CN102596270B - 非拔牙根管填充材料以及非拔牙的牙组织再生方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种非拔牙根管填充材料，该非拔牙根管填充材料对牙根发育完全的牙齿能够实现不发生内部吸收或外部吸收，不出现破牙质细胞，成牙本质细胞平滑地排列在牙本质壁上的牙组织再生。非拔牙根管填充材料(200)含有牙髓干细胞(220)和胞外基质(210)，在摘除牙髓后或对受感染根管进行根管扩大、清创后，插入非拔牙的根管的根尖侧。牙髓干细胞例如为牙髓CXCR4阳性细胞。优选使含有细胞趋化因子、细胞增殖因子、神经营养因子、和血管新生因子中的至少一种因子的趋化因子附着在根管的牙冠侧。

Description

非拔牙根管填充材料以及非拔牙的牙组织再生方法
技术领域
本发明涉及一种填充在非拔牙的根管中的非拔牙根管填充材料，以及使用该非拔牙根管填充材料的非拔牙的牙组织再生方法。
背景技术
目前，牙齿缺失的原因包括牙折在内大约一半是由龋齿造成的，如果摘除牙髓则牙齿缺失的可能性剧增这一情况为人所知。
牙齿的平均寿命据说现在是57岁，如果想要一生都用自己的牙齿咀嚼，则牙齿的寿命需要提高20年以上。虽然进行了8020运动(即使到了80岁自己的牙齿也能残留20颗以上的运动)，但是现在80岁的人牙齿的平均颗数为大约8颗，老年人残存的牙齿数量几乎没有增加，需要对龋齿治疗进行彻底改革。
如果将牙髓除去(摘除牙髓)，则修复性牙本质形成能力和感染防御机制丧失，由于疼痛这一警告信号的丧失导致龋齿扩大的危险性增加。而且，在牙髓摘除治疗中没有完美无缺的方法，在进行牙髓摘除、根管填充后，可能会因填充材料从牙冠侧露出而产生根尖病灶、垂直性牙折或审美性消失、或者术后疼痛。
因此，在超老龄化社会中，以避免轻易摘除牙髓、延长牙齿寿命为目标，开发出由利用了牙齿再生医疗技术的牙本质/牙髓再生所得到的新的龋齿/牙髓炎疗法非常重要。
关于牙本质再生，作为细胞疗法或基因疗法，在生体外向牙髓干细胞/前体细胞内导入骨形态发生蛋白(BMP，Bone Morphogenetic Proteins，成骨因子)等蛋白质或基因，再将进行了三维培养而分化后的成牙本质细胞与其胞外基质一起自体移植到活髓切断面上，能够使大量牙本质再生(非专利文献1、2)。
但是，在产生牙髓炎的情况下，除了牙本质以外还需要使牙髓组织本身再生。
另一方面，牙髓组织是血管和神经极其丰富的组织。在牙髓组织中存在一种自然治愈机制，即：在牙髓受到创伤时会从局部释放出趋化因子，干细胞从牙髓深部血管周围迁移到创伤部位，进行增殖、分化，产生新生血管，形成修复性牙本质。特别是，牙髓的血管系统对营养或氧的供给源、代谢产物的排泄路径、牙髓的恒常性维持很重要。而且，牙髓神经对血流、牙本质小管内溶液的液流、牙髓内压的调节具有重要的作用，对血管新生、免疫应答细胞或炎性细胞的浸润进行干预并调节炎症，有助于维持牙髓的恒常性、强化牙髓防御反应。因此，在牙本质/牙髓再生过程中，需要考虑血管和神经的相互作用以及血管新生、神经再生。
侧群细胞(SP细胞)以大致各占一半的比例含有CD31-/CD146-SP细胞和CD31-/CD146+SP细胞。与CD31-/CD146+SP细胞相比，CD31-/CD146-SP细胞极显著地促进血管新生、神经再生以及牙髓再生，并且显著地对基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的趋化因子受体即CXCR4mRNA进行表达。
从皮肤等创伤部位分泌出SDF-1，由SDF-1引起的人干细胞的迁移依赖于CXCR4的表达这一情况为人所知。CXCR4也被称为干细胞的标记物，从人脐带血分选出胚胎干细胞样细胞作为CXCR4+/SSEA-4+/Oct-4+(非专利文献3)。
作为神经干细胞，从小鼠胎鼠脑部分选出迁移到中枢神经部位且具有显著的神经分化能力的CXCR4+/SSEA-1+细胞(非专利文献4)。
据报告在人胰脏内，CXCR4阳性细胞具有多能性，能够用于对可分化成胰岛素分泌细胞的干细胞、前体细胞(非专利文献5)进行分选。
另一方面，关于牙髓再生，迄今为止还有以下报告：在牙根未发育完全的牙齿中，如果在拔牙并进行牙髓摘除、根管治疗后再次移植，则牙髓可再生。而且，还有以下报告：即使是在根尖部发生病变的牙根未发育完全的牙齿，通过在拔牙后进行彻底的根管扩大、清创，并将血块填充至牙骨质-牙本质界，再用三氧化矿物凝聚体(Mineral TrioxideAggregate，MTA)将窝洞完全封闭，也能 使牙髓样组织再生。
据报告，在犬的牙根发育完全的牙齿中，如果拔牙后摘除牙髓，切断根尖部或者将根尖部扩大1.1mm以上后再进行移植，然后填充血块，则会出现牙髓样组织的再生(非专利文献6)。
上述根管内牙髓再生大部分都是关于牙根未发育完全的牙齿的报告，无法证明已在根管内再生的组织是带有血管、神经的牙髓固有的组织。而且，都是先拔牙再在生体外进行根管扩大、清创，然后进行再移植并填充血块。
非专利文献1：Nakashima和Reddi，2003(PMID12949568 doi10.1038/nbt864)
非专利文献2：Nakashima和Akamine，2006(PMID 16186748)
非专利文献3：KuciaM等，2007(PMID：17136117doi：10.1038/sj.leu.2404470)
非专利文献4：CortiS 等，2005(PMID：16150803doi：10.2478/v10042-008-0045-0)
非专利文献5：KoblasT等，2007(PMID：17328838)
非专利文献6：Laureys 等2001，(PMID：11298308doi：10.1067/mod.2001.113259)
发明内容
-发明所要解决的技术问题-
但是，在先拔牙再在生体外进行根管扩大、清创，然后进行再移植并填充血块的方法中，有时会在牙髓腔、根管内的牙本质发生特发性牙质吸收(内部吸收)，如果该内部吸收增加则会在牙本质上发生穿孔。而且，对于临床上通常进行的将牙根已发育完全的正常智齿等再植入其它牙齿缺失部位的疗法，有可能在再植牙数年后发生由内部吸收或外部吸收引起的牙齿松动或脱落。并且，对于在牙根发育完全牙齿的情况下，摘除牙髓或治疗受感染根管的牙髓组织再生方法以及用于牙髓组织再生的根管填充材料的开发则完全没有确立。
本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于提供一种新型独创且适当的根管填充材料以及使用该根管填充材料的牙组织再生方法。该根管填充材料对牙根发育完全的牙齿能够实现不发生内部吸收或外部吸收，不出现破牙质细胞，成牙本质细胞平滑地排列在牙本质壁上的牙组织再生。
-用以解决技术问题的技术方案-
本发明的第一观点所涉及的非拔牙根管填充材料，该非拔牙根管填充材料含有向摘除牙髓后或者在对受感染根管进行根管扩大清创后，插入非拔牙根管的根尖侧的牙髓干细胞和胞外基质。
优选上述牙髓干细胞包含：牙髓CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-1阳性细胞、CD105阳性细胞、牙髓SP细胞、CD31阴性且CD146阴性细胞、CD24阳性细胞、CD150阳性细胞、CD29阳性细胞、CD34阳性细胞、CD44阳性细胞、CD73阳性细胞以及CD90阳性细胞中的至少任一种。
优选上述牙髓SP细胞为CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-1阳性细胞、CD31阴性且CD146阴性细胞、CD24阳性细胞、CD105阳性细胞、CD150阳性细胞、CD29阳性细胞、CD34阳性细胞、CD44阳性细胞、CD73阳性细胞或者CD90阳性细胞中的任一种。
优选上述非拔牙根管填充材料使牙髓干细胞附着在根管的根尖侧，并且使含有细胞趋化因子、细胞增殖因子、神经营养因子以及血管新生因子中的至少一种因子的趋化因子附着在根管的牙冠侧。
优选上述细胞趋化因子为SDF-1、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干细胞因子(SCF)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、Slit以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)中的至少任一种。
优选上述细胞增殖因子为胰岛素样生长因子(IGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及血小板衍生生长因子(PDGF)中的至少一种。
优选上述神经营养因子为胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经肽Y(NeuropeptideY)以及神经营养蛋白3(Neurotrophin 3)中的至少一种。
优选上述胞外基质由生体亲和性材料组成，该生体亲和性材料包含：胶原蛋白、人工蛋白聚糖、明胶、水凝胶、血纤蛋白、二乙氧磷酰硫胆碱、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、壳多糖、聚乳酸(PLA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙醇酸(PGA)、聚内消旋乳酸(PDLLA)、聚己内酯(PCL)、羟基磷灰石、β-磷酸三钙(β-TCP)、碳酸钙、钛以及金中的至少一种。
优选上述牙髓干细胞在上述胞外基质中的含有率在1×103cell/μl以上1×106cell/μl以下。
本发明的第二观点所涉及的非拔牙的牙组织再生方法，是通过在摘除牙髓后或对受感染根管进行根管扩大清创后的非拔牙根管的根尖侧注入含有牙髓干细胞和胞外基质的非拔牙根管填充材料，使根管内的牙组织再生。
优选上述牙髓干细胞包含：牙髓CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-1阳性细胞、CD105阳性细胞、牙髓SP细胞、CD31阴性且CD146阴性细胞、CD24阳性细胞、CD150阳性细胞、CD29阳性细胞、CD34阳性细胞、CD44阳性细胞、CD73阳性细胞以及CD90阳性细胞中的至少一种。
优选上述牙髓SP细胞为CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-1阳性细胞、CD31阴性且CD146阴性细胞、CD24阳性细胞、CD105阳性细胞、CD150阳性细胞、CD29阳性细胞、CD34阳性细胞、CD44阳性细胞、CD73阳性细胞CD90阳性细胞中的任一种。
优选上述非拔牙根管填充材料使牙髓干细胞附着在根管的根尖侧，并且使含有细胞趋化因子、细胞增殖因子、神经营养因子以及血管新生因子中的至少一种因子的趋化因子附着在根管的牙冠侧。
优选上述细胞趋化因子为SDF-1、VEGF、G-CSF、SCF、MMP3、Slit以及GM-CSF中的至少一种。
优选上述细胞增殖因子为IGF、bFGF以及PDGF中的至少一种。
优选上述神经营养因子为GDNF、BDNF、NGF、神经肽Y以及神经营养蛋白3中的至少一种。
优选上述胞外基质由生体亲和性材料组成，该生体亲和性材料包含：胶原蛋白、人工蛋白聚糖、明胶、水凝胶、血纤蛋白、二乙氧磷酰硫胆碱、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、壳多糖、PLA、PLGA、PEG、PGA、PDLLA、PCL、羟基磷灰石、β-TCP、碳酸钙、钛以及金中的至少一种。
优选在将上述根管填充材料注入上述根管的根尖侧之前，通过对上述根管进行扩大，使根尖部的根管的粗细达到规定大小。
优选上述牙髓干细胞在上述胞外基质中的含有率在1×103cell/μl以上1×106cell/μl以下。
-发明的效果-
根据本发明，对牙根发育完全的牙齿能够实现不发生内部吸收或外部吸收，不出现破牙质细胞，成牙本质细胞平滑地排列在牙本质壁上的牙组织再生。
附图说明
图1是第一实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料的说明图。
图2是对第一实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料的制备工序进行说明的说明图。
图3A是患有牙髓炎的牙齿的说明图。
图3B是说明已进行了摘除牙髓后的根管扩大处置之处的示意图。
图3C是对填充非拔牙根管填充材料之处进行说明的示意图。
图3D是对已注入明胶(spongel)和树脂之处进行说明的示意图。
图3E是表示牙髓再生和血管再生的示意图。
图3F是对已注入形态发生因子和树脂之处进行说明的示意图。
图3G是表示牙本质再生的示意图。
图3H是细菌到达根管壁的牙本质和根尖牙周组织的根尖性牙周炎的示意图。
图4A是使趋化因子附着在根管的牙冠侧的非拔牙根管填充材料的说明图。
图4B是使趋化因子附着在根管的牙冠侧，并且在牙冠部侧残留有胞外基质的非拔牙根管填充材料的说明图。
图5是对第二实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料的制备工序进行说明的说明图。
图6A是拔牙后在生体外进行牙髓摘除后根管扩大，使SDF-1和CD105阳性细胞吸附在I型/III型混合胶原蛋白上，对将吸附有SDF-1和CD105阳性细胞的I型/III型混合胶原蛋白注入根管内并进行再移植14天后的情况进行说明的图。
图6B是拔牙后在生体外进行牙髓摘除后根管扩大，使SDF-1和CD105阳性细胞吸附在I型/III型混合胶原蛋白上，将吸附有SDF-1和CD105阳性细胞的I型/III型混合胶原蛋白注入根管内并进行再移植14天后根管内部牙本质壁的高倍率图像。
图6C是拔牙后在生体外进行牙髓摘除后根管扩大，使SDF-1和CD105阳性细胞吸附在I型/III型混合胶原蛋白上，将吸附有SDF-1和CD105阳性细胞的I型/III型混合胶原蛋白注入根管内并进行再移植14天后牙根外侧的牙本质/牙骨质壁的高倍率图像。
图7A是在未拔牙的情况下在生体内进行牙髓摘除后根管扩大，使SDF-1和CD105阳性细胞吸附在I型/III型混合胶原蛋白上，对将吸附有SDF-1和CD105阳性细胞的I型/III型混合胶原蛋白注入根管内14天后的情况进行说明的图。
图7B是在未拔牙的情况下在生体内进行牙髓摘除后根管扩大，使SDF-1和CD105阳性细胞吸附在I型/III型混合胶原蛋白上，将吸附有SDF-1和CD105阳性细胞的I型/III型混合胶原蛋白注入根管内14天后根管内部牙本质壁的高倍率图像。
图8A是在未拔牙的情况下在生体内进行牙髓摘除后根管扩大，使SDF-1和CXCR4阳性细胞吸附在I型/III型混合胶原蛋白上，对将吸附有SDF-1和CXCR4阳性细胞的I型/III型混合胶原蛋白注入根管内14天后的情况进行说明 的图。
图8B在未拔牙的情况下在生体内进行牙髓摘除后根管扩大，使SDF-1和CXCR4阳性细胞吸附在I型/III型混合胶原蛋白上，将吸附有SDF-1和CXCR4阳性细胞的I型/III型混合胶原蛋白注入根管内14天后根管内部牙本质壁的高倍率图像。
图9A是表示从犬恒牙牙髓组织分离出的由流式细胞术得到的牙髓源性CD105阳性细胞之比例的图。
图9B是表示从犬恒牙牙髓组织分离出的由流式细胞术得到的脂肪源性CD105阳性细胞之比例的图。
图9C是表示从犬恒牙牙髓组织分离出的培养第3天的初代牙髓CD105阳性细胞的图。
图9D是表示从犬恒牙牙髓组织分离出的培养第10天的初代牙髓CD105阳性细胞的图。
图9E是表示从脂肪组织分离出的培养第3天的初代脂肪CD105阳性细胞的图。
图9F是表示从脂肪组织分离出的培养第10天的初代脂肪CD105阳性细胞的图。
图10A是表示在第30天，牙髓CD105阳性细胞的脂肪诱导力的图。
图10B是表示在第30天，未分选的总牙髓细胞的脂肪诱导力的图。
图10C是表示在第30天，脂肪CD105阳性细胞的脂肪诱导力的图。
图10D是表示牙髓CD105阳性细胞、未分选的总牙髓细胞以及脂肪CD105阳性细胞脂肪诱导力的基因表达对比图。
图10E是表示12小时后，牙髓CD105阳性细胞的血管诱导力的图。
图10F是表示12小时后，未分选的总牙髓细胞的血管诱导力的图。
图10G是表示12小时后，脂肪CD105阳性细胞的血管诱导力的图。
图10H是表示在第14天，牙髓CD105阳性细胞的神经球(Neurosphere)形成能力的图。
图10I是表示在第14天，未分选的总牙髓细胞的神经球形成能力的图。
图10J是表示在第28天，对牙髓CD105阳性细胞进行神经丝免疫染色的图。
图10K是表示牙髓CD105阳性细胞的神经丝、神经调制蛋白、电压依赖性钠通道以及Ia型(Scn1A)mRNA表达的图。
图10L是表示在第28天，牙髓CD105阳性细胞的牙本质/成骨诱导力的图。
图10M是表示在第28天，未分选的总牙髓细胞的牙本质/成骨诱导力的图。
图10N是表示在第28天，脂肪CD105阳性细胞的牙本质/成骨诱导力的图。
图10O是表示牙髓CD105阳性细胞、未分选的总牙髓细胞以及脂肪CD105阳性细胞分化为成牙本质细胞的能力对比图。
图10P是表示已添加了SDF-1终浓度50ng/ml的牙髓CD105阳性细胞、未分选的总牙髓细胞以及脂肪CD105阳性细胞的增殖能力的图，表示培养2、12、24以及36小时后的细胞数。
图11A是表示在摘除犬牙髓后第14天，将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图。
图11B是表示在摘除犬牙髓后第14天，将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的局部放大图。
图11C是表示在摘除犬牙髓后第14天，将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的局部放大图。
图11D是表示在摘除犬牙髓后第14天，将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的成牙本质细胞分化的图。
图11E是表示在摘除犬牙髓后第14天，只将CD105阳性细胞自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图。
图11F是表示在摘除犬牙髓后第14天，只将SDF-1自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图。
图11G是表示在摘除犬牙髓后第90天，将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图。
图11H是表示在摘除犬牙髓后第90天，将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图，表示再生组织上部的新生血管。
图11I是表示在摘除犬牙髓后第90天，将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图，表示再生组织中央部的新生血管。
图11J是表示正常牙髓组织的细胞的图。
图11K是表示在摘除犬牙髓后，将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起自体移植到空洞的根管内，在第90天，并列在沿牙本质侧壁重新形成的骨样/管样牙本质(OD)上的成牙本质细胞的图。
图11L是表示在摘除犬牙髓后，将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起自体移植到空洞的根管内，在第90天，由原位杂交分析得到的成牙本质细胞分化的图，表示烯胺素(Enamelysin)/MMP20。
图11M是表示摘除犬牙髓后，将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起自体移植到空洞的根管内，在第90天，由原位杂交分析得到的成牙本质细胞分化的图，表示牙本质涎磷蛋白(Dentin Sialophosphoprotein，Dspp)。
图11N是表示在摘除犬牙髓后第14天，将总牙髓细胞与SDF-1一起移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图。
图11O是表示在摘除犬牙髓后第14天，将总牙髓细胞与SDF-1一起移植到空洞的根管内进行牙髓再生的血管新生的放大图。
图11P是表示在摘除犬牙髓后第90天，将总牙髓细胞与SDF-1一起移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图。
图11Q是表示在摘除犬牙髓后第90天，将总牙髓细胞与SDF-1一起移植到空洞的根管内进行牙髓再生的放大图。
图11R是表示在摘除犬牙髓后第14天，将脂肪CD105阳性细胞与SDF-1一起移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图。
图11S是表示第14天的新生再生组织相对于根管表面积之比例的图，图中 的数据是用5个试样的平均值±SD来表示的比例。
图11T是表示由BS-1凝集素进行免疫染色的图。
图11U是由全样载片(Whole Mount)凝集素染色得到的新生血管的三维解析，是表示移植牙髓CD105阳性细胞存在于新生毛细血管周围之状态的图。
图11V是由全样载片凝集素染色得到的新生血管的三维解析，是表示第14天再生组织的诱导血管之三维图像的图。
图11W是由全样载片凝集素染色得到的新生血管的三维解析，是表示DiI标记的移植细胞分散在整个再生组织中之状态的图。
图11X是表示正常牙髓组织的图。
图11Y是表示第14天的新生再生组织的蛋白基因产物9.5(PGP 9.5)免疫染色的图。
图11Z是表示在下颚第三切牙再生的牙髓组织DiI标记的图。
图12A是表示正常牙髓组织的二维电泳的图。
图12B是表示再生牙髓组织的二维电泳的图。
图12C是使正常牙髓组织的二维电泳与再生牙髓组织的二维电泳重叠所得的图。
图12D是表示正常牙髓组织的二维电泳的图。
图12E是表示牙周膜组织的二维电泳的图。
图12F是使正常牙髓组织的二维电泳与牙周膜组织的二维电泳重叠所得的图。
图13A是表示在犬受感染根管治疗后第14天，将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起自体移植到已拔牙的根管内进行牙髓再生的图。
图13B是表示在犬受感染根管治疗后第14天，将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起自体移植到未拔牙的根管内进行牙髓再生的图。
图13C是表示在犬受感染根管治疗后第14天，将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起自体移植到未拔牙的根管内进行牙髓再生的局部放大图。
图14A是表示在摘除犬牙髓后第14天，将牙髓CD105阳性细胞与G-CSF 一起自体移植到已拔牙的根管内进行牙髓再生的图。
图14B是表示在摘除犬牙髓后第14天，将牙髓CD105阳性细胞与G-CSF一起自体移植到未拔牙的根管内进行牙髓再生的图。
图14C是表示在摘除犬牙髓后第14天，将牙髓CD105阳性细胞与G-CSF一起自体移植到未拔牙的根管内进行牙髓再生的局部放大图。
-附图标记说明-
100 对象牙齿
110 根尖性牙周炎
200 非拔牙根管填充材料
210 胞外基质
220 牙髓干细胞
230 趋化因子
400 管
500 牙本质
610 明胶
620 树脂
630 形态发生因子。
具体实施方式
《第一实施方式》
以下，参照附图对本发明的实施方式进行具体说明。本实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料含有牙髓干细胞和胞外基质，在摘除牙髓后或在对受感染根管进行根管扩大清创后，插入非拔牙的根管的根尖侧。
图1是本实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200的说明图。非拔牙根管填充材料200通过使牙髓干细胞220附着在胞外基质210上而形成。牙髓干细胞220附着在非拔牙根管填充材料200的根管的根尖侧。
牙髓干细胞是源自恒牙或乳牙的牙髓干细胞。牙髓干细胞包含：牙髓 CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-1阳性细胞、CD105阳性细胞、牙髓SP细胞、CD31阴性且CD146阴性细胞、CD24阳性细胞、CD150阳性细胞、CD29阳性细胞、CD34阳性细胞、CD44阳性细胞、CD73阳性细胞以及CD90阳性细胞中的至少一种。例如，犬恒牙牙髓细胞包含0.8％的CXCR4阳性细胞，血管新生能力等组织再生能力较高。
牙髓SP细胞包含：CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-1阳性细胞、CD31阴性且CD146阴性细胞、CD24阳性细胞、CD105阳性细胞、CD150阳性细胞、CD29阳性细胞、CD34阳性细胞、CD44阳性细胞、CD73阳性细胞、或者CD90阳性细胞中的任一种。
应予说明，CD31-/CD146-侧群(SP)细胞若移植到小鼠下肢缺血部位则能促进血流恢复、血管新生，若移植到大鼠脑梗死缺血部位则能促进神经细胞的分化、使运动麻痹康复。而且，CD31-/CD146-SP细胞若移植到犬活髓切断面上则在活髓切断面上的窝洞内出现血管新生、神经再生、牙髓再生。由此，在采用CD31-/CD146-SP细胞作为牙髓干细胞的情况下，虽然认为牙髓再生能力较高，但为了分选SP细胞，需要用DNA结合荧光色素即Hoechst33342对细胞进行标记，因此应用于临床时在安全性方面可能会产生问题。
但是，由于能够不采用因为存在污染的可能性而在临床上无法使用的流式细胞术或者因价格高昂而使用受到限制的抗体珠(Antibody Beads)法对牙髓CXCR4阳性细胞进行分选，而是通过使用了SDF-1、AMD3100、或G-CSF等的迁移法对牙髓CXCR4阳性细胞进行分选，因此能够安全且低成本地进行分选。因此，在用CXCR4阳性细胞作为牙髓干细胞的情况下，能够立刻用于临床，而且还有价格便宜这一重要优点。
牙髓干细胞可以是从接受牙组织再生处置的对象动物本身提取出的自体细胞，也可以是从接受牙组织再生处置的对象动物以外的动物提取出的同种细胞。
优选牙髓干细胞在非拔牙根管填充材料200中的含有率在1×103cell/μl以上1×106cell/μl以下。这是因为如果牙髓干细胞的含有率小于1×103cell/μl，则根管内牙组织的再生可能会不充分。另一方面，如果牙髓干细胞的含有率大于 1×106cell/μl，则可能会对对象牙齿产生难以预料的副作用。
优选胞外基质(支架(Scaffold))210由生体亲和性材料组成，该生体亲和性材料包含：胶原蛋白、人工蛋白聚糖、明胶、水凝胶、血纤蛋白、二乙氧磷酰硫胆碱、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、壳多糖、聚乳酸(PLA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙醇酸(PGA)、聚内消旋乳酸(PDLLA)、聚己内酯(PCL)、羟基磷灰石、β-磷酸三钙(β-TCP)、碳酸钙、钛以及金中的至少一种。应予说明，蛋白聚糖是蛋白质和糖链(糖胺聚糖)以共价键连接而成的一种复合糖。而且，胞外基质还可以使用三维结构体，该三维结构体呈海绵状，由用热塑性高分子等高分子体制成的数均直径为1nm～1000nm的纳米纤维构成。优选这种三维结构体的空隙率为80％～99.99％。
优选作为胞外基质使用的胶原蛋白采用I型胶原蛋白和III型胶原蛋白的混合物即I型/III型混合胶原蛋白。I型胶原蛋白是基础胶原蛋白，即纤维性胶原蛋白。III型胶原蛋白形成与胶原蛋白纤维不同的称为网状纤维的细网眼状结构，成为细胞等的支架。
优选III型胶原蛋白在上述混合胶原蛋白中的比例在10重量％以上50重量％以下。这是因为如果III型胶原蛋白的比例大于50重量％，则混合胶原蛋白可能会无法固化。另一方面，如果III型胶原蛋白的比例小于10重量％，则I型胶原蛋白的比例增加，可能不会发生后述血管新生，而是使牙本质再生。
接着，用图2对本实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200的制备方法进行说明。图2是对非拔牙根管填充材料200的制备方法进行说明的说明图。
非拔牙根管填充材料200通过使牙髓干细胞220附着在胞外基质210的根尖侧而形成。优选牙髓干细胞220附着非拔牙根管填充材料200根尖部的1/4～2/3，更优选附着根尖部的1/3。作为根管填充材料的制备方法的一个具体例，首先，向自动移液器(Pipetman)的内管等中吸入10μl～13μl的I型/III型混合胶原蛋白，然后吸入7μl～10μl混合有牙髓干细胞的I型/III型混合胶原蛋白(例如胶原蛋白XYZ(新田明胶))，总吸入量为20μl。优选在吸入自动移液器的内管 等时以缓慢的速度抽吸，以避免产生气泡。这是因为如果根管填充材料内部产生气泡，则所产生的气泡会妨碍细胞的迁移并不利于牙组织再生的促进。优选自动移液器的内管的内径较细，例如可以使用内管的下内径为0.5～0.7mm的自动移液器，例如可使用QSP公司的H-010-96RS微细吸头(Micro Capillary Tip)。非拔牙根管填充材料的形状没有特别限定，其形状例如为圆锥、圆台、圆柱等。
接着，用图3A～图3F对使用非拔牙根管填充材料200的牙组织再生方法进行说明。
如图3A所示，本实施方式所涉及的牙髓组织再生方法对作为例如患有牙髓炎的对象牙齿100，以非拔牙的方式进行牙组织再生。对象牙齿是指，由于龋齿、牙髓炎等，细菌感染扩及冠部牙髓或根部牙髓的牙齿。
如图3B所示，对对象牙齿100进行牙髓摘除或受感染根管的根管扩大清创。牙髓摘除是指，将存在于牙齿内部的牙髓除去的行为。受感染根管是指，在细菌到达牙髓后再扩及根管壁的牙本质的情况下的根管，根管扩大清创后是指，将受感染根管中的细菌除去后。
优选在摘除牙髓后，通过将对象牙齿的根管扩大，使根尖部的根管的大小达到规定的粗细。这是因为如后所述，将非拔牙根管填充材料200填充到已摘除牙髓或完成受感染根管治疗的根管内时，事先将根管扩大的方式更容易填充非拔牙根管填充材料200，而且血管和神经也更容易从根尖牙周组织进入。此处，根尖是指与对象牙齿的牙槽骨结合的端部(牙根的尖端部分)。
例如，在图3B中，优选根尖部根管的粗细d为根管直径在0.7mm以上1.5mm以下。这是因为如果根管的粗细d小于0.7mm，则血管和神经难以从根尖牙周组织进入，并且非拔牙根管填充材料200的填充可能难以进行；另一方面，如果根管的粗细大于1.5mm，则对象牙齿可能会受到不必要的负担而变得容易破裂。
接着，如图3C所示，用小镊子等将非拔牙根管填充材料200填充到根管的根尖侧。由于非拔牙根管填充材料200含有生物学材料，因此能够作为生物学的根管填充材料。优选将非拔牙根管填充材料200填充到根管内牙髓存在过 之处即牙髓对应部位。应予说明，在胞外基质210为凝胶状的情况下，无法用小镊子等夹住胞外基质210，此时要利用自动移液器、注射等注入胞外基质210。
在将非拔牙根管填充材料200注入根管的根尖侧后，如图3D所示，将明胶610注入非拔牙根管填充材料200的上部，用树脂620将其覆盖。
由此，使根管内的牙组织再生。如图3E所示，再生的牙组织为例如为根管内的牙髓固有组织、血管400、神经等。而且，通过使用骨形态发生蛋白(BMPs)等形态发生因子，再生的牙组织还包括牙本质。并且，在将非拔牙根管填充材料200填充到受感染根管内的情况下，再生的牙组织，还包括牙周膜(使牙齿固立在牙槽骨上的牙周组织)、牙骨质等牙周组织。
然后，如图3F所示，一次性除去树脂620，将BMPs等形态发生因子630或牙本质形成因子涂布在牙冠部牙髓上，用树脂620进行覆盖。如图3G所示，通过将形态发生因子630或牙本质形成因子涂布到牙冠部牙髓上，还能使牙本质500再生。
使用本实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200进行的牙组织再生，在再生组织中未出现内部吸收和外部吸收，而且也未出现破牙质细胞，成牙本质细胞平滑地排列在牙本质壁上。考虑到若出血所产生的血块大量存在则会对牙髓组织再生造成障碍，由于本实施方式所涉及的发明是非拔牙，因此能够将血块的产生抑制得很低，从而能够有效率地促进牙组织再生。并且，由于本实施方式所涉及的发明是非拔牙，因此能够在根管上敷药，待根管扩大后的出血或症状消失后再进行根管填充，从而能够更贴近实际临床治疗。
应予说明，如上所述，对象牙齿100是因龋齿、牙髓炎等细菌感染扩及冠部牙髓或根部牙髓的牙齿，但并不限于此，对象牙齿100还包括神经功能降低咬合感减弱的牙齿。在此情况下，通过在摘除牙髓后填充非拔牙根管填充材料200，能够使牙髓再生以提高咬合感。而且，如图3H所示，对象牙齿100还包括细菌感染扩及根尖牙周组织的牙齿(细菌到达牙髓后再扩及根管壁的牙本质和根尖牙周组织的牙齿)。这样的牙齿多伴随有根尖性牙周炎110。对受感染根管进行根管扩大清创后注入非拔牙根管填充材料200。
《第二实施方式》
图4A和图4B是本发明第二实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200的说明图。如图4A所示，非拔牙根管填充材料200使牙髓干细胞220附着在根管的根尖侧，并使包含细胞趋化因子、细胞增殖因子、神经营养因子以及血管新生因子中的至少一种因子的趋化因子230附着在根管的牙冠侧(例如根管的上部1/2～2/3)。
使牙髓干细胞220附着在根管的根尖侧，并使趋化因子230附着在根管的牙冠侧的原因是，即便让牙髓干细胞220附着至根管的牙冠侧，也无法供给来自组织的营养，可能会发生坏死。而且，附着在根管的根尖侧的牙髓干细胞220被附着在根管的牙冠侧的趋化因子所牵引，易于促进牙组织再生。应予说明，如图4B所示，可以在非拔牙根管填充材料200的根管的牙冠侧残留胞外基质210。
细胞趋化因子是指，通过与受体结合来激活与细胞迁移有关的信号传导系统的分子。细胞增殖因子是指，通过与受体结合来激活与细胞增殖有关的信号传导系统的分子。神经营养因子是指，通过与受体结合来激活与细胞存活有关的信号传导系统的分子。血管新生因子是指，通过与受体结合来激活与血管内皮细胞的增殖、迁移、抗细胞凋亡有关的信号传导系统的分子。
优选细胞趋化因子采用SDF-1、VEGF、G-CSF、SCF、MMP3、Slit以及GM-CSF中的至少一种。特别是MMP3的细胞迁移能较高，可优选使用。
优选细胞增殖因子采用IGF、bFGF以及PDGF中的至少任一种。
优选神经营养因子采用GDNF、BDNF、NGF、神经肽Y以及神经营养蛋白3中的至少一种。
优选血管新生因子采用内皮细胞选凝素(E-selectin)、血管内皮细胞粘附分子1(VCAM1)、ECSCR(Endothelial Cell-specific Chemotaxis Receptor)以及SLC6A6(SoluteCarrier Family 6Member 6)中的至少一种。
趋化因子在附着有趋化因子的胞外基质中的含有率在0.1ng/μl以上500ng/μl以下。这是因为如果趋化因子的含有率小于0.1ng/μl，则迁移程度可能 会减少。另一方面，如果趋化因子的含有率大于500ng/μl，则可能会对对象牙齿产生难以预料的副作用。
接着，用图5对本实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200的制备方法进行说明。图5是对使趋化因子230附着在根管的牙冠侧的非拔牙根管填充材料200的制备方法进行说明的说明图。
作为实施方式2所涉及的非拔牙根管填充材料200的制备方法之一具体例，首先，向自动移液器的内管等中吸入10μl～13μl混合有趋化因子的I型/III型混合胶原蛋白(I型胶原蛋白和III型胶原蛋白的混合比为1∶1)，然后吸入7μl～10μl混合有牙髓干细胞的I型/III型混合胶原蛋白，总吸入量为20μl。在实施方式2中也优选在吸入自动移液器的内管等时以缓慢的速度抽吸，以避免产生气泡。而且，优选自动移液器的内管的内径较细。由此，制备图4A所示的根管填充材料200。
实施方式2所涉及的非拔牙根管填充材料200的使用形态与实施方式1相同，在摘除牙髓后或对受感染根管进行根管扩大清创后，填充到非拔牙根管的根尖侧。
根据本实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200，由于含有趋化因子，故能够更有效率地进行牙组织再生，再生组织中没有内部吸收，也未出现破牙质细胞，成牙本质细胞平滑地排列在牙本质壁上。
《第三实施方式》
在上述第一实施方式中，使牙髓干细胞220附着在非拔牙根管填充材料200的根管的根尖侧形成非拔牙根管填充材料200。但并不限于这样的实施方式，牙髓干细胞220还可以均匀混合在整个非拔牙根管填充材料200中。这种非拔牙根管填充材料200也能够对牙根发育完全的牙齿实现不发生内部吸收或外部吸收，不会出现破牙质细胞，并且成牙本质细胞平滑地排列在牙本质壁上的牙组织再生。
这种非拔牙根管填充材料200例如可通过以下方式制备：将牙髓干细胞与I型/III型混合胶原蛋白(例如胶原蛋白XYZ(新田明胶))不产生气泡地混合均匀。
在上述第二实施方式中，使牙髓干细胞220附着在根管的根尖侧，并使趋化因子230附着在根管的牙冠侧，组成非拔牙根管填充材料200。但并不限于这样的实施方式，牙髓干细胞220和趋化因子230可以一起均匀地混合在整个非拔牙根管填充材料200中。这种非拔牙根管填充材料200也能够实现对牙根发育完全的牙齿不发生内部吸收或外部吸收，不会出现破牙质细胞，并且成牙本质细胞平滑地排列在牙本质壁上的牙组织再生。
该非拔牙根管填充材料200例如可通过以下方式制备：将牙髓干细胞、趋化因子以及I型/III型混合胶原蛋白(例如胶原蛋白XYZ(新田明胶))不产生气泡地混合均匀。
[实施例]
《实施例1》
<细胞分选和特征化>
摘出人牙髓后，用胶原酶在37℃下进行1.5小时酶消化分离出牙髓细胞后，以1×106cells/ml的浓度将细胞分散在含有2％血清的DMEM中，用CXCR4抗体在4℃下标记30分钟，然后进行流式细胞术。人牙髓源性CXCR4阳性细胞占总量的20％。
表1表示流式细胞术的结果。对于CD29和CD44，CXCR4阳性细胞与CD105阳性细胞同样在90％以上。对于CD105，CD105阳性细胞为90.0％，而CXCR4阳性细胞为1.7％。对于CD146，CXCR4阳性细胞与CD105阳性细胞同样为较低值。而且，对于用于未分化的干细胞的标记物即CD150，CXCR4阳性细胞显示出比CD105阳性细胞略高的值。
[表1]
采用实时RT-PCR，用表2和表3所示的引物对牙髓源性CXCR4阳性细胞和牙髓源性CD105阳性细胞进行RNA表达，比较其结果，前血管诱导因子VEGF-A显示出与基准大致相同的表达量，CXCR4阳性细胞的细胞因子GM-CSF表达高达基准的2.5倍，CD105阳性细胞的神经营养因子NGF表达高达基准的2倍，CXCR4阳性细胞的神经肽Y、神经营养蛋白3和BDNF表达比基准略高，CXCR4阳性细胞的干细胞标记物SOX2表达比基准高，CXCR4阳性细胞的Stat3和Rex1表达与基准大致相同。
[表2]
[表3]
<犬牙髓摘除后的牙髓再生>
接着，对采用了CD105阳性细胞和CXCR4阳性细胞的摘除犬牙髓后的牙 髓再生进行说明。
从犬牙髓组织中分选出CD105阳性细胞和CXCR4阳性细胞。向自动移液器的内管中吸入40μl混合有SDF-1(200ng)的胶原蛋白XYZ(新田明胶，I型/III型混合胶原蛋白)，然后吸入20μl混合有1×106个CD105阳性细胞的胶原蛋白XYZ(新田明胶，I型/III型混合胶原蛋白)，总吸入量为60μl，由此制成用于插入已拔牙根管中的根管填充材料。拔去犬上颚前牙后，在培养基中将牙髓除去并扩大到#70，使根尖部根管的粗细在0.7mm以上。在拔牙后30分钟以内将上述根管填充材料填充到已扩大的根管内牙髓存在过之处即牙髓对应部位。在30分钟以内再移植到犬的已拔牙窝洞内，上部用磷酸粘固剂(Phosphate Cement)和化学聚合树脂封闭。14天后将牙齿拔下，制成石蜡标本。结果如图6A所示。根管内牙本质壁的高倍率图像如图6B所示。牙根外侧的牙本质/牙骨质壁的高倍率图像如图6C所示。图6A、图6B和图6C为苏木精-伊红染色(H-E染色)。
接着，向自动移液器的内管中吸入13μl混合有SDF-1(200ng)的胶原蛋白XYZ(新田明胶，I型/III型混合胶原蛋白)，然后吸入7μl混合有1×106个CD105阳性细胞的胶原蛋白XYZ(新田明胶，I型/III型混合胶原蛋白)，总吸入量为20μl，制成非拔牙根管填充材料200。该非拔牙根管填充材料200在根管的牙冠部2/3附着有SDF-1，在根管的根尖侧1/3附着有CD105阳性细胞。不拔去犬上颚前牙，直接将牙髓除去并扩大至#70，使根尖部根管的粗细在0.7mm以上。在拔牙后30分钟以内将上述非拔牙根管填充材料200填充到已扩大的根管内牙髓存在过之处即牙髓对应部位。在30分钟以内上部用磷酸粘固剂和化学聚合树脂封闭。14天后将牙齿拔去，制成石蜡标本。结果如图7A所示。根管内牙本质壁的高倍率图像如图7B所示。图7A和图7B为H-E染色。
向自动移液器的内管中吸入13μl混合有SDF-1(200ng)的胶原蛋白XYZ(新田明胶，I型/III型混合胶原蛋白)，然后吸入7μl混合有1×106个CXCR4阳性细胞的胶原蛋白XYZ(新田明胶，I型/III型混合胶原蛋白)，总吸入量为20μl，制成非拔牙根管填充材料200。该非拔牙根管填充材料200在根管的牙冠部2/3附着有SDF-1，在根管的根尖侧1/3附着有CXCR4阳性细胞。不拔去犬上颚前 牙，直接将牙髓除去并扩大至#70，使根尖部根管的粗细在0.7mm以上。在拔牙后30分钟以内将上述非拔牙根管填充材料200填充到已扩大的根管内牙髓存在过之处即牙髓对应部位。在30分钟以内上部用磷酸粘固剂和化学聚合树脂封闭。14天后将牙齿拔去，制成石蜡标本。结果如图8A所示。根管内牙本质壁的高倍率图像如图8B所示。图8A和图8B为H-E染色。
在新生牙髓组织中，与未拔牙的情况(图7A、图7B以及图8A、图8B)相比较，在拔牙的情况(图6A、图6B和图6C)下，血块残存并出现轻微的炎症。特别是在图6A中，在已再生的牙髓组织内的图中上部出现血块，并呈现小直径血块大量分散在已再生的整个牙髓组织内的状态。而且，在拔牙的情况下，根管内牙本质壁出现破牙质细胞，并出现内部吸收(图6B)。并且，牙根外侧的牙本质/牙骨质出现外部吸收(图6C)。虽然在内部吸收和外部吸收的吸收程度较轻且吸收结束的情况下不会对生活造成障碍，但是在吸收高度进行的情况下，牙齿松动、脱落等危险性提高，而且龋齿或牙周病的风险也提高。
另一方面，在未拔牙的情况下，根管内牙本质壁未出现破牙质细胞，也未出现内部吸收和外部吸收，并且成牙本质细胞平滑地排列在牙本质壁上(图7B、图8B)。而且，作为牙髓干细胞，在采用CD105阳性细胞的情况以及采用CXCR4阳性细胞的情况下，再生牙髓的新生毛细血管、神经和固有牙髓组织的程度二者未出现差异。
从以上结果可知，与填充到已拔牙的根管内的情况相比，填充到非拔牙的根管内的情况明显更有利于牙髓再生。而且还可知，牙髓源性CXCR4阳性细胞与CD105阳性细胞同样对牙髓再生有效。
《实施例2》
接着，在实施例2中，对非拔牙根管填充材料的牙组织再生能力进行更详细的验证。
<采用流式细胞术进行的细胞分选>
从上颚犬牙中分离出牙髓细胞。从同一个体的犬脂肪组织中分离出初代脂肪细胞作为对照。将细胞作为小鼠IgG1阴性对照(W3/25)(AbD Serotec Ltd.， Oxford，UK)进行免疫染色。细胞在小鼠IgG1阴性对照(藻红蛋白，PE)(MCA928PE)(AbD Serotec)和小鼠抗人(Mouse Anti-human)CD105(PE)(43A3)(BioLegend，San Diego，CA，USA)中于4℃下免疫染色90分钟。再次溶解到2μg/ml含有碘化丙锭的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液(Sigma)中，用JSAN(Bay Bioscience，Kobe，Japan)进行分选。牙髓和脂肪源性CD105阳性细胞、CD105阴性细胞、以及未分选的总牙髓细胞接种到35mm胶原蛋白I型置培养皿(Collagentype I Coated dish)(Asahi Technoglass Corp.，Funabashi，JAPAN)中，在添加有10ng/ml胰岛素样生长因子(IGF)(Cambrex Bio Science)、5ng/mlEGF(Cambrex Bio Science)和10％胎牛血清(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，USA)的EBM2(Cambrex BioScience，Walkersville，Maryland，USA)中进行培养，维持细胞的性状。培养基每4～5天更换一次，达到60～70％铺满(confluent)后，在37℃下与0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)反应10分钟，将细胞剥离，以1∶4的比例稀释制成传代细胞。
牙髓CD105阳性细胞进一步对第三代细胞进行特征化，与脂肪CD105阳性细胞和未分选的总牙髓细胞进行比较。用抗体分别对以下物质进行染色：小鼠IgG1阴性对照(AbDSerotec Ltd.)、小鼠IgG1阴性对照(异硫氰酸荧光素，FITC)(MCA928F)(AbD Serotec)、小鼠IgG1阴性对照(藻红蛋白-Cy5，PE-Cy5)(MCA928C)(AbD Serotec)、小鼠IgG1阴性对照(Alexa 647)(MRC OX-34)(AbDSerotec)以及CD24(Alexa Fluor 647)(ML5)(BioLegend)、CD29(PE-Cy5)(MEM-101A)(eBioscience)、CD31(FITC)(Qbend10)(Dako)、CD33(FITC)(HIM3-4)(BD Bioscience)、CD34(别藻蓝蛋白，APC)(1H6)(R&DSystems，Inc.，Minneapolis，MN，USA)、CD44(藻红蛋白-Cy7，PE-Cy7)(IM7)(eBioscience)、CD73(APC)(AD2)(BioLegend)、CD90(FITC)(YKIX337.217)(AbD Serotec)、CD146(FITC)(sc-18837)(Santa Cruz，Biotech，Santa Cruz，CA，USA)、CD150(FITC)(A12)(AbD Serotec)、主要组织相容性复合体I类(MHCclass I)(R-PE)(3F10)(AncellCorporation，Bayport，MN，USA)、主要组织相容性复合体II类(MHC class II)(APC)(TDR31.1)(Ancell)、以及CXCR4(FITC)(12G5)(R&D)。
<采用干细胞标记物、血管新生、神经营养因子的实时RT-PCR进行的表达分析>
为了使细胞组分的性状进一步特征化，用Trizol(Invitrogen)从第三代牙髓和脂肪CD105阳性细胞以及总牙髓细胞中分离出总RNA。在各实验中细胞数的标准为5×104个。使用ReverTra Ace-α(Toyobo，Tokyo，Japan)由总RNA合成第一链cDNA，使用LightCycler-Fast Start DNAmaster SYBR Green I (Roche Diagnostics，Pleasanton，CA)由LightCycler(Roche Diagnostics)以95℃10秒、62℃15秒、72℃8秒的程序，进行上述表2和表3所示的干细胞标记物的犬CXCR4、Sox2、Stat3、Bmil以及Rex1的实时RT-PCR。使用已公开发表的犬cDNA序列制成寡核苷酸引物。犬序列如果没有登录，则使用人序列。为了研究血管新生因子和神经营养因子的mRNA，进行犬基质金属蛋白酶(MMP)-3、VEGF-A、粒细胞-单核细胞集落刺激因子(granulocyte-monocyte colony stimulating factor，GM-CSF)、SDF-1、NGF、BDNF、神经肽Y、神经营养蛋白3、内皮细胞选凝素、VCAMl、斜方蛋白2、ECSCR以及SLC6A6的实时RT-PCR。RT-PCR产物用已登录的cDNA序列进行确认。第三代牙髓CD105阳性细胞和脂肪CD105阳性细胞由β-肌动蛋白标准化，与总牙髓细胞进行比较。
<增殖和迁移分析>
在添加有0.2％牛血清蛋白(Sigma)和SDF-1(50ng/ml)的EBM2中，向96孔板接种103个牙髓CD105阳性细胞，将牙髓CD105阳性细胞对基质细胞衍生因子-1(SDF-1)(Acris，Herford，Germany)的增殖能力与总牙髓细胞和脂肪CD105阳性细胞在第四代细胞中进行比较。将10μl Tetra-colorone(注册商标，Seikagaku Kogyo，Co.，Tokyo，JAPAN)添加到96孔板中，在吸光度450nm下用吸光光度计(absorption spectrometer)测定2、12、24和36小时后的细胞数。将未加入细胞的试样作为阴性对照。
采用水平化学趋化性分析法将牙髓CD105阳性细胞对SDF-1的迁移能力与总牙髓细胞和脂肪CD105阳性细胞进行比较。使用TAXIScan-FL (Effector Cell Institute，Tokyo，JAPAN)进行实时水平化学趋化性分析。TAXIScan-FL在开有6μm孔的硅海绵和玻璃板之间形成最适合于细胞大小的通道，向通道内的一端加入细胞(105个/ml，1μl)，向另一端加入10ng/μl的SDF-1以形成一定浓度梯度，在显微镜下对迁移的细胞进行6小时拍照。
<牙髓和脂肪源性CD105阳性细胞的分选和特征化>
如图9A和图9B所示，采用流式细胞术利用CD105抗体从犬恒牙牙髓组织中分离出的牙髓源性CD105阳性细胞以及同一个体的脂肪组织源性CD105阳性细胞分别为细胞总量的6％和5.8％。而且，如图9C、图9D、图9E和图9F所示，牙髓和脂肪CD105阳性细胞都呈星形且具有长突起。虽未图示，牙髓CD105阴性细胞呈不规则形状且具有短突起。如果将IGF1、EGF和10％胎牛血清添加到EBM2中，则CD105阳性细胞的性状得以维持，即使是第六代细胞也有98％以上的CD105为阳性。如果向35mm胶原蛋白I型置培养皿中接种一个CD105阳性细胞，则在10天内形成集落，显示出该细胞的集落形成能力。牙髓、脂肪CD105阳性细胞和牙髓CD105阴性细胞的细胞附着和增殖效率分别为8％、3.7％、1％。采用有限稀释法对第三代细胞进行分析，集落形成单位(CFU)在牙髓CD105阳性细胞中为80％，在总牙髓细胞中为30％，在脂肪CD105阳性细胞中为50％。
为了进行牙髓CD105阳性细胞的特征化，采用细胞表面抗原标记物进行流式细胞术，将牙髓CD105阳性细胞与脂肪CD105阳性细胞和总牙髓细胞进行比较。在牙髓CD105阳性细胞、脂肪CD105阳性细胞和总牙髓细胞的第三代细胞中，CD29、CD44、CD90和CD105为阳性，CD31为阴性。如下表4所示，应该特别注意，与脂肪CD105阳性细胞和总牙髓细胞相比，牙髓CD105阳性细胞的CD73、CD150和CXCR4的表达更强。
[表4]
与总牙髓细胞相比，在牙髓CD105阳性细胞中，CXCR4、Sox2和BmilmRNA等干细胞标记物的表达高达总牙髓细胞的16.8、64和3.5倍，暗示牙髓CD105阳性细胞作为干细胞的性质。CXCR4、Sox2和BmilmRNA在牙髓CD105阳性细胞中的表达比脂肪CD105阳性细胞更高。如表5所示，VEGF-A、GM-CSF、神经生长因子(NGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经肽Y、神经营养蛋白3、内皮细胞选凝素、VCAM-1等血管新生因子或神经营养因子在牙髓CD105阳性细胞的表达比脂肪CD105阳性细胞更高。
[表5]
<体外的多分化能力>
在第三代到第五代细胞中，诱导牙髓CD105阳性细胞分化成脂肪、血管、神经、以及牙本质/骨，对脂肪CD105阳性细胞和未分选的牙髓细胞进行比较。
如图10A和图10D所示，牙髓干细胞显示出分化成脂肪细胞的分化能力。如图10E所示，牙髓干细胞显示出分化成血管内皮细胞的分化能力。如图10H、图10J和图10K所示，牙髓干细胞显示出分化成神经细胞的分化能力。而且，如图10L和图10O所示，牙髓干细胞显示出分化为成牙本质细胞或骨芽细胞谱系的分化能力。
然而，如图10L和图10M所示，与牙髓CD105阳性细胞相比，在总牙髓细胞中观察到更多钙化基质。而且，如图10C、图10D、图10N、图10O和图 10G所示，脂肪CD105阳性细胞虽然具有脂肪诱导力和骨诱导力，但未出现血管诱导力或神经诱导力。如图10P所示，SDF-1的增殖活性在牙髓CD105阳性细胞中比总牙髓细胞和脂肪CD105阳性细胞更高。应予说明，图10P中的数据采用4个试样的平均值±SD来表示(*P＜0.01)，实验重复进行3次。如TAXIScan-FL所示，SDF-1的迁移活性在牙髓CD105阳性细胞中比总牙髓细胞和脂肪CD105阳性细胞更高。
<干细胞/前体细胞在摘除牙髓后的根管内自体移植>
建立将根尖已发育完全的犬(Narc，Chiba，Japan)恒牙的牙髓全部除去，移植细胞组分使牙髓再生的实验模型。用戊巴比妥钠(Schering-Plough，Germany)全身麻醉后，将上颚第二切牙和下颚第三切牙的牙髓完全除去，用#70K-file(MANI.INC，Tochigi，Japan)将根尖部扩大至0.7mm。使用胶原蛋白XYZ作为胞外基质，采用使牙髓干细胞附着在根尖侧并使SDF-1附着在牙冠侧的根管填充材料。即，将1x106个第三代至第四代牙髓CD105阳性细胞、脂肪CD105阳性细胞或总牙髓细胞与胶原蛋白XYZ(新田明胶，Osaka，Japan)一起进行DiI标记后，自体移植到根管内的下部。再将终浓度15ng/μl的SDF-1与胶原蛋白XYZ一起移植到根管上部。窝洞用磷酸锌粘固剂(EliteCement，GC，Tokyo，Japan)和粘结材料(Clearfil Mega Bond，Kuraray)处理后，再用复合材料树脂(Clearfil FII，Kuraray，Kurashiki，Japan)进行修补。使用15只犬的60颗牙齿。其中，10颗牙齿注入牙髓CD105阳性细胞和SDF-1，5颗牙齿注入脂肪CD105阳性细胞和SDF-1，5颗牙齿注入总牙髓细胞和SDF-1，5颗牙齿只注入SDF-1而不注入细胞，5颗牙齿只注入牙髓CD105阳性细胞而不注入SDF-1，5颗牙齿只注入支架而不注入细胞，在14天后制成标本。6颗牙齿注入牙髓CD105阳性细胞和SDF-1，在28天后进行二维电泳分析。向4颗牙齿中注入牙髓CD105阳性细胞和SDF-1、脂肪CD105阳性细胞和SDF-1、以及总牙髓细胞和SDF-1，90天后制成标本。使用7颗正常牙作为对照。为了进行形态分析，在4℃下用4％低聚甲醛(PFA)(Nakarai Tesque，Kyoto，Japan)固定一夜，用10％甲酸脱灰后，包埋在石蜡(Sigma)中。对石蜡切片(厚度5μm)进行苏木精-伊红(H-E)染色， 并进行形态学观察。
为了进行血管染色，对厚度5μm的石蜡切片进行脱石蜡，用荧光素-加纳籽(Griffonia(Bandeiraea)Simplicifolia)凝集素1/荧光素-雪花莲(galanthus nivalis(snowdrop))凝集素(20μg/ml，Vector laboratories，Inc.，Youngstown，Ohio)染色15分钟，用荧光显微镜BIOREVO，BZ-9000(KEYENCE，Osaka，Japan)观察移植细胞在新生血管中的存在和定位性。用4％低聚甲醛将移植14天后的再生牙髓和正常牙髓固定45分钟后，用0.3％含有Triton X的PBS处理，然后进行封阻，用GS-IB4(Griffoniasimplicifolia，AlexaFluor 488)凝集素在4℃下进行12小时全样载片免疫染色。用双光子显微镜FV1000MPE(Olympus)对新生血管和移植细胞进行三维照相。
新生神经的染色采用以下方式进行：对厚度5μm的石蜡切片进行脱石蜡，用含有3％曲通X(Triton X)的PBS处理后，用2％山羊血清进行封阻，再用PGP-9.5在4℃下进行12小时第一次染色。用PBS洗涤三次后，用生物素化羊抗兔IgG(Biotinylated Goat Anti-rabbit IgG)(Vector)(1∶200)在室温下进行1小时第二次染色。用ABC试剂(VectorLaboratories，Burlingame，CA)处理后，再用DAB进行10分钟发色。
为了确认新生神经突起与下牙槽神经相关，将未进行DiI标记的牙髓CD105阳性细胞移植到下颚第三切牙，移植后第14天在再生牙髓上使用DiI，移植后第17天摘除下颚骨，用荧光显微镜(Leica，M 205FA，Wetzlar，Germany)进行观察。
为了对第14天的再生牙髓的再生量进行统计分析，从注入牙髓CD105阳性细胞和SDF-1的标本、注入脂肪CD105阳性细胞和SDF-1的标本、注入总牙髓细胞和SDF-1的标本、只注入SDF-1而不注入细胞的标本、只注入牙髓CD105阳性细胞而不注入SDF-1的标本、以及只注入支架而不注入细胞的标本的每个标本中选5颗牙齿，以150μm间隔用立体显微镜(Leica，M 205FA)进行拍照，并且用Leica Application Suite software进行解析。新生再生组织与根管表面积的比例通过每颗牙齿的三个位置的平均值进行计算。统计计算采用Student t检验进行。
在牙髓CD105阳性细胞和SDF-1移植后第90天的5μm-石蜡切片中，利用原位杂交在根管的侧壁观察生体内的成牙本质细胞分化标记物即牙本质涎磷蛋白(Dspp)和烯胺素的表达。分别用NcoI和Spe I切断犬Dspp(183bp)和烯胺素(195bp)的cDNA并线性化成线状，制成anti-senseprobes。在对PCR产物进行亚克隆后，由质粒制成探针，并由在实时RT-PCR中使用的表2和表3记载的引物制成探针。由TSA系统(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)检测出DIG信号。
<由牙髓CD105阳性细胞的摘除牙髓后根管内移植进行的牙髓再生>
接着，按照如上述图3所示的顺序，在将根尖已发育完全的犬恒牙的牙髓摘除后，将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起自体移植到根管内。图11A是表示由SDF-1和牙髓CD105阳性细胞进行的牙髓再生的图。图11B是图11A中区域B的放大图。图11C是图11A中区域C的放大图。如图11A、图11B和图11C所示，如果将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起移植，则牙髓样组织在14天以内形成。如图11E所示，虽然即使只移植CD105阳性细胞也能形成牙髓样组织，但CD105阳性细胞与SDF-1一起移植时能够进一步促进牙髓样组织的形成。另一方面，如图11F所示，如果只移植SDF-1，则仅能形成极少量的牙髓。如图11S所示，如果采用非成对student t检验进行统计分析，则与只移植CD105阳性细胞或只移植SDF-1的情况相比，将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起移植时再生面积显著增加(分别增加3.3倍和4.2倍)。如图11D所示，成牙本质细胞样细胞附着在根管的牙本质壁上，在小管内将突起拉长。如图11G所示，将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起移植时，牙髓样组织在90天后到达牙骨质釉质界。如图11H所示，存在于再生组织上部的细胞呈纺锤形，如图11I所示，在中央部呈星状。这些再生组织与图11J所示的正常牙髓组织的细胞相似。如图11G和图11K所示，应该特别说明，沿着牙本质侧壁观察到管样牙本质。如图11L和图11M所示，存在并排列于牙本质侧壁的成牙本质细胞是成牙本质细胞的两个标记物即烯胺素/基质金属蛋白酶(MMP)20和Dspp 阳性细胞。
但是，如图11N和图11O所示，在移植未分选的总牙髓细胞来代替CD105阳性细胞的情况下，只能再生更加少量的牙髓组织。如图11P的箭头表示的钙化组织和图11Q中用“OD”表示的骨样牙本质所示，在90天后出现钙化。如图11R所示，即使在同样移植了脂肪源性CD105阳性细胞的情况下，也只能观察到更少量的再生组织。如图11S所示，通过进一步的统计分析可知，与将脂肪CD105阳性细胞与SDF-1一起移植、或者将总牙髓细胞与SDF-1一起移植的情况相比，将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起移植的情况在第14天，新生再生组织相对于根管的表面积的比例显著提高(51.6倍和2.2倍)。如图11T所示，用BS-1凝集素对冷冻切片进行染色后，利用共聚焦激光扫描显微镜分析，确认再生组织中的血管新生情况。如图11U所示，利用双光子显微镜分析，在新生毛细血管附近观察到大量由DiI标记的移植牙髓CD105阳性细胞，暗示血管新生中的这些细胞具有释放出血管新生因子的作用。如图11V所示，在第14天内再生组织诱导血管的三维图像在密度和方向性方面与图11X所示的正常牙髓的图像相似。图如11W所示，观察到已移植的CD105阳性细胞遍布新的再生牙髓，暗示通过SDF-1使牙髓CD105阳性细胞具有迁移到上部的能力。如图11Y所示，由PGP9.5抗体染色的神经突起从根尖孔延长到新的再生组织中。如图11Z所示，表明对在下颚第三切牙再生的牙髓组织进行DiI标记后，在新生牙髓组织(用虚线表示)中再生的神经与下牙槽神经相连。
<牙髓再生的二维电泳分析和基因表达分析>
为了对再生组织进行二维电泳分析，将第28天的再生牙髓样组织、正常牙髓组织和牙周膜组织切细，溶解于裂解缓冲液(lysis buffer)(6M尿素，1.97M硫脲，2％(w/v)CHAPS，64.8mM DTT，2％(v/v)Pharmalyte)，进行超声。在4℃下以15000rpm离心15分钟，对上清液进行二维电泳。等电点聚焦电泳(IEF)由CoolPhoreSter2-DE system进行。IPG胶条(IPG strips)(Immobiline DryStrips，pH4～7，18cm，GE)按照制造商的指示使用。IPGstrips用重泡胀液(rehydration solution)(6M尿素，1.97M硫脲，2％(v/v)Triton X-100，13mM DTT， 2％(v/v)Pharmalyte，2.5mM乙酸，0.0025％BPB)在20℃下进行重性水化一夜。等电点聚焦电泳(IEF)采用以下方式进行：以500V下2小时、700～3000V下1小时、以及3500V下24小时的梯度缓慢升高电压。进行等电点聚焦电泳后，使IPG strips在平衡缓冲液(equilibration buffer)(6M尿素，2.4mM DTT，5mMTris-HCl，pH6.8，2％(w/v)SDS，0.0025％BPB，30％(v/v)甘油)中于室温下反应30分钟。再让IPG strips在5mM Tris-HCl、pH6.8、2％(w/v)SDS、0.0025％BPB、30％(v/v)甘油、243mM碘乙酰胺中于室温下平衡20分钟。然后，在12.5％SDS-PAGE凝胶(20cm×20cm)中以25mA/gel进行15分钟二维电泳，然后以30mA/gel进行电泳。用Flamingo凝胶荧光染料(Flamingo Fluorescent GelStain)(Bio-Rad Laboratories，CA，USA)对凝胶进行染色，然后用FluoroPhorester3000(Anatech，Tokyo，Japan)进行扫描。用Progenesis(Nonlinear Dynamics，NC，USA)对凝胶图像进行分析，并对各图像的模式进行比较。
采用牙周膜的特异性犬轴蛋白2、periostin和asporin/牙周膜相关蛋白1(Periodontal Ligament-Associated Protein 1，PLAP-1)进行实时RT-PCR分析。将胶原蛋白aI(I)型、黏结蛋白聚糖3和生腱蛋白C在再生组织中的表达与正常牙髓和牙周膜进行比较。
<采用二维电泳对再生牙髓进行的蛋白化学分析和基因表达解析>
如图12A、图12B和图12C所示，通过二维电泳分析，明确了再生牙髓组织在第28天定性和定量的蛋白表达模式与同一个体源性正常牙髓组织相似。在正常牙髓组织和再生牙髓组织中均出现的蛋白斑点(protein spot)为85.5％(123个斑点)。另一方面，如图12D、图12E和图12F所示，正常牙髓组织的蛋白斑点与牙周膜组织不同。因此，通过二维电泳分析明确了再生组织是能发挥功能的正常牙髓组织。
至此还未在牙髓组织中发现特异性标记物。因此，为了证明再生组织是正常的牙髓组织，采用axin2、periostin和asporin/PLAP-1作为牙周膜组织的特异性标记物。axin2、periostin和PLAP-1的mRNA在正常牙周膜中的表达在第28天分别高达在再生牙髓组织中的表达的25531倍、179倍和11倍。如表6所示， 这些基因在正常牙髓中的表达与在再生组织中的表达大致相同(0.4倍、0.4倍和2.4倍)。
[表6]
如表6所示，胶原蛋白αI(I)在牙周膜中的表达高达再生组织的9.3倍，在正常牙髓与再生牙髓之间几乎未出现差异。由此可知，黏结蛋白聚糖3和生腱蛋白C在牙髓组织中表达较高，而在再生组织中的表达分别高达牙周膜的14.3倍和50.0倍。因此，通过二维电泳分析和基因表达分析，可明确再生组织是能发挥功能的正常牙髓组织。
<由牙髓CD105阳性细胞的受感染根管治疗后向根管内自体移植进行的牙髓再生>
将根尖已发育完全的犬恒牙的牙髓全部除去，用K-file将根尖部扩大至#30，保持此状态将根管敞开放置2周，制成受感染根管牙齿模型。然后，交替用次氯酸钠和过氧化氢溶液洗涤，将根管洗涤液(日文名称：スメァクリ一ン)放入根管内30秒钟后，再用生理盐水洗涤。接着，将甲醛煤酚(FC)帖在根管内1周，实现根管内无菌化。然后，再次用生理盐水洗涤，用纸针(Paper Point)使根管内干燥。采用胶原蛋白XYZ作为胞外基质，并且采用使牙髓干细胞附着在根尖侧且使SDF-1附着在牙冠侧的根管填充材料。即，采用与摘除牙髓后根管内自体移植相同的方法，将1x106个第三代到第四代牙髓CD105阳性细胞与胶 原蛋白XYZ一起自体移植到根管内下部。再进一步将终浓度15ng/il的SDF-1与胶原蛋白XYZ一起移植到根管上部，用磷酸锌粘固剂和复合材料树脂修补窝洞。14天后制成标本。采用通用方法进行形态学观察。
图13A是表示由SDF-1和牙髓CD105阳性细胞进行的牙髓再生的图。图13B是已在图13A的根管内再生的牙髓组织中央部的放大图。图13C是已在图13A的根管内再生的牙髓组织的与牙本质侧壁接触的部位之放大图。如图13A、图13B和图13C所示，如果将牙髓CD105阳性细胞与SDF-1一起移植，则在13天以内形成牙髓样组织。如图13B所示，牙髓组织内出现新生血管和牙髓细胞，但也有若干炎性细胞散布。如图13C所示，成牙本质细胞样细胞附着存在排列于根管的牙本质侧壁上。
《实施例3》
接着，在实施例3中，使用趋化因子G-CSF和牙髓CD105阳性细胞，对填充到已拔牙的根管中的情况与填充到非拔牙的根管中的情况进行比较。
与上述实施例1和实施例2相同，在将犬前牙拔下后，将5x105cell(10μl)牙髓CD105阳性细胞与作为支架的胶原蛋白XYZ一起移植到根管内下部，并且将200ng(10μl)G-CSF作为趋化因子移植到根管内上部，经过14天。结果如图14A所示。如图14A所示，牙髓样组织只有少量形成，如箭头所示，出现强炎症图像和外部吸收。
接着，在未拔下犬前牙的情况下，将5x105cells(10μl)牙髓CD105阳性细胞与作为支架的胶原蛋白XYZ一起移植到根管内下部，并且将200ng(10μl)G-CSF作为趋化因子移植到根管内上部，经过14天。结果如图14B所示。如图14B所示，牙髓样组织显著形成，未出现炎症图像。而且也未出现外部吸收。图14C是图14B所示箭头部分的牙髓样组织的放大图。如图14C所示，在再生牙髓样组织中，存在细长的纺锤形纤维芽细胞样牙髓细胞，未出现炎性细胞。
-序列表之非关键词文字-
序列号1～64：引物

Claims (7)

1.一种非拔牙根管填充材料，为在摘除牙髓后或者在对受感染根管进行根管扩大清创后插入非拔牙根管的根尖侧的非拔牙根管填充材料，其特征在于：
该非拔牙根管填充材料含有：
(a)通过分选包含90％以上的CD105阳性牙髓干细胞；和
(b)胞外基质。
2.根据权利要求1所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于：
所述非拔牙根管填充材料使所述牙髓干细胞附着在根管的根尖侧，并且使含有细胞趋化因子、细胞增殖因子、神经营养因子以及血管新生因子中的至少一种因子的趋化因子附着在根管的牙冠侧。
3.根据权利要求2所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于：
所述细胞趋化因子为基质细胞衍生因子-1、血管内皮细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、干细胞因子、基质金属蛋白酶3、Slit以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中的至少任一种。
4.根据权利要求2所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于：
所述细胞增殖因子为胰岛素样生长因子、碱性成纤维细胞生长因子以及血小板衍生生长因子中的至少一种。
5.根据权利要求2所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于：
所述神经营养因子为胶质细胞系衍生神经营养因子、脑衍生神经营养因子、神经生长因子、神经肽Y以及神经营养蛋白3中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于：
所述胞外基质由生体亲和性材料组成，该生体亲和性材料包含：胶原蛋白、人工蛋白聚糖、明胶、水凝胶、血纤蛋白、二乙氧磷酰硫胆碱、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、壳多糖、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚乙二醇、聚乙醇酸、聚内消旋乳酸和聚己内酯中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于：
所述牙髓干细胞在所述胞外基质中的含有率在1×103cell/μl以上1×106cell/μl以下。
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