WO2011030552A1 - 非抜歯根管充填材及び非抜歯による歯組織再生方法 - Google Patents

非抜歯根管充填材及び非抜歯による歯組織再生方法 Download PDF

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WO2011030552A1
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dental pulp
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中島美砂子
庵原耕一郎
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独立行政法人国立長寿医療研究センター
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    • A61L2430/12—Materials or treatment for tissue regeneration for dental implants or prostheses

Definitions

  • the present invention relates to a non-extraction root canal filling material filled in a non-extraction tooth root canal, and a tooth tissue regeneration method in non-extraction using the non-extraction tooth root canal filling material.
  • the average life of a tooth is said to be 57 years old. Considering that you will bite with your own teeth for the rest of your life, it is necessary to increase the life of your teeth by 20 years or more. Despite the 8020 exercise (exercises that leave 20 or more teeth even when they are 80 years old), the average number of teeth of an 80-year-old person is about 8, and the number of remaining teeth of the elderly has almost increased. There is no need for drastic reform of caries treatment.
  • dentin regeneration as a cell therapy or gene therapy, proteins or genes such as BMP (Bone morphogenetic proteins) are introduced into dental pulp stem cells / progenitor cells in vitro and differentiated by three-dimensional culture A large amount of dentin can be regenerated by autotransplanting the odontoblasts together with its extracellular matrix onto the living pulp cut surface (Non-patent Documents 1 and 2).
  • BMP Bis morphogenetic proteins
  • dental pulp tissue is a tissue rich in blood vessels and nerves.
  • a migratory factor is released from the local area, and stem cells migrate from the periphery of the deep pulp to the wound, proliferate and differentiate, revascularize, and form a repair dentin.
  • the vascular system of the pulp is important for the supply of nutrients and oxygen, the metabolic pathway, and the maintenance of pulp homeostasis.
  • the pulpal nerve plays an important role in the regulation of blood flow, the flow of dentinal tubules, and the pressure in the pulp, and regulates inflammation by participating in angiogenesis, immune response cells or inflammatory cell infiltration, and makes the pulp constant. Contributes to maintaining sex and strengthening dental pulp defense response. Therefore, in dentin / dental regeneration, it is necessary to consider the interaction between blood vessels and nerves, and angiogenesis / nerve regeneration.
  • SP cells contain CD31- / CD146-SP cells and CD31- / CD146 + SP cells in almost half the proportion, and CD31- / CD146-SP cells are significantly more significant than CD31- / CD146 + SP cells. It promotes angiogenesis, nerve regeneration, and dental pulp regeneration, and significantly expresses chemokine receptor, CXCR4 mRNA for Stromalcell-derived factor-1 (SDF-1).
  • SDF-1 Stromalcell-derived factor-1
  • CXCR4 is also said to be a marker for stem cells, and embryonic stem cell-like cells are sorted from human umbilical cord blood as CXCR4 + / SSEA-4 + / Oct-4 + (Non-patent Document 3).
  • Non-patent Document 4 CXCR4 + / SSEA-1 + cells that migrate to the central nerve site and have remarkable nerve differentiation ability have been collected from the brains of mouse fetuses as neural stem cells.
  • CXCR4-positive cells are said to have multipotency and can be used to sort stem cells / progenitor cells that can differentiate into cells secreting insulin (Non-patent Document 5). .
  • Non-Patent Document 6 extraction of the pulp after extraction and cutting of the apex or enlargement of the apex by 1.1 mm or more, transplantation again, and filling of the blood clot can regenerate the pulp-like tissue.
  • the present invention has been made in view of such problems, and does not generate internal absorption or external absorption with respect to a complete tooth root, no occlusion cells are seen, and odontoblasts are smooth on the dentin wall. It is an object of the present invention to provide a novel, original and appropriate root canal filling material that aims to regenerate tooth tissues, and a tooth tissue regeneration method using such a root canal filling material.
  • the non-extracted root canal filling material according to the first aspect of the present invention is a dental pulp stem cell and extracellular matrix that are inserted into the apical side of the non-extracted root canal after extraction or after root canal expansion cleaning of the infected root canal It is characterized by having.
  • the dental pulp stem cells are dental pulp CXCR4 positive cells, SSEA-4 positive cells, FLK-1 positive cells, CD105 positive cells, dental pulp SP cells, CD31 negative and CD146 negative cells, CD24 positive cells, CD150 positive cells, CD29 positive cells , CD34 positive cells, CD44 positive cells, CD73 positive cells, and CD90 positive cells.
  • the dental pulp SP cells are CXCR4 positive, SSEA-4 positive, FLK-1 positive, CD31 negative and CD146 negative, CD24 positive, CD105 positive, CD150 positive, CD29 positive cell, CD34 positive cell, CD44 positive cell, CD73 positive cell, Alternatively, it is preferably any of CD90 positive cells.
  • the non-extracted root canal filling material attaches dental pulp stem cells to the apical side of the root canal, and at least one of cell migration factor, cell growth factor, neurotrophic factor and angiogenic factor on the crown side of the root canal It is preferable to attach a migratory factor including one.
  • the cell migration factor is preferably at least one of SDF-1, VEGF, G-CSF, SCF, MMP3, Slit, and GM-CSF.
  • the cell growth factor is preferably at least one of IGF, bFGF and PDGF.
  • the neurotrophic factor is preferably at least one of GDNF, BDNF, NGF, NeuropeptideY and Neurotrophin®3.
  • the extracellular matrix is collagen, artificial proteoglycan, gelatin, hydrogel, fibrin, phosphophorin, heparan sulfate, heparin, laminin, fibronectin, alginic acid, hyaluronic acid, chitin, PLA, PLGA, PEG, PGA, PDLLA, PCL, It is preferably made of a biocompatible material containing at least one of hydroxyapatite, ⁇ -TCP, calcium carbonate, titanium and gold.
  • the content rate of the dental pulp stem cells in the extracellular matrix is preferably 1 ⁇ 10 3 cells / ⁇ l or more and 1 ⁇ 10 6 cells / ⁇ l or less.
  • the tooth tissue regeneration method by non-extraction provides a pulp stem cell and an extracellular matrix on the apical side of the non-extraction root canal after extraction or after root canal enlargement cleaning of the infected root canal
  • the tooth tissue in the root canal is regenerated by injecting a non-extracted root canal filling material having
  • the dental pulp stem cells are dental pulp CXCR4 positive cells, SSEA-4 positive cells, FLK-1 positive cells, CD105 positive cells, dental pulp SP cells, CD31 negative and CD146 negative cells, CD24 positive cells, CD150 positive cells, CD29 positive cells, CD34 It is preferable to include at least one of positive cells, CD44 positive cells, CD73 positive cells, and CD90 positive cells.
  • the dental pulp SP cells are CXCR4 positive, SSEA-4 positive, FLK-1 positive, CD31 negative and CD146 negative, CD24 positive, CD105 positive, CD150 positive, CD29 positive cell, CD34 positive cell, CD44 positive cell, CD73 positive cell, Alternatively, it is preferably any of CD90 positive cells.
  • the non-extracted root canal filling material attaches dental pulp stem cells to the apical side of the root canal, and at least one of cell migration factor, cell growth factor, neurotrophic factor and angiogenic factor on the crown side of the root canal It is preferable to attach a migratory factor including one.
  • the cell migration factor is preferably at least one of SDF-1, VEGF, G-CSF, SCF, MMP3, Slit, and GM-CSF.
  • the cell growth factor is preferably at least one of IGF, bFGF and PDGF.
  • the neurotrophic factor is preferably at least one of GDNF, BDNF, NGF, NeuropeptideY and Neurotrophin®3.
  • the extracellular matrix is collagen, artificial proteoglycan, gelatin, hydrogel, fibrin, phosphophorin, heparan sulfate, heparin, laminin, fibronectin, alginic acid, hyaluronic acid, chitin, PLA, PLGA, PEG, PGA, PDLLA, PCL, It is preferably made of a biocompatible material containing at least one of hydroxyapatite, ⁇ -TCP, calcium carbonate, titanium and gold.
  • the root canal filling material Before injecting the root canal filling material into the apical side of the root canal, it is preferable to enlarge the root canal so that the thickness of the root canal at the apical portion becomes a predetermined size.
  • the content rate of the dental pulp stem cells in the extracellular matrix is preferably 1 ⁇ 10 3 cells / ⁇ l or more and 1 ⁇ 10 6 cells / ⁇ l or less.
  • Drawing 1 is an explanatory view of the non-extraction tooth root canal filling material concerning a 1st embodiment.
  • Drawing 2 is an explanatory view explaining the manufacturing process of the non-extraction tooth root canal filling material concerning a 1st embodiment.
  • FIG. 3A is an explanatory diagram of a tooth suffering from pulpitis.
  • FIG. 3B is a schematic diagram for explaining a root canal enlargement treatment after extraction.
  • FIG. 3C is a schematic diagram illustrating the filling of the non-extracted root canal filling material.
  • FIG. 3D is a schematic diagram for explaining the injection of sponzel (gelatin) and resin.
  • FIG. 3E is a schematic diagram showing dental pulp regeneration and blood vessel regeneration.
  • FIG. 3A is an explanatory diagram of a tooth suffering from pulpitis.
  • FIG. 3B is a schematic diagram for explaining a root canal enlargement treatment after extraction.
  • FIG. 3C is a schematic diagram illustrating the filling of the non-extracted root canal fill
  • FIG. 3F is a schematic diagram for explaining the injection of a morphogenic factor and a resin.
  • FIG. 3G is a schematic diagram showing dentin regeneration.
  • FIG. 3H is a schematic diagram of apical periodontitis in which bacteria extend to the dentin and apical periodontal tissue of the root canal wall.
  • FIG. 4A is an explanatory diagram of a non-extracted root canal filling material in which a migration factor is attached to the crown side of the root canal.
  • FIG. 4B is an explanatory diagram of a non-extracted root canal filling material in which a migration factor is attached to the crown side of the root canal and an extracellular matrix is left on the crown side.
  • FIG. 6A shows 14 days after the extraction of the tooth and the root canal expanded in vitro after adsorbing the teeth, adsorbing SDF-1 and CD105 positive cells to type I / type III mixed collagen, injecting into the root canal, and reimplanting
  • FIG. 6B shows the root canal enlarged after extraction and explanted in vitro, and adsorbed SDF-1 and CD105 positive cells to type I / III mixed collagen, injected into the root canal, and reimplanted 14 days later It is a high-magnification figure of the dentin wall inside the root canal.
  • FIG. 6A shows 14 days after the extraction of the tooth and the root canal expanded in vitro after adsorbing the teeth, adsorbing SDF-1 and CD105 positive cells to type I / type III mixed collagen, injecting into the root canal, and reimplanting
  • FIG. 6B shows the root canal enlarged after extraction and explanted in vitro, and adsorbed SDF-1 and CD105 positive cells to type I / III
  • FIG. 6C shows 14 days after the extraction of the root canal after incision after the extraction of the tooth, adsorbing SDF-1 and CD105 positive cells to the type I / III type mixed collagen, injecting into the root canal, and reimplanting It is a high magnification image figure of dentin and cementum wall of the tooth root outer side in FIG.
  • FIG. 7A is a diagram for explaining 14 days after the root canal is expanded in vivo without tooth extraction, and SDF-1 and CD105 positive cells are adsorbed on type I / III type mixed collagen and injected into the root canal. It is.
  • FIG. 7A is a diagram for explaining 14 days after the root canal is expanded in vivo without tooth extraction, and SDF-1 and CD105 positive cells are adsorbed on type I / III type mixed collagen and injected into the root canal. It is.
  • FIG. 7A is a diagram for explaining 14 days after the root canal is expanded in vivo without tooth extraction, and SDF-1 and CD105 positive cells are adsorbed on type I
  • FIG. 7B is an enlarged view of the root canal after extraction in vivo without tooth extraction, and adsorbs SDF-1 and CD105 positive cells to type I / type III mixed collagen and injected into the root canal 14 days later. It is a high-magnification figure of the dentin wall.
  • FIG. 8A is a diagram illustrating 14 days after the root canal has been expanded in vivo without tooth extraction, and SDF-1 and CXCR4 positive cells have been adsorbed on type I / III type mixed collagen and injected into the root canal. It is.
  • FIG. 8A is a diagram illustrating 14 days after the root canal has been expanded in vivo without tooth extraction, and SDF-1 and CXCR4 positive cells have been adsorbed on type I / III type mixed collagen and injected into the root canal. It is.
  • FIG. 8B shows the root canal enlarged after extraction of the pulp in vivo without extracting the teeth, and adsorbing SDF-1 and CXCR4 positive cells to the mixed collagen of type I / III and injecting into the root canal. It is a high-magnification figure of the dentin wall.
  • FIG. 9A is a graph showing the percentage of dental pulp-derived CD105 positive cells isolated from canine permanent dental pulp tissue by flow cytometry.
  • FIG. 9B is a graph showing the proportion of fat-derived CD105-positive cells by flow cytometry separated from canine adipose tissue.
  • FIG. 9C is a diagram showing primary dental pulp CD105-positive cells on the third day of culture isolated from canine permanent dental pulp tissues.
  • FIG. 9D is a diagram showing primary dental pulp CD105-positive cells on the 10th day of culture isolated from canine permanent dental pulp tissues.
  • FIG. 9E is a view showing primary fat CD105-positive cells on the third day of culture separated from adipose tissue.
  • FIG. 9F is a view showing primary fat CD105-positive cells on the 10th day of culture separated from adipose tissue.
  • FIG. 10A is a diagram showing the fat-inducing ability of dental pulp CD105-positive cells on the 30th day.
  • FIG. 10B is a diagram showing the fat-inducing ability of unsorted total dental pulp cells on the 30th day.
  • FIG. 10C is a diagram showing the fat-inducing ability of fat CD105-positive cells on the 30th day.
  • FIG. 10A is a diagram showing the fat-inducing ability of dental pulp CD105-positive cells on the 30th day.
  • FIG. 10B is a diagram showing the fat-inducing ability of unsorted total dental pulp cells on
  • FIG. 10D is a graph showing gene expression comparison of fat inducing ability of dental pulp CD105-positive cells, unsorted total dental pulp cells, and fat CD105-positive cells.
  • FIG. 10E is a diagram showing the blood vessel inducing ability of dental pulp CD105-positive cells after 12 hours.
  • FIG. 10F is a diagram showing the blood vessel induction ability of unsorted total dental pulp cells after 12 hours.
  • FIG. 10G is a diagram showing the blood vessel induction ability of fat CD105-positive cells after 12 hours.
  • FIG. 10H is a diagram showing the neurosphere-forming ability of dental pulp CD105-positive cells on the 14th day.
  • FIG. 10I is a diagram showing the neurosphere-forming ability of unsorted total pulp cells on the 14th day.
  • FIG. 10J is a diagram showing immunostaining of dental pulp CD105-positive cells with neurofilaments on the 28th day.
  • FIG. 10K is a graph showing the expression of neurofilament, neuromodulin and voltage-gated sodium channel, type Ia (Scn1A) mRNA ⁇ in dental pulp CD105-positive cells.
  • FIG. 10L is a diagram showing dentin / bone formation-inducing ability of dental pulp CD105-positive cells on the 28th day.
  • FIG. 10M is a diagram showing dentin / bone formation-inducing ability of unsorted total pulp cells on the 28th day.
  • FIG. 10N is a diagram showing dentin / bone formation-inducing ability of fat CD105-positive cells on the 28th day.
  • FIG. 10K is a diagram showing immunostaining of dental pulp CD105-positive cells with neurofilaments on the 28th day.
  • FIG. 10K is a graph showing the expression of neurofilament, neuromodulin and voltage-gate
  • FIG. 10O is a diagram showing a comparison of the differentiation potential of dental pulp CD105-positive cells, unsorted total dental pulp cells, and fat CD105-positive cells into odontoblasts.
  • FIG. 10P is a graph showing the proliferative ability of dental pulp CD105-positive cells to which SDF-1 final concentration of 50 ng / ml was added, total unsorted dental pulp cells, and fat CD105-positive cells; The number of cells after 36 hours.
  • FIG. 11A is a diagram showing pulp regeneration by autotransplanting dental pulp CD105-positive cells together with SDF-1 into the root canal of the cavity on the 14th day after canine extraction.
  • FIG. 11A is a diagram showing pulp regeneration by autotransplanting dental pulp CD105-positive cells together with SDF-1 into the root canal of the cavity on the 14th day after canine extraction.
  • FIG. 11B is a partially enlarged view of pulp regeneration by autotransplanting dental pulp CD105-positive cells together with SDF-1 into the root canal of the cavity on the 14th day after the canine extraction.
  • FIG. 11C is a partially enlarged view of pulp regeneration by autotransplanting dental pulp CD105-positive cells together with SDF-1 into the root canal of the cavity on the 14th day after extraction of the canine.
  • FIG. 11D is a diagram showing odontoblast differentiation in dental pulp regeneration by autotransplanting dental pulp CD105 positive cells together with SDF-1 into the root canal of the cavity on the 14th day after extraction of the canine.
  • FIG. 11B is a partially enlarged view of pulp regeneration by autotransplanting dental pulp CD105-positive cells together with SDF-1 into the root canal of the cavity on the 14th day after the canine extraction.
  • FIG. 11C is a partially enlarged view of pulp regeneration by autotransplanting dental pulp CD105-positive cells together with SDF-1 into the root canal of the cavity on the 14th day after
  • FIG. 11E is a diagram showing dental pulp regeneration by autotransplanting only dental pulp CD105-positive cells into the root canal of the cavity on the 14th day after extraction of the dog.
  • FIG. 11F shows regeneration of dental pulp by transplanting only SDF-1 into the root canal of the cavity on day 14 after extraction of the dog.
  • FIG. 11G is a diagram showing dental pulp regeneration by autotransplanting dental pulp CD105-positive cells together with SDF-1 into the root canal of the cavity on the 90th day after the canine extraction.
  • FIG. 11H is a diagram showing dental pulp regeneration by autotransplanting dental pulp CD105-positive cells together with SDF-1 into the root canal of the cavity on the 90th day after the canine extraction, showing neovascularization above the regenerated tissue .
  • FIG. 11E is a diagram showing dental pulp regeneration by autotransplanting only dental pulp CD105-positive cells into the root canal of the cavity on the 14th day after extraction of the dog.
  • FIG. 11F shows regeneration of dental pulp by transplanting only SDF-1 into
  • FIG. 11I is a diagram showing dental pulp regeneration by autotransplanting dental pulp CD105-positive cells together with SDF-1 into the root canal of the cavity on the 90th day after extraction of the dog, and the neovascularization at the center of the regenerated tissue is shown.
  • FIG. 11J is a diagram showing cells of normal dental pulp tissue.
  • FIG. 11K shows the bone-like / tubule dentin newly formed along the dentin sidewall on day 90 after autologous transplantation of SDF-1 and pulp CD105 positive cells into the root canal of the cavity after extraction of the dog. It is a figure which shows the odontoblast parallel to (OD).
  • FIG. 11L is a diagram showing odontoblast differentiation by In situ hybridization analysis on day 90 after autologous transplantation of dental pulp CD105-positive cells together with SDF-1 into the hollow root canal after pulp extraction in dogs. / MMP20.
  • FIG. 11M is a graph showing odontoblast differentiation by in-situ hybridization analysis on day 90 after autologous transplantation of dental pulp CD105-positive cells together with SDF-1 into the hollow root canal after extraction of the dog, sialophosphoprotein (Dspp).
  • FIG. 11N is a diagram showing pulp regeneration by transplanting total pulp cells together with SDF-1 into the root canal of the cavity on the 14th day after extraction of the canine.
  • FIG. 110 is an enlarged view showing angiogenesis in pulp regeneration by transplanting total pulp cells together with SDF-1 into the root canal of the cavity on the 14th day after extraction of the canine.
  • FIG. 11P is a diagram showing pulp regeneration by transplanting total pulp cells together with SDF-1 into the root canal of the cavity on day 90 after extraction of the dog.
  • FIG. 11Q is an enlarged view showing dental pulp regeneration by transplanting total dental pulp cells together with SDF-1 into the root canal of the cavity on the 90th day after the canine extraction.
  • FIG. 11R is a diagram showing dental pulp regeneration by transplanting fat CD105 positive cells together with SDF-1 into the root canal of the cavity on the 14th day after the canine extraction.
  • FIG. 11S is a diagram showing the ratio of the newly regenerated tissue on the 14th day to the root canal surface area, and the data is expressed as an average value ⁇ SD of 5 samples.
  • FIG. 11T is a diagram showing immunostaining with BS-1 lectin.
  • FIG. 11U is a three-dimensional analysis of new blood vessels by whole-mount lectin staining, and shows that transplanted dental pulp CD105-positive cells are present around the new capillaries.
  • FIG. 11V is a three-dimensional analysis of new blood vessels by whole-mount lectin staining, and shows a three-dimensional image of the induced blood vessels of regenerated tissue on the 14th day.
  • FIG. 11T is a diagram showing immunostaining with BS-1 lectin.
  • FIG. 11U is a three-dimensional analysis of new blood vessels by whole-mount lectin staining, and shows that transplanted dental pulp CD105-positive cells are present around the new capillaries.
  • FIG. 11V is a
  • FIG. 11W is a three-dimensional analysis of new blood vessels by whole-mount lectin staining, showing that the transplanted cells with DiI label are scattered throughout the regenerated tissue.
  • FIG. 11X is a diagram showing normal dental pulp tissue.
  • FIG. 11Y is a view showing PGP 9.5. Immunostaining of newly regenerated tissue on the 14th day.
  • FIG. 11Z is a diagram showing the DiI label of the pulp tissue regenerated on the lower third incisor.
  • FIG. 12A is a diagram showing two-dimensional electrophoresis of normal dental pulp tissue.
  • FIG. 12B is a diagram showing two-dimensional electrophoresis of regenerated dental pulp tissue.
  • FIG. 12A is a diagram showing two-dimensional electrophoresis of normal dental pulp tissue.
  • FIG. 12B is a diagram showing two-dimensional electrophoresis of regenerated dental pulp tissue.
  • FIG. 12C is a diagram in which two-dimensional electrophoresis of normal pulp tissue and two-dimensional electrophoresis of regenerated pulp tissue are superimposed.
  • FIG. 12D is a diagram showing two-dimensional electrophoresis of normal dental pulp tissue.
  • FIG. 12E is a diagram showing two-dimensional electrophoresis of periodontal ligament tissue.
  • FIG. 12F is a diagram in which two-dimensional electrophoresis of normal dental pulp tissue and two-dimensional electrophoresis of periodontal ligament tissue are superimposed.
  • FIG. 13A is a diagram showing regeneration of dental pulp by autologous transplantation of dental pulp CD105-positive cells together with SDF-1 into the extracted root canal on the 14th day after treatment of infected root canal in dogs.
  • FIG. 13A is a diagram showing regeneration of dental pulp by autologous transplantation of dental pulp CD105-positive cells together with SDF-1 into the extracted root canal on the 14th day after treatment of infected root canal in dogs.
  • FIG. 13B is a diagram showing dental pulp regeneration by autotransplanting dental pulp CD105-positive cells together with SDF-1 into a root canal that has not been extracted, on the 14th day after treatment of infected root canal in dogs.
  • FIG. 13C is a partially enlarged view showing pulp regeneration by autotransplanting dental pulp CD105-positive cells together with SDF-1 into a root canal that has not been extracted, on the 14th day after treatment of infected root canal in a dog.
  • FIG. 14A is a diagram showing dental pulp regeneration by autotransplanting dental pulp CD105-positive cells together with G-CSF into the extracted root canal on the 14th day after canine pulp extraction.
  • FIG. 14B is a diagram showing dental pulp regeneration by autotransplanting dental pulp CD105-positive cells together with G-CSF into a root canal that has not been extracted, on the 14th day after the extraction of the dog.
  • FIG. 14C is a partially enlarged view showing dental pulp regeneration by autotransplanting dental pulp CD105-positive cells together with G-CSF into a root canal that has not been extracted, on the 14th day after the extraction of the dog.
  • the non-extracted root canal filling material according to this embodiment has dental pulp stem cells and an extracellular matrix, and is inserted into the apical side of the non-extracted root canal after extraction or after cleaning of the root canal of the infected root canal.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram of a non-extracted root canal filling material 200 according to the present embodiment.
  • the non-extraction root canal filling material 200 is formed by attaching dental pulp stem cells 220 to the extracellular matrix 210.
  • the dental pulp stem cell 220 is attached to the apical side of the root canal of the non-extracted root canal filling material 200.
  • Dental pulp stem cells are dental pulp stem cells derived from permanent or deciduous teeth.
  • the dental pulp stem cells are dental pulp CXCR4 positive cells, SSEA-4 positive cells, FLK-1 positive cells, CD105 positive cells, dental pulp SP cells, CD31 negative and CD146 negative cells, CD24 positive cells, CD150 positive cells, CD29 positive cells, CD34 positive It includes at least one of cells, CD44 positive cells, CD73 positive cells, and CD90 positive cells.
  • canine permanent dental pulp cells contain 0.8% of CXCR4 cell positivity and have high tissue regeneration ability such as angiogenesis ability.
  • the dental pulp SP cell is CXCR4 positive, SSEA-4 positive, FLK-1 positive, CD31 negative and CD146 negative, CD24 positive, CD105 positive, CD150 positive, CD29 positive cell, CD34 positive cell, CD44 positive cell, CD73 positive cell, or Preferably, it is any of CD90 positive cells.
  • CD31- / CD146- side population (SP) cells promote blood flow recovery and angiogenesis when transplanted into the ischemic part of the lower limb of mice, and promote neuronal differentiation and motor paralysis when transplanted into the ischemic part of rat cerebral infarction. Recovers.
  • angiogenesis, nerve regeneration, and pulp regeneration are observed in the cavity on the cut surface of the living pulp.
  • the pulp regeneration ability is considered to be high, but in order to sort SP cells, the cells are labeled with Hoechst 33342, a DNA-binding fluorescent dye. This may cause safety problems in clinical applications.
  • dental pulp CXCR4-positive cells can be contaminated, and therefore, without using a flow cytometry method that cannot be used clinically or an antibody bead method that is expensive and limited in use, SDF-1, AMD3100, or G- Since it can be sorted by the traveling method using CSF or the like, it can be sorted safely and inexpensively. Therefore, when CXCR4-positive cells are used as dental pulp stem cells, there is a significant advantage that they can be used immediately in the clinic and are economical.
  • the dental pulp stem cell may be an autologous cell extracted from the subject animal itself undergoing the dental tissue regeneration treatment or an allogeneic cell extracted from an animal other than the subject animal subject to the dental tissue regeneration treatment.
  • the content rate of dental pulp stem cells in the non-extraction root canal filling material 200 is preferably 1 ⁇ 10 3 cells / ⁇ l or more and 1 ⁇ 10 6 cells / ⁇ l or less. This is because if the content of dental pulp stem cells is less than 1 ⁇ 10 3 cells / ⁇ l, regeneration of the tooth tissue in the root canal may be insufficient. On the other hand, if the content rate of dental pulp stem cells is more than 1 ⁇ 10 6 cells / ⁇ l, an unexpected side effect may occur on the subject tooth.
  • Extracellular matrix (Scaffold) 210 is collagen, artificial proteoglycan, gelatin, hydrogel, fibrin, phosphophorin, heparan sulfate, heparin, laminin, fibronectin, alginic acid, hyaluronic acid, chitin, PLA (polylactic acid), PLGA (lactic acid) Glycolic acid copolymer), PEG (polyethylene glycol), PGA (polyglycolic acid), PDLLA (poly-DL-lactic acid), PCL (polycaprolactone), hydroxyapatite, ⁇ -TCP, calcium carbonate, titanium and gold It is preferable that it is comprised from the biocompatible material containing at least any one.
  • Proteoglycan is a type of complex carbohydrate in which a protein and a sugar chain (glycosaminoglycan) are covalently bonded.
  • a sponge-like three-dimensional structure made of nanofibers having a number average diameter of 1 nm to 1000 nm made of a polymer such as a thermoplastic polymer can be used.
  • the porosity of such a three-dimensional structure is preferably 80% to 99.99%.
  • the collagen used as the extracellular matrix is preferably an I / III mixed collagen that is a mixture of type I collagen and type III collagen.
  • Type I collagen is basic collagen and is fibrous collagen.
  • Type III collagen forms a fine mesh-like structure called reticulated fibers, which is different from collagen fibers, and creates a scaffold for cells and the like.
  • the ratio of type III collagen in the above-described mixed collagen is preferably 10% by weight or more and 50% by weight or less. This is because if the proportion of type III collagen exceeds 50% by weight, the mixed collagen may not be solidified. On the other hand, when the proportion of type III collagen is less than 10% by weight, the proportion of type I collagen increases, and angiogenesis as described later may not occur, and dentin may be regenerated. .
  • FIG. 2 is an explanatory diagram for explaining a method of manufacturing the non-extracted root canal filling material 200.
  • the non-extracted root canal filling material 200 is formed by attaching dental pulp stem cells 220 to the apical side of the extracellular matrix 210.
  • the dental pulp stem cells 220 are preferably attached to 1/4 to 2/3 of the apex portion of the non-extracted root canal filling material 200, more preferably 1/3 of the apex portion.
  • the manufacturing method of the root canal filling material first, the total volume is 20 ⁇ l, 10 ⁇ l to 13 ⁇ l of type I / III mixed collagen is sucked into a pipetman's tip, etc., and then the dental pulp stem cells are mixed Aspirate 7 ⁇ l to 10 ⁇ l of the mixed type I / III collagen (for example, collagen XYZ (Nitta Gelatin)).
  • the mixed type I / III collagen for example, collagen XYZ (Nitta Gelatin)
  • sucking into a pipetteman's tip or the like it is preferable to make the suction speed moderate so that bubbles are not generated. This is because if bubbles are generated inside the root canal filling material, the generated bubbles impede cell migration and impair the promotion of tooth tissue regeneration.
  • the pipetman tip preferably has a small inner diameter, for example, a tip having a lower inner diameter of 0.5 to 0.7 mm can be used, for example, H-010-96RS microcapillary chip manufactured by QSP can be used.
  • the shape of the non-extracted root canal filling material is not particularly limited, and is, for example, a cone, a truncated cone, a cylinder, or the like.
  • tooth tissue regeneration is performed without tooth extraction on the tooth 100 that is subject to pulpitis.
  • the target tooth is a tooth in which bacterial infection has spread to the crown pulp or the root pulp due to caries, pulpitis or the like.
  • Infected root canal refers to the root canal when bacteria reach the dental pulp and reaches the dentin of the root canal wall, and after cleaning the root canal, removes the bacteria in the infected root canal.
  • the root apex refers to an end portion (tip end portion of the tooth root) coupled to the alveolar bone of the target tooth.
  • the thickness d of the root canal at the apex is preferably 0.7 mm or more and 1.5 mm or less in the diameter of the root canal.
  • the root canal thickness d is less than 0.7 mm, blood vessels and nerves are difficult to enter from the apical periodontal tissue, and filling of the non-extracted root canal filling material 200 may be difficult, This is because if the thickness of the root canal is larger than 1.5 mm, the target tooth may be easily cracked due to an unnecessary load.
  • the root canal side of the root canal is filled with a non-extracted root canal filling material 200 with tweezers or the like. Since the non-extracted root canal filling material 200 contains a biological material, it can also be a biological root canal filling material.
  • the non-extracted root canal filling material 200 is preferably filled in a portion corresponding to the pulp, where the pulp in the root canal exists.
  • the extracellular matrix 210 is in a gel form, it cannot be pinched with tweezers or the like, so that it is injected by pipetman, injection or the like.
  • gelatin 610 is injected into the upper portion of the non-extracted root canal filling material 200 and the resin 620 is capped. .
  • the regenerated tooth tissue is, for example, a pulp intrinsic tissue in the root canal, a blood vessel 400, and a nerve. Further, there is dentin as a tooth tissue regenerated by using a morphogenic factor such as BMPs. Further, when the non-extracted root canal filling material 200 is filled into the infected root canal, periodontal tissues such as periodontal ligament (periodontal tissue for setting teeth on the alveolar bone) and cementum as the regenerated tooth tissue. There is.
  • the resin 620 is removed once, and as shown in FIG. 3F, a morphogenic factor 630 such as BMPs or a dentinogenic factor is applied to the dental pulp of the crown, and the resin 620 is capped.
  • a morphogenic factor 630 such as BMPs or a dentinogenic factor
  • the dentin 500 is also regenerated as shown in FIG. 3G.
  • the tooth tissue regeneration using the non-extraction root canal filling material 200 according to the present embodiment internal regeneration and external absorption are not seen in the regenerated tissue, and no occlusion cells are seen, and the dentinal wall is seen in the dentin wall.
  • the blasts are lined up smoothly.
  • the invention according to this embodiment is non-extraction, the generation of clots can be suppressed low and tooth tissue regeneration can be efficiently performed. Can be promoted.
  • the invention according to the present embodiment is non-extraction, it is possible to wait for root canal filling and root canal filling until bleeding and symptoms after root canal enlargement disappear, and close to actual clinical treatment Can do.
  • the target tooth 100 is a tooth in which bacterial infection has spread to the crown pulp or the root pulp due to caries, pulpitis, etc., but is not limited thereto.
  • the tooth 100 includes a tooth whose nerve function is reduced and the occlusal sensation is weakened. In such a case, the occlusal sensation can be improved by regenerating the pulp by filling the non-extraction root canal filling material 200 after the pulp removal.
  • the target tooth 100 is a tooth in which bacterial infection has spread to the apical periodontal tissue (after the bacteria reach the pulp, the dentin and apical periodontium on the root canal wall) Teeth extending to the tissue) are also included. Such teeth are often accompanied by apical periodontitis 110. After the root canal enlargement cleaning of the infected root canal, the non-extracted root canal filling material 200 is injected.
  • FIG. 4A and 4B are explanatory diagrams of the non-extraction root canal filling material 200 according to the second embodiment of the present invention.
  • the non-extracted root canal filling material 200 attaches dental pulp stem cells 220 to the apical side of the root canal, and at the crown side of the root canal (for example, the upper 1/2 to 2/3 of the root canal).
  • the migration factor 230 containing at least one of cell migration factor, cell growth factor, neurotrophic factor, and angiogenic factor.
  • the reason why the dental pulp stem cell 220 is attached to the apical side of the root canal and the migratory factor 230 is attached to the crown side of the root canal is that nutrition from the tissue can be achieved even if the dental pulp stem cell 220 is attached to the crown side of the root canal.
  • the dental pulp stem cell 220 attached to the apical side of the root canal is pulled by the migratory factor attached to the crown side of the root canal. This is because tissue regeneration is easily promoted.
  • the extracellular matrix 210 can be left on the crown side of the root canal of the non-extracted root canal filling material 200.
  • the cell migration factor means a molecule that activates a signal transmission system involved in cell migration by binding to a receptor.
  • the cell growth factor means a molecule that activates a signal transmission system involved in cell growth when it binds to a receptor.
  • the neurotrophic factor means a molecule that activates a signal transmission system related to cell survival by binding to a receptor.
  • An angiogenic factor means a molecule that activates a signal transduction system involved in proliferation, migration, and anti-apoptosis of vascular endothelial cells by binding to a receptor.
  • MMP3 has high cell migration ability and can be suitably used.
  • IGF insulin growth factor
  • bFGF vascular endothelial growth factor
  • PDGF cell growth factor
  • the neurotrophic factor it is preferable to use at least one of GDNF, BDNF, NGF, Neuropeptide Y and Neurotrophin 3.
  • E-selectin As the angiogenic factor, it is preferable to use at least one of E-selectin, VCAM1, ECSCR, and SLC6A6.
  • the content of the migration factor in the extracellular matrix to which the migration factor is attached is preferably 0.1 ng / ⁇ l or more and 500 ng / ⁇ l or less. This is because if the migration factor content is less than 0.1 ng / ⁇ l, the degree of migration may be reduced. On the other hand, if the migration factor content is higher than 500 ng / ⁇ l, an unexpected side effect may occur on the target tooth 100.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram for explaining a method of manufacturing the non-extracted root canal filling material 200 in which the migratory factor 230 is attached to the crown side of the root canal.
  • the method for producing the non-extraction root canal filling material 200 first, a total of 20 ⁇ L, and a mixed type I / III collagen (I The mixing ratio of type I collagen and type III collagen is 1: 1). Next, 7 ⁇ l to 10 ⁇ l of type I / type III mixed collagen mixed with dental pulp stem cells is sucked. Also in the second embodiment, it is preferable to reduce the suction speed so that bubbles are not generated when sucking into a pipetteman's tip or the like. In addition, the pipetman tip preferably has a narrow inner diameter. In this way, the root canal filling material 200 shown in FIG. 4A is manufactured.
  • the usage pattern of the non-extracted root canal filling material 200 according to the second embodiment is filled in the apical side of the non-extracted root canal after the pulp extraction or after the root canal enlargement cleaning of the infected root canal, as in the first embodiment. .
  • the tooth tissue regeneration can be performed more efficiently because it has a migratory factor. Dentinoblasts are lined up smoothly on the dentin wall without any cells.
  • the dental pulp stem cell 220 is attached to the apical side of the root canal of the non-extraction root canal filling material 200, and the non-extraction tooth root canal filling material 200 is configured.
  • the present invention is not limited to such an embodiment, and the dental pulp stem cells 220 may be uniformly mixed throughout the non-extraction root canal filling material 200.
  • Such a non-extracted root canal filling material 200 also does not generate internal absorption or external absorption with respect to the complete root of the tooth, no occlusion cells are seen, and odontoblasts line up smoothly in the dentin wall. Playback can be achieved.
  • Such a non-extracted root canal filling material 200 is manufactured by, for example, mixing dental pulp stem cells and type I / type III mixed collagen (for example, collagen XYZ (Nitta gelatin)) uniformly so as not to generate bubbles. Is done.
  • type I / type III mixed collagen for example, collagen XYZ (Nitta gelatin)
  • the dental pulp stem cell 220 is attached to the apical side of the root canal, and the migration factor 230 is attached to the crown side of the root canal, so that the non-extracted root canal filling material 200 is configured. It was.
  • the present invention is not limited to such an embodiment, and both the dental pulp stem cell 220 and the migration factor 230 may be mixed uniformly in the entire non-extraction root canal filling material 200.
  • Such a non-extracted root canal filling material 200 also does not generate internal absorption or external absorption with respect to the complete root of the tooth, no occlusion cells are seen, and odontoblasts line up smoothly in the dentin wall. Playback can be achieved.
  • This non-extracted root canal filling material 200 is, for example, to uniformly mix dental pulp stem cells, migratory factors, and type I / type III mixed collagen (for example, collagen XYZ (Nitta gelatin)) so as not to generate bubbles. Manufactured by.
  • Example 1 ⁇ Cell sorting and characterization> After removing the human dental pulp, the dental pulp cells were separated by enzyme digestion with collagenase at 37 ° C. for 1 hour and a half, and then the cells were dispersed at 1 ⁇ 10 6 cells / ml in DMEM containing 2% serum. CXCR4 antibody After labeling at 4 ° C. for 30 minutes, flow cytometry was performed. Human dental pulp-derived CXCR4-positive cells accounted for 20% of the total.
  • Table 1 shows the results of flow cytometry.
  • CXCR4 positive cells were 90% or more like CD105 positive cells.
  • CD105 CD105 positive cells were 90.0%, while CXCR4 positive cells were 1.7%.
  • CD146 CXCR4-positive cells had low values as well as CD105-positive cells.
  • CD150 which is a marker of more undifferentiated stem cells, CXCR4-positive cells showed slightly higher values than CD105-positive cells.
  • CD105 positive cells and CXCR4 positive cells were collected from canine pulp tissue.
  • a total of 60 ⁇ L is drawn, 40 ⁇ L of collagen XYZ (Nitta Gelatin Type I / III mixed collagen) mixed with Pipetman's chip SDF-1 (200 ng) is sucked, and then 1 ⁇ 10 6 CD105 positive cells
  • a root canal filling material for insertion into an extraction tooth root canal was prepared by sucking 20 ⁇ l of collagen XYZ (Nitta gelatin type I / III type mixed collagen) mixed with. After removing the canine maxillary anterior teeth, the pulp was removed in the medium and expanded to # 70, and the root canal thickness at the apex was 0.7 mm or more.
  • the root canal filling material was filled into the pulp-corresponding site where the pulp in the enlarged root canal was present. Within 30 minutes, it was reimplanted into the extraction socket of the dog and the upper part was sealed with phosphate cement and chemically polymerized resin. After 14 days, the tooth was extracted to prepare a paraffin specimen. The result is shown in FIG. 6A. Moreover, the high magnification image of the dentine wall in the root canal is shown in FIG. 6B. Furthermore, a high-magnification image of the dentine / cement wall outside the root is shown in FIG. 6C. 6A, 6B, and 6C show H ⁇ E staining.
  • Non-extracted root canal filling material 200 was prepared by sucking 7 ⁇ l of collagen XYZ (Nitta gelatin type I / III mixed collagen) mixed with CD105 positive cells.
  • SDF-1 was attached to the crown part 2/3 of the root canal, and CD105 positive cells were attached to the apical side 1/3 of the root canal.
  • the pulp was removed and expanded to # 70, and the root canal thickness at the apex was 0.7 mm or more.
  • the non-extracted root canal filling material 200 was filled into the pulp-corresponding site where the enlarged pulp was present.
  • the upper part was sealed with phosphate cement and chemically polymerized resin.
  • the tooth was extracted to prepare a paraffin specimen. The result is shown in FIG. 7A.
  • the high magnification image of the dentine wall in the root canal is shown in FIG. 7B. 7A and 7B are H ⁇ E staining.
  • a non-extracted root canal filling material 200 was prepared by sucking 7 ⁇ l of collagen XYZ (Nitta gelatin type I / III mixed collagen) mixed with CXCR4-positive cells.
  • SDF-1 was attached to the crown part 2/3 of the root canal, and CXCR4-positive cells were attached to the apical side 1/3 of the root canal.
  • the pulp was removed and expanded to # 70, and the root canal thickness at the apex was 0.7 mm or more.
  • the non-extracted root canal filling material 200 was filled into the pulp-corresponding site where the enlarged pulp was present.
  • the upper part was sealed with phosphate cement and chemically polymerized resin.
  • the tooth was extracted to prepare a paraffin specimen.
  • the tooth was extracted to prepare a paraffin specimen. The result is shown in FIG. 8A.
  • a high-magnification image of the dentin wall in the root canal is shown in FIG. 8B. 8A and 8B are H ⁇ E staining.
  • Example 2 the tooth tissue regeneration ability of the non-extracted root canal filling material is verified in more detail.
  • ⁇ Cell sorting by flow cytometry> The dental pulp cells were isolated from the maxillary canine. Primary adipocytes were isolated from canine adipose tissue of the same individual as a control. Cells were immunostained as a mouse IgG1 negative control (W3 / 25) (AbD Serotec Ltd., Oxford, UK). The cells were immunostained with mouse IgG1 negative control (Phycoerythrin, PE) (MCA928PE) (AbD Serotec) and mouseanti-human CD105 (PE) (43A3) (BioLegend, San Diego, CA, USA) for 90 minutes.
  • the medium was changed once every 4 to 5 days, and after reaching 60 to 70% confluence, the cells were reacted with 0.02% EDTA at 37 ° C. for 10 minutes, and the cells were detached and passaged at a 1: 4 dilution. .
  • mouse IgG1 negativecontrol (AbD Serotec Ltd.), mouse IgG1 negative control (fluoresceinisothiocyanate, FITC) (MCA928F) (AbD Serotec), mouse IgG1 negative control (Phycoerythrin-Cy5, PE-Cy5) negative control (Alexa 647) (MRC OX-34) (AbDSerotec), CD24 (Alexa Fluor 647) (ML5) (BioLegend), CD29 (PE-Cy5) (MEM-101A) (eBioscience), CD31 (FITC) ( Qbend10) (Dako), CD33 (FITC) (HIM3-4) (BD Bioscience), CD34 (Allophycocyanin, APC) (1H6) (R & D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA), CD44 (Phycoerythrin-Cy7, -C
  • RNA was isolated from the third generation pulp and adipose CD105 positive cells and total pulp cells using Trizol (Invitrogen). In each experiment, the number of cells was normalized to 5 ⁇ 10 4 cells.
  • First-strand cDNA synthesis was synthesized from total RNA using ReverTra Ace- ⁇ (Toyobo, Tokyo, Japan) and Light Cycler (Roche Diagnostics, Pleasanton, CA) using Light Cycler-Fast Start DNAmaster SYBR Green I (Roche Diagnostics, Pleasanton, CA). ) At 95 ° C. for 10 seconds, 62 ° C.
  • RNA expression of angiogenic factors and neurotrophic factors canine matrix metalloproteinase (MMP) -3, VEGF-A, granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (GM-CSF), SDF-1, NGF, BDNF, Neuropeptide Y , Neurotrophin 3, E-selectin, VCAM1, rhombotin 2, ECSCR and SLC6A6 real-time RT-PCR.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • ⁇ Proliferation and migration analysis> The proliferation ability of dental pulp CD105-positive cells against stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) (Acris, Herford, Germany) was determined by adding EBM2 supplemented with 0.2% bovine serum albumin (Sigma) and SDF-1 (50 ng / ml). Among them, 10 3 seeds were seeded in 96 wells and compared with total dental pulp cells and fat CD105 positive cells in the fourth generation. 10 ⁇ l Tetra-colorone (registered trademark, Seikagaku Kogyo, Co., Tokyo, Japan) was added to a 96-well plate, and the number of cells was measured after 2, 12, 24 and 36 hours using an absorptiometer at an absorbance of 450 nm. Samples without cells were designated as negativecontrol.
  • SDF-1 stromal cell-derived factor-1
  • TAXIScan-FL Effector Cell Institute, Tokyo, JAPAN
  • TAXIScan-FL between the silicon and the glass plate perforated 6 ⁇ m pore, forms a channel optimized for the size of the cell, to one end of the channel contains a cell (10 1 [mu] l five / ml), the other end 10 ng / ⁇ l of SDF-1 was added to form a constant concentration gradient, and migrating cells were photographed under a microscope for 6 hours.
  • CD105 positive cells When IGF1, EGF and 10% fetal bovine serum were added to EBM2, the characteristics of CD105 positive cells were maintained, and CD105 was 98% or more positive even in the sixth generation.
  • one CD105 positive cell was seeded on a 35 mm collagen type I coat dish, a colony was formed in 10 days, and the colony forming ability of this cell was shown.
  • the cell attachment and proliferation efficiency of dental pulp, adipose CD105 positive cells and dental pulp CD105 negative cells were 8%, 3.7% and 1%, respectively.
  • colony forming units CFU
  • CFU colony forming units
  • dental pulp CD105 positive cells were compared with fat CD105 positive cells and total dental pulp cells.
  • the dental pulp CD105 positive cells, adipose CD105 positive cells and total dental pulp cells were positive for CD29, CD44, CD90 and CD105 in the third generation and negative for CD31.
  • dental pulp CD105-positive cells strongly express CD73, CD150, and CXCR4 as compared to fat CD105-positive cells and total dental pulp cells.
  • stem cell markers such as CXCR4, Sox2 and Bmi1 mRNA are expressed 16.8, 64 and 3.5 times higher than total dental pulp cells, and the properties of dental pulp CD105 positive cells as stem cells It was suggested.
  • CXCR4, Sox2 and Bmi1 mRNA were highly expressed in dental pulp CD105-positive cells compared to fat CD105-positive cells.
  • angiogenic factors such as VEGF-A, GM-CSF, nerve growth , factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neuropeptideY, neurotrophin 3, E-selectin, and VCAM-1 The factor was highly expressed in dental pulp CD105-positive cells compared to fat CD105-positive cells.
  • dental pulp stem cells showed the ability to differentiate into adipocytes.
  • the dental pulp stem cells showed the ability to differentiate into vascular endothelial cells.
  • the dental pulp stem cells showed the ability to differentiate into nerve cells.
  • the dental pulp stem cell showed the differentiation ability to an odontoblast or an osteoblast lineage.
  • FIGS. 10L and 10M more calcified matrix was observed in total pulp cells than in pulp CD105 positive cells.
  • FIGS. 10C, 10D, 10N, 10O, and 10G fat CD105-positive cells have fat-inducing ability and bone-inducing ability, but neither vascular-inducing ability nor nerve-inducing ability was observed.
  • FIG. 10P the proliferation activity by SDF-1 was higher in dental pulp CD105 positive cells than in total dental pulp cells and fat CD105 positive cells.
  • the data is represented by the average value ⁇ SD of 4 samples (* P ⁇ 0.01), and the experiment shows a typical example repeated three times.
  • TAXIScan-FL the migration activity by SDF-1 was higher in dental pulp CD105 positive cells than total dental pulp cells and adipose CD105 positive cells.
  • Collagen XYZ was used as the extracellular matrix, and a root canal filling material in which dental pulp stem cells were attached to the apical side and SDF-1 was attached to the crown side was used. That is, 1 ⁇ 10 6 3rd to 4th generation pulp CD105 positive cells, adipose CD105 positive cells or total pulp cells together with collagen XYZ (Nitta Gelatin, Osaka, Japan) are labeled with DiI and placed in the lower part of the root canal Self-transplanted. The upper root canal was further transplanted with collagenXYZ at a final concentration of 15 ng / ⁇ l SDF-1.
  • Cavities were treated with zinc phosphate cement (EliteCement, GC, Tokyo, Japan) and bonding material (Clearfil Mega Bond, Kuraray), and then repaired with composite resin (Clearfil FII, Kuraray, Kurashiki, Japan).
  • 10 teeth are pulp CD105 positive cells and SDF-1
  • 5 teeth are fat CD105 positive cells and SDF-1
  • 5 teeth are total pulp cells and SDF-1
  • 5 teeth are SDF-1 only without cells
  • 5 teeth are Only pulp CD105 positive cells without SDF-1 were injected, and only 5 scaffolds without cells were injected, and specimens were prepared 14 days later.
  • Six teeth were injected with dental pulp CD105 positive cells and SDF-1, and analyzed two-dimensionally after 28 days.
  • paraffin sections having a thickness of 5 ⁇ m were deparaffinized, treated with 3% Triton X-containing PBS, blocked with 2% goat serum, and subjected to primary staining with PGP-9.5 for 12 hours at 4 ° C. After washing with PBS three times, secondary staining was performed with biotinylatedgoat anti-rabbit IgG (Vector) (1: 200) for 1 hour at room temperature. ABC reagent After treatment with (VectorLaboratories, Burlingame, CA), color was developed with DAB for 10 minutes.
  • dental pulp CD105-positive cells were transplanted to the third incisor without diI labeling, and DiI was applied onto the regenerated pulp 14 days after transplantation. On the 17th day after transplantation, the mandible was removed and observed with a fluorescence microscope (Leica, M 205 FA, Wetzlar, Germany).
  • pulp CD105 positive cells and SDF-1 In order to statistically analyze the regeneration amount of the regenerated dental pulp on the 14th day, pulp CD105 positive cells and SDF-1, fat CD105 positive cells and SDF-1, total dental pulp cells and SDF-1, without cells, SDF- No. 1, SDF-1 not included, pulp CD105 positive cells only, and 5 specimens from the scaffold alone without cells taken with a stereomicroscope (Leica, M 205 FA), Leica Application Suite software And analyzed. The ratio of newly regenerated tissue to the surface area of the root canal was calculated by averaging the three locations of each tooth. Statistical calculations were performed using Student's t test.
  • Dspp dentinialophosphoprotein
  • lyenamelysin which are markers of odontoblast differentiation in vivo
  • the canine Dspp (183 bp) and enamelysin (195 bp) cDNAs were cut with NcoI and Spe I, respectively, and linearized to produce anti-sense probes.
  • the probe was prepared from the plasmid after subcloning the PCR product, and prepared from the primers shown in Tables 2 and 3 used in real-time RT-PCR.
  • DIG signal was detected by TSAsystem (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).
  • FIG. 11A is a diagram showing pulp regeneration by SDF-1 and pulp CD105 positive cells.
  • FIG. 11B is an enlarged view of area B in FIG. 11A.
  • FIG. 11C is an enlarged view of area C in FIG. 11A.
  • FIGS. 11A, 11B, and 11C when dental pulp CD105-positive cells were transplanted with SDF-1, pulp-like tissue was formed by 14 days. As shown in FIG.
  • the pulp-like tissue reached the cement-enamel boundary after 90 days when pulp CD105 positive cells were transplanted with SDF-1.
  • the cells present in the upper part of the regenerated tissue were spindle-shaped, and as shown in FIG. 11I, the cells were star-shaped.
  • These regenerated tissues were similar to the cells of normal dental pulp tissue shown in FIG. 11J.
  • tubule dentin was observed along the dentin sidewall.
  • the odontoblasts present alongside the dentinal heterogeneous side wall were positive for enamelysin / matrix metalloproteinase (MMP) 20 and Dspp, which are two markers of odontoblasts.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • FIG. 11N and FIG. 110 when transplanted unprepared total dental pulp cells instead of CD105 positive cells, only a smaller amount of dental pulp tissue is regenerated, and the lime indicated by the arrow in FIG. Calcification was observed after 90 days, as was the case and the bone-like dentin shown by OD in FIG. 11Q.
  • FIG. 11R when a fat-derived CD105-positive cell was similarly transplanted, only a smaller amount of regenerated tissue was observed.
  • FIG. 11S when dental pulp CD105 positive cells were transplanted with SDF-1 by statistical analysis, fat CD105 positive cells were transplanted with SDF-1, or total dental pulp cells were transplanted with SDF-1.
  • the ratio of newly regenerated tissue to root canal surface area was found to be significantly higher (51.6 and 2.2 times).
  • FIG. 11T after the frozen section was stained with BS-1 ⁇ ⁇ lectin, angiogenesis in the regenerated tissue was observed by confocal laser microscope analysis.
  • FIG. 11U by two-photon microscopic analysis, many of the transplanted dental pulp CD105-positive cells labeled with DiI are observed near new capillaries, and the role of releasing the angiogenic factors of these cells in angiogenesis is shown. It was suggested.
  • FIG. 11V the three-dimensional image of the induced blood vessel of the regenerated tissue on the 14th day was similar in density and direction to the normal pulp image shown in FIG.
  • FIG. 11X the transplanted CD105 positive cells were observed everywhere in the newly regenerated dental pulp, and it was suggested by SDF-1 that the dental pulp CD105 positive cells have the ability to migrate upward.
  • FIG. 11Y neurites stained with the PGP9.5 antibody extended from the apical hole into the newly regenerated tissue.
  • FIG. 11Z when the pulp tissue regenerated in the lower third incisor was labeled with DiI, it became clear that the nerve regenerated in the new pulp tissue (indicated by the dotted line) was connected to the inferior alveolar nerve. It was.
  • Isoelectric focusing was performed with CoolPhoreSter2-DE system. IPG strips (Immobiline DryStrips, pH 4-7, 18 cm, GE) were used according to manufacturer's instructions. IPGstrips is 20 ° C overnight with rehydration solution (6M urea, 1.97M thiourea, 2% (v / v) TritonX-100, 13mM DTT, 2% (v / v) Pharmalyte, 2.5mMacetic acid, 0.0025% BPB). Hydrated again. Isoelectric focusing (IEF) was performed by gradually increasing the voltage of 500V, 2 hours, 700-3000V, 1 hour, and 3500V, 24 hours.
  • Isoelectric focusing was performed by gradually increasing the voltage of 500V, 2 hours, 700-3000V, 1 hour, and 3500V, 24 hours.
  • IPGstrips was equilibrated with an equilibration buffer (6M urea, 2.4 mM DTT, 5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% (w / v) SDS, 0.0025% BPB, 30% (v / v) Glycerol) for 30 minutes at room temperature.
  • the IPG strips were further equilibrated with 5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% (w / v) SDS, 0.0025% BPB, 30% (v / v) Glycerol, 243 mM iodoacetamid for 20 minutes at room temperature.
  • axin2 periostin and asporin / periodontal ligament-associated protein 1 (PLAP-1) were further used as markers specific to periodontal ligament tissue.
  • Expressions of axin2, periostin and PLAP-1 mRNA were higher in normal periodontal ligaments at 25, 531, 179 and 11 times, respectively, on the 28th day than that of regenerated pulp tissue.
  • Table 6 the expression of these genes was observed in the normal dental pulp at almost the same level (0.4 times, 0.4 times, and 2.4 times) as compared with the regenerated tissue.
  • Collagen ⁇ I (I) was expressed 9.3 times more in the periodontal ligament than in the regenerated tissue, and there was almost no difference between normal and regenerated pulp.
  • Syndecan 3 and Tenascin C are known to be highly expressed in the pulp tissue, and the regenerated tissue was expressed 14.3 times and 50.0 times higher than the periodontal ligament tissue. Therefore, the two-dimensional electrophoresis analysis and gene expression analysis revealed that the regenerated tissue was functionally normal pulp tissue.
  • CollagenXYZ was used as an extracellular matrix, and a root canal filling material having dental pulp stem cells attached to the apical side and SDF-1 attached to the crown side was used. That is, 1 ⁇ 10 6 third- to fourth-generation dental pulp CD105 positive cells were autotransplanted together with collagen XYZ in the lower part of the root canal in the same manner as in the root canal autotransplantation after extraction. The upper root canal was further transplanted with collagen XYZ and SDF-1 at a final concentration of 15 ng / il, and the cavity was repaired with zinc phosphate cement and composite resin. Samples were prepared after 14 days. It was observed morphologically in the usual way.
  • FIG. 13A is a diagram showing regeneration of dental pulp by SDF-1 and dental pulp CD105 positive cells.
  • FIG. 13B is an enlarged view of the central part of the pulp tissue regenerated in the root canal in FIG. 13A.
  • FIG. 13C is an enlarged view of a portion in contact with the dentin side wall of the pulp tissue regenerated in the root canal in FIG. 13A.
  • FIGS. 13A, 13B, and 13C when dental pulp CD105-positive cells were transplanted with SDF-1, pulp-like tissue was formed by day 13.
  • FIG. 13B blood vessels were born in the pulp tissue, and pulp cells were observed, but inflammatory cells were also slightly scattered.
  • FIG. 13C the odontoblast-like cells attached to the dentin sidewall of the root canal and existed in parallel.
  • Example 3 Next, in Example 3, using the migration factor G-CSF and pulp CD105 positive cells, a comparison was made between filling the extracted root canal and filling the non-extracted root canal.
  • FIG. 14B is an enlarged view of the pulp-like tissue of the arrow portion shown in FIG. 14B. As shown in FIG. 14C, in the regenerated pulp-like tissue, elongated spindle-shaped pulp cells like fibroblasts were present, and no inflammatory cells were observed.
  • target tooth 110 apical periodontitis
  • non-extracted root canal filling material 210: extracellular matrix 220: dental pulp stem cell 230: migration factor 400: blood vessel 500: dentin 610: gelatin 620: resin 630: Morphogenetic factor

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Abstract

　歯根完成歯に対して、内部吸収や外部吸収発生させず、破歯細胞が見られず、象牙質壁に象牙芽細胞に滑らかに並ぶ歯組織再生を図る非抜歯根管充填材を提供する。非抜歯根管充填材２００は、歯髄幹細胞２２０及び細胞外基質２１０を有し、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、非抜歯の根管の根尖側に挿入される。歯髄幹細胞は、例えば歯髄ＣＸＣＲ４陽性細胞である。根管の歯冠側に細胞遊走因子、細胞増殖因子、神経栄養因子、及び血管新生因子のうち少なくとも何れか一つを含む遊走因子を付着させることが好ましい。

Description

非抜歯根管充填材及び非抜歯による歯組織再生方法
　本発明は、非抜歯の根管に充填される非抜歯根管充填材、及び、その非抜歯根管充填材を使用する非抜歯における歯組織再生方法に関する。
　現在、歯を失う原因は、破折を含めると約半分がう蝕によるもので、歯髄を抜くと歯を失う可能性が激増することが知られている。
　歯の平均寿命は現在５７歳といわれ、一生自分の歯で咬むことを考えると、歯の寿命は２０年以上高める必要がある。８０２０運動（８０歳になっても自分の歯を２０本以上残す運動）にもかかわらず、現在８０歳の人の歯の平均本数は約８本で、高齢者の残存歯数はほとんど増加しておらず、う蝕治療の抜本的改革が必要である。
　歯の歯髄を除去（抜髄）すると、修復象牙質形成能及び感染防御機構が喪失し、痛みという警告信号の喪失により、う蝕拡大の危険性が増加する。また、抜髄治療に完璧な方法はなく、抜髄・根管充填後、歯冠側からの漏えいにより根尖病巣が生じたり、垂直性破折や審美性の消失、術後疼痛の可能性もある。
　従って、超高齢社会では、安易に抜髄を行うことを避け、歯の延命化をめざして、歯再生医療技術を組み入れた象牙質・歯髄再生による新しいう蝕・歯髄炎治療法を開発することは非常に重要である。
　象牙質再生に関しては、細胞治療法あるいは遺伝子治療法として、生体外で歯髄幹細胞／前駆細胞にBMP (Bone morphogenetic proteins, 骨形成因子)等の蛋白質あるいは遺伝子を導入し、三次元培養して分化した象牙芽細胞をその細胞外基質とともに生活歯髄切断面上に自家移植し、大量の象牙質を再生させることができる（非特許文献１及び２）。
　しかしながら、歯髄炎が生じている場合には、象牙質ばかりでなく、歯髄組織そのものも再生させる必要がある。
　一方、歯髄組織は非常に血管と神経に富む組織である。歯髄は創傷を受けると局所から遊走因子が放出され、歯髄深部血管周囲から幹細胞が創傷部に遊走し、増殖・分化し、血管が新生され、修復象牙質が形成される自然治癒メカニズムが存在する。特に歯髄の血管系は栄養や酸素の供給源、代謝産物の排出路、歯髄の恒常性維持に重要である。また、歯髄神経は血流・象牙細管内溶液の流れ・歯髄内圧の調節に重要な役割を有し、血管新生、免疫応答細胞あるいは炎症性細胞浸潤に関与して炎症を調節し、歯髄の恒常性の維持、歯髄防御反応の強化に寄与する。よって、象牙質・歯髄再生においては血管と神経の相互作用及び血管新生・神経再生を考慮する必要がある。
　ＳＰ細胞はCD31-/CD146-ＳＰ細胞とCD31-/CD146+ＳＰ細胞がほぼ半々の割合で含まれ、CD31-/CD146-ＳＰ細胞は、CD31-/CD146+ＳＰ細胞に比べ、非常に有意に血管新生・神経再生・歯髄再生を促進し、Stromalcell-derived factor-1（ＳＤＦ－１）に対するケモカインレセプター、ＣＸＣＲ４ mRNAを有意に発現している。
　皮フ等の創傷部位からはＳＤＦ－１が分泌され、ＳＤＦ－１に対するヒト幹細胞の遊走はＣＸＣＲ４の発現に依存することが知られている。ＣＸＣＲ４は幹細胞のマーカーともいわれ、ヒト臍帯血からは胚性幹細胞様細胞がCXCR4+/SSEA-4+/Oct-4+として分取されている（非特許文献３）。
　また、マウス胎児の脳からは神経幹細胞として、中枢神経部位に遊走し顕著な神経分化能を有するCXCR4+/SSEA-1+細胞が分取されている（非特許文献４）。
　更に、ヒト膵臓において、ＣＸＣＲ４陽性細胞は多潜能性を有し、インシュリンを分泌する細胞に分化可能な幹細胞・前駆細胞を分取するために用いることができるといわれている（非特許文献５）。
　一方、歯髄再生に関しては、これまで、歯根未完成歯において、抜歯して抜髄・根管治療をした後に再度移植すると歯髄が再生されるといわれている。根尖部に病変を伴う歯根未完成歯でも、抜歯して徹底的な根管拡大・清掃を行い、セメント・象牙境まで血餅を満たしMineral trioxide aggregate（ＭＴＡ）で窩洞を完全封鎖することにより、歯髄様組織が再生されるとの報告がある。
　また、イヌの健全歯根完成歯においては、抜歯後抜髄し、根尖部を切断するあるいは根尖部を１．１ｍｍ以上拡大し再び移植し、血餅を充填すると歯髄様組織の再生がみられるといわれている（非特許文献６）。
　上述の根管内歯髄再生は、歯根未完成歯についての報告が大半であり、根管内に再生された組織が血管や神経を伴う歯髄固有の組織であることの証明もなされていない。また、すべて、一旦抜歯して生体外で根管拡大・清掃を行い、再移植して血餅を充填している。
Nakashima and Reddi、2003 (PMID12949568 doi 10.1038/nbt864) Nakashima and Akamine、2006 (PMID 16186748) KuciaM et al、2007 (PMID: 17136117doi:10.1038/sj.leu.2404470) CortiS et al、2005（PMID: 16150803 doi:10.2478/v10042-008-0045-0) KoblasT et al、2007（PMID: 17328838) Laureyset al、2001　(PMID:11298308doi:10.1067/mod.2001.113259)
　しかし、一旦抜歯して生体外で根管拡大・清掃を行い、再移植して血餅を充填する手法では、歯髄腔や根管内の象牙質に起こる特発性の歯質の吸収（内部吸収）が発生する場合があり、この内部吸収が大きくなると象牙質に穿孔が生じることもある。また、臨床で一般的に行われている歯根の完成した正常智歯等を他の歯喪失部位に再植する治療法については、再植後数年後に内部吸収や外部吸収による歯の動揺や脱落が生じる可能性がある。更に、歯根完成歯の場合における抜髄や感染根管治療における歯髄組織再生方法及び歯髄組織再生のための根管充填材の開発は全く確立されていない。
　本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、歯根完成歯に対して、内部吸収や外部吸収を発生させず、破歯細胞が見られず、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並ぶ歯組織再生を図る新規で独創的で適切な根管充填材、及び、そのような根管充填材を使用する歯組織再生方法を提供することを目的とする。
　本発明の第１の観点に係る非抜歯根管充填材は、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、非抜歯の根管の根尖側に挿入される、歯髄幹細胞及び細胞外基質を有することを特徴とする。
　前記歯髄幹細胞は、歯髄ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＳＳＥＡ－４陽性細胞、ＦＬＫ－１陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、歯髄ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、及び、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、及びＣＤ９０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含むことが好ましい。
　前記歯髄ＳＰ細胞が、ＣＸＣＲ４陽性、ＳＳＥＡ－４陽性、ＦＬＫ－１陽性、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ１５０陽性、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、又はＣＤ９０陽性細胞の何れかであることが好ましい。
　前記非抜歯根管充填材は、歯髄幹細胞を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側に細胞遊走因子、細胞増殖因子、神経栄養因子及び血管新生因子のうち少なくとも何れか一つを含む遊走因子を付着させていることが好ましい。
　前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ－１、ＶＥＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭ－ＣＳＦのうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
　前記細胞増殖因子が、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦのうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
　前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、NeuropeptideY及びNeurotrophin 3のうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
　前記細胞外基質が、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＧＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＣＬ、ハイドロキシアパタイト、β－ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくとも何れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることが好ましい。
　前記細胞外基質における前記歯髄幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下であることが好ましい。
　また、本発明の第２の観点に係る非抜歯による歯組織再生方法は、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の非抜歯の根管の根尖側に、歯髄幹細胞及び細胞外基質を有する非抜歯根管充填材を注入することで、根管内の歯組織を再生することを特徴とする。
　前記歯髄幹細胞は、歯髄ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＳＳＥＡ－４陽性細胞、ＦＬＫ－１陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、歯髄ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、及びＣＤ９０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含むことが好ましい。
　前記歯髄ＳＰ細胞が、ＣＸＣＲ４陽性、ＳＳＥＡ－４陽性、ＦＬＫ－１陽性、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ１５０陽性、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、又はＣＤ９０陽性細胞の何れかであることが好ましい。
　前記非抜歯根管充填材は、歯髄幹細胞を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側に細胞遊走因子、細胞増殖因子、神経栄養因子及び血管新生因子のうち少なくとも何れか一つを含む遊走因子を付着させていることが好ましい。
　前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ－１、ＶＥＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭ－ＣＳＦのうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
　前記細胞増殖因子が、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦのうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
　前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、NeuropeptideY及びNeurotrophin 3のうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
　前記細胞外基質が、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＧＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＣＬ、ハイドロキシアパタイト、β－ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくとも何れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることが好ましい。
　前記根管充填材を前記根管の根尖側に注入する前に、前記根管を拡大することで根尖部の根管の太さを所定の大きさにすることが好ましい。
　前記細胞外基質における前記歯髄幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下であることが好ましい。
　本発明によれば、歯根完成歯に対して、内部吸収や外部吸収を発生させず、破歯細胞が見られず、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並ぶ歯組織再生を図ることができる。
図１は、第１実施形態に係る非抜歯根管充填材の説明図である。 図２は、第１実施形態に係る非抜歯根管充填材の製造工程を説明する説明図である。 図３Ａは、歯髄炎に罹患している歯の説明図である。 図３Ｂは、抜髄後の根管拡大処置を行ったところを説明する模式図である。 図３Ｃは、非抜歯根管充填材を充填するところを説明する模式図である。 図３Ｄは、スポンゼル（ゼラチン）及びレジンを注入したところを説明する模式図である。 図３Ｅは、歯髄再生及び血管再生を示す模式図である。 図３Ｆは、形態形成因子及びレジンを注入したところを説明する模式図である。 図３Ｇは、象牙質再生を示す模式図である。 図３Ｈは、細菌が根管壁の象牙質及び根尖歯周組織に及んでいる根尖性歯周炎の模式図である。 図４Ａは、根管の歯冠側に遊走因子を付着させている非抜歯根管充填材の説明図である。 図４Ｂは、根管の歯冠側に遊走因子を付着させ、歯冠部側に細胞外基質を残している非抜歯根管充填材の説明図である。 図５は、第２実施形態に係る非抜歯根管充填材の製造工程を説明する説明図である。 図６Ａは、抜歯後、生体外で抜髄後根管拡大して、I型・III型混合コラーゲンにＳＤＦ－１及びＣＤ１０５陽性細胞を吸着させて、根管内に注入して再移植した１４日後を説明する図である。 図６Ｂは、抜歯後、生体外で抜髄後根管拡大して、I型・III型混合コラーゲンにＳＤＦ－１及びＣＤ１０５陽性細胞を吸着させて、根管内に注入して再移植した１４日後における根管内部の象牙質壁の高倍像図である。 図６Ｃは、抜歯後、生体外で抜髄後根管拡大して、I型・III型混合コラーゲンにＳＤＦ－１及びＣＤ１０５陽性細胞を吸着させて、根管内に注入して再移植した１４日後における歯根外側の象牙質・セメント質壁の高倍像図である。 図７Ａは、抜歯せず生体内で抜髄後根管拡大して、I型・III型混合コラーゲンにＳＤＦ－１及びＣＤ１０５陽性細胞を吸着させて、根管内に注入した１４日後を説明する図である。 図７Ｂは、抜歯せず生体内で抜髄後根管拡大して、I型・III型混合コラーゲンにＳＤＦ－１及びＣＤ１０５陽性細胞を吸着させて、根管内に注入した１４日後における根管内部の象牙質壁の高倍像図である。 図８Ａは、抜歯せず生体内で抜髄後根管拡大して、I型・III型混合コラーゲンにＳＤＦ－１及びＣＸＣＲ４陽性細胞を吸着させて、根管内に注入した１４日後を説明する図である。 図８Ｂは、抜歯せず生体内で抜髄後根管拡大して、I型・III型混合コラーゲンにＳＤＦ－１及びＣＸＣＲ４陽性細胞を吸着させて、根管内に注入した１４日後における根管内部の象牙質壁の高倍像図である。 図９Ａは、イヌ永久歯歯髄組織から分離したフローサイトメトリーによる歯髄由来のＣＤ１０５陽性細胞の割合を示す図である。 図９Ｂは、イヌ脂肪組織から分離したフローサイトメトリーによる脂肪由来のＣＤ１０５陽性細胞の割合を示す図である。 図９Ｃは、イヌ永久歯歯髄組織から分離した培養３日目の初代歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を示す図である。 図９Ｄは、イヌ永久歯歯髄組織から分離した培養１０日目の初代歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を示す図である。 図９Ｅは、脂肪組織から分離した培養３日目の初代脂肪ＣＤ１０５陽性細胞を示す図である。 図９Ｆは、脂肪組織から分離した培養１０日目の初代脂肪ＣＤ１０５陽性細胞を示す図である。 図１０Ａは、３０日目において、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の脂肪誘導能を示す図である。 図１０Ｂは、３０日目において、未分取のトータル歯髄細胞の脂肪誘導能を示す図である。 図１０Ｃは、３０日目において、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞の脂肪誘導能を示す図である。 図１０Ｄは、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞、未分取のトータル歯髄細胞、及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞の脂肪誘導能の遺伝子発現比較を示す図である。 図１０Ｅは、１２時間後において、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の血管誘導能を示す図である。 図１０Ｆは、１２時間後において、未分取のトータル歯髄細胞の血管誘導能を示す図である。 図１０Ｇは、１２時間後において、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞の血管誘導能を示す図である。 図１０Ｈは、１４日目において、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞のNeurosphere形成能を示す図である。 図１０Ｉは、１４日目において、未分取のトータル歯髄細胞のNeurosphere形成能を示す図である。 図１０Ｊは、２８日目において、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞のニューロフィラメントによる免疫染色を示す図である。 図１０Ｋは、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞のニューロフィラメント、neuromodulin及び電位依存性ナトリウムチャンネル、type Ia (Scn1A) mRNA 発現を示す図である。 図１０Ｌは、２８日目において、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の象牙質・骨形成誘導能を示す図である。 図１０Ｍは、２８日目において、未分取のトータル歯髄細胞の象牙質・骨形成誘導能を示す図である。 図１０Ｎは、２８日目において、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞の象牙質・骨形成誘導能を示す図である。 図１０Ｏは、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞、未分取のトータル歯髄細胞、及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞の象牙芽細胞への分化能の比較を示す図である。 図１０Ｐは、ＳＤＦ－１最終濃度50ng/mlを添加した歯髄ＣＤ１０５陽性細胞、分取していないトータル歯髄細胞及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞の増殖能を示す図であり、培養２，１２，２４，及び３６時間後の細胞数である。 図１１Ａは、イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内にＳＤＦ－１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す図である。 図１１Ｂは、イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内にＳＤＦ－１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生のうちの一部拡大図である。 図１１Ｃは、イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内にＳＤＦ－１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生のうちの一部拡大図である。 図１１Ｄは、イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内にＳＤＦ－１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生における象牙芽細胞分化を示す図である。 図１１Ｅは、イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内に歯髄ＣＤ１０５陽性細胞のみを自家移植することによる歯髄再生を示す図である。 図１１Ｆは、イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内にＳＤＦ－１のみを移植することによる歯髄再生を示す図である。 図１１Ｇは、イヌの抜髄後、９０日目における、空洞の根管内にＳＤＦ－１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す図である。 図１１Ｈは、イヌの抜髄後、９０日目における、空洞の根管内にＳＤＦ－１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す図であり、再生組織上部の新生血管を示す。 図１１Ｉは、イヌの抜髄後、９０日目における、空洞の根管内にＳＤＦ－１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す図であり、再生組織中央部の新生血管を示す。 図１１Ｊは、正常歯髄組織の細胞を示す図である。 図１１Ｋは、イヌの抜髄後、空洞の根管内にＳＤＦ－１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植して、９０日目における、象牙質側壁に沿って新しく形成された骨様・細管象牙質(OD)に並列する象牙芽細胞を示す図である。 図１１Ｌは、イヌの抜髄後、空洞の根管内にＳＤＦ－１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植して、９０日目における、In situ hybridization分析による象牙芽細胞分化を示す図であり、Enamelysin/MMP20である。 図１１Ｍは、イヌの抜髄後、空洞の根管内にＳＤＦ－１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植して、９０日目における、In situ hybridization分析による象牙芽細胞分化を示す図であり、Dentin sialophosphoprotein(Dspp)である。 図１１Ｎは、イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内にＳＤＦ－１とともにトータル歯髄細胞を移植することによる歯髄再生を示す図である。 図１１Ｏは、イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内にＳＤＦ－１とともにトータル歯髄細胞を移植することによる歯髄再生における血管新生を示す拡大図である。 図１１Ｐは、イヌの抜髄後、９０日目における、空洞の根管内にＳＤＦ－１とともにトータル歯髄細胞を移植することによる歯髄再生を示す図である。 図１１Ｑは、イヌの抜髄後、９０日目における、空洞の根管内にＳＤＦ－１とともにトータル歯髄細胞を移植することによる歯髄再生を示す拡大図である。 図１１Ｒは、イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内にＳＤＦ－１とともに脂肪ＣＤ１０５陽性細胞を移植することによる歯髄再生を示す図である。 図１１Ｓは、１４日目の新生再生組織の根管表面積に対する割合を示す図であり、データは５サンプルで平均値±SDで表したものである。 図１１Ｔは、BS-1 lectinによる免疫染色を示す図である。 図１１Ｕは、ホールマウントlectin染色による新生血管の三次元解析であり、移植歯髄ＣＤ１０５陽性細胞が新生毛細血管周囲に存在していることを示す図である。 図１１Ｖは、ホールマウントlectin染色による新生血管の三次元解析であり、１４日目における再生組織の誘導血管の三次元像を示す図である。 図１１Ｗは、ホールマウントlectin染色による新生血管の三次元解析であり、DiIラベルの移植細胞が再生組織全体に散在していることを示す図である。 図１１Ｘは、正常歯髄組織を示す図である。 図１１Ｙは、１４日目の新生再生組織のPGP 9.5.免疫染色を示す図である。 図１１Ｚは、下顎第三切歯に再生された歯髄組織のDiIラベルを示す図である。 図１２Ａは、正常歯髄組織の二次元電気泳動を示す図である。 図１２Ｂは、再生歯髄組織の二次元電気泳動を示す図である。 図１２Ｃは、正常歯髄組織の二次元電気泳動と再生歯髄組織の二次元電気泳動とを重ね合わせた図である。 図１２Ｄは、正常歯髄組織の二次元電気泳動を示す図である。 図１２Ｅは、歯根膜組織の二次元電気泳動を示す図である。 図１２Ｆは、正常歯髄組織の二次元電気泳動と歯根膜組織の二次元電気泳動とを重ね合わせた図である。 図１３Ａは、イヌの感染根管治療後、１４日目における、抜歯した根管内にＳＤＦ－１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す図である。 図１３Ｂは、イヌの感染根管治療後、１４日目における、抜歯していない根管内にＳＤＦ－１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す図である。 図１３Ｃは、イヌの感染根管治療後、１４日目における、抜歯していない根管内にＳＤＦ－１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す一部拡大図である。 図１４Ａは、イヌの抜髄後、１４日目における、抜歯した根管内にＧ－ＣＳＦとともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す図である。 図１４Ｂは、イヌの抜髄後、１４日目における、抜歯していない根管内にＧ－ＣＳＦとともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す図である。 図１４Ｃは、イヌの抜髄後、１４日目における、抜歯していない根管内にＧ－ＣＳＦとともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す一部拡大図である。
　≪第１実施形態≫
　以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明する。本実施形態に係る非抜歯根管充填材は、歯髄幹細胞及び細胞外基質を有し、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、非抜歯の根管の根尖側に挿入される。
　図１は、本実施形態に係る非抜歯根管充填材２００の説明図である。非抜歯根管充填材２００は、細胞外基質２１０に歯髄幹細胞２２０を付着させて形成される。歯髄幹細胞２２０は、非抜歯根管充填材２００の根管の根尖側に付着される。
　歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来の歯髄幹細胞である。歯髄幹細胞は、歯髄ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＳＳＥＡ－４陽性細胞、ＦＬＫ－１陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、歯髄ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、及びＣＤ９０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む。例えばイヌ永久歯歯髄細胞は、ＣＸＣＲ４細胞陽性を０．８％含み、血管新生能等の組織再生能力が高い。
　歯髄ＳＰ細胞は、ＣＸＣＲ４陽性、ＳＳＥＡ－４陽性、ＦＬＫ－１陽性、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ１５０陽性、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、又はＣＤ９０陽性細胞の何れかとすることが好ましい。
　なお、CD31-/CD146- side population（ＳＰ）細胞は、マウス下肢虚血部に移植すると血流回復・血管新生が促進され、ラット脳梗塞虚血部に移植すると神経細胞の分化促進、運動麻痺が回復する。また、イヌの生活歯髄切断面上に移植すると生活歯髄切断面上の窩洞内に血管新生・神経再生・歯髄再生が見られる。このように、歯髄幹細胞としてCD31-/CD146-ＳＰ細胞を用いる場合、歯髄再生能力は高いと考えられるが、ＳＰ細胞を分取するためには、ＤＮＡ結合蛍光色素であるHoechst 33342で細胞をラベルする必要があり、臨床応用をする際、安全性に問題を生じる可能性がある。
　しかしながら、歯髄ＣＸＣＲ４陽性細胞は、コンタミネーションの可能性があるため臨床で使用できないフローサイトメトリー法や高価で使用が限定されている抗体ビーズ法を用いずに、ＳＤＦ－１やＡＭＤ３１００、あるいはＧ－ＣＳＦ等を用いた遊走法により分取できるので、安全且つ安価に分取することができる。そのため、歯髄幹細胞としてＣＸＣＲ４陽性細胞を用いる場合は、臨床にて即座に使用することができ、且つ、経済的であるという重大な利点がある。
　歯髄幹細胞は、歯組織再生の処置を受ける対象動物自身から抽出した自家細胞でもよいし、また、歯組織再生の処置を受ける対象動物以外の動物から抽出した同種細胞でもよい。
　非抜歯根管充填材２００における歯髄幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下とすることが好ましい。歯髄幹細胞の含有率が、１×１０３セル／μｌよりも少ないと、根管内の歯組織の再生が不十分なものとなる可能性があるからである。一方、歯髄幹細胞の含有率が、１×１０６セル／μｌよりも多いと、対象の歯に対して予期せぬ副作用が生じる可能性があるからである。
　細胞外基質（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）２１０は、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＬＧＡ（乳酸グリコール酸共重合体）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ＰＤＬＬＡ（ポリ－ＤＬ－乳酸）、ＰＣＬ（ポリカプロラクトン）、ハイドロキシアパタイト、β－ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくとも何れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることが好ましい。なお、プロテオグリカンは、タンパク質と糖鎖（グリコサミノグリカン）が共有結合した複合糖質の一種である。また、細胞外基質は、熱可塑性高分子等の高分子体で作製された数平均直径が１ｎｍ～１０００ｎｍのナノファイバーからなるスポンジ状の三次元構造体も使用できる。そのような三次元構造体の空隙率は８０％～９９．９９％とすることが好ましい。
　細胞外基質として使用されるコラーゲンは、Ｉ型コラーゲンとIII型コラーゲンとの混合であるＩ型・III型混合コラーゲンを用いることが好ましい。Ｉ型コラーゲンとは、基本的コラーゲンであり、線維性コラーゲンである。III型コラーゲンは、コラーゲン線維とは別の、細網線維と呼ばれる細い網目状の構造を形成し、細胞等の足場を作る。
　上述の混合コラーゲンにおける、III型コラーゲンの割合は１０重量％以上５０重量％以下とすることが好ましい。III型コラーゲンの割合が５０重量％よりも多くなると、混合コラーゲンが固化できないおそれがあるからである。一方、III型コラーゲンの割合が１０重量％よりも少なくなると、Ｉ型コラーゲンの割合が多くなり、後述するような血管新生が起こるのではなく、象牙質が再生される可能性があるからである。
　次に、図２を用いて、本実施形態に係る非抜歯根管充填材２００の製造方法を説明する。図２は、非抜歯根管充填材２００の製造方法を説明する説明図である。
　非抜歯根管充填材２００は、細胞外基質２１０の根尖側に歯髄幹細胞２２０を付着させて形成される。歯髄幹細胞２２０は非抜歯根管充填材２００の根尖部の１／４～２／３に付着されているのが望ましく、より望ましくは根尖部の１／３である。根管充填材の製造方法の一具体例としては、まず、トータルで２０μリットルとし、ピペットマンのチップ等に１０μリットル～１３μリットルのI型・III型混合コラーゲンを吸い込み、次に、歯髄幹細胞を混合させたI型・III型混合コラーゲン（例えばコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン））を７μリットル～１０μリットル吸い込む。ピペットマンのチップ等に吸い込む際には気泡が発生しないように吸引速度は緩やかにすることが好ましい。根管充填材内部に気泡が発生すると、発生した気泡が細胞の遊走を妨げて歯組織再生の促進が損なわれるからである。ピペットマンのチップの内径は細いものが好ましく、例えばチップの下内径が０．５～０．７ｍｍのものが使用でき、例えばＱＳＰ社のＨ－０１０－９６ＲＳマイクロキャピラリーチップを使用できる。非抜歯根管充填材の形状は、特に限定されるものではなく、例えば円錐、円錐台、円柱等である。
　次に、図３Ａ～図３Ｆを用いて、非抜歯根管充填材２００を使用する歯組織再生方法について説明する。
　本実施形態に係る歯髄組織再生方法は、図３Ａに示すように、例えば歯髄炎が発生している対象となる歯１００について、非抜歯にて歯組織再生を行う。対象となる歯とは、う蝕、歯髄炎等により、細菌感染が冠部歯髄又は根部歯髄まで波及している歯をいう。
　対象となる歯１００について、図３Ｂに示すように、抜髄又は感染根管の根管拡大清掃が行われる。抜髄とは、歯牙の内部に存在する歯髄を取り去る行為である。また、感染根管とは、細菌が歯髄に到達後、根管壁の象牙質に及んでいる場合の根管をいい、根管拡大清掃後とは、感染根管における細菌を除去した後をいう。
　抜髄後は、対象となる歯の根管を拡大することで、根尖部の根管の大きさを所定の太さにすることが望ましい。なぜならば、後述するように、抜髄あるいは感染根管治療した根管内に非抜歯根管充填材２００を充填する際に、根管を拡大しておくほうが非抜歯根管充填材２００を充填しやすいからであり、また根尖歯周組織から血管及び神経が進入しやすいからである。ここで、根尖とは、対象となる歯の歯槽骨に結合される端部（歯根の先端部分）をいう。
　例えば、図３Ｂにおいて、根尖部の根管の太さｄは、根管の直径において０．７ｍｍ以上１．５ｍｍ以下とすることが望ましい。根管の太さｄが０．７ｍｍよりも小さいと、血管及び神経が根尖歯周組織から進入しにくく、また非抜歯根管充填材２００の充填が難しいおそれがあるからであり、一方、根管の太さが１．５ｍｍよりも大きいと、対象となる歯に対して必要以上の負担を与えて割れやすくなるおそれがあるからである。
　次に、図３Ｃに示されるように、根管の根尖側にピンセット等により非抜歯根管充填材２００を充填する。非抜歯根管充填材２００は、生物学的材質を含有するので、生物学的根管充填材とすることもできる。非抜歯根管充填材２００は、根管内の歯髄が存在した場所である歯髄相当部位に充填することが望ましい。なお、細胞外基質２１０がゲル状の場合はピンセット等でつまむことができないので、ピペットマン、注射等により注入することになる。
　根管の根尖側に非抜歯根管充填材２００を注入した後は、図３Ｄに示されるように、非抜歯根管充填材２００の上部にゼラチン６１０を注入し、レジン６２０により蓋をする。
　これにより、根管内の歯組織が再生される。再生される歯組織は、図３Ｅに示されるように、例えば根管内の歯髄固有組織、血管４００、神経等である。また、ＢＭＰｓ等の形態形成因子を用いることにより、再生される歯組織としては象牙質がある。更に、感染根管に対して非抜歯根管充填材２００を充填する場合は、再生される歯組織として歯根膜（歯槽骨に歯を植立する歯周組織）やセメント質等の歯周組織がある。
　その後は、レジン６２０を一度除去して、図３Ｆに示すように、ＢＭＰｓ等の形態形成因子６３０又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布し、レジン６２０により蓋をする。形態形成因子６３０又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布したことにより、図３Ｇに示されるように象牙質５００も再生される。
　更に、本実施形態に係る非抜歯根管充填材２００を用いる歯組織再生では、再生組織に内部吸収及び外部吸収が見られず、且つ、破歯細胞も見られずに、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並んでいる。また、出血による血餅が多量に存在すると歯髄組織再生の障害になると考えられるところ、本実施形態に係る発明は非抜歯であるため、血餅の発生を低く抑えられ、効率的に歯組織再生を促進させることができる。また、本実施形態に係る発明は非抜歯であるので、根管拡大後の出血や症状が消失するまで根管貼薬して根管充填を待つことができ、実際の臨床治療に近接させることができる。
　なお、上述したように、対象となる歯１００は、う蝕、歯髄炎等により、細菌感染が冠部歯髄又は根部歯髄まで波及している歯であったが、これに限定されず、対象となる歯１００には神経機能が低下して咬合感覚が弱くなっている歯も含まれる。係る場合は、抜髄後に、非抜歯根管充填材２００を充填することにより、歯髄を再生させることで咬合感覚を向上させることができる。また、図３Ｈに示すように、対象となる歯１００には、細菌感染が根尖歯周組織まで波及している歯（細菌が歯髄に到達後、根管壁の象牙質及び根尖歯周組織に及んでいる歯）も含まれる。このような歯は根尖性歯周炎１１０を伴うことが多い。感染根管の根管拡大清掃後に、非抜歯根管充填材２００が注入される。
　≪第２実施形態≫
　図４Ａ及び図４Ｂは、本発明の第２実施形態に係る非抜歯根管充填材２００の説明図である。図４Ａに示すように、非抜歯根管充填材２００は、歯髄幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側（例えば根管の上部１／２～２／３）に細胞遊走因子、細胞増殖因子、神経栄養因子及び血管新生因子のうち少なくとも何れか一つを含む遊走因子２３０を付着させている。
　歯髄幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させ、根管の歯冠側に遊走因子２３０を付着させる理由は、歯髄幹細胞２２０を根管の歯冠側にまで付着させても組織からの栄養が供給されずに壊死する可能性があるからであり、また、根管の根尖側に付着している歯髄幹細胞２２０が根管の歯冠側に付着している遊走因子に引っぱられて歯組織再生が促進されやすいからである。なお、図４Ｂに示すように、非抜歯根管充填材２００の根管の歯冠側に細胞外基質２１０を残しておくことも可能である。
　細胞遊走因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の遊走に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。また、細胞増殖因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の増殖に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。そして、神経栄養因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の生存に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。血管新生因子とは、それが受容体に結合することによって血管内皮細胞の増殖・遊走・抗アポトーシスに関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。
　細胞遊走因子は、ＳＤＦ－１、ＶＥＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭ－ＣＳＦのうち少なくとも何れか一つを用いることが好ましい。特に、ＭＭＰ３は、細胞遊走能が高く好適に使用することができる。
　細胞増殖因子は、ＩＧＦ，ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦの少なくとも何れか一つを用いることが好ましい。
　神経栄養因子は、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、Neuropeptide Y及びNeurotrophin 3のうち少なくとも何れか一つを用いることが好ましい。
　血管新生因子は、E-selectin、VCAM1、ECSCR及びSLC6A6のうち少なくとも何れか一つを用いることが好ましい。
　遊走因子を付着させた細胞外基質における、遊走因子の含有率は、０．１ｎｇ／μｌ以上５００ｎｇ／μｌ以下とすることが好ましい。遊走因子の含有率が０．１ｎｇ／μｌよりも少ないと、遊走の程度が少なくなる可能性がありうるからである。一方、遊走因子の含有率が５００ｎｇ／μｌよりも多いと、対象となる歯１００に対して予期せぬ副作用が生じる可能性があり得るからである。
　次に、図５を用いて、本実施形態に係る非抜歯根管充填材２００の製造方法を説明する。図５は、根管の歯冠側に遊走因子２３０を付着させる非抜歯根管充填材２００の製造方法を説明する説明図である。
　実施形態２に係る非抜歯根管充填材２００の製造方法の一具体例としては、まず、トータルで２０μリットルとし、ピペットマンのチップ等に遊走因子を混合させたI型・III型混合コラーゲン（Ｉ型コラーゲンとIII型コラーゲンとの混合割合は１：１）を１０μリットル～１３μリットル吸い込む。次に、歯髄幹細胞を混合させたI型・III型混合コラーゲンを７μリットル～１０μリットル吸い込む。実施形態２においても、ピペットマンのチップ等に吸い込む際には気泡が発生しないように吸引速度は緩やかにすることが好ましい。また、ピペットマンのチップの内径は細いものが好ましい。このようにして、図４Ａに示す根管充填材２００が製造される。
　実施形態２に係る非抜歯根管充填材２００の使用形態は、実施形態１と同様に、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の非抜歯の根管の根尖側に充填される。
　本実施形態に係る非抜歯根管充填材２００によれば、遊走因子を有しているため更に効率的に、歯組織再生を行うことができ、再生組織には、内部吸収は無く、破歯細胞も見られずに、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並んでいる。
　≪第３実施形態≫
　上述の第１実施形態では、歯髄幹細胞２２０が非抜歯根管充填材２００の根管の根尖側に付着されて非抜歯根管充填材２００は構成されていた。しかし、そのような実施形態に限定されることはなく、歯髄幹細胞２２０は、非抜歯根管充填材２００の全体に均一に混合されていても良い。このような非抜歯根管充填材２００も、歯根完成歯に対して、内部吸収や外部吸収を発生させず、破歯細胞が見られず、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並ぶ歯組織再生を図ることができる。
　このような非抜歯根管充填材２００は、例えば、歯髄幹細胞と、I型・III型混合コラーゲン（例えばコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン））とを気泡を発生させないように均一に混合させることにより製造される。
　また、上述の第２実施形態では、歯髄幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側に遊走因子２３０を付着させて、非抜歯根管充填材２００は構成されていた。しかし、そのような実施形態に限定されることはなく、歯髄幹細胞２２０及び遊走因子２３０は共に非抜歯根管充填材２００の全体に均一に混合されていても良い。このような非抜歯根管充填材２００も、歯根完成歯に対して、内部吸収や外部吸収を発生させず、破歯細胞が見られず、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並ぶ歯組織再生を図ることができる。
　この非抜歯根管充填材２００は、例えば、歯髄幹細胞と、遊走因子と、I型・III型混合コラーゲン（例えばコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン））とを気泡を発生させないように均一に混合させることにより製造される。
　≪実施例１≫
　〈細胞分取と特徴化〉
　ヒト歯髄を摘出後、３７℃で１時間半、コラーゲナーゼで酵素消化して歯髄細胞を分離した後、２％血清を含むＤＭＥＭ中に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで細胞を分散させ、ＣＸＣＲ４抗体を用いて４℃で３０分ラベル後、フローサイトメトリーを行った。ヒト歯髄由来のＣＸＣＲ４陽性細胞は全体の２０％を占めた。
　表１にフローサイトメトリーの結果を示す。ＣＤ２９及びＣＤ４４については、ＣＸＣＲ４陽性細胞は、ＣＤ１０５陽性細胞と同様に９０％以上であった。また、ＣＤ１０５については、ＣＤ１０５陽性細胞は９０．０％であったが、ＣＸＣＲ４陽性細胞は１．７％であった。ＣＤ１４６については、ＣＸＣＲ４陽性細胞はＣＤ１０５陽性細胞と同様に低い値であった。また、より未分化な幹細胞のマーカーのＣＤ１５０については、ＣＸＣＲ４陽性細胞は、ＣＤ１０５陽性細胞に比べてやや高い値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Real-time　RT-PCRにて、歯髄由来ＣＸＣＲ４陽性細胞と歯髄由来ＣＤ１０５陽性細胞を表２及び表３に示すプライマーを用いてＲＮＡ発現を比較すると、前血管誘導因子ＶＥＧＦ－Ａはほぼ同様の発現量を示し、サイトカインＧＭ－ＣＳＦはＣＸＣＲ４陽性細胞が２．５倍高く、神経栄養因子ＮＧＦはＣＤ１０５陽性細胞の方が２倍高く、NeuropeptideY、Neurotrophine 3及びＢＤＮＦはＣＸＣＲ４陽性細胞がやや高く、幹細胞マーカーＳＯＸ２はＣＸＣＲ４陽性細胞の方が高く、Ｓｔａｔ３及びＲｅｘ１発現はほぼ同等であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　〈イヌ抜髄後の歯髄再生〉
　次に、ＣＤ１０５陽性細胞及びＣＸＣＲ４陽性細胞を用いたイヌ抜髄後の歯髄再生を示す。
　イヌ歯髄組織よりＣＤ１０５陽性細胞及びＣＸＣＲ４陽性細胞を分取した。トータルで６０μリットルとし、ピペットマンのチップＳＤＦ－１（２００ｎｇ）を混合させたコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン　Ｉ型・III型混合コラーゲン）を４０μリットル吸い込み、次に、１×１０６個のＣＤ１０５陽性細胞を混合させたコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン　Ｉ型・III型混合コラーゲン）を２０μリットル吸い込むことにより、抜歯根管への挿入用の根管充填材を作成した。イヌ上顎前歯を抜去後、培地中で歯髄を除去して＃７０まで拡大し、根尖部の根管の太さを０．７ｍｍ以上にした。抜去後３０分以内に上記の根管充填材を、拡大した根管内の歯髄が存在した場所である歯髄相当部位に充填した。３０分以内にイヌの抜歯窩に再移植し、上部は燐酸セメント及び化学重合レジンで封鎖した。１４日後、抜歯し、パラフィン標本を作製した。この結果を図６Ａに示す。また、根管内象牙質壁の高倍像図を図６Ｂに示す。更に、歯根外側の象牙質・セメント質壁の高倍像図６Ｃに示す。図６Ａ、図６Ｂ及び図６ＣはＨ・Ｅ染色である。
　次に、トータルで２０μリットルとし、ピペットマンのチップＳＤＦ－１（２００ｎｇ）を混合させたコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン　Ｉ型・III型混合コラーゲン）を１３μリットル吸い込み、次に、１×１０６個のＣＤ１０５陽性細胞を混合させたコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン　Ｉ型・III型混合コラーゲン）を７μリットル吸い込むことにより、非抜歯根管充填材２００を作成した。この非抜歯根管充填材２００は、根管の歯冠部２／３にＳＤＦ－１が付着されており、根管の根尖側１／３にＣＤ１０５陽性細胞が付着されていた。イヌ上顎前歯を抜去しないで、そのまま歯髄を除去して＃７０まで拡大し、根尖部の根管の太さを０．７ｍｍ以上にした。抜去後３０分以内に上記の非抜歯根管充填材２００を、拡大した根管内の歯髄が存在した場所である歯髄相当部位に充填した。３０分以内に上部は燐酸セメント及び化学重合レジンで封鎖した。１４日後、抜歯し、パラフィン標本を作製した。この結果を図７Ａに示す。また、根管内象牙質壁の高倍像図を図７Ｂに示す。図７Ａ及び図７ＢはＨ・Ｅ染色である。
　次に、トータルで２０μリットルとし、ピペットマンのチップＳＤＦ－１（２００ｎｇ）を混合させたコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン　Ｉ型・III型混合コラーゲン）を１３μリットル吸い込み、次に、１×１０６個のＣＸＣＲ４陽性細胞を混合させたコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン　Ｉ型・III型混合コラーゲン）を７μリットル吸い込むことにより、非抜歯根管充填材２００を作成した。この非抜歯根管充填材２００は、根管の歯冠部２／３にＳＤＦ－１が付着されており、根管の根尖側１／３にＣＸＣＲ４陽性細胞が付着されていた。イヌ上顎前歯を抜去しないで、そのまま歯髄を除去して＃７０まで拡大し、根尖部の根管の太さを０．７ｍｍ以上にした。抜去後３０分以内に上記の非抜歯根管充填材２００を、拡大した根管内の歯髄が存在した場所である歯髄相当部位に充填した。３０分以内に上部は燐酸セメント及び化学重合レジンで封鎖した。１４日後、抜歯し、パラフィン標本を作製した。１４日後、抜歯し、パラフィン標本を作製した。この結果を図８Ａに示す。また、根管内象牙質壁の高倍像図を図８Ｂに示す。図８Ａ及び図８ＢはＨ・Ｅ染色である。
　新生歯髄組織では、抜歯した場合（図６Ａ・図６Ｂ・図６Ｃ）は、抜歯しない場合（図７Ａ・図７Ｂ及び図８Ａ・図８Ｂ）と比較して、血餅が残存しやや炎症がみられた。特に、図６Ａには、再生された歯髄組織内の図中上部に血塊が見られ、更に再生された歯髄組織内の全般に小径の血塊が多数点在している状態が見られた。また、抜歯した場合の根管内象牙質壁には破歯細胞がみられ、内部吸収が見られた（図６Ｂ）。また、歯根外側の象牙質・セメント質に外部吸収が見られた（図６Ｃ）。内部吸収及び外部吸収は、いずれも軽度で吸収が終息している場合は生活に支障が出ないものの、吸収が高度に進行した場合は、歯の動揺、脱落等の危険性が高まり、また虫歯や歯周病に対するリスクも高まる。
　一方、抜歯しない場合の根管内象牙質壁には破歯細胞が見られず、内部吸収及び外部吸収も見られず、更に、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並んでいた（図７Ｂ、図８Ｂ）。また、歯髄幹細胞として、ＣＤ１０５陽性細胞を用いる場合と、ＣＸＣＲ４陽性細胞を用いる場合とでは、再生歯髄の新生毛細血管、神経及び固有歯髄組織の程度は両者に差は見られなかった。
　以上の結果より、抜歯した根管に充填する場合より、非抜歯の根管に充填する場合の方が、明らかに歯髄再生に有利であることが判明した。また、歯髄由来のＣＸＣＲ４陽性細胞は、ＣＤ１０５陽性細胞と同様に、歯髄再生に有効であることが判明した。
　≪実施例２≫
　次に、実施例２では、非抜歯根管充填材の歯組織再生能をより詳細に検証する。
〈フローサイトメトリ―による細胞分取〉
　歯髄細胞を上顎犬歯より分離した。初代脂肪細胞は同一個体のイヌの脂肪組織よりコントロールとして分離した。細胞をマウスIgG1 陰性コントロール(W3/25) (AbD Serotec Ltd., Oxford, UK)として免疫染色した。細胞は、mouseIgG1 negative control (Phycoerythrin, PE) (MCA928PE) (AbD Serotec)及びmouseanti-human ＣＤ１０５ (PE) (43A3) (BioLegend, San Diego, CA, USA)で４℃、９０分免疫染色した。２μg/ml propidium iodide 含有HEPESbuffer (Sigma)に、再溶解し、JSAN (Bay Bioscience, Kobe,Japan)にて分取した。歯髄及び脂肪由来のＣＤ１０５陽性細胞、ＣＤ１０５陰性細胞及び、分取していないトータル歯髄細胞は３５mmcollagen type Iコートディッシュ (Asahi Technoglass Corp., Funabashi, JAPAN)に播種し、１０ng/mlIGF (Cambrex Bio Science)、５ng/ml EGF(Cambrex Bio Science)及び１０％ fetal bovineserum (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)を添加したEBM2(Cambrex Bio Science, Walkersville, Maryland, USA)中で培養し、細胞の形質を維持した。培地は４～５日に一度交換し、６０～７０％コンフレントに達した後、３７℃、１０分、０．０２％EDTAで反応させ、細胞を剥離し、１：４希釈にて継代した。
　歯髄ＣＤ１０５陽性細胞は、更に三代目にて特徴化し、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及び未分取のトータル 歯髄細胞と比較した。mouse IgG1 negativecontrol (AbD Serotec Ltd.), mouse IgG1 negative control (fluoresceinisothiocyanate, FITC) (MCA928F) (AbD Serotec),mouse IgG1 negative control (Phycoerythrin-Cy5,PE-Cy5)(MCA928C) (AbD Serotec), mouse IgG1 negative control (Alexa 647) (MRC OX-34) (AbDSerotec),及びCD24 (Alexa Fluor 647) (ML5) (BioLegend), CD29 (PE-Cy5)(MEM-101A) (eBioscience), CD31 (FITC) (Qbend10) (Dako), CD33 (FITC) (HIM3-4)(BD Bioscience), CD34 (Allophycocyanin, APC) (1H6) (R&D Systems, Inc.,Minneapolis, MN, USA), CD44 (Phycoerythrin-Cy7, PE-Cy7) (IM7) (eBioscience),CD73 (APC) (AD2) (BioLegend), CD90 (FITC) (YKIX337.217) (AbD Serotec), CD146(FITC) (sc-18837) (Santa Cruz, Biotech,Santa Cruz, CA, USA), CD150(FITC) (A12) (AbD Serotec), MHC class I (R-PE) (3F10) (AncellCorporation, Bayport, MN, USA), MHC class II (APC) (TDR31.1) (Ancell), 及びCXCR4 (FITC) (12G5) (R&D)に対する抗体でそれぞれ染色した。
　〈幹細胞マーカー、血管新生、神経栄養因子のReal-time RT-PCRによる発現分析〉
　細胞画分の形質を更に特徴化するために、Trizol (Invitrogen) を用いて三代目の歯髄及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及びトータル歯髄細胞からトータル RNAを分離した。それぞれの実験において細胞数は５×１０４個に標準化した。First-strand cDNA 合成はReverTra Ace-α(Toyobo, Tokyo, Japan)を用いてトータルRNAから合成し、Light Cycler-Fast Start DNAmaster SYBR Green I (Roche Diagnostics, Pleasanton, CA)を用いてLight Cycler (RocheDiagnostics)にて９５℃で１０秒，６２℃で１５秒，７２℃で８秒のプログラムで、上記表２及び表３に示す幹細胞マーカーのイヌＣＸＣＲ４，Ｓｏｘ２，Ｓｔａｔ３，Ｂｍｉ１及びＲｅｘ１のReal time RT-PCRを行った。oligonucleotideプライマーは、公表されているイヌcDNAシークエンスを用いて作成した。イヌシークエンスが登録されていない場合、ヒトシークエンスを用いた。血管新生因子及び神経栄養因子のmRNA発現を検討するため、イヌmatrix metalloproteinase（ＭＭＰ）-３,ＶＥＧＦ－Ａ,granulocyte-monocytecolony-stimulating factor（ＧＭ－ＣＳＦ）,ＳＤＦ－１,ＮＧＦ,ＢＤＮＦ,Neuropeptide Y,Neurotrophin 3,E-selectin,ＶＣＡＭ１,rhombotin 2,ＥＣＳＣＲ及びＳＬＣ６Ａ６のreal-time RT-PCRを行った。RT-PCR産物は登録されたcDNAシークエンスを用いて確定した。三代目歯髄ＣＤ１０５陽性細胞及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞は、β-actinで標準化してトータル歯髄細胞と比較した。
　〈増殖及び遊走分析〉
　stromal cell-derived factor-1(ＳＤＦ－１)(Acris, Herford, Germany)に対する歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の増殖能を、０．２％ bovine serum albumin (Sigma)及びＳＤＦ－１(５０ng/ml)添加EBM2中で９６wellに１０３個播種し、トータル歯髄細胞及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞と、四代目において比較した。１０μｌ Tetra-colorone(登録商標、Seikagaku Kogyo, Co., Tokyo, JAPAN)を９６well plateに添加し、細胞数を吸光度４５０nmにて吸光度計を用いて２，１２，２４及び３６時間後に計測した。細胞を入れてないサンプルをnegativecontrolとした。
　歯髄ＣＤ１０５陽性細胞のＳＤＦ－１に対する遊走能を、水平化学走化性分析法にてトータル歯髄細胞及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞と比較した。TAXIScan-FL (Effector Cell Institute, Tokyo, JAPAN)を用いてreal-time水平化学走化性分析を行った。TAXIScan-FL は６μmの孔のあいたsilicon及びガラスプレートの間に、細胞の大きさに最適化したチャンネルを形成し、チャンネル内の一端に細胞(１０５個/mlを１μl)を入れ、もう一端に１０ng/μｌのＳＤＦ－１を一定濃度勾配に形成させるように投入して、遊走する細胞を顕微鏡下で６時間撮影した。
　〈歯髄及び脂肪由来ＣＤ１０５陽性細胞の分取及び特徴化〉
　ＣＤ１０５抗体を用いてイヌ永久歯歯髄組織からフローサイトメトリーにより分離した歯髄由来のＣＤ１０５陽性細胞及び同一個体の脂肪組織由来のＣＤ１０５陽性細胞は、図９Ａ及び図９Ｂに示すように、それぞれトータル細胞の６％及び５．８％であった。また、図９Ｃ、図９Ｄ、図９Ｅ及び図９Ｆに示すように、歯髄及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞は、ともに星状で長い突起を有していた。図示しないが、歯髄ＣＤ１０５陰性細胞は、不規則な形で短い突起を有していた。IGF1,EGF及び１０％ウシ胎児血清をEBM2に添加すると、ＣＤ１０５陽性細胞の形質が維持され、６代目でも９８％以上ＣＤ１０５が陽性であった。３５mmcollagen type I コートディッシュにＣＤ１０５陽性細胞を一個播種すると、１０日でコロニーを形成し、この細胞のコロニー形成能を示した。歯髄、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及び歯髄ＣＤ１０５陰性細胞の細胞付着及び増殖効率はそれぞれ８％，３．７％，１％であった。三代目で限界希釈法により、コロニーフォーミングユニット(CFU)は、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞では、８０％であり、トータル歯髄細胞では３０％、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞では５０％であった。
　歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の特徴化を進めるために細胞表面抗原マーカーを用いて、フローサイトメトリーを行い、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及びトータル歯髄細胞と比較した。歯髄ＣＤ１０５陽性細胞、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及びトータル歯髄細胞は三代目でＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０及びＣＤ１０５が陽性であり、ＣＤ３１が陰性であった。下記の表４に示すように、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞は、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及びトータル歯髄細胞に比べてＣＤ７３，ＣＤ１５０及びＣＸＣＲ４を強く発現していることは特筆すべきことである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　歯髄ＣＤ１０５陽性細胞においては、トータル歯髄細胞に比べ、ＣＸＣＲ４，Ｓｏｘ２及びＢｍｉ１ ｍＲＮＡ等の幹細胞マーカーを１６．８，６４及び３．５倍高く発現しており、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の幹細胞としての性質が示唆された。ＣＸＣＲ４，Ｓｏｘ２及びＢｍｉ１ｍＲＮＡは歯髄ＣＤ１０５陽性細胞において脂肪ＣＤ１０５陽性細胞に比べて高く発現していた。表５に示すように、ＶＥＧＦ－Ａ，ＧＭ－ＣＳＦ，nerve growth factor（ＮＧＦ），brain-derivedneurotrophic factor（ＢＤＮＦ），neuropeptideY，neurotrophin 3，E-selectin及びＶＣＡＭ－１等の血管新生因子あるいは神経栄養因子は、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞に比べ歯髄ＣＤ１０５陽性細胞において高く発現していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　〈in vitroにおける多分化能〉
　三代目から五代目において歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の脂肪、血管、神経、及び象牙質／骨への分化誘導を行い、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及び未分取の歯髄細胞と比較した。
　図１０Ａ及び図１０Ｄに示すように、歯髄幹細胞は脂肪細胞への分化能を示した。また、図１０Ｅに示すように、歯髄幹細胞は血管内皮細胞への分化能を示した。また、図１０Ｈ、図１０Ｊ及び図１０Ｋに示すように、歯髄幹細胞は神経細胞への分化能を示した。また、図１０Ｌ及び図１０Ｏに示すように、歯髄幹細胞は、象牙芽細胞あるいは骨芽細胞系譜への分化能を示した。
　しかしながら、図１０Ｌ及び図１０Ｍに示すように、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞に比べてトータル歯髄細胞においては石灰化基質が多く認められた。また、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｎ、図１０Ｏ及び図１０Ｇに示すように、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞は脂肪誘導能及び骨誘導能はあるが、血管誘導能あるいは神経誘導能は見られなかった。図１０Ｐに示すように、ＳＤＦ－１による増殖活性は、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞においてトータル歯髄細胞及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞に比べて高かった。なお、図１０Ｐにおいて、データは４サンプルで平均値±SDで表しており(*P<0.01)、実験は３回繰り返し行った典型例を示したものである。TAXIScan-FLにおいて示されるように、ＳＤＦ－１による遊走活性は歯髄ＣＤ１０５陽性細胞においてトータル歯髄細胞及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞よりも高かった。
　〈幹細胞／前駆細胞の抜髄後根管内自家移植〉
　イヌ(Narc, Chiba, Japan)永久歯完全根尖完成歯を全部歯髄除去し、細胞画分を移植して歯髄を再生させる実験的モデルを確立した。sodiumpentobarbital(Schering-Plough, Germany)で全身麻酔後、上顎第二切歯及び下顎第三切歯の完全歯髄除去を行い、根尖部を#70K-file (MANI. INC, Tochigi, Japan)を用いて０．７mmに拡大した。細胞外基質としてcollagen XYZを用い、根尖側に歯髄幹細胞を付着させると共に歯冠側にＳＤＦ－１を付着させた根管充填材を用いた。即ち、１ｘ１０６個の、三代目から四代目の歯髄ＣＤ１０５陽性細胞、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞あるいはトータル歯髄細胞をcollagen XYZ(新田ゼラチン,Osaka,Japan)とともにDiIラべリング後、根管内の下部に自家移植した。根管上部は更にcollagenXYZとともに最終濃度１５ng/μlのＳＤＦ－１を移植した。窩洞はリン酸亜鉛セメント(EliteCement, GC, Tokyo, Japan)及びボンディング材(Clearfil Mega Bond, Kuraray)で処理した後、コンポジットレジン(Clearfil FII,Kuraray,Kurashiki,Japan)で修復した。１５匹のイヌ６０歯を用いた。１０歯は歯髄ＣＤ１０５陽性細胞及びＳＤＦ－１、５歯は脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及びＳＤＦ－１、５歯はトータル歯髄細胞及びＳＤＦ－１、５歯は細胞を入れずＳＤＦ－１のみ、５歯はＳＤＦ－１を入れず歯髄ＣＤ１０５陽性細胞のみ、５歯は細胞を入れずscaffoldのみ注入し、１４日後に標本を作製した。６歯は歯髄ＣＤ１０５陽性細胞及びＳＤＦ－１を注入し、２８日後に二次元電気泳動分析した。４歯に、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞及びＳＤＦ－１、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及びＳＤＦ－１、並びに、トータル歯髄細胞及びＳＤＦ－１を注入し、９０日後に標本を作製した。７歯の正常歯をcontrolとして用いた。形態分析のために４％paraformaldehyde(PFA) (Nakarai Tesque, Kyoto, Japan)で４℃一晩固定し、１０％蟻酸にて脱灰後、paraffin wax (Sigma)に包埋した。paraffin切片(厚さ５μm)をhematoxylin-eosin(HE)染色し、形態学的に観察した。
　血管染色のため、５μm厚みのparaffin切片を脱パラフィンし、Fluorescein Griffonia (Bandeiraea)Simplicifolia Lectin 1/fluorescein-galanthus nivalis (snowdrop) lectin (２０μg/ml, Vector laboratories, Inc., Youngstown,Ohio)にて１５分染色し、fluorescence microscope BIOREVO, BZ－9000（KEYENCE, Osaka, Japan)にて新生血管に対する移植細胞の存在及び局在性を観察した。移植後１４日後の再生歯髄と正常歯髄を４％ paraformaldehydeで４５分固定した後、０．３％Triton X 含有PBSで処理後、ブロッキングを行い、GS-IB4 (Griffoniasimplicifolia, Alexa Fluor 488)レクチンにて１２時間４℃にてホールマウント免疫染色した。新生血管と移植細胞は二光子顕微鏡FV1000MPE (Olympus)にて三次元的に撮影した。
　新生神経の染色は、５μm厚みのparaffin切片を脱パラフィンし、３％ Triton X 含有PBSで処理後、２％ヤギ血清でブロッキングを行い、PGP-9.5にて１２時間４℃にて一次染色した。三回PBSで洗浄した後、biotinylatedgoat anti-rabbit IgG (Vector)(1:200)で二次染色を１時間室温で行った。ABC reagent (VectorLaboratories, Burlingame, CA)にて処理した後、DABにて１０分間発色させた。
　新生神経突起が下歯槽神経とつながっていることの確認のため、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞をDiIラベルせずに下顎第三切歯に移植し、移植後に１４日目にDiIを再生歯髄上に適用し、移植後１７日目に下顎骨を摘出し、蛍光顕微鏡(Leica,M 205 FA, Wetzlar, Germany)にて観察した。
　１４日目における再生歯髄の再生量を統計学的に解析するため、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞及びＳＤＦ－１、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及びＳＤＦ－１、トータル歯髄細胞及びＳＤＦ－１、細胞を入れずＳＤＦ－１のみ、ＳＤＦ－１を入れず歯髄ＣＤ１０５陽性細胞のみ、並びに、細胞を入れずscaffoldのみの標本から５本ずつ１５０μm間隔で実体顕微鏡にて(Leica, M 205 FA)撮影、Leica Application Suite softwareを用いて解析した。根管の表面積に対する新生再生組織の割合はそれぞれの歯牙の三か所を平均して計算した。統計計算はスチューデントｔ検定を用いて行った。
　生体内における象牙芽細胞分化マーカーであるdentinsialophosphoprotein（Ｄｓｐｐ）と enamelysinの発現は、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞及びＳＤＦ－１移植後９０日目の５μm-paraffin切片において、in situ hybridizationにて根管の側壁において観察した。イヌＤｓｐｐ（１８３ｂｐ）及びenamelysin（１９５ｂｐ）のcDNAをそれぞれNcoI 及びSpe Iにて切断して線状にリニアライズし、anti-senseprobesを作製した。プローブはPCR productをsubcloning後プラスミドから作成し、real-time RT-PCRで用いた表２及び表３記載のプライマーから作成した。DIGシグナルはTSAsystem (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)にて検出した。
　〈歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の抜髄後根管内移植による歯髄再生〉
　次に、上述の図３に示したような手順にて、イヌにおいて永久歯の完全根尖完成歯の抜髄後根管内に、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞をＳＤＦ－１とともに自家移植した。図１１Ａは、ＳＤＦ－１及び歯髄ＣＤ１０５陽性細胞による歯髄再生を示す図である。図１１Ｂは、図１１ＡにおけるエリアＢの拡大図である。図１１Ｃは、図１１ＡにおけるエリアＣの拡大図である。図１１Ａ、図１１Ｂ及び図１１Ｃに示すように、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞をＳＤＦ－１とともに移植すると、歯髄様組織が１４日までに形成された。図１１Ｅに示すように、ＣＤ１０５陽性細胞のみを移植しても歯髄様組織が形成されたが、ＳＤＦ－１とともに移植したほうが歯髄様組織の形成が促進された。一方、図１１Ｆに示すように、ＳＤＦ－１のみを移植すると、極めて少量の歯髄しか形成されなかった。図１１Ｓに示すように、non-pairedスチューデントｔ検定で統計学的解析を行うと、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞をＳＤＦ－１とともに移植すると、ＣＤ１０５陽性細胞のみあるいはＳＤＦ－１のみと比べて、再生された面積は有意に増加した（それぞれ３．３倍及び４．２倍）。図１１Ｄに示すように、象牙芽細胞様細胞は、根管の象牙質壁に付着し、細管内に突起を伸ばしていた。図１１Ｇに示すように、歯髄様組織は、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞をＳＤＦ－１とともに移植すると、９０日後にはセメント-エナメル質境まで達していた。図１１Ｈに示すように、再生組織の上部に存在する細胞は、紡錘形であり、また図１１Ｉに示すように、中央部では星状であった。これらの再生組織は、図１１Ｊに示す正常歯髄組織の細胞に類似していた。図１１Ｇ及び図１１Ｋに示すように、象牙質側壁に沿って、細管象牙質が観察されたのは特筆すべきことである。図１１Ｌ及び図１１Ｍに示すように、象牙異質側壁に並んで存在する象牙芽細胞は、象牙芽細胞の二つのマーカーであるenamelysin/matrixmetalloproteinase（ＭＭＰ）２０及びＤｓｐｐ陽性であった。
　しかしながら、図１１Ｎ及び図１１Ｏに示すように、ＣＤ１０５陽性細胞の代わりに、未分取のトータル歯髄細胞を移植した場合には、より少量の歯髄組織しか再生されず、図１１Ｐの矢印に示す石灰化組織及び図１１ＱにＯＤにて示す骨様象牙質のように、９０日後には石灰化がみられた。図１１Ｒに示すように、同様に脂肪由来のＣＤ１０５陽性細胞を移植した場合にも、より少量の再生組織しか見られなかった。図１１Ｓに示すように、更に、統計学的解析により、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞をＳＤＦ－１とともに移植した場合、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞をＳＤＦ－１とともに移植、あるいはトータル歯髄細胞をＳＤＦ－１とともに移植した場合よりも、１４日目で、根管の表面積に対する新生再生組織の割合は、有意に高いことが分かった（５１．６倍及び２．２倍）。図１１Ｔに示すように、凍結切片をBS-1 lectinで染色後、共焦点レーザー顕微鏡分析により、再生組織における血管新生が認められた。図１１Ｕに示すように、二光子顕微鏡分析により、DiIでラベルした移植歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の多くが、新生毛細血管の近くに観察され、血管新生におけるこれらの細胞の血管新生因子を放出する役割が示唆された。図１１Ｖに示すように、１４日目における再生組織の誘導血管の三次元像は、図１１Ｘに示される正常歯髄の像と、密度及び方向性において類似していた。図１１Ｗに示すように、移植したＣＤ１０５陽性細胞は、新しく再生された歯髄のあらゆるところに観察され、ＳＤＦ－１により、上部に遊走する能力を歯髄ＣＤ１０５陽性細胞が持つことが示唆された。図１１Ｙに示すように、PGP9.5抗体で染色される神経突起は、根尖孔から新しく再生された組織中に伸長していた。図１１Ｚに示すように、下顎第三切歯に再生された歯髄組織をDiIラベルしたところ、新生歯髄組織(点線で示す)において再生された神経は下歯槽神経とつながっていることが明らかとなった。
　〈歯髄再生の二次元電気泳動分析及び遺伝子発現分析〉
　再生組織の二次元電気泳動分析のために、２８日目の再生歯髄様組織、正常歯髄組織、及び歯根膜組織を細切し、lysis buffer(６Ｍ urea,１．９７Ｍ thiourea,２％（ｗ／ｖ） CHAPS,６４．８mM DTT,２％（ｖ／ｖ）Pharmalyte)に溶解し、超音波をかけた。15,000rpmで１５分、４℃で遠心し、上清を二次元電気泳動した。等電点電気泳動(IEF)はCoolPhoreSter2-DE systemにて行った。IPG strips (Immobiline DryStrips，ｐＨ４～７，１８cm, GE)はmanufacturerの指示に従い用いた。IPGstripsはrehydration solution(６Ｍ urea,１．９７Ｍ thiourea,２％（ｖ／ｖ）TritonX-100,１３mM DTT,２％（ｖ／ｖ）Pharmalyte,２．５mMacetic acid,0.0025％ BPB)により一晩２０℃にて再度水和した。等電点電気泳動(IEF)は500Ｖ、２時間、700-3000Ｖ、１時間、及び3500Ｖ、２４時間の電圧を徐々に上昇させる方法で行った。等電点電気泳動後、IPGstripsは平衡緩衝液equilibration buffer (６Ｍ urea,２．４mM DTT,５mM Tris-HCl,pＨ６．８,２％（ｗ／ｖ）SDS,0.0025％BPB,３０%（ｖ／ｖ） Glycerol)にて３０分室温にて反応させた。IPG stripsは更に5mM Tris-HCl、pH６．８、２％（ｗ／ｖ）SDS、0.0025％BPB、３０%（ｖ／ｖ）Glycerol、２４３mM iodoacetamidにて２０分室温にて平衡化させた。その後、二次元目は12.5% SDS-PAGEgel (２０cm×２０cm)にて２５mA/gelで１５分、その後３０mA/gelで泳動した。GelはFlamingo Fluorescent GelStain (Bio-Rad Laboratories,CA,USA)で染色し、(FluoroPhorester 3000, Anatech, Tokyo,Japan)にてscanした。GelイメージはProgenesis (Nonlinear Dynamics, NC, USA)を用いて分析し、それぞれのパターンを比較した。
　歯根膜に特異的なイヌaxin2、periostin、及びasporin/periodontal ligament-associatedprotein 1 (PLAP-1)を用いてReal time RT-PCR 分析を行った。再生組織におけるCollagen type aI(I)、syndecan3、及びtenascin Cの発現を正常歯髄並びに歯根膜と比較した。
　〈再生歯髄の二次元電気泳動によるタンパク化学分析及び遺伝子発現解析〉
　図１２Ａ、図１２Ｂ及び図１２Ｃに示すように、二次元電気泳動分析により、再生歯髄組織は２８日目において同一個体由来の正常歯髄組織に定性及び定量的にタンパク発現パターンが類似していることが明らかとなった。正常及び再生歯髄組織両方に見られるタンパクスポットは８５．５％（１２３ spots）であった。一方、図１２Ｄ、図１２Ｅ及び図１２Ｆに示すように、正常歯髄組織のタンパクスポットは、歯根膜組織と比べて、違いがみられた。従って、二次元電気泳動分析により、再生組織は機能的に正常歯髄組織であることが判明した。
　歯髄組織に特異的なマーカーはこれまでに見つかっていない。従って、再生組織が正常の歯髄組織であることを証明するために、歯根膜組織に特異的なマーカーとして、axin2,periostin及びasporin/periodontal ligament-associated protein 1 (PLAP-1)を更に用いた。axin2、periostin及びPLAP-1 mRNA発現は、正常歯根膜において再生歯髄組織のそれに比べて２８日目でそれぞれ２５、５３１倍、１７９倍及び１１倍と高い発現がみられた。表６に示すように、これらの遺伝子は、正常歯髄で再生組織と比べて、ほぼ同程度（０．４倍、０．４倍、及び２．４倍）に発現がみられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示すように、CollagenαI(I)は歯根膜において再生組織よりも9.3倍多く発現し、正常歯髄と再生歯髄の間ではほとんど違いが認められなかった。Syndecan 3及びTenascin Cは歯髄組織で高く発現していることが知られており、再生組織においては歯根膜組織と比較して、１４．３倍及び５０．０倍高く発現が見られた。従って二次元電気泳動分析及び、遺伝子発現分析により、再生組織は機能的に正常歯髄組織であることが判明した。
　〈歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の感染根管治療後根管内自家移植による歯髄再生〉
　イヌ永久歯完全根尖完成歯を全部歯髄除去し、根尖部をK-fileにて＃３０まで拡大し、そのまま根管を開放し２週間放置し、感染根管歯モデルを作製した。その後、次亜塩素酸ソーダおよびオキシドールにて交互洗浄し、さらにスメアクリーンを根管内に３０秒間入れた後、生理食塩水にてさらに洗浄した。さらにFC（ホルムクレゾール）を根管内に一週間貼薬し、根管内の無菌化を図った。その後、再度、生理食塩水にて洗浄し、根管内をペーパーポイントにて乾燥させた。細胞外基質としてcollagenXYZを用い、根尖側に歯髄幹細胞を付着させると共に歯冠側にＳＤＦ－１を付着させた根管充填材を用いた。即ち、抜髄後の根管内自家移植と同様の方法にて、１ｘ１０６個の、三代目から四代目の歯髄ＣＤ１０５陽性細胞をcollagen XYZとともに、根管内の下部に自家移植した。根管上部は更にcollagenXYZとともに最終濃度１５ng/ilのＳＤＦ－１を移植し、窩洞をリン酸亜鉛セメント及びコンポジットレジンで修復した。１４日後に標本を作製した。通法にて形態学的に観察した。
　図１３Ａは、ＳＤＦ－１及び歯髄ＣＤ１０５陽性細胞による歯髄再生を示す図である。図１３Ｂは、図１３Ａにおける根管内に再生された歯髄組織の中央部の拡大図である。図１３Ｃは、図１３Ａにおける根管内に再生された歯髄組織の象牙質側壁に接する部位の拡大図である。図１３Ａ、図１３Ｂ及び図１３Ｃに示すように、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞をＳＤＦ－１とともに移植すると、歯髄様組織が１３日までに形成された。図１３Ｂに示すように、歯髄組織内は血管が新生され、歯髄細胞がみられたが、炎症性細胞も若干散在していた。図１３Ｃに示すように、象牙芽細胞様細胞は、根管の象牙質側壁に付着し、並列して存在していた。
　《実施例３》
　次に、実施例３では、遊走因子Ｇ－ＣＳＦ及び歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を用いて、抜歯した根管に充填する場合と非抜歯の根管に充填する場合との比較を行った。
　上述の実施例１及び実施例２と同様に、イヌ前歯を抜歯した後、scaffoldとしてcollagen XYZとともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を５ｘ１０５cells（１０μl）を根管内下部に、そして遊走因子としてＧ－ＣＳＦを２００ｎｇ（１０μl）を根管内上部に移植して、１４日経過させた。その結果を図１４Ａに示す。図１４Ａに示されるように、歯髄様組織は少量しか形成せず、矢印で示すように、強い炎症像及び外部吸収がみられた。
　次に、イヌ前歯を抜歯せずに、scaffoldとしてcollagenXYZとともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を５ｘ１０５cells(１０μl）を根管内下部に、そして遊走因子としてＧ－ＣＳＦを２００ng（１０μl）を根管内上部に移植して、１４日経過させた。その結果を図１４Ｂに示す。図１４Ｂに示されるように、歯髄様組織が著明に形成され、炎症像はみられなかった。また外部吸収もみられなかった。図１４Ｃは、図１４Ｂに示した矢印部分の歯髄様組織の拡大図である。図１４Ｃに示すように、再生歯髄様組織中には、細長い紡錘形の線維芽細胞様の歯髄細胞が存在し、炎症性細胞はみられなかった。
１００：対象となる歯
１１０：根尖性歯周炎
２００：非抜歯根管充填材
２１０：細胞外基質
２２０：歯髄幹細胞
２３０：遊走因子
４００：血管
５００：象牙質
６１０：ゼラチン
６２０：レジン
６３０：形態形成因子
　配列番号１～６４：プライマー

Claims (19)

  1. 　抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、非抜歯の根管の根尖側に挿入される、歯髄幹細胞及び細胞外基質を有することを特徴とする非抜歯根管充填材。
  2. 　前記歯髄幹細胞は、歯髄ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＳＳＥＡ－４陽性細胞、ＦＬＫ－１陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、歯髄ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、及びＣＤ９０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする請求項１記載の非抜歯根管充填材。
  3. 　前記歯髄ＳＰ細胞が、ＣＸＣＲ４陽性、ＳＳＥＡ－４陽性、ＦＬＫ－１陽性、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ１５０陽性、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、又はＣＤ９０陽性細胞の何れかであることを特徴とする請求項２記載の非抜歯根管充填材
  4. 　前記歯髄幹細胞を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側に細胞遊走因子、細胞増殖因子、神経栄養因子及び血管新生因子のうち少なくとも何れか一つを含む遊走因子を付着させていることを特徴とする請求項１に記載の非抜歯根管充填材。
  5. 　前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ－１、ＶＥＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭ－ＣＳＦのうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項４記載の非抜歯根管充填材。
  6. 　前記細胞増殖因子が、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦのうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項４記載の非抜歯根管充填材。
  7. 　前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、NeuropeptideY及びNeurotrophin 3のうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項４記載の非抜歯根管充填材。
  8. 　前記細胞外基質が、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＧＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＣＬ、ハイドロキシアパタイト、β－ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくとも何れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることを特徴とする請求項１に記載の非抜歯根管充填材。
  9. 　前記細胞外基質における前記歯髄幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下であることを特徴とする請求項１に記載の非抜歯根管充填材。
  10. 　抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の非抜歯の根管の根尖側に、歯髄幹細胞及び細胞外基質を有する非抜歯根管充填材を注入することで、根管内の歯組織を再生することを特徴とする非抜歯による歯組織再生方法。
  11. 　前記歯髄幹細胞は、歯髄ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＳＳＥＡ－４陽性細胞、ＦＬＫ－１陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、歯髄ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、及びＣＤ９０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする請求項１０記載の非抜歯による歯組織再生方法。
  12. 　前記歯髄ＳＰ細胞が、ＣＸＣＲ４陽性、ＳＳＥＡ－４陽性、ＦＬＫ－１陽性、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ１５０陽性、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、又はＣＤ９０陽性細胞の何れかであることを特徴とする請求項１１記載の非抜歯による歯組織再生方法。
  13. 　前記非抜歯根管充填材は、歯髄幹細胞を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側に細胞遊走因子、細胞増殖因子、神経栄養因子及び血管新生因子のうち少なくとも何れか一つを含む遊走因子を付着させていることを特徴とする請求項１０に記載の非抜歯による歯組織再生方法。
  14. 　前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ－１、ＶＥＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭ－ＣＳＦのうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項１３記載の非抜歯による歯組織再生方法。
  15. 　前記細胞増殖因子が、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦのうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項１３記載の非抜歯による歯組織再生方法。
  16. 　前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、NeuropeptideY及びNeurotrophin 3のうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項１３記載の非抜歯による歯組織再生方法。
  17. 　前記細胞外基質が、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＧＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＣＬ、ハイドロキシアパタイト、β－ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくとも何れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることを特徴とする請求項１０に記載の非抜歯による歯組織再生方法。
  18. 　前記根管充填材を前記根管の根尖側に注入する前に、前記根管を拡大することで根尖部の根管の太さを所定の大きさにすることを特徴とする請求項１０に記載の非抜歯による歯組織再生方法。
  19. 　前記細胞外基質における前記歯髄幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下であることを特徴とする請求項１０に記載の非抜歯による歯組織再生方法。
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