma)를 DPBS에 혼합하여 제조하였으며 조직-동결 보존제 혼합액은 프로그래밍 동결기(Kryo 360-1.7; Planer)를 이용하여 동결하였다.

동결 프로그램은 다음과 같았다 (도 1). ① 시작온도(Start temperature) + 1℃에서 동결보존제의 침투를 위하여 30분간 조직과 동결 보존제의 평형상태(Equilibrium)를 유지, ② -9.0℃까지 분당 -2.0℃로 냉각, ③ -9.0℃에서 식빙하여 -9.1도로 냉각한 후, 5분간 유지, ④ -40℃까지 분당 -0.3℃로 동결, ⑤ -140℃까지 분당 -10.0℃로 동결, ⑥ -140℃까지 동결된 동결용 튜브를 -196℃ 액체질소(lipuid nitrogen)에 보관.

본 실시예에서 동결된 조직은 최소 3개월간 보관한 후 해동하였다. 조직 해동시 액체질소에 보관된 동결용 튜브를 37℃의 물에서 1~2분간 해동한 후, 동결 보존제를 완전히 제거하기 위하여 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신, 0.25 ㎍/㎖ 암포테리신 B(amphotericin B, Invitrogen)가 함유된 DPBS를 이용하여 1500rpm에 5분간 원심분리하여 수 차례 세척하였다.

조직에서 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)을 분리하기 위하여 collagenase type IV(Sigma, USA)를 30분간 효소처리 하였다. 처리된 조직을 100μm cell strainer (BD FalconTM, USA), 40μm cell strainer(BD FalconTM, USA)에 각각 한차례 거른 후, 15ml 코니컬 튜브(15ml polypropylene conical tube; BD FalconTM, USA)에 옮긴 다음 페니실린/스트렙토마이신, 암포테리신B(amphotericin B, Gibco, USA)가 함유된 DPBS를 이용하여 1500rpm에서 5분간 원심분리하여 두 차례 세척하였다. 10% FBS(fetal bovine serum; Invitrogen, USA), 10 ng/㎖ bFGF(basic fibroblast growth factor; Sigma, USA), 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신 과 0.25 ㎍/㎖ 암포테리신 B를 첨가한 2 ㎖ ADMEM (Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium; Invitrogen, USA) 배지가 함유된 35㎜ 또는 60㎜ 크기의 조직 배양판(tissue culture plates, Nunc, Denmark)에 넣고 38.5℃, 5% CO₂와 습한(humidity) 조건에서 조직 배양을 실시하였다. 일차배양 2일 후 포가 조직 배양판에 부착된 것을 확인하고 부착되지 않은 세포를 제거하고 오염을 방지하기 위하여 배지를 교체하였다. 1주일에 2번씩 배지를 교체하였으며, 융합 세포(confluent cells)는 0.25% Trypsin/EDTA (trypsin-etylenediaminetetraacetic acid; Invitrogen,USA)로 처리한 후 계대배양(subculture) 하고 신선조직 유래 세포(도 2)와 동결조직 유래 세포(도 3)를 비교 관찰하였다. 도 2 및 도 3은 일차 배양판에서 약 1주간 일차배양 후의 모습으로, 초기 치아 주변 조직 유래 세포들의 형태가 heterogeneous한 것이 관찰되었다. 그러나 세포를 약 3주간 2~3차 계대 배양하면서 점차 안정적이고 균일한 모양의 세포의 형태가 관찰되었다 (도 4).

또한 도 5에 나타내었듯이 해동 전 후의 세포증식 능력을 비교한 결과, 동결 후에도 동결전과 거의 동일한 증식능력을 가지는 것으로 조사되어 본 발명에 의한 조직 동결에 의하여 조직 내에 존재하는 세포의 활성이 저해되지 않았음을 나타내었다.

약 2주간 배양한 다음, 균일한 모양의 치아 주변 조직 유래 중간엽줄기세포를 수득하고, qRT-PCR을 통하여 초기전사인자 마커인 Oct-4, Sox-2 및 Nanog의 발현을 확인함으로써 원시적이고 다기능 및 다분화 능력을 가진 줄기세포 및 전구세포임을 확인하였다 (도 6). 본 실시예에 사용된 프라이머는 하기와 같다.

Oct-4의 정방향 프라이머(F) 및 역방향 프라이머(R) (119 bp):

F: 5'-GTGGAGGAAGCTGACAACAA-3' (서열번호 1)

R: 5'-ATTCTCCAGGTTGCCTCTCA-3' (서열번호 2)

Nanog의 정방향 프라이머(F) 및 역방향 프라이머(R) (133 bp):

F: 5'-GCAGATGCAAGAACTCTCCAAC-3' (서열번호 3)

R: 5'-CTGCGTCACACCATTGCTATTC-3' (서열번호 4)

SOX2의 정방향 프라이머(F) 및 역방향 프라이머(R) (77 bp):

F: 5'-TCCACACTCACGCAAAAACC-3' (서열번호 5)

R: 5'-AGTCCCCCAAAAAGAAGTCCAG-3' (서열번호 6)

RPL13a의 정방향 프라이머(F) 및 역방향 프라이머(R) (100 bp):

F: 5'-AAGTACCAGGCAGTGACAG-3' (서열번호 7)

R: 5'-CCTGTTTCCGTAGCCTCATG-3' (서열번호 8)

한편, 실시예에 사용된 조직 초자화 동결용 조성물의 세포에 대한 영향을 알아보기 위하여 해동 후 생존률을 조사하여 기존의 방법과 비교하였다. DAPI/PI 염색을 통하여 기존에 널리 사용되는 동결 프로그램(-1℃/min 동결 프로토콜)과 비교한 결과 기존의 방법을 사용하는 경우 동일한 초자화 동결용 조성물을 사용하였음에도 생존률이 약 25%로 매우 낮았으나, 본 발명의 동결 프로그램을 사용하는 경우 약 80%의 높은 생존률을 가지는 것을 확인하였다 (도 7).

실시예 2: 시험관 내 골 형성( osteogenic ) 및 지방 조직 생성( adipogenic ) 분화

골 형성 유도를 위하여 3번째 계대 배양된 줄기세포가 면적의 약 70%로 배양되었을 때, 배양된 배지를 골형성 유도 배지(10nM dexamethasone(Sigma, USA), 10mM sodium β-glycerophosphate (Sigma, USA) 및 50μM ascorbic acid (Sigma, USA)가 첨가된 DMEM)로 교체하였다.

지방조직 생성 유도를 위하여, 3번째 계대 배양된 줄기세포가 면적의 약 70%로 배양되었을 때, 배양된 배지를 지방 생성 유도 배지(10nM dexamethasone, 0.5mM indomethacin (Sigma, USA), 5 μg/㎖ insulin (Sigma, USA) 및 10% FBS가 첨가된 DMEM)로 교체하였다.

골 형성 및 지방 조직 분화는 3주에 걸쳐 진행되었으며, 상기 배양된 양 배지는 1주일에 2번 교체하였고, 분화된 세포의 존재를 확인하기 위하여 조직화학 염색(histochemical staining) 및 qRT-PCR를 수행하였다.

실시예 3: 분화된 세포의 조직학염색 및 면역화학염색

골 노듈 형성(bone nodule formation) 분석을 위하여, 광물화 기질(mineralized matrix)을 폰 코사(von Kossa), 알리자린 레드(Alizarin red), 알칼라인포스파테이즈 S(Akaline phosphatase S) 염색을 실시하여 측정하였다. 골 형성 유도 3주 후에, 배양된 세포는 DPBS로 30분간 실온에서 4% 중성 완충 포름알데하이드(neutral buffered formaldehyde; Simga)에 고정시켰다. 폰 코사 염색방법은 다음과 같다. 고정한 세포는 증류수로 세척한 후, 5% 질산은 용액(silver nitrate solution, Sigma)으로 처리하였다. 30분간 염색한 후, 증류수를 사용하여 과량의 질산은 용액을 수 회 세척하였다.

알리자린 레드 염색을 위하여 고정한 세포를 증류수로 세척한 후, 2% 알리자린 레드 용액(Alizarin red S, Sigma)으로 처리하였다. 30분간 염색한 후, 과량 염색을 제거하기 위하여 증류수를 사용하여 수 회 세척하였다.

알칼라인포스파테이즈 염색을 위하여 고정한 세포를 증류수로 세척한 후, Tris-HCl용액(100mM Tris-HCl(Sigma), 50mM NaCl(Sigma), 50mM MgCl2, 0.1% Tween-20(Sigma))으로 10분간 3회 처리하였다. 이 후 알칼라인포스파테이즈 용액 (Alkaline phosphatase; Promega, Korea)으로 60분간 염색한 후, 과량의 염색을 제거하기 위하여 증류수를 사용하여 수 회 세척하였다. 그 결과 도 8에 나타내었듯이 알칼라인포스파테이즈는 파란색, 알리자린 레드 S는 붉은색, 폰 코사는 검은색으로 관찰되어 해동한 줄기세포가 골세포 분화능력을 지니고 있음을 확인하였다.

지방 생성 유도 배지의 유지질 노듈(lipoid nodules)는 오일-레드 O(Oli-red O) 염색을 통하여 측정 하였다. 지방 생성 유도 3주 후, 배양된 세포는 PBS로 세척한 뒤, 30분간 실온에서 4% 중성 완충 포름알데하이드(neutral buffered formaldehyde)에 고정시켰다. 오일-레드 O 반응 용액은 오일-레드 O(Oli-re O; Sigma)를 6ml Isoprophanol(Fisher Scientific, USA)과 4 ㎖ 증류수 혼합액에 2 % 농도로 첨가하여 제조하였다. 증류수로 세척한 후, 세포를 오일-레드 O 염색으로 처리하였고, 30분 동안 실온에서 보관하였다. 과량 염색을 제거하기 위하여 증류수로 세포를 수 회 세척하였다. 그 결과 지방 생성 분화된 세포에서 양성의 붉은 유지질 조직(lipoid tissues)이 관찰되었다 (도 9).

실시예 4: RNA 추출 및 qRT - PCR 분석

상기 실시예에서 분화시킨 세포를 배양판으로부터 떼어내어, qRT-PCR로 분화 마커의 발현을 분석하였다. 전체 RNA을 RNeasy Mini Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 배양된 세포로부터 추출하였으며, 올리고-dT 프라이머(oligo-dT primer)로 Omniscript Reverse Transcription Kit(Qiagen)를 이용하여 37℃에서 60분 동안 cDNA를 합성하였다. PCR 증폭을 위해 주형으로 cDNA를 사용하였고, DNA Master SYBR Green I(Roche Diagnostics)를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. qRT-PCR은 Rotor-Gene Q(Qiagen)을 이용하여 수행되었다.

오스테모듈린(osteomodulin), 오스테오넥틴(osteonectin) 및 BMP2(bone morphogenic protein 2)의 유전자 발현을 이용하여 골 형성 분화를 확인하였고, PPARγ2(peroxisome proliferators activated receptor gamma 2), FABP4(fatty acid binding protein 4) 및 LPL(lipoprotein lipase)의 유전자 발현을 이용하여 지방 생성 분화를 확인하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다.

오스테오모듈린의 정방향 프라이머(F) 및 역방향 프라이머(R) (219 bp):

F: 5'-TCCAAGAAATTTGGAACACC-3' (서열번호 9)

R: 5'-TGACCATTAGTGCTTCGTTG-3' (서열번호 10)

오스테오넥틴의 정방향 프라이머(F) 및 역방향 프라이머(R) (202 bp):

F: 5'-GTGCAGAGGAAACCGAAGAG-3' (서열번호 11)

R: 5'-AAGTGGCAGGAAGAGTCGAA-3' (서열번호 12)

BMP2의 정방향 프라이머(F) 및 역방향 프라이머(R) (149 bp):

F: 5'-TAGACCTGTATCGCAGGCACTC-3' (서열번호 13)

R: 5'-GGTTGTTTTCCCACTCGTTTCT-3' (서열번호 14

PPARγ2의 정방향 프라이머(F) 및 역방향 프라이머(R) (124 bp):

F: 5'-TTGCTGTCATTATTCTCAGTGGA-3' (서열번호 15)

R: 5'-GAGGACTCAGGGTGGTTCAGC-3' (서열번호 16)

FABP4의 정방향 프라이머(F) 및 역방향 프라이머(R) (128 bp):

F: 5'-TGAGATTTCCTTCATACTGGG-3' (서열번호 17)

R: 5'-TGGTTGATTTTCCATCCCATT-3' (서열번호 18)

LPL의 정방향 프라이머(F) 및 역방향 프라이머(R) (137 bp):

F: 5'-AGACACAGCTGAGGACACTT-3' (서열번호 19)

R: 5'-GCACCCAACTCTCATACATT-3' (서열번호 20)

95℃에서 10분간 전변성(pre-denatureation) 후, 94℃에서 30초간 변성(denaturation), 60℃에서 30초간 풀림(annealing), 및 72℃에서 15초간 연장(elongation)을 30회 수행하였다. 마지막은 72℃에서 45초간 신장시킴으로서 마무리하였다. 1 ㎍/㎕ EtBr(ethidium bromide)이 첨가된 1% 아가로스겔에 전기 영동함으로써 PCR 생성물을 분리하였고, 자외선을 조사하여 관찰하였다.

그 결과, 골 분화를 유도한 세포에서 골 기질 관련 유전자인 오스테오모듈린(osteomodulin, ODM), 오스테오넥틴(osteonectin, ON) 및 BMP2(bone morphogenic protein 2)가 관찰되었다(도 10). 또한 도 11에 나타내었듯이, 지방 분화를 유도한 줄기세포에서는 지방 생성 분화된 세포에서 발현되는 마커인 PPARγ2 (Peroxisome proliferators activated receptor gamma 2), FABP4 (fatty acid binding protien 4) 및 LPL (ipoprotein lipase)가 발현되는 것을 관찰하였다.

실시예 5: 유세포분석기를 이용한 세포표면 항원인자 조사

세포표면 항원은 중간엽줄기세포 특이적인 항원으로서 CD44(BD pharmingenTM), CD90(BD pharmingenTM), CD105(Santa cruz biotechnology), Vimentin(Sigma), CD34(BD pharmingenTM) 및 CD45(BD pharmingenTM)의 발현 정도를 분석하였다. 배양된 줄기세포를 3번째 계대 배양 후에 배양판으로부터 떼어내어, 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 DPBS로 수 차례 세척한였다. 떼어낸 세포는 1% BSA(bovine serum albumin; Sigma)가 함유된 DPBS 용액으로 4℃에서 40분간 반응을 억제(bloking) 시킨 후, 세포표면 항원에 대한 1차 항체를 4℃에서 50분간 반응시킨 다음, 1% BSA용액으로 1500rpm에서 5분간 두 차례 세척하였다. 이 후 1차 항체에 대한 2차 항체를 4℃에서 50분간 반응 시켰다. 2차 반응은 FITC(Fluorescein isothiocyanate; BD pharmingenTM)가 부착(conjugate)된 항체를 사용하였다. 50분간 반응 후 DPBS로 1500rpm에서 5분간 두 차례 세척 한 후, 5ml 둥근 바닥 튜브(5ml polystyrene round-bottom tube; BD FalconTM)로 옮기고 세포표면 항원의 형광 발현 정도를 조사하기 위하여 FACS Calibur(Becton Dickinson)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 치아 주변 조직유래 줄기세포는 CD44, CD90, CD105 및 vimentin을 발현하고 CD34 및 CD45은 발현하지 않는 것으로 조사되었다 (도 12). 이러한 표면항원 특성은 해동 후에도 동일하게 유지되었으며 발현 강도 또한 동결전과 유사한 것으로 나타나(도 13), 본 발명의 조직 초자화 동결보존용 조성물 및 동결방법이 세포의 특성을 변화시키지 않았음을 증명하였다.

실시예 6: 조직의 동결보존에 따른 세포자살( apoptosis ) 조사

동결 보존의 세포자살에 대한 영향을 조사하기 위하여 세포자살에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 단백질인 Bak, Bcl2, p21 및 p53의 발현을 mRNA 수준에서 조사하였다. qRT-PCR로 분화 마커의 발현을 분석하였다. 전체 RNA을 RNeasy Mini Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 배양된 세포로부터 추출하였으며, 올리고-dT 프라이머(oligo-dT primer)로 Omniscript Reverse Transcription Kit(Qiagen)를 이용하여 37℃에서 60분 동안 cDNA를 합성하였다. PCR 증폭을 위해 주형으로 cDNA를 사용하였고, DNA Master SYBR Green I(Roche Diagnostics)를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. qRT-PCR은 Rotor-Gene Q(Qiagen)을 이용하여 수행되었다.

동결한 조직 전체로부터 얻은 세포의 유전자 발현과 신선한 조직의 유전자 발현을 조사한 결과 세포자살을 유도하는 단백질인 p53, Bak 및 p21의 유전자 발현이 정상보다 억제되어 있고, 세포자살을 막는 역할을 하는 p53의 발현은 증가되어 있어(도 14), 동결에 의한 스트레스에 대하여 세포사멸을 억제하는 방어기전이 나타나고 있는 형태의 유전자 발현 패턴이 나타나고 있음을 관찰하였다. 해동 후 2회 계대한 세포에서 세포자살과 관련한 인자의 유전자 발현을 조사한 결과, 동결당시와는 달리 모든 유전자의 발현이 정상과 유사한 수준으로 회복되어 있었으며, 줄기세포의 다분화 마커인 Nanog 및 Oct4 역시 정상 발현 수준을 나타내었다 (도 15).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의한 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Composition for Cryopreservation of Teeth Related Tissues and Cryopreservation Method for Using Same <130> P13-B194 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct-4 F <400> 1 gtggaggaag ctgacaacaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct-4 R <400> 2 attctccagg ttgcctctca 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog F <400> 3 gcagatgcaa gaactctcca ac 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog R <400> 4 ctgcgtcaca ccattgctat tc 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox-2 F <400> 5 tccacactca cgcaaaaacc 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox-2 R <400> 6 agtcccccaa aaagaagtcc ag 22 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL13a F <400> 7 aagtaccagg cagtgacag 19 <210> 8 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL13a R <400> 8 cctgtttccg tagcctcatg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Osteomodulin F <400> 9 tccaagaaat ttggaacacc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Osteomodulin R <400> 10 tgaccattag tgcttcgttg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Osteonectin F <400> 11 gtgcagagga aaccgaagag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Osteonectin R <400> 12 aagtggcagg aagagtcgaa 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP2 F <400> 13 tagacctgta tcgcaggcac tc 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP2 R <400> 14 ggttgttttc ccactcgttt ct 22 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma F <400> 15 ttgctgtcat tattctcagt gga 23 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma R <400> 16 gaggactcag ggtggttcag c 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FABP4 F <400> 17 tgagatttcc ttcatactgg g 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FABP4 R <400> 18 tggttgattt tccatcccat t 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL F <400> 19 agacacagct gaggacactt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL R <400> 20 gcacccaact ctcatacatt 20

Claims

1~2M 에틸렌 글라이콜(Ethylene glycol), 0.01~0.1M 수크로오스(Sucrose) 및 0.01~0.1M 글루코오스를 함유하는 인체로부터 분리된 조직의 초자화 동결보존용 조성물.

제1항에 있어서, 상기 조직의 크기는 0.5mm³ 내지 2mm³인 것을 특징으로 하는 조직의 초자화 동결보존용 조성물.

제1항에 있어서, 상기 조직은 치낭조직, 치수조직 및 치수유두조직으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조직의 초자화 동결보존용 조성물.

제1항에 있어서, 상기 조직은 사랑니(wisdom teeth) 주변조직인 것을 특징으로 하는 조직의 초자화 동결보존용 조성물.

제1항에 있어서, 상기 조직은 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)를 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 조직의 초자화 동결보존방법.

다음 단계를 포함하는 인체로부터 분리된 조직의 초자화 동결보존방법:
(a) 조직을 항생제가 함유된 용액으로 세척하는 단계;
(b) 상기 세척된 조직을 초자화 동결보존용 조성물과 혼합하는 단계; 및
(c) 상기 혼합물을 동결 프로그램에 따라 동결하는 단계, 상기 동결 프로그램은 (a) 시작온도를 기점으로 3℃ 범위 내에서 30분간 온도를 유지하는 단계;
(b) -10.0℃ 내지 -15.0℃ 까지 -1.5℃/min 내지 -2.5℃/min의 속도로 냉각하는 단계;
(c) -10.0℃ 내지 -15.0℃ 까지 냉각한 후 5분간 온도를 유지하는 단계;
(d) -30.0℃ 내지 -50.0℃ 까지 -0.1℃/min 내지 -0.9℃/min의 속도로 냉각하는 단계;
(e) -130.0℃ 내지 -150.0℃ 까지 -5℃/min 내지 -15℃/min의 속도로 냉각하는 단계; 및
(f) 동결된 조직을 액체질소(liquid nitrogen) 하에서 보관하는 단계를 순차적으로 시행함.

제6항에 있어서, 상기 조직의 크기는 0.5mm³ 내지 2mm³인 것을 특징으로 하는 조직의 초자화 동결보존방법.

제6항에 있어서, 상기 조직은 치낭조직, 치수조직 및 치수유두조직으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조직의 초자화 동결보존방법.

제6항에 있어서, 상기 조직은 사랑니(wisdom teeth) 주변조직인 것을 특징으로 하는 조직의 초자화 동결보존방법.

제6항에 있어서, 상기 조직은 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)를 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 조직의 초자화 동결보존방법.

제6항에 있어서, 상기 초자화 동결보존용 조성물은 1~2M 에틸렌 글라이콜(Ethylene glycol), 0.01~0.1M 수크로오스(Sucrose) 및 0.01~0.1M 글루코오스를 함유하는 것을 특징으로 하는 조직의 초자화 동결보존방법.